本發(fā)明關(guān)于一種山竹組合物以及其用于制備增進阿爾茨海默癥患者學習能力與記憶的藥物的用途。
背景技術(shù)：
：老年失智癥是所有神經(jīng)退化性疾病中為數(shù)最多的一種，其實為各種相似的神經(jīng)退化性疾病的總稱，其中發(fā)生率最高的疾病就是阿爾茨海默癥(alzheimer’sdisease)。目前全球約有2,400萬名阿爾茨海默癥患者，且隨著老化人口增加，每年約增加460萬病例，世界衛(wèi)生組織(who)預估到2040年將增至8,000萬人。阿爾茨海默癥是一種發(fā)病進程緩慢、隨著時間不斷惡化的持續(xù)性神經(jīng)功能障礙。最常見的早期癥狀，是喪失短期記憶力。而之后隨著疾病的發(fā)展，癥狀可能會包含：譫妄、易怒、具攻擊性、無法正常言語、容易迷路、情緒不穩(wěn)定、喪失生存動力、喪失長期記憶、難以自理和行為異常等。雖然疾病的進程因人而異，很難預測患者的預后，但一般而言，確定診斷后的平均余命是三到九年。阿爾茨海默癥的成因至今仍未完全的明了，目前已知的阿爾茨海默癥患者的腦部中的神經(jīng)元細胞會出現(xiàn)斑塊(plaques)和神經(jīng)纖維糾結(jié)(neurofibrillarytangles，簡稱nfts)的現(xiàn)象，以及腦部中的meynert氏基底核(nucleusbasalisofmeynert)部退化，且神經(jīng)傳導物質(zhì)乙酰膽堿(acetylcholine)減少。所謂神經(jīng)纖維糾結(jié)(nfts)，是指在腦部病理解剖發(fā)現(xiàn)糾結(jié)的神經(jīng)，其細胞型態(tài)嚴重變形，并且堆棧成團。目前已知神經(jīng)纖維糾結(jié)的病征應與tau蛋白過磷酸化有關(guān)，其造成tau蛋白的聚集，對細胞產(chǎn)生毒性，因而間接或直接造成神經(jīng)細胞的損傷。技術(shù)實現(xiàn)要素：鑒于上述缺失，本發(fā)明的目的在于提供一種組合物，以及其用于制備抑制阿爾茨海默癥進程的藥物的用途，特別是提供一種山竹與西洋參的組合物，并利用其制備用于在活體中抑制阿爾茨海默癥進程的藥物的用途，因而有效增進活體的學習及記憶力。為達成上述目的，本發(fā)明提供一種山竹組合物，其包含山竹以及西洋參，其中山竹與西洋參的凈重比可為4：1至1：16，且該山竹為每公斤體重使用40至320mg，該西洋參為每公斤體重使用80至640mg。優(yōu)選地，山竹可取自新鮮山竹、山竹干、山竹粉末、冷凍山竹、或其任意組合。優(yōu)選地，西洋參可取自新鮮西洋參、西洋參干、西洋參粉末、冷凍西洋參、或其任意組合。優(yōu)選地，山竹可為水萃取物、油萃取物、極性溶劑萃取物、非極性溶劑萃取物或其組合。優(yōu)選地，西洋參可為水萃取物、油萃取物、極性溶劑萃取物、非極性溶劑萃取物或其組合。優(yōu)選地，山竹組合物可為粉末狀、錠狀或液體狀。為達成上述目的，本發(fā)明另提供一種山竹組合物用于制備增進阿爾茨海默癥學習與記憶能力的藥物的用途，其中組合物包含山竹及西洋參。優(yōu)選地，山竹與西洋參的凈重比可為4：1至1：16，且該山竹每公斤體重使用可為4.5至35mg，該西洋參每公斤體重使用可為9至70mg。承上述，山竹組合物可增加神經(jīng)細胞的突起長度以及增加神經(jīng)細胞存活率。優(yōu)選地，藥物的給藥方式可包含口服、肌內(nèi)注射、皮下注射或腦 部給藥。根據(jù)本發(fā)明提出的組合物用于制備增進阿爾茨海默癥患者的學習與記憶的藥物的用途，其組合物利用山竹與西洋參的結(jié)合，可具有下列優(yōu)點：(1)根據(jù)本發(fā)明的山竹組合物，利用山竹與西洋參的合并使用，相較于僅使用山竹或僅使用西洋參，均可降低阿爾茨海默癥狀態(tài)的神經(jīng)細胞的死亡率且增加神經(jīng)突起的長度。(2)根據(jù)本發(fā)明的山竹組合物，相較于僅使用山竹或僅使用西洋參，可大幅增加受試者的短期記憶以及提升受試者的長期記憶。(3)根據(jù)本發(fā)明的山竹組合物，利用山竹與西洋參的合并使用，相較于僅使用山竹或僅使用西洋參，均可顯著提升受試者的學習能力。附圖說明圖1a及圖1b顯示體外培養(yǎng)小鼠海馬回初級神經(jīng)細胞，分別以山竹及/或西洋參處理的結(jié)果。圖1a顯示相對neun蛋白表現(xiàn)量，可用以判斷細胞存活率。圖1b則顯示經(jīng)處理后小鼠海馬回初級神經(jīng)細胞的神經(jīng)突起長度結(jié)果。*表示與控制組比較；#表示與控制組或經(jīng)wt/gfx的處理組別比較；&表示各與兩倍單一成分比較(#及&，p<0.05；**,##及&&，p<0.01；###及&&&，p<0.001)。圖2a及圖2b顯示動物實驗的流程與y迷宮實驗結(jié)果。圖2a顯示動物實驗的時序圖。圖2b則顯示小鼠偶發(fā)性改變率結(jié)果。*表示與控制組(食鹽水/食鹽水)比較；#表示與stz組(stz/食鹽水)比較(*及#，p<0.05；###，p<0.001)。圖3a至圖3d顯示莫瑞氏水迷宮的分析結(jié)果。圖3a為注射后第6天的小鼠游泳速度分析。圖3b顯示為期4天訓練期的學習曲線：正常小鼠(●，f(3,39)＝5.754；p＝0.003)；經(jīng)注射鏈佐霉素至腦內(nèi)的小鼠(○，f(3,39)＝1.478；p＝0.237)；單獨給予西洋參的小 鼠(△，f(3,43)＝4.716；p＝0.007)或單獨給予山竹的小鼠(▼，f(3,31)＝6.619；p＝0.002)、或是合并使用山竹與西洋參組合物的小鼠(■，f(3,31)＝7.090；p＝0.001)。圖3c則顯示注射后第6天的分析結(jié)果。圖3d顯示注射第7天后小鼠穿越平臺象限的次數(shù)結(jié)果。*表示與控制組(食鹽水/食鹽水)比較；#表示與stz組(stz/食鹽水)相比(*及#，p<0.05；##，p<0.01；###，p<0.001)。具體實施方式本發(fā)明將通過下列優(yōu)選實施例及參照附圖，作進一步的詳細說明。需注意的是，以下各實施例所揭示的實驗數(shù)據(jù)，為便于解釋本案技術(shù)特征，并非用以限制其可實施的態(tài)樣。定義術(shù)語“大約”或“大概”，當結(jié)合可測量的數(shù)值變量使用時，指變量的指示值以及在指示值的實驗誤差內(nèi)(例如，平均值的95％信賴區(qū)間(confidenceinterval))或在指示值的10％內(nèi)的變量的所有值，從中取最大值?！敖o藥”指物質(zhì)對受試者的引入，如山竹與西洋參組合物通過至少包含經(jīng)口、非經(jīng)口(例如：皮下、肌內(nèi)、經(jīng)皮、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、眼內(nèi)及靜脈內(nèi)注射)的給藥方式予以受試者?！笆茉囌摺敝感枰虮徽J為潛在需要本發(fā)明的組合物的任何哺乳動物，其包含靈長類、嚙齒類、寵物、實驗室試驗動物、眷養(yǎng)野生動物。舉例來說，此可包含，但不限于：猴子、人類、豬只、牛、綿羊、山羊、馬科動物、小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、兔子、貓(felines)、犬(canines)。優(yōu)選地，受試者為小鼠或人類?！百x形劑”指山竹組合物中非山竹與西洋參組成的有效成分的任何成分。材料與方法實驗動物小鼠：c57bl/6j品系，8周大的懷孕母鼠與公鼠(國家實驗動物中心，臺灣)。小鼠房的環(huán)境溫度為20–25℃，相對濕度為60％，日夜周期為12小時。所有實驗均于早上7點到下午7點進行。所有實驗過程均完全依照國立臺灣師范大學實驗動物照護及使用委員小組的規(guī)定進行。小鼠海馬回初級神經(jīng)元培養(yǎng)及藥物處理修正前人研究(seibenhenerandwooten,2012)而建立小鼠海馬回初級神經(jīng)元培養(yǎng)的方法：將c57bl/6j品系的懷孕母鼠予以斷頸后取出16-18天大的胚胎，將其海馬回組織取出后于37℃下使用0.05％的胰蛋白酶(trypsin)消化分解15分鐘。在涂有poly-l-lysine(100μg/ml)的24孔或6孔盤培養(yǎng)皿的每個孔種入3×104個細胞；培養(yǎng)液的成分：neurobasal(gibcotm；thermofisherscientific，usa)，另添加補充2％的添加劑(gibcotm；thermofisherscientific，usa)、0.5mm的麩酰胺(glutamine)(gibcotm；thermofisherscientific，usa)、25μm的麩胺酸鹽(sigma-aldrich，usa)、20單元/ml的青霉素/鏈霉素(gibcotm；thermofisherscientific，usa)、1mm的hepes(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicacid))(sigma-aldrich)、以及1％的熱去活馬血清(donorhorseserum,heatinactivated,(gibcotm；thermofisherscientific，usa))。初級小鼠海馬回神經(jīng)元均培養(yǎng)于37℃、co2濃度5％的培養(yǎng)箱內(nèi)。在培養(yǎng)第1、4及7天時，更新一半的培養(yǎng)液(不含馬血清)。另為了減少星型膠細胞數(shù)量而使神經(jīng)元的純度有所增加，于培養(yǎng)第4天及第7天時加入2μm的胞嘧啶阿拉伯醣(cytosinearabinoside；sigma-aldrich)。于培養(yǎng)第9天時，細胞同時接受不同劑量的山竹、西洋參，以及10nm的wortmannin(wt)/gf-109203x(gfx)(下文簡稱為wt/gfx)或dmso，另培養(yǎng)1小時。免疫熒光染色分析小鼠海馬回初級神經(jīng)元經(jīng)培養(yǎng)后，經(jīng)過10nm的wt/gfx或其溶劑dmso處理1小時后，將細胞用4％的三聚甲醛(paraformaldehyde)(sigma-aldrich)固定30分鐘，之后用pbst洗滌三次，每次10分鐘以去除殘余的三聚甲醛。接著使用10％的胎牛血清(fbs)破壞其非專一性反應2小時后，加入neun蛋白質(zhì)(1：1000；millipore，usa)與map2蛋白質(zhì)(1：1000；millipore，usa)的一抗于4℃反應16小時，接著將二抗于37℃反應2小時。最后透過4',6-二胺基-2-苯基吲哚(4′,6-diamino-2-phenylindole，dapi；sigma-aldrich，usa)將神經(jīng)元細胞核染色后，使用高通量顯微影像分析系統(tǒng)與分析軟件(moleculardevices，usa)來分析神經(jīng)元與神經(jīng)突起長度等數(shù)值。山竹組合物制備發(fā)明人分別將山竹全果以及西洋參，冷凍干燥處理之后，脫去水分并研磨至粉末狀。山竹(garciniamangostana)可取自于，例如但不限于，新鮮山竹、山竹干、山竹粉末、冷凍山竹、或其組合。優(yōu)選地，本發(fā)明的山竹取自新鮮山竹。西洋參(panaxquinquefoliusl.)可取自于，例如但不限于：新鮮西洋參、西洋參干、西洋參粉末、冷凍西洋參、或其組合。優(yōu)選地，本發(fā)明的西洋參來自新鮮西洋參。接著將粉末狀的山竹以及西洋參以4：1至1：16的凈重比例混合，優(yōu)選地，以1：2的凈重比混合。另一方面，本發(fā)明的山竹組合物可進一步包含山竹萃取物以及西洋參萃取物。山竹萃取物及西洋參萃取物可通過所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
具熟知的萃取方法而得。萃取方法可為，舉例但不限于，水蒸餾法、非極性溶劑萃取、極性溶劑萃取或二氧化碳萃取。非極性溶劑萃取利用非極性溶劑例如石油醚、甲苯等；極性溶劑萃取利用乙醇、丙醇等。本發(fā)明的山竹萃取物與西洋參萃取物利用水萃取法取得，以避免對人體有害的溶劑殘留，然本發(fā)明并不限于此。此外，山竹萃取物與西洋參萃 取物的凈重比可為4：1至1：16，優(yōu)選地可為1：2。活體實驗及藥物處理經(jīng)由立體定位方式注射3μl(3mg/kg)的鏈佐霉素(streptozotocin，stz，其為一種破壞胰島β細胞，并會造成胰島素抗性的藥物)進入小鼠側(cè)腦室，以建立偶發(fā)型阿爾茨海默癥(sporadicalzheimer’sdisease)的非基因轉(zhuǎn)殖動物模式系統(tǒng)(non-transgenicmousemodel，icv-stz)。具有阿爾茨海默癥的小鼠共分五組，每組16只，分別以山竹及/或西洋參處理具阿爾茨海默癥的小鼠并觀察其結(jié)果。持續(xù)給予四周后進行一系列行為評估，最后犧牲小鼠進行病理分析。其五組分別如下表1：表1組別側(cè)腦室注射(icv)管喂(每天一次)1(控制組)食鹽水食鹽水2stz食鹽水3stz山竹(40mg/kg)4stz西洋參(80mg/kg)5stz山竹(40mg/kg)加西洋參(80mg/kg)行為評估：y迷宮活動力測試利用白色壓克力制成的三臂(長35公分、寬5公分與高20公分)y迷宮行為工具模塊，利用小鼠生性喜歡探索新環(huán)境的特性，測量小鼠的短期空間記憶。將小鼠放在y迷宮三臂的中間，而后給予小鼠自由探索時間計時8分鐘，小鼠的四肢要完全踏進入三臂其中一臂才能計算一次。計算方式：小鼠偶發(fā)性改變率＝無重復進入三臂的次數(shù)*100/(總共進入各臂的次數(shù)-2)。行為評估：水迷宮記憶測試莫瑞式(mwn)水迷宮測試指在廣大的水池某處放置一平臺，來針對小鼠的空間學習與記憶的能力的測試方法。小鼠厭惡處于水中的狀態(tài)，同時游泳對于老鼠來說十分消耗體力，因此小鼠會本能地尋找水中可以休息的場所(平臺)。尋找平臺的行為涉及到大腦復雜的記憶過程，其包括(1)收集與空間定位有關(guān)的視覺訊息(如四方形、 圓形與三角形等形狀信息)，以及(2)對這些訊息進行處理、整理、記憶、穩(wěn)固以及回憶記憶的功能。將小鼠置于充滿乳白色無毒廣告顏料(為使水不透光而遮掩平臺，讓小鼠無法事先知悉平臺的位置)的水池，讓其探索位于水面下的平臺(固定在某一象限內(nèi))。本訓練區(qū)分幾種階段：1.探索階段：其將小鼠置于水中歷時1分鐘，若小鼠無法在時間之內(nèi)找到平臺，則抓取小鼠使其站立于平臺上20秒，再將小鼠置于干燥處休息以待下次實驗。2.驗收階段：將小鼠由四個特定的位置分次放入水迷宮，以試驗其是否能順利找到平臺。每天訓練四次，持續(xù)四天，(每只老鼠均有16次訓練)。四天訓練完后進行測量小鼠獲得的學習能力：與訓練間隔24小時后，將平臺移走，此次讓小鼠在游泳池內(nèi)自由游泳1分鐘測量小鼠是否還記得平臺所在的位置(長期空間記憶測試)。游泳路徑透過ccd攝影后再經(jīng)由影像追蹤系統(tǒng)(ethovision-xt)進行分析。統(tǒng)計所有數(shù)據(jù)使用spss15.0版本進行單因子變異數(shù)分析與事后比較檢定(lsd)。實施例為了評估山竹(garciniamangostana)與西洋參(panaxquinquefoliusl.)的組合效果是否對緩解阿爾茨海默氏癥具有功效，我們以活體細胞與動物作體外及體內(nèi)檢測。體外(invitro)實驗經(jīng)wt/gfx處理的擬阿爾茨海默癥細胞為了了解山竹與西洋參在阿爾茨海默癥神經(jīng)細胞中的功效，首先利用神經(jīng)母細胞瘤細胞株sh-sy5y測得山竹(gm)與西洋參(pq)的細胞半致死劑量(ic50)分別為10.0mg/ml及20.0mg/ml。體外培養(yǎng)小鼠海馬回初級神經(jīng)細胞，并在培養(yǎng)第9天時以wt/gfx處理，使得tau蛋白過度磷酸化，進而可使細胞模擬處在阿爾茨海默癥的狀 態(tài)。接著給予培養(yǎng)的細胞1/2000至1/250的細胞半致死劑量(ic50劑量)亦即5至40μg/ml)的山竹(gm)、或/以及1/2000-1/250的細胞半致死劑量(ic50劑量)亦即10至80μg/ml的西洋參(pq)。發(fā)明人將各ic50劑量的山竹與西洋參排列組合施用于體外培養(yǎng)的小鼠海馬回初級神經(jīng)細胞做測試，發(fā)現(xiàn)不論何種比例，只要將山竹與西洋參并用，便具有比起單獨使用要佳的效果。山竹與西洋參的比例可為，但不限于，4：1(40μg/ml：10μg/ml)、1：1(40μg/ml：40μg/ml)、2：1(40μg/ml：20μg/ml)、1：1(10μg/ml：10μg/ml)以及1：2等。在眾多比例的組合中，發(fā)明人進一步將山竹與西洋參以1比2的比值，對小鼠海馬回初級神經(jīng)細胞測試，其劑量如表2所示：表2、體外實驗的山竹(gm)與西洋參(pq)施用濃度ic50劑量山竹(gm)西洋參(pq)山竹(gm)+西洋參(pq)1/20005μg/ml10μg/ml5μg/ml+10μg/ml1/100010μg/ml20μg/ml10μg/ml+20μg/ml1/50020μg/ml40μg/ml20μg/ml+40μg/ml1/25040μg/ml80μg/ml40μg/ml+80μg/ml結(jié)果請參閱圖1a及圖1b，從圖1a的相對neun蛋白表現(xiàn)細胞的數(shù)量結(jié)果可看出，不論是添加1/2000、1/1000、1/500或是1/250的山竹或西洋參的ic50劑量，神經(jīng)細胞的存活率均增加。此外，將山竹與西洋參合并(gm+pq)使用之后，可得到更佳的增進細胞存活率的效果(#及&，p<0.05；**,##及&&，p<0.01；###及&&&，p<0.001)。另外，圖1b，其顯示經(jīng)處理后小鼠海馬回初級神經(jīng)細胞的神經(jīng)元長度結(jié)果。從其結(jié)果看出，單獨施以山竹或西洋參、以及山竹與西洋參合并使用之后，均可提升神經(jīng)突起長度，且合并使用的效果較單獨施用的效果為佳。由此可知，本發(fā)明提出山竹與西洋參兩者對于修復阿爾茨海默癥細胞的加乘效果。體內(nèi)(invivo)實驗根據(jù)上述體外實驗，發(fā)明人已初步得出將山竹與西洋參合并使用于阿爾茨海默癥細胞培養(yǎng)基中可改善其神經(jīng)元修復狀況，因而發(fā)明人欲進一步將其施用于小鼠活體中，以測試是否本發(fā)明提出的組合物可改善阿爾茨海默癥的學習能力及記憶。請參閱圖2a及圖2b，其為動物實驗的流程與y迷宮實驗結(jié)果。圖2a為動物實驗的時序圖，發(fā)明人將購自動物中心的c57b/6品系(b6)小鼠于實驗環(huán)境適應6天后，在第7天將鏈佐霉素(stz)注射至小鼠單側(cè)(左)側(cè)腦室中以建立偶發(fā)型阿爾茨海默氏癥動物模式(注射食鹽水以作為控制組)。接著每天以管喂方式給予每公斤小鼠凈重40mg(無水)的山竹(gm，40mg/kg)、每公斤小鼠凈重80mg的西洋參(pq，80mg/kg)、山竹(gm，40mg/kg)結(jié)合西洋參(pq，80mg/kg)共4周。如此直到第26天進行y字迷宮分析，第28-34天進行莫瑞氏水迷宮(mwm)分析，第35天將小鼠犧牲以觀察病理現(xiàn)象。繼續(xù)參閱圖2b，從圖2b的小鼠偶發(fā)性改變率結(jié)果可看出，當鏈佐霉素注射至小鼠腦內(nèi)所建立的偶發(fā)型阿爾茨海默氏癥，會造成小鼠的短期記憶損傷，然而當給予山竹及/或西洋參可恢復小鼠的短期記憶，且特別是當山竹與西洋參合并施用后，可顯著恢復小鼠的短期記憶。接著進行莫瑞式水迷宮實驗。將經(jīng)處理的小鼠置于充滿乳白色無毒廣告顏料(為以使水不透光而遮掩平臺，讓小鼠無法事先知悉平臺的位置)的水池中，讓其探索位于水面下的平臺(固定在某一象限內(nèi))。圖3a至圖3d顯示莫瑞氏水迷宮(mwm)的分析結(jié)果。圖3a為小鼠游泳速度分析，這表示不同組別小鼠在水迷宮的游泳速度相當，無先天體力的差別。圖3b為4天訓練期(trainingtrial)的學習曲線，從其可看出，正常小鼠注射食鹽水到腦中，不會影響其學習能力，呈 現(xiàn)有效的學習曲線(●)；當注射鏈佐霉素(stz)至小鼠腦中，使其學習能力下降，無法呈現(xiàn)有效的學習曲線(○)；當單獨使用西洋參(△)或山竹(▼)給予小鼠、以及合并使用西洋參與山竹(山竹，均可恢復有效的學習曲線。接著，經(jīng)過訓練期后，在第6天對小鼠進行長期記憶的驗收，可看到與正常小鼠(注射食鹽水)相比較，注射鏈佐霉素至小鼠腦內(nèi)會顯著地傷害長期記憶，而山竹與西洋參同時施用則可增加其停留在平臺所在的象限內(nèi)的時間(圖3d)。這意味著，透過合并使用山竹與西洋參，可恢復小鼠因阿爾茨海默癥損傷的長期記憶力。發(fā)明人另以特定范圍的山竹以及西洋參，以各種重量的比例組合，同樣以管喂方式施予小鼠，實驗的山竹量為小鼠的每公斤體重使用40至320mg，西洋參量為小鼠的每公斤體重使用80至640mg。詳細組合如下列表3所示，將山竹及/或西洋參管喂方式給予小鼠共4周，重復如上述的記憶及學習能力測試。結(jié)果均發(fā)現(xiàn)，將山竹與西洋參合并使用于呈現(xiàn)阿爾茨海默癥病癥的小鼠，均可部分恢復小鼠損傷的記憶能力。詳細實驗流程請參閱上述，于此不再贅述。表3、本發(fā)明實施例所施用的山竹與西洋參的重量本發(fā)明提出的山竹組合物，如若于人體施用時，須根據(jù)基礎代謝率的差異，換算成適合人體施用的重量。故而本發(fā)明的山竹組合物中，將原施以小鼠的重量均除以9，為適于人體的使用量。人的每公斤體重使用山竹4.4至35.5mg；西洋參則是人的每公斤體重使用8.9至71mg。承上所述，本發(fā)明提供的山竹組合物，其透過山竹與西洋參的組合，經(jīng)過體外及活體測試，均可有效降低阿爾茨海默癥狀態(tài)的神經(jīng)細胞的死亡率且增加神經(jīng)突起的長度、亦可大幅增加受試者的短期記憶以及提升受試者的長期記憶以及顯著提升受試者的學習能力。綜上所述，雖然本發(fā)明已以優(yōu)選實施例揭露如上，然其并非用以限定本發(fā)明。本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中具有通常知識者，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，當可作各種的更動與潤飾。因此，本發(fā)明的保護范圍當以申請專利范圍所界定為準。當前第1頁12