Wrw三肽在制備治療阿爾茨海默癥藥物中的用途
【專利摘要】本發(fā)明請求保護(hù)WRW三肽在制備預(yù)防或治療阿爾茨海默癥藥物中的用途，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。本發(fā)明WRW三肽動物給藥量明確，而且可以制成片劑、微球劑、粉狀劑、口服液、注射液，WRW三肽用于治療阿爾茨海默癥時，可以單獨(dú)用藥，也可以與其他作用機(jī)制不同的阿爾茨海默癥藥物聯(lián)合用藥，其中WRW三肽與漢防己甲素、雷公藤甲素組成的藥物組合物用于阿爾茨海默癥的治療時，不僅能夠降低藥物毒副作用，而且可以取得協(xié)同治療的效果，藥理實驗證實，WRW三肽能有效的抑制Aβ1-42聚集和防止Aβ1-42單聚體的低聚化的現(xiàn)象，顯著抑制β淀粉樣蛋白的沉積，其用于阿爾茨海默癥預(yù)防或治療療效確切，副作用小，因此具有廣闊的醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。
【專利說明】WRW三肽在制備治療阿爾茨海默癥藥物中的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種已知藥物的新用途，具體的說涉及WRW三肽在制 備治療阿爾茨海默癥藥物中的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease, AD)是一種以短期記憶丟失、持續(xù)性認(rèn)知能 力減退和行為紊亂為特征的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。阿爾茨海默病影響了全球龐大的人口， 給人們的生活帶來極大的痛苦。現(xiàn)在，AD的確切發(fā)病機(jī)制尚不明確，初步認(rèn)為是老化、遺傳 和環(huán)境多種因素的共同結(jié)果。目前也有很多種學(xué)說想證實AD的確切發(fā)病機(jī)制，其中最為廣 泛接受的是以聚合和原纖維形成的β淀粉樣蛋白（Αβ)肽為生物標(biāo)志物的淀粉樣蛋白假 說。Αβ是一種由38至42個氨基酸殘基組成的短肽，來自于淀粉樣前體蛋白（APP)的水 解。而AD患者的大腦中有大量的Ai^_ 42。通過對AD患者的觀察發(fā)現(xiàn)，Αβ在神經(jīng)組織中 的聚集和沉積與神經(jīng)細(xì)胞的死亡和認(rèn)知功能減退有關(guān)。因此，Αβ是對AD進(jìn)行干預(yù)治療的 潛在靶點。并且已經(jīng)有很多的研究以Αβ為靶點尋找不同的藥物。
[0003] 以Αβ為靶點尋找不同的藥物是近年來的熱門話題，據(jù)文獻(xiàn)老年癡呆癥（AD)發(fā)病 的Αβ假說及相關(guān)藥物研究進(jìn)展(安徽教育學(xué)院學(xué)報，2007-5,第25卷第3期）詳細(xì)的說明 了干擾Aβ形成和沉積的藥物和以Aβ為靶點的阻止老年斑形成的藥物可在多個途徑起到 作用：（1)可減少Αβ前體蛋白的合成，在轉(zhuǎn)錄和翻譯的水平上阻止APP的合成；（2)減少 Αβ的生成，調(diào)節(jié)腦組織a、i3分泌酶的活性；（3)由于Αβ聚集是其神經(jīng)毒性作用的前提， 該過程涉及Αβ由a-螺旋向-β-片層結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化，而這一過程與分子中特異膚段有關(guān)；
[4] 拮抗A β參與的炎癥反應(yīng)。即使提出了很多新的合成分子作為抑制A ?^_42聚積的潛在 藥物，但是這些分子的作用機(jī)制尚未完全闡明。中國專利CN101346396B公開了預(yù)防和治療 阿爾茨海默癥的G蛋白偶聯(lián)受體拮抗劑及其應(yīng)用，該拮抗劑產(chǎn)生毒素，有嚴(yán)重的副作用，效 果不明顯，不利于大規(guī)模的推廣應(yīng)用。
[0004] 隨著藥物研究結(jié)果的不明朗，針對Αβ的肽類抑制物的研究進(jìn)展開始備受關(guān)注， 很多的多肽片段被認(rèn)為可以結(jié)合到Αβ聚合體的中央疏水核心從而防止Αβ的沉積。多種 短肽也被證明是治療AD的有效分子，例如作為抗氧化劑的谷胱甘肽。另有證據(jù)表明，WMDF 和Ac-AVVIA對AD有療效。此外，研究表明諸如KLVFF和LPFFD的多肽和肽類分子對AD的 發(fā)病進(jìn)程有較強(qiáng)的抑制特性。存在一種二十四肽，能夠抗廣泛的AD相關(guān)的細(xì)胞毒作用，包 括在體外試驗中暴露在Αβ的環(huán)境中，表現(xiàn)出抗細(xì)胞死亡活性。
[0005] 第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科發(fā)表了一篇關(guān)于A β 2Q_29短肽阻斷ΑροΕ/Α β結(jié)合 并減少Αβ 纖維化及其神經(jīng)毒性的效應(yīng)作用（Chin J Clin Neurosci 2009. 17(1). 1飛） 中公開了利用硫磺素-T(Th-T)熒光分析和透射電鏡法證實了人工合成的Αβ 2(|_29短肽無 細(xì)胞毒性作用，能夠競爭性地與Αρ〇Ε4結(jié)合，從而阻斷對A β i_42與Αρ〇Ε4結(jié)合，減少Αρ〇Ε4 對A β i_42纖維化的促進(jìn)作用及其神經(jīng)毒性作用，說明A β 2(|_29短肽將能夠成為抑制A β i_42/ Ap〇E4結(jié)合的新型阻斷劑，為探索防止AD新的治療方法提供有效的實驗基礎(chǔ)，但其效果尚 進(jìn)一步的研究。
[0006] 三肽是經(jīng)三個氨基酸脫水縮合而成，利于體內(nèi)吸收，無副作用的優(yōu)點，三肽異亮氨 酸-脯氨酸-脯氨酸（IPP)和纈氨酸-脯氨酸-脯氨酸（VPP)對臨界高血壓有一定的治療 作用。不同種類的三肽具有不同的藥效作用。色氨酸-精氨酸-色氨酸（Trp-Arg-Trp，簡 稱WRW三肽）三肽在哺乳動物體內(nèi)易降解并且易于吸收的優(yōu)點，利于藥物的發(fā)揮。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在治療阿爾茨海默癥的藥物不明確，效果不明顯，藥物毒 副作用大的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供預(yù)防和治療阿爾茨海默癥的藥物。由上述可知， Λβ 20_29短肽阻斷ΑροΕ/Αβ結(jié)合并減少Λβ卜42纖維化及其神經(jīng)毒性的效應(yīng)作用，因此本發(fā) 明涉及WRW三肽的一種藥物用途，即WRW三肽用于制備預(yù)防或治療老年癡呆癥藥物中的用 途。本發(fā)明所提供的藥物用于阿爾茨海默癥的治療或預(yù)防時療效確切，藥物毒副作用小，具 有廣泛的醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。
[0008] 本發(fā)明的目的之一是提供WRW三肽在制備治療和預(yù)防阿爾茨海默癥藥物中的應(yīng) 用。發(fā)明人經(jīng)過探索性試驗發(fā)現(xiàn)，WRW三肽具有顯著地抑制β淀粉樣蛋白沉積的作用，WRW 三肽是通過與Αβρ42結(jié)合成復(fù)合物來穩(wěn)定A^_42的α-螺旋、螺旋結(jié)構(gòu)和抑制β-折疊結(jié) 構(gòu)的形成，從而保持穩(wěn)定A β i_42的構(gòu)象，從而抑制A β i_42的聚集，由于A β的聚集與老年斑 的形成以及阿爾茨海默癥的發(fā)生和進(jìn)展之間具有十分密切的關(guān)系，因此可以預(yù)見本發(fā)明中 WRW三肽用于阿爾茨海默癥的預(yù)防或治療會改善患者的病情或延緩疾病的發(fā)生起到積極的 作用。本發(fā)明藥效實施例6和藥效實施例7證實WRW三肽對A β H2所致大鼠阿爾茨海癥 模型和D-半乳糖所致小鼠阿爾茨海默癥模型具有很好的治療或預(yù)防作用。本發(fā)明的WRW 三肽為口服制劑，其動物給藥量為l〇〇mg/kg · cT500mg/kg · d，優(yōu)選為50mg/kg · cT500mg/ kg · d，更優(yōu)選為 lOOmg/kg · d?500mg/kg · d，進(jìn)一步優(yōu)選為 lOOmg/kg · d?300mg/kg · d。
[0009] 本發(fā)明的目的之二是提供一種含有WRW三肽的藥物組合物在制備治療和預(yù)防阿 爾茨海默癥藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明的藥物組合物包含WRW三肽、漢防己甲素和/或雷公藤甲 素，所述藥物組合物中WRW三肽：漢防己甲素：雷公藤甲素的重量比為（1-500) :(0. 1-5): (0· 1-5)。
[0010] 本發(fā)明的目的之三是公開含有WRW三肽并能夠?qū)崿F(xiàn)上述藥物用途的藥物制劑。以 上所述的藥物用途中，發(fā)明人通過試驗將其制備成了制成片劑、微球劑、粉狀劑、口服液和 注射液。其中片劑含有兩種以上如下輔料：淀粉、糊精、低取代羥丙基纖維素、硬脂酸鎂、微 晶纖維素、羥丙基纖維素、淀粉漿乳糖、甘露醇、微粉硅膠、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉和交聯(lián)聚乙 烯吡咯烷酮；所述微球劑含有如下輔料：明膠、硫酸鈉、甲醛溶液。所述WRW三肽利于哺乳動 物體內(nèi)降解并易于吸收，有利于藥效的發(fā)揮，所述WRW三肽藥物的口服制劑中每一制劑單 位中含有WRW三肽的含量為0. lmg-200mg。
[0011] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于： (1) WRW三肽在哺乳動物體內(nèi)易降解并且易于吸收，有利于藥效的發(fā)揮； (2) WRW三肽與A β H2結(jié)合的肽-A β H2復(fù)合物穩(wěn)定，并且WRW三肽能穩(wěn)定A β H2的 α -螺旋、螺旋結(jié)構(gòu)和抑制β -折疊結(jié)構(gòu)的形成，能有效的抑制A β i_42的聚集和防止A β n 單聚體的低聚化的現(xiàn)象； (3)WRW三肽與其它作用機(jī)制并對老年癡呆癥起到治療作用的藥物聯(lián)用時，其藥物作用 機(jī)制互補(bǔ)，其與漢防己甲素和雷公藤甲素聯(lián)用可以起到對老年癡呆癥預(yù)防或治療的協(xié)同作 用，可以改善老年癡呆癥患者的運(yùn)動機(jī)能和治療效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1為WRW三肽與A β i_42的硫磺素 T試驗結(jié)果示意圖： 圖2為WRW三肽與A β i_42的圓二色譜試驗結(jié)果示意圖： 圖3為WRW三肽與A β H2的誘射電子顯微鏡（TEM)試驗結(jié)果示意圖。

【具體實施方式】
[0013] 下面采用具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容。
[0014] 以下內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定 本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
[0015] 實驗例1、一種預(yù)防或治療阿爾茨海默癥的WRW三肽的硫磺素 T試驗： 將A β卜42溶解在ΡΗ7. 4,濃度為0· Olmol/L的磷酸鹽緩沖劑中配成50 μ mol/L的混合 溶液，該混合溶液中A β卜42和肽的初始濃度為50 μ mol/L，直到最終濃度為2. 5 μ mol/L時， 放置在37°C孵育48 h，接著加入ThT (5μπι〇1/1溶解于50 mmol/L甘氨酸-NaOH溶液中， PH8. 50)檢測450 nm和485 nm的熒光性。每個樣品測量3次，記錄熒光強(qiáng)度。
[0016] 結(jié)合圖1所示，實施例1結(jié)果表明：硫磺素 T可以迅速地與Αβ i_42的聚合纖維結(jié) 合，激發(fā)出一個新的波長為450nm的光，并表現(xiàn)為波長為482nm的光明顯增強(qiáng)，而WRW三肽 與A β i_42共培養(yǎng)的WRW三肽-A β i_42復(fù)合物的硫磺素 T熒光強(qiáng)度會減少，這種熒光技術(shù)可 用于檢測WRW三肽對4^_42聚合或分解的調(diào)節(jié)能力。如圖1所示，相較于白藜蘆醇，WRW三 肽的濃度為2. 5 μ mol/L表現(xiàn)出對A β i_42聚合體更好的抑制效果，表明WRW三肽是A β i_42聚 合體的抑制物。
[0017] 實驗例2、一種預(yù)防或治療阿爾茨海默癥的WRW三肽的圓二色譜試驗： 將濃度為50 μ mol/L的Αβ i_42溶解于磷酸鹽緩沖溶液中，并在實驗組加入濃度為 50 μ mol/L的WRW三肽，接著放置37°C下孵育48 h，該混合溶液中A β i_42和WRW三肽的最 終濃度為5 μ mol/L，使用Imm厚度的容器皿，將A β卜42單體和WRW三肽-A β卜42復(fù)合物樣品 分別防止圓二色譜儀中檢測結(jié)構(gòu)，光譜在25°C，波長為190-260 nm，波寬0. 5nm時被記錄。
[0018] 結(jié)合圖2所示，實施例2結(jié)果表明：圓二色譜表明WRW三肽-A β復(fù)合物中β折疊 結(jié)構(gòu)會減少，如圖2所示，圓二色譜檢測A β i_42單獨(dú)時發(fā)現(xiàn)在217 nm附近有一條暗帶，表明 存在β -折疊結(jié)構(gòu)，當(dāng)檢測WRW三肽-A β復(fù)合物時發(fā)現(xiàn)217nm附近的暗條紋顯著減輕，則 表明WRW三肽可以減少β -折疊結(jié)構(gòu)的形成，從而抑制A β i_42單體的聚合。
[0019] 實驗例3、一種預(yù)防或治療阿爾茨海默癥的WRW三狀的誘射電子顯微鏡（TEM)試 驗： 用磷酸緩沖液（PBS，pH7. 4)將A β i_42樣品溶解成lmg/ml的濃度，然后放置在濃度為 25 μ mol/L的WRW三肽實驗組和空白對照組，直到混合溶液的最終濃度為25 μ mol/L時共孵 育48 h，將5μ1的樣品點樣于300孔Formvar-carbon的銅網(wǎng)，加入1%的甲酸雙氧鈾染色 lmin，放在空氣中烘干，再置于電鏡下觀察，檢測A β i_42和WRW三肽-A β i_42復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。
[0020] 結(jié)合圖3所示，實施例3結(jié)果表明：如圖3的電鏡圖所示，從A^_42單體，圖中可以 觀察到高密度長線狀的A β i_42纖維，纖維聚集成平行束狀，束與束之間又互相交叉；然而， 從WRW三肽-Αβ i_42復(fù)合物圖中只看到少量短線性纖維以及無定型聚合物，短的Αβ i_42纖維 束隨機(jī)互相交聯(lián)，從而形成了不規(guī)則的聚合物；說明WRW三肽可以抑制A β i_42單體的聚合。
[0021] 實施例4、WRW三肽片劑制備

【權(quán)利要求】
1. WRW三肽在制備預(yù)防或治療阿爾茨海默癥藥物中的用途。
2. 如權(quán)利要求1所述的藥物用途，其特征在于，WRW三肽的動物給藥量為lmg/ kg · d?500mg/kg · d〇
3. 如權(quán)利要求1所述的藥物用途，其特征在于，WRW三肽的動物給藥量為50mg/ kg · d?500mg/kg · d〇
4. 如權(quán)利要求1所述的藥物用途，其特征在于，WRW三肽的動物給藥量為lOOmg/ kg · d?500mg/kg · d〇
5. 如權(quán)利要求2所述的藥物用途，其特征在于，所述的動物給藥量為lOOmg/ kg · cT300mg/kg · d。
6. 如權(quán)利要求2-3任一所述的藥物用途，其特征在于，所述的WRW三肽制成片劑、微球 齊U、粉狀劑、口服液、注射液。
7. 如權(quán)利要求1-4任一所述的藥物用途，其特征在于，所述藥物的口服制劑中每一制 劑單位中含有WRW三肽的含量為0. lmg-200mg。
8. -種含有WRW三肽的藥物組合物，其特征在于，它含有漢防己甲素。
9. 如權(quán)利要求8所述的含有WRW三肽的藥物組合物，其特征在于，它還含有雷公藤甲 素。
10. 如權(quán)利要求9所述的含有WRW三肽的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物中 WRW三肽：漢防己甲素：雷公藤甲素的重量比為（1-500) :(0. 1-5) :(0. 1-5)。
【文檔編號】A61P25/28GK104274817SQ201410497263
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月25日
【發(fā)明者】顧懷宇, 黃嘉琦, 凌楚雯, 段松偉, 林潤軒, 林睿邦 申請人:中山大學(xué)