本發(fā)明提供一種海洋深層水萃取物，特別是一種具有有機(jī)成分的海洋深層水萃取物及其用途。

背景技術(shù)：

最近10年，含有質(zhì)子泵抑制劑(PPI)及抗生素的三合一療法被視為清除幽門螺旋桿菌感染首選。然而，服藥順從性不足和抗藥性菌株的增加常導(dǎo)致除菌的失敗。初步治療失敗后，被推薦的二線療法包括抗生素的三合一療法及四合一療法，但是這些療法仍然無法克服因抗藥性菌株增加而造成的困擾。因此找出能有效預(yù)防和治療幽門螺旋桿菌感染的新成分或混合物，就有迫切的需要。

目前已知飲水中鎂不足會(huì)增加心血管病變的機(jī)會(huì)，而飲水中含高鈣與鎂離子則可提升對(duì)心肌梗塞的保護(hù)效應(yīng)。高鎂攝取會(huì)改善高血脂、降低代謝癥候群與氧化壓力的發(fā)生率。海洋深層水(Deep-sea water，DSW)得自低于海平面200公尺以下是富含高鎂、高鈣與高鉀離子與高營養(yǎng)成分或高有機(jī)成分的低溫、干凈衛(wèi)生的無污染水。近年，DSW已被廣泛應(yīng)用于食品加工業(yè)、農(nóng)業(yè)、藥用與化妝品業(yè)。研究文獻(xiàn)也指出DSW具有降低血脂肪與脂質(zhì)氧化、血管硬化、高血壓與減少血管管壁增生。在異位性皮膚炎也發(fā)現(xiàn)飲用或浸泡DSW也會(huì)改善皮膚發(fā)炎與過敏癥狀，同時(shí)DSW飲用也改善白內(nèi)障。

氧化壓力(oxidative stress)與發(fā)炎對(duì)幽門螺旋桿菌感染和腸胃潰瘍有關(guān)，飲用高鎂離子可改善幽門螺旋桿菌感染、胃潰瘍與胃食道逆流等癥狀。而飲用海洋深層水對(duì)幽門螺旋桿菌感染患者的抗菌效用幽門螺旋桿菌與胃炎、十二指腸潰瘍、胃潰瘍、胃腺癌，以及其他胃部癌癥如胃的「粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤」(MALToma)有強(qiáng)烈相關(guān)性。有限的數(shù)據(jù)或文獻(xiàn)顯示在體外試驗(yàn)時(shí)DSW可能藉由內(nèi)含高濃度的一些離子以抑制幽門螺旋桿菌的作用。有報(bào)告指出在人體血清中的鎂濃度和胃幽門螺旋桿菌聚集于胃部有關(guān)聯(lián)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于上述，本發(fā)明進(jìn)行抗胃幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)的臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)飲用海洋深層水兩周對(duì)幽門螺旋桿菌感染患者的抗菌有效成分，非經(jīng)由本發(fā)明技術(shù)領(lǐng)域中習(xí)知認(rèn)為高鈣、高鎂離子及硬水所引起，而是海洋深層水中的有機(jī)成分。

有鑒于此，本發(fā)明的一目的在于提供一種海洋深層水萃取物，其是將海洋深層水由一方法而制得，該方法是逆滲透(reverse osmosis，RO)與電透析(Electrodialysis，ED)的方法或是納米過濾(nanofilter)的方法；其中該海洋深層水萃取物具有一有機(jī)成分，該有機(jī)成分選自于由685至690、733至738、以及1070至1075的分子量所組成的群組。

在本發(fā)明一實(shí)施例中，其中該方法進(jìn)一步選自于由凝膠層析(gel filtration)方法、二氯甲烷(Dichloromethane，DCM)萃取方法、丙酮萃取方法、以及三氯甲烷萃取方法所組成的群組。

在本發(fā)明一實(shí)施例中，其中該海洋深層水萃取物的分子量較佳為1070至1075。

在本發(fā)明一實(shí)施例中，其中該海洋深層水是為低于海平面200公尺以下的海水。

在本發(fā)明一實(shí)施例中，其中該海洋深層水萃取物進(jìn)一步包含一抗氧化物以延緩該有機(jī)成分的降解，且該抗氧化物是槲皮素(quercetin)、綠茶素(EGCG)或是氫氣。

在本發(fā)明一實(shí)施例中，其中該海洋深層水萃取物具有2400ppm至4800ppm的硬度。

在本發(fā)明一實(shí)施例中，其中該海洋深層水萃取物是經(jīng)由巴氏殺菌或?yàn)V菌方式而獲得。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種上述海洋深層水萃取物用于制備抑制胃幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)生長(zhǎng)的藥物的用途。

在本發(fā)明一實(shí)施例中，其中該海洋深層水萃取物具有2400ppm至4800ppm的硬度。

在本發(fā)明一實(shí)施例中，其中該海洋深層水萃取物進(jìn)一步包含一抗氧化物以 延緩該有機(jī)成分的降解；且該抗氧化物是為氫氣、槲皮素(quercetin)或綠茶素(EGCG)。

以下將配合圖式進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)施方式，下述所列舉的實(shí)施例是用以闡明本發(fā)明，并非用以限定本發(fā)明的范圍，任何熟習(xí)此技藝者，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可做些許更動(dòng)與潤飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視后附的申請(qǐng)專利范圍所界定者為準(zhǔn)。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的2400ppm硬度海洋深層水萃取物(DSW2400)電噴灑/質(zhì)譜法(ESI/MS)分析的質(zhì)譜圖；(A)以竹簽電噴灑/質(zhì)譜法(ESI/MS)分析RO逆滲透水做為比較例；(B)以竹簽質(zhì)譜儀分析本發(fā)明DSW2400；(C)以濾紙電噴灑/質(zhì)譜法分析本發(fā)明DSW2400；(D)以竹簽質(zhì)譜儀分析本發(fā)明DSW2400；

圖2是為電噴灑/質(zhì)譜法(ESI/MS)分析以DCM、丙酮、三氯甲烷三種有機(jī)溶液萃取本發(fā)明DSW2400的質(zhì)譜圖；

圖3是電噴灑/質(zhì)譜法(ESI/MS)分析不同海水區(qū)域與不同處理的海洋深層水或海洋表面水的質(zhì)譜圖；CS1-HB是商品臺(tái)肥海礦1400深層海水、CS2-DM是Deep Mine深層海水、DSW2400是本發(fā)明DSW2400、SSW-50是海洋表面水、CS3-TY是商品臺(tái)鹽海洋堿性離子水、CS4-T1是商品統(tǒng)一PH 9.0堿性離子水、CS5-LB是商品Light堿性水以及會(huì)出現(xiàn)338.5的波形的背景值；

圖4是拉曼光譜儀測(cè)量電透析的本發(fā)明的海洋深層水萃取物2400ppm(DSW2400)；上圖為未加熱，下圖為經(jīng)滅菌鍋加熱；

圖5是電噴灑/質(zhì)譜法(ESI/MS)分析不同處理的本發(fā)明的海洋深層水萃取物2400ppm(DSW2400)；(A)50ml以RO逆滲透處理后淡化的RO逆滲透水；(B)未經(jīng)任何處理50ml本發(fā)明DSW2400；(C)50ml本發(fā)明DSW2400連同離心管在滅菌鍋內(nèi)經(jīng)121℃15分鐘的加熱滅菌處理；(D)50ml本發(fā)明DSW2400加入HCl至pH值為5，進(jìn)行電透析的樣品；(E)50ml本發(fā)明DSW2400加入HCl至pH值為4，進(jìn)行電透析的樣品；(F)50ml本發(fā)明DSW2400加入HCl至pH值為3，進(jìn)行電透析的樣品；(G)剛接觸空氣的50ml本發(fā)明DSW2400；(H)接觸空氣三天的50ml本發(fā)明DSW2400，進(jìn)行電透析 的樣品；(I)通入氫氣的50ml本發(fā)明DSW2400，進(jìn)行電透析的樣品；(G)經(jīng)過0.22μm濾紙過濾的50ml本發(fā)明DSW2400，進(jìn)行電透析的樣品；

圖6是電噴灑/質(zhì)譜法(ESI/MS)分析量測(cè)第一天(Day 1)不同處理的本發(fā)明的海洋深層水萃取物1070波形組的強(qiáng)度；

圖7是電噴灑/質(zhì)譜法(ESI/MS)分析量測(cè)第二天(Day 2)不同處理的本發(fā)明的海洋深層水萃取物1070波形組的強(qiáng)度；

圖8是電噴灑/質(zhì)譜法(ESI/MS)分析量測(cè)第九天(Day 9)不同處理的本發(fā)明的海洋深層水萃取物1070波形組的強(qiáng)度；

圖9是電噴灑/質(zhì)譜法(ESI/MS)分析量測(cè)第一天(Day 1)、第二天(Day 2)及第九天(Day 9)不同處理的本發(fā)明的海洋深層水萃取物1070波形組的強(qiáng)度是樹形圖。此數(shù)值為三重復(fù)數(shù)據(jù)；*P<0.05與第一天的個(gè)別控制組比較；#P<0.05與第九天的本發(fā)明的海洋深層水萃取物無處理組(Air 2)比較；

圖10是以維他命C作為抗氧化劑會(huì)破壞本發(fā)明的海洋深層水萃取物的成分；

圖11A及B是本發(fā)明的海洋深層水萃取物具有抑制胃幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)生長(zhǎng)的數(shù)據(jù)圖；

圖12是含有不同成分1070波形組含量的海洋深層水萃取物對(duì)抑制胃幽門螺旋桿菌的抑制效果的關(guān)系圖。1070波形組含量越高的海洋深層水萃取物與抑制胃幽門螺旋桿菌能力成正相關(guān)；A為RO逆滲透樣品；B為表面海水SSW(50公尺海平面下的海水)樣品；C為經(jīng)過滅菌鍋處理后的DSW2400樣品；D為在pH 3.93的條件下的DSW2400樣品；E為經(jīng)過0.22m過濾的DSW2400樣品；F為經(jīng)過ED處理的DSW2400樣品；H為樣品A至F對(duì)抑制胃幽門螺旋桿菌的抑制效果的關(guān)系圖；G為樣品A至F的1070波形組含量的平均強(qiáng)度量化數(shù)值；

圖13是本發(fā)明的海洋深層水萃取物可明顯降低胃幽門螺旋桿菌感染所放出的碳十三尿素呼吸數(shù)值的曲線圖；DSW是本發(fā)明的海洋深層水萃取物，CMW是一般礦泉水。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供一種主要目的是確認(rèn)海洋深層水萃取物的抑菌或其他功效的活性成分，以及該海洋深層水萃取物用于制備抑制胃幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)生長(zhǎng)的藥物的用途，經(jīng)由取得低于海平面200公尺以下的本發(fā)明的海洋深層水進(jìn)行有機(jī)成分分析確定可能分子并鑒定其特性，并藉由拉曼光譜確認(rèn)該有機(jī)成分的活性。本發(fā)明海洋深層水萃取物證實(shí)具有抑制胃幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)生長(zhǎng)的活性成分并非是與其高鈣、高鎂濃度或高硬度有關(guān)。

實(shí)施例1本發(fā)明的海洋深層水(Deep sea water，DSW)萃取物的制造方法

本發(fā)明的海洋深層水水源取自中國臺(tái)灣花蓮縣七星潭(Chisingtan)灣200米以下深度的水源，海洋深層水由石頭和資源行業(yè)研究與發(fā)展中心(Guanghuajian，花蓮，中國臺(tái)灣)獲準(zhǔn)后取得。海洋深層水的改良與制備是由石材和資源行業(yè)研究與發(fā)展中心(Guanghuajian，花蓮，中國臺(tái)灣)所提供。海洋深層水水源會(huì)先經(jīng)逆滲透(reverse osmosis，RO)的處理和電透析(Electrodialysis，ED)為了減少海洋深層水的硬度，以每ppm的硬度表示，以下列公式計(jì)算：

[CaCO₃]ppm＝([Ca²⁺]×2.5+[Mg²⁺]×4.1)ppm。

經(jīng)逆滲透(RO)和電透析(ED)后得到了不同硬度的海洋深層水。如1200至4800ppm的硬度。海洋深層水以巴氏殺菌在60秒80℃或以濾菌方式后立即存儲(chǔ)在室溫(25℃)，即為本發(fā)明的海洋深層水萃取物。

本發(fā)明利用電感耦合的等離子體發(fā)射光譜儀(JY ULTIMA2000，堀場(chǎng)，法國)，分析本發(fā)明1200ppm硬度海洋深層水萃取物(DSW1200)、本發(fā)明2400ppm硬度海洋深層水萃取物(DSW2400)以及2.1ppm RO水的礦物質(zhì)含量，并另分析該些樣品的pH值，如表一所示。另外，本發(fā)明亦取得海洋深層水200公尺以下所制備的RO逆滲透水、海洋深層水、海平面下50公尺的海洋表面水(surface water，SSW)，以及從市面上所購買的其他海洋深層水或是表面水的相關(guān)產(chǎn)品做為比較。所用的化學(xué)藥品如綠茶素(EGCG)和槲皮素(quercetin)等均采購自Sigma-Aldrich公司。

表一、本發(fā)明的海洋深層水萃取物及RO逆滲透水的pH及礦物質(zhì)含量分析

實(shí)施例2電噴灑/質(zhì)譜法(ESI/MS)

本發(fā)明是利用改良式竹簽當(dāng)作電噴灑游離法(ESI)，將3μl樣品滴加竹簽尖端同時(shí)利用甲醇當(dāng)作揮發(fā)性溶劑(Harvard Apparatus Model 22)，流速6μl/min，并施加+3000v高電壓(Gamma,FL,USA Model RR30-2R)，使樣品離子化進(jìn)到質(zhì)譜儀(Thermo Finnigan LCQ LC/MS)進(jìn)行分析，偵測(cè)范圍是150-2000m/z，并使用抽氣回轉(zhuǎn)泵(EDWARDS EM30)來維持質(zhì)譜儀內(nèi)的真空狀態(tài)，每次樣品測(cè)試完畢后把竹簽使用超音波洗凈器(BRANSON 3510)震蕩30分鐘。利用電噴灑離子化/質(zhì)譜法主要用來測(cè)量主成分物質(zhì)的分子量。

電噴灑游離法中主要包含霧化(nebulization)、去溶劑(desovation)以及游離(ionization)三部分。

2.1霧化(nebulization)：形成帶電液滴

當(dāng)樣品通過未施加高電壓的金屬毛細(xì)管出口端時(shí)，由于缺乏電場(chǎng)的作用，只會(huì)形成正負(fù)離子分布均勻的液滴。但當(dāng)樣品流經(jīng)外加高電壓的金屬毛細(xì)管時(shí)，毛細(xì)管出口端會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)大的電場(chǎng)作用，使得溶液中的正負(fù)離子受到電場(chǎng)作用而產(chǎn)生電荷分離的現(xiàn)象。若施加的為正電壓，則正離子會(huì)因?yàn)殡妶?chǎng)排斥的作用力 往毛細(xì)管出口端移動(dòng)，負(fù)離子會(huì)受正電場(chǎng)吸引而聚集在金屬毛細(xì)管壁，當(dāng)溶液大量聚集出口端時(shí)，會(huì)在液滴表面累積大量正電荷。當(dāng)正電荷累積到一定的數(shù)量，此時(shí)所產(chǎn)生的排斥力與電場(chǎng)作用力會(huì)將正電荷的液體表面往低電場(chǎng)方向拉長(zhǎng)，在毛細(xì)管出口端形成一錐狀液滴，稱之為泰勒錐(Taylor cone)。此時(shí)向外的庫倫排斥力和向內(nèi)的表面張力呈現(xiàn)平衡狀態(tài)，稱為雷利極限(Rayleigh limit)。當(dāng)外加電場(chǎng)逐漸增強(qiáng)時(shí)，累積在溶液表面的正電荷排斥力大于表面張力，液滴的作用力就會(huì)突破雷利極限，由泰勒錐前端噴灑出表面帶有電荷的微小液滴，此即為電噴灑游離法中帶電液滴形成的過程。

2.1去溶劑(desovation)：電噴灑液滴的揮發(fā)與分裂

從金屬毛細(xì)管出口端噴灑出來的帶正電荷液滴，因會(huì)受到質(zhì)譜入口較低電場(chǎng)的吸引而進(jìn)入質(zhì)譜儀。在飛行過程中，帶電液滴不斷接觸大量的空氣，使得液滴中的溶劑分子快速揮發(fā)，造成液滴體積持續(xù)縮小，但液滴內(nèi)電荷是固定的，因此液滴內(nèi)電荷密度會(huì)逐漸增加，當(dāng)體積縮小到一定程度時(shí)，電荷間的排斥力會(huì)大于液滴的表面張力，為了平衡內(nèi)部的作用力，此時(shí)液滴會(huì)產(chǎn)生分裂現(xiàn)象，而分裂的程度會(huì)因液滴的半徑大小、溶劑的表面張力和液滴內(nèi)所帶的電荷數(shù)而有所不同。相同的過程會(huì)在電噴灑端與質(zhì)譜儀間不斷重復(fù)，帶電液滴經(jīng)過多次分裂，體積不斷減少，最終便能去除溶劑。為了提高去除溶劑的效率，通常會(huì)在分析物溶液中添加揮發(fā)性較高的有機(jī)溶劑，降低溶液的表面張力以利電噴灑時(shí)的溶劑的揮發(fā)。也會(huì)利用霧化氣流來增加電噴灑的效率，或是在質(zhì)譜儀入口端往電噴灑端施予一輔助氣流來幫助溶劑揮發(fā)。

2.3游離(ionization)：形成氣相離子

目前為止并無法定論將帶電液滴形成氣相離子的機(jī)制，但是目前較為被科學(xué)家接受的理論主要有兩個(gè)，一個(gè)是在1968年由M.Dole所提出電荷殘留理論；另一個(gè)是在1976年由B.A.Thomson所提出的離子揮發(fā)理論。電荷殘留理論討論到當(dāng)帶電液滴的溶劑經(jīng)過不斷的揮發(fā)和多次分裂后，溶劑會(huì)完全揮發(fā)，使液滴無法再一次分裂，而原本液滴上的電荷會(huì)殘留在分析物分子上，使分析物形成帶多電荷的氣相離子。離子揮發(fā)理論則認(rèn)為氣相離子不一定是溶劑揮發(fā)后才能形成，而是當(dāng)帶電液滴的溶劑揮發(fā)到最后，液滴直徑縮小至10至20nm，造成液滴內(nèi)部電荷不穩(wěn)定，為了降低內(nèi)部過大的向外排斥力，帶電的液滴就會(huì) 突破液滴表面形成帶多電荷的氣態(tài)離子。1993年Fenn將離子揮發(fā)理論改良并發(fā)表，用來解釋大分子會(huì)帶多電荷的現(xiàn)象，他認(rèn)為液滴一開始就帶有多電荷，而這些液滴中同時(shí)包含異性電荷的離子。由于大分子在液滴中行布朗運(yùn)動(dòng)而移動(dòng)到液滴的表面取代部分液滴表面的電荷，再藉由熱能驅(qū)動(dòng)使大分子的部分帶電區(qū)域突破液滴表面，使分子與液滴脫離而形成多價(jià)電荷的氣相離子。

實(shí)施例3拉曼散射光譜

本發(fā)明利用拉曼光譜法主要用來測(cè)量主成分物質(zhì)的分子振動(dòng)譜峰，作為分析物的光譜指紋辨識(shí)之用。

拉曼光譜的產(chǎn)生機(jī)制為牽涉入射光和樣品分子交互作用后，當(dāng)分子上的原子受到入射光的擾動(dòng)時(shí)，其入射光的電場(chǎng)會(huì)和分子的電子云產(chǎn)生交互作用，因而產(chǎn)生輻射散射(electromagnetic radiation)，而此交互作用所引起電子的周期性振動(dòng)，會(huì)伴隨產(chǎn)生震蕩電極矩(electric moment)，其振蕩的電子即為散射光的來源。散射過程中，入射光和樣品分子牽扯到能量轉(zhuǎn)移，所產(chǎn)生的散射光頻率和光源入射光頻率不相等，故拉曼散射(Raman scattering)即是非彈性碰撞，其中拉曼散射又可分為兩種，當(dāng)散射光頻率相對(duì)于入射光增加時(shí)，稱為反史托克散射(anti-Stokes Raman scattering)；而當(dāng)散射光頻率相對(duì)于入射光減少時(shí)，稱為史托克散射(Stokes Raman scattering)。而生活中?？吹降纳⑸涫抢桌⑸?，因?yàn)椴粻可婀獠ㄩL(zhǎng)的改變，所以屬于彈性散射。相對(duì)于雷利散射，拉曼強(qiáng)度通常僅是其百萬分一左右，因此在日常生活中要觀察到拉曼散射現(xiàn)象并不容易。從量子力學(xué)角度來看，拉曼散射光頻率之所以和入射光不同，主要是因?yàn)殡娮铀紦?jù)的能階改變所致，及散射光頻率改變可對(duì)應(yīng)分子振動(dòng)能階。

實(shí)施例4本發(fā)明的海洋深層水萃取物活性成分分析

本發(fā)明的2400ppm硬度海洋深層水萃取物(DSW2400)以電噴灑/質(zhì)譜法(ESI/MS)包括竹簽電噴灑離子化、濾紙電噴灑離子化方法和拉曼光譜分析海洋深層水萃取物可能有某些特殊成分的分析。

電噴灑/質(zhì)譜法(ESI/MS)的結(jié)果如圖1所示，以竹簽質(zhì)譜儀發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明DSW2400有三種主要687(685-690)、733(733-738)、1070(1070-1075)波形組分子量的強(qiáng)度(B)；687、733、1070波形組分子量在快速圖的表現(xiàn)(D)。或是利用濾紙電噴灑/質(zhì)譜法(ESI/MS)亦可發(fā)現(xiàn)733和1070波形組分子量(C)；而RO 水樣品在竹簽電噴灑/質(zhì)譜法(ESI/MS)無法發(fā)現(xiàn)有此波形(A)。

為確定本發(fā)明的海洋深層水萃取物成分的溶解性有機(jī)質(zhì)(DOM)為有機(jī)成分，本發(fā)明分別以二氯甲烷(Dichloromethane，DCM)、丙酮、三氯甲烷三種有機(jī)溶液萃取的海洋深層水萃取物與本發(fā)明2400ppm硬度海洋深層水萃取物(DSW2400)原液作電噴灑/質(zhì)譜法(ESI/MS)質(zhì)譜圖的比較。結(jié)果如圖2所示，竹簽電噴灑/質(zhì)譜法(ESI/MS)發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明DSW2400以DCM、丙酮、三氯甲烷三種有機(jī)溶液萃取可得到主要687、733、1070波形的分子量。利用本發(fā)明DSW2400進(jìn)行的濾紙電噴灑/質(zhì)譜法(ESI/MS)亦可發(fā)現(xiàn)733和1070波形的分子量。因此，證明本發(fā)明的海洋深層水萃取物的687、733、1070分子量為有機(jī)成分。

本發(fā)明取不同海水區(qū)域與不同處理的海洋深層水或海洋表面水(surfacewater，SSW)的以電噴灑/質(zhì)譜法(ESI/MS)分析，結(jié)果如圖3所示，分子量在2000以下的有機(jī)成分的分子量表現(xiàn)不同，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的海洋深層水(DSW2400)比海洋表面水(SSW-50)、臺(tái)肥海礦1400深層海水(CS1-HB)樣品更能表現(xiàn)1070波形組的強(qiáng)度；且其他深井深層海水(CS2-DM系)、臺(tái)鹽海洋堿性離子水(CS3-TY)、統(tǒng)一pH 9.0堿性離子水(CS4-T1)以及弱堿性水(CS5-LB)皆不具有1070波形，表示該些商品未含有該有機(jī)成分。

以市售RENISHAW拉曼光譜儀測(cè)量電透析(ED)的DSW2400的樣品，如圖4所示，在波數(shù)(wavenumber)為1000的分子振動(dòng)譜峰的強(qiáng)度，會(huì)受到滅菌鍋加熱后和未處理的本發(fā)明海洋深層水萃取物相比有顯著降低的情形，證實(shí)加熱會(huì)破壞有機(jī)成分。

實(shí)施例5本發(fā)明的海洋深層水萃取物活性成分對(duì)酸的表現(xiàn)

將400ml的本發(fā)明的2400ppm硬度海洋深層水萃取物(DSW2400)開封后立即使用。取10個(gè)離心管分別加入：(A)50ml以RO逆滲透處理后淡化的RO逆滲透水；(B)未經(jīng)任何處理50ml本發(fā)明DSW2400；(C)50ml本發(fā)明DSW2400連同離心管在滅菌鍋內(nèi)經(jīng)121℃15分鐘的加熱滅菌處理；(D)50ml本發(fā)明DSW2400加入HCl至pH值為5，進(jìn)行電透析的樣品；(E)50ml本發(fā)明DSW2400加入HCl至pH值為4，進(jìn)行電透析的樣品；(F)50ml本發(fā)明DSW2400加入HCl至pH值為3，進(jìn)行電透析的樣品；(G)剛接觸空氣的50ml 本發(fā)明DSW2400；(H)接觸空氣三天的50ml本發(fā)明DSW2400，進(jìn)行電透析的樣品；(I)通入氫氣的50ml本發(fā)明DSW2400，進(jìn)行電透析的樣品；(G)經(jīng)過0.22μm濾紙過濾的50ml本發(fā)明DSW2400，進(jìn)行電透析的樣品。10個(gè)樣品進(jìn)行電噴灑/質(zhì)譜法(ESI/MS)，如圖5所示，發(fā)明1070波形組的強(qiáng)度在各樣品中表現(xiàn)不同，以剛接觸空氣的50ml本發(fā)明DSW2400，及以經(jīng)過0.22μm濾紙過濾的50ml本發(fā)明DSW2400的波鋒最高，而用酸(pH 3至4)、接觸空氣越久氧化以及高溫滅菌的樣品1070波形的有機(jī)成分會(huì)被破壞。

實(shí)施例6添加抗氧化物對(duì)保存本發(fā)明的海深層水萃取物活性成分的效果

將400ml的本發(fā)明的海洋深層水開封后(第一天)立即以電噴灑/質(zhì)譜法(ESI/MS)分析，用量筒取出200ml，然后分裝至4瓶50ml離心管內(nèi)，每瓶50ml處理后封瓶鎖緊，第一瓶不做任何處理(減少接觸空氣面積)，第二瓶則通氫氣30秒(可能會(huì)導(dǎo)至DSW溢出)，第三瓶加入抗氧化物槲皮素(quercetin)(1mg/200ml)及第四瓶加抗氧化物綠茶素(EGCG)(12mg/50ml)，另外殘余的200ml則仍舊留在原容器中并暴露于空氣中作為無處理對(duì)照組。所有液體都會(huì)在第二、九天分別開封測(cè)試不同處理方式后的以電噴灑/質(zhì)譜法(ESI/MS)評(píng)估1070等波形強(qiáng)度。

結(jié)果如圖6至圖8所示，以電噴灑/質(zhì)譜法(ESI/MS)發(fā)現(xiàn)以1070波形組的強(qiáng)度在第一天的各種情形的表現(xiàn)量，在第一天剛開瓶時(shí)五種處理有相近的1070波形組的強(qiáng)度(圖6)。以電噴灑/質(zhì)譜法(ESI/MS)發(fā)現(xiàn)以1070波形組的強(qiáng)度在第二天的各種情形的表現(xiàn)量，在第二天減少空氣接觸、通入氫氣30秒或加入抗氧化物如槲皮素或綠茶素處理都有保留1070波形組的強(qiáng)度表現(xiàn)量，相對(duì)于大瓶未處理與大量接觸空氣的1070波形組的強(qiáng)度表現(xiàn)量明顯消失(圖7)。以電噴灑/質(zhì)譜法(ESI/MS)發(fā)現(xiàn)以1070波形組的強(qiáng)度在第九天的各種情形的表現(xiàn)量，各組1070波形組的強(qiáng)度表現(xiàn)量皆明顯降低，但加入抗氧化物如槲皮素或綠茶素的1070波形組的強(qiáng)度表現(xiàn)量比其它組別仍有較高的趨勢(shì)(圖8)。

以電噴灑/質(zhì)譜法(ESI/MS)量測(cè)以1070波形組的強(qiáng)度為指標(biāo)統(tǒng)計(jì)五組處理本發(fā)明的海洋深層水萃取物在第一天(Day 1)、第二天(Day 2)和第九天(Day 9)的各種情形的1070波形表現(xiàn)強(qiáng)度。如圖9所示，除了暴露在大量空氣中的第一組(Air 1)外，四組1070波形組的強(qiáng)度在第二天尚可保持。各組1070波形組 的強(qiáng)度在第九天表現(xiàn)量皆明顯降低，但加入抗氧化物如氫氣、槲皮素(quercetin)或綠茶素(EGCG)的1070波形組的強(qiáng)度表現(xiàn)量比其它組別仍有較高的趨勢(shì)。在無處理的對(duì)照組中(以Air 1表示)，將200ml本發(fā)明的海洋深層水萃取物暴露在大量空氣中；在無處理組中(以Air 2表示)，將50ml本發(fā)明的海洋深層水萃取物緊密封住在50ml離心管中；通入氫氣(以H2表示)組中，將50ml本發(fā)明的海洋深層水萃取物緊密封住在通入氫氣30秒的50ml離心管中；加入槲皮素組中(以quercetin表示)，將50ml本發(fā)明的海洋深層水萃取物緊密封住在已添加1mg/200ml槲皮素的50ml離心管中；加入綠茶素(以EGCG表示)，將50ml本發(fā)明的海洋深層水萃取物緊密封住在已添加12mg/50ml綠茶素的50ml離心管中。其結(jié)果顯示與空氣接觸，皆會(huì)使本發(fā)明的海洋深層水萃取物的有機(jī)成分氧化，而加入具安全、常用的可食性物質(zhì)的抗氧化物能減少本發(fā)明的海洋深層水萃取物的1070波形組的有機(jī)成分氧化。

本發(fā)明利用海洋深層水萃取物經(jīng)過reverse osmosis(RO逆滲透)和電透析(electrodialysis)或是經(jīng)由小分子膜納米過濾(nanofilter)等其它方式可以取得或保留具有抑制胃幽門螺旋桿菌生長(zhǎng)的活性成分。這些活性成分可進(jìn)一步經(jīng)由凝膠層析(gel filtration)、二氯甲烷(Dichloromethane，DCM)萃取、丙酮萃取、以及三氯甲烷萃取后取得分子量在2000以下具有抑制胃幽門螺旋桿菌生長(zhǎng)的性質(zhì)。以電噴灑/質(zhì)譜法(ESI/MS)分析可發(fā)現(xiàn)三種主要分子量在687(685-690)、733(733-738)、1070(1070-1075)波形組的強(qiáng)度。并以電噴灑/質(zhì)譜法(ESI/MS)發(fā)現(xiàn)在以DCM、丙酮、三氯甲烷三種有機(jī)溶液萃取2400ppm硬度海洋深層水萃取物(DSW2400)的樣品可得到主要687、733以及1070波形，證實(shí)687、733以及1070分子量為有機(jī)成分。

本發(fā)明的海洋深層水萃取物接觸空氣氧化、以121℃或加熱100℃處理或是用酸(pH 3至4)會(huì)破壞687、733以及1070等波形的有機(jī)成分。以市售RENISHAW拉曼光譜儀測(cè)量電透析的DSW2400的樣品，在波數(shù)(wavenumber)為1000的分子振動(dòng)譜峰的強(qiáng)度，會(huì)受到滅菌鍋加熱后和未處理的本發(fā)明海洋深層水萃取物有顯著降低的情形。以電噴灑/質(zhì)譜法(ESI/MS)發(fā)現(xiàn)以1070波形組的強(qiáng)度在第二天接觸空氣后的表現(xiàn)量明顯降低。在第二天減少空氣接觸、通入氫氣30秒或加入抗氧化物如槲皮素或綠茶素處理都有保留1070波形組的強(qiáng) 度表現(xiàn)量。以電噴灑/質(zhì)譜法(ESI/MS)發(fā)現(xiàn)以1070波形組的強(qiáng)度在第九天的強(qiáng)度表現(xiàn)量皆明顯降低，但加入抗氧化物如槲皮素或綠茶素的1070波形組的強(qiáng)度表現(xiàn)量比其它組別仍有較高的趨勢(shì)。

此外，本發(fā)明亦采用其他抗氧化劑進(jìn)行比較，如圖10所示，以維他命C作為抗氧化劑會(huì)破壞本發(fā)明的海洋深層水萃取物的有效成分，非所有的抗氧化劑皆具有減緩本發(fā)明的海洋深層水萃取物氧化的效果。

實(shí)施例7本發(fā)明的海深層水萃取物具有抑制胃幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)生長(zhǎng)的效果

本發(fā)明證實(shí)海洋深層水萃取物具有抑制胃幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)生長(zhǎng)的活性成分并非是與其高鈣、高鎂濃度及高硬度有關(guān)。如第十一圖A所示，本發(fā)明1200、2400、3600、4800以及6000ppm硬度的海洋深層水萃取物分別以滅菌鍋、0.22μm過濾膜進(jìn)行濾菌以及滅菌鍋與0.22μm過濾膜進(jìn)行濾菌處理后，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明硬度2400ppm以上具有抑制胃幽門螺旋桿菌的效果，同時(shí)以濾菌處理后的抑制較果較佳(圖11A)。本發(fā)明利用EDTA二價(jià)金屬螯合劑將鈣和鎂移除，證實(shí)本發(fā)明的海洋深層水萃取物不含鈣及鎂離子，仍具有抑制胃幽門螺旋桿菌生長(zhǎng)的效應(yīng)；而以含相同的鎂離子濃度的蒸餾水則無法產(chǎn)生抑制胃幽門螺旋桿菌生長(zhǎng)的效應(yīng)(圖11B)。

另外，本發(fā)明利用質(zhì)譜儀量化海洋深層水萃取物1070成分強(qiáng)度數(shù)值與抑制胃幽門螺旋桿菌生長(zhǎng)百分比的關(guān)系圖，本實(shí)施方式為制備不同硬度的海洋深層水萃取物、加入不同濃度的EDTA于海洋深層水萃取物或不同濃度MgCl₂的洋菜膠(agar)，接著以0.22μm過濾膜滅菌或是鍋(autoclave)滅菌進(jìn)行濾菌。混合羊血之后，倒入9cm的培養(yǎng)基，等待凝固成為洋菜膠固體培養(yǎng)基(agar plate)。取2.85毫克MgCl₂，加入其他培養(yǎng)基成分與水，最后泡成體積為10ml的agar plate，則代表agar plate所含有MgCl₂濃度為285mg/L。依據(jù)上述方法，分別制備含有MgCl₂濃度為285mg/L與570mg/L的agar plate；并且分別制備不同硬度1200至6000ppm海洋深層水萃取物或加入不同濃度的EDTA于硬度2400的ppm海洋深層水萃取物制備成不同成分含量的洋菜膠固體培養(yǎng)基。本案為確定海洋深層水具抑制胃幽門螺旋桿菌生長(zhǎng)的主要成份為何者，選取來自10個(gè)不同病人檢體的胃幽門螺旋桿菌，使用無菌棉棒，沾取適量的胃幽門 螺旋桿菌，涂抹于洋菜膠固體培養(yǎng)基上，放入?yún)掟B(yǎng)培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)3至4天之后，觀察是否有胃幽門螺旋桿菌細(xì)菌生長(zhǎng)，如果沒有生長(zhǎng)以－標(biāo)示，如果有微量生長(zhǎng)以+/－標(biāo)示，如果會(huì)有正常生長(zhǎng)以+標(biāo)示。其結(jié)果如圖12所示，發(fā)現(xiàn)該海洋深層水萃取物濃度愈高其抑菌效果越好。滅菌鍋(autoclave)滅菌降低1070波形組含量，但以0.22μm過濾膜進(jìn)行濾菌不會(huì)影響1070波形組含量，證實(shí)1070波形組含量為海洋深層水具抑制胃幽門螺旋桿菌生長(zhǎng)的主要成份。圖12是含有不同成分1070波形組含量的海洋深層水萃取物對(duì)抑制胃幽門螺旋桿菌的抑制效果的關(guān)系圖。1070波形組含量越高的海洋深層水萃取物與抑制胃幽門螺旋桿菌能力成正相關(guān)。A為RO逆滲透水樣品；B為表面海水SSW(50公尺海平面下的海水)樣品；C為經(jīng)過滅菌鍋處理后的DSW2400樣品；D為在pH 3.93的條件下的DSW2400樣品；E為經(jīng)過0.22μm過濾的DSW2400樣品；F為經(jīng)過ED處理的DSW2400樣品；H為樣品A至F對(duì)抑制胃幽門螺旋桿菌的抑制效果的關(guān)系圖；G為樣品A至F的1070波形組含量的平均強(qiáng)度量化數(shù)值。

更進(jìn)一步地，本發(fā)明的實(shí)施例另采前瞻、雙盲的方式進(jìn)行臨床試驗(yàn)檢測(cè)本發(fā)明的海洋深層水萃取物是否可明顯降低胃幽門螺旋桿菌感染所放出的碳十三尿素呼吸數(shù)值。

首先，針對(duì)年齡20歲以上的成年男性或女性，因有上腹痛等消化不良癥狀而來接受胃鏡檢查，經(jīng)檢查發(fā)現(xiàn)有慢性胃炎或輕微胃糜爛(直徑小于5mm，數(shù)目不超過3個(gè))或在瘢痕期的消化性潰瘍，同時(shí)有幽門螺旋桿菌感染的病患，將征求其意愿，邀請(qǐng)參與本試驗(yàn)。病患若有下列情況之一，就被排除：1)懷孕或哺乳婦女；2)嚴(yán)重并存疾病如腎衰竭、肝硬化等；3)無法治愈的惡性腫瘤；4)嚴(yán)重的潰瘍出血；5)以前接受胃切除手術(shù)；6)在胃鏡檢查前一個(gè)月之內(nèi)曾服用鉍鹽、PPIs、抗生素，或非類固醇消炎止痛劑。治療前都接受胃鏡和其附屬檢查同時(shí)做碳13尿素呼氣試驗(yàn)(13C-UBT)判定幽門螺旋桿菌存在的狀態(tài)。病患先經(jīng)過負(fù)責(zé)計(jì)劃的人員解說試驗(yàn)內(nèi)容及流程且簽署受試者同意書后，依照試驗(yàn)流程接受試驗(yàn)前后抽血篩檢身體基本功能(血液常規(guī)檢驗(yàn)(CBC)、肝功能檢驗(yàn)(LFT)、腎功能檢驗(yàn)(RFT)、血糖、血脂及、電解質(zhì))，碳13尿素呼氣試驗(yàn)(分別在本發(fā)明的海洋深層水萃取物(DSW)飲用前、2周DSW剛飲用完畢后、 DSW飲用完畢4周后)。受試者分別為每次飲用200mL本發(fā)明的海洋深層水萃取物(DSW)或飲用相同包裝非本發(fā)明的海洋深層水萃取物的一般礦泉水(CMW)，一天4次(三餐飯前一小時(shí)及睡前)，為期四周。同時(shí)在三餐飯后服用促進(jìn)腸胃蠕動(dòng)藥物(prokinetics)(甲氧氯普胺(metoclopramide)5mg/tab)一天三次和抗酸劑(antacid)(息痛佳音錠(Strocain)(含有歐西拉因(oxethazaine)5mg以及polymigel 244mg/tab)，一天三次，以幫助消化不良癥狀的緩解。所有病患被要求填寫一份問卷，同時(shí)在治療期間每天記錄臨床癥狀和DSW飲用量。DSW飲用期間，病人將維持其平時(shí)規(guī)則性飲食方式，但被要求禁止同時(shí)使用下列食物或藥物：乳制品、漢方草藥、蜂蜜、蔓越莓、含乳酸菌的保健食品、過度酸辣的食物等。本發(fā)明的海洋深層水萃取物(DSW)飲用結(jié)束后，病患被安排至門診以便評(píng)估DSW飲用順從度和不良反應(yīng)發(fā)生的內(nèi)容、程度和頻率。同時(shí)安排評(píng)估DSW飲用后改變幽門螺旋桿菌菌量效果的追蹤檢查。治療前，當(dāng)(1)組織學(xué)檢查及13C-UBT均為陽性時(shí)；或(2)細(xì)菌培養(yǎng)陽性，則判定為有帶菌的狀態(tài)。治療后的效果則以系列性的13C-UBT數(shù)值的變化做為判斷的依據(jù)。

如圖13所示在臨床研究數(shù)值發(fā)現(xiàn)具有陽性幽門螺旋桿菌感染的病患在飲用本發(fā)明的含有1070成分的海洋深層水萃取物可以明顯降低胃幽門螺旋桿菌感染所放出的碳十三尿素呼吸數(shù)值，而以不含1070成分的一般礦泉水(CMW)則不能改善碳十三尿素呼吸數(shù)值(無法改善胃幽門螺旋桿菌感染程度)。

因此，本發(fā)明提供一種具有分子量為2000以下的有機(jī)成分的海洋深層水萃取物，能有效抑制胃幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)生長(zhǎng)，其為治療胃幽門螺旋桿菌感染的新策略。