專利名稱：引藻萃取物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種引藻(Chlorella sorokiniana)萃取物，尤其是指一種適 用于治療糖尿病、肥胖及血脂異常的引藻萃取物。
背景技術(shù)：
過(guò)氧化體增生齊ll活化受體(peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs)屬于核受體家族，其可控制許多細(xì)胞功能及代謝過(guò)程，其中如 PPARa、 PPARS、及PPARY等三種哺乳動(dòng)物的PPARs已被鑒定確認(rèn)，(參考 Lee C.H. et al., Endocrinology 2003, 144: 2201-7)。關(guān)于活化方面，PPARs 會(huì)觸發(fā)一連串轉(zhuǎn)錄事件，導(dǎo)致脂質(zhì)及葡萄糖的代謝改變(例如參考Willson T.M. et al.， J Med Chem 2000， 43, 527-50;及Moraes L,A. et al., Pharmacol Ther. 2006， 110,371-85)。
以PPARs在脂質(zhì)及葡萄糖代謝上所扮演的角色來(lái)看，如PPARs的于第 二型糖尿病、肥胖、C型肝炎、血脂異常、冠狀動(dòng)脈心臟病、發(fā)炎性疾病 及癌癥等疾病的重要性，貝IJPPARs可為以上相關(guān)疾病具發(fā)展性的治療標(biāo) 的。舉例而言，作為PPARY促效劑的格列酮(glitazones)，則已經(jīng)用于治療 第二型糖尿病。另外例如作為PPARot促效劑的纖維酸酯(fibrates)，其可作 為有效降低血液中三酸甘油含量的藥物。不過(guò)，大部分PPAR類的治療劑， 其功效有限且具有明顯的副作用。
因此，仍需發(fā)展出可調(diào)控PPAR活性的藥物，以更為有效地控制脂質(zhì) 及葡萄糖的代謝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種引藻(單細(xì)胞嗜溫性綠藻)萃取物，其能夠 有效的活化PPARa及PPARy。因此本發(fā)明一方面關(guān)于一種萃取物，其包含 肉豆蔻酸(myristic acid)、棕櫚酸(palmitic acid)、棕櫚烯酸(palmitoleic acid)、油酸(oleic acid)、亞麻油酸(linoleic acid)、次亞麻油酸(linolenic acid)、及硬 脂酸(stearic acid)，其中含量分別為萃取物干重的0.1%至5%、 10%至60%、 2%至15%、 2%至15%、 2%至15%、 0.8%至6%、及0.5%至5%。其中較佳而
言，肉豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚烯酸、油酸、亞麻油酸、次亞麻油酸、及硬 脂酸的含量分別為萃取物干重的0.5%至4%、 15%至50%、3.5%至12%、3.5% 至12%、 3%至12%、 1.2%至5%、及0.8%至4%。然而，在萃取物中依上述 次序的七種成分，其含量更佳分別為萃取物干重的0.7%至1.7%、 19.2%至 43.6%、 4.4%至10.1%、 4.4%至10.0%、 3.9%至8.8%、 1.8%至4.00/0、及1.1% 至2.6%。
該萃取物可還包含十六碳二烯酸(hexadecadienoic acid)、十六碳烯酸 (hexadecenoic acid)、及十八碳烯酸(octadecenoic acid)，其含量分別為萃取 物干重的0.8%至6%、 1.2%至8%、及1.2%至8%。在一實(shí)施例中，十六碳二 烯酸、十六碳烯酸、及十八碳烯酸的含量分別為萃取物干重的1.2%至5%、 2%至7%、及2%至7%。舉例而言，在萃取物中的十六碳二烯酸、十六碳烯 酸、及十八碳烯酸，其含量也可分別為萃取物干重的1.9%至4.3%、 2.6%至 6.00/o、及2.60/0至5.90/0。
本發(fā)明另一方面關(guān)于一種治療糖尿病、肥胖或血脂異常的方法，此方 法包含投遞有效劑量的上述萃取物給所需主體。
含上述萃取物及醫(yī)藥上可接受的載體的醫(yī)藥組成物、使用這種組成物 治療糖尿病、肥胖或血脂異常的用途及使用此種組成物制出治療這些疾病 的藥劑的用途，也涵蓋在本發(fā)明范圍內(nèi)。
以下列舉幾個(gè)本發(fā)明實(shí)施例的詳細(xì)內(nèi)容，由權(quán)利要求范圍及下述說(shuō) 明，本發(fā)明其它特征、目標(biāo)及優(yōu)點(diǎn)將更臻明確。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明萃取物是利用醋酸乙酯萃取引藻(Chlorella sorokiniana)的方式 來(lái)進(jìn)行制備，以此所得的萃取物可再以薄層層析法(thin layer chromatography)、 快速管柱層析法(flash column chromatography)、 高效液 相層析法(high performance liquid chromatography)或j壬何其它合適的方法
進(jìn)行純化。以下將提出一個(gè)實(shí)際實(shí)施例。該萃取物能夠有效活化PPRAa/Y，造成脂質(zhì)及葡萄糖代謝改變，所以 可以用于治療糖尿病、肥胖或血脂異常。因此，本發(fā)明關(guān)于一種治療上述 其中1疾病的方法，由投遞有效劑量的萃取物給所需主體。「有效劑量」 一詞是指能夠?qū)τ谠撝黧w產(chǎn)生上述治療效果的萃取物劑量。如同本領(lǐng)域技 術(shù)人員所知，有效劑量可能會(huì)依投藥的途徑、賦形劑的使用、以及與其它
藥劑共同使用而改變。「治療」 一詞是指以治愈(cure)、療傷(heal)、減輕 (alleviate)、緩禾口 (relieve)、改變(alter)、補(bǔ)救(remedy)、改良(ameliorate)、 改善(improve)、或影響(affect)目標(biāo)疾病、目標(biāo)疾病的癥狀、或朝目標(biāo)疾病 發(fā)展等為目的，投遞該萃取物給具有糖尿病、肥胖或血脂異常、或具有傾 向其中一疾病發(fā)展的主體。
為實(shí)現(xiàn)上述其中一方法，可由口服、直腸、腸外、噴霧吸入、或經(jīng)由 植入式貯藏器，將上述萃取物的單獨(dú)組成物或該萃取物與醫(yī)藥上可接受載 體的混合組成物投遞給所需主體。于此所使用的「腸外」 一詞，包含皮下 (subcutaneous)注射、皮內(nèi)(intracutaneous)注身寸、靜脈(intravenous)注身t、肌 肉(intramuscular)注射、關(guān)節(jié)內(nèi)(intraarticular)注身寸、動(dòng)脈(intraarterial)注射、 滑膜內(nèi)(intrasynovial)注射、胸骨內(nèi)(intrasternal)注射、鞘內(nèi)(intrathecal)注射、 病灶內(nèi)(intralesional)注射和顱內(nèi)(intracranial)注射或輸液技術(shù)(infiision techniques)。
口服組成物為任何口服上可接受的藥劑形式，可包含但不限于藥片、 膠囊、乳劑及水懸浮液、分散液及溶液。通常用于藥片的載體包含乳糖及 玉米淀粉， 一般藥片也會(huì)添加如硬脂酸鎂的潤(rùn)滑劑。若要以膠囊形式口服 投藥，可使用的稀釋劑包括乳糖及干玉米淀粉。當(dāng)水懸浮液或乳化液以口 服方式投藥，則有效成分會(huì)懸浮或溶解于結(jié)合乳化劑或懸浮劑的油相中。 如果需要的話，可添加一些甜味劑、香料或著色劑。
可根據(jù)本領(lǐng)域已知技術(shù)，使用適合的分散劑或濕潤(rùn)劑(例如Tween 80) 及懸浮劑，配制無(wú)菌可注射式的組成物(如水或油質(zhì)懸浮液)。無(wú)菌可注射 式的配制液，也可為腸外上可接受的無(wú)毒稀釋劑或溶劑中的無(wú)菌可注射式 溶液或懸浮液，舉例如l,3-丁二醇溶液。在可接受載體及溶劑間，能使用 者為甘露醇、水、林格氏液及等滲透的氯化鈉溶液。此外，公知上使用無(wú) 菌固定油作為溶劑或懸浮基質(zhì)(如合成的單-或雙-甘油酯)。可根據(jù)醫(yī)藥配制領(lǐng)域的已知技術(shù)，制備出吸入組成物，且可添加苯甲 醇或其它合適的防腐劑、加強(qiáng)生物可利用性的吸收促進(jìn)劑、氟碳化合物、 及/或其它本領(lǐng)域已知的穩(wěn)定劑或分散劑，以制備成鹽水溶液。
局部組成物可配置成油狀、霜狀、乳液狀、油膏狀及類似形式，而適 用于此組成物的載體包括植物性或礦物性油、白礦脂(白色軟石蠟)、支鏈 脂肪或油脂、動(dòng)物性脂肪及高分子量醇類(大于C12)，較佳的載體為有效成 分可溶于其中者。如果需要的話，也可包含乳化劑、安定劑、濕潤(rùn)劑與抗 氧化劑，以及引入顏色或香味的藥劑。此外，這些局部性的配方中也可添
加透皮加強(qiáng)劑，這類透皮加強(qiáng)劑的例子則記載于美國(guó)專利第3,989,816及 4，444,762號(hào)。霜?jiǎng)┹^佳配制方式，是將礦物油、自乳化性蜂蠟及水的混合 物，與溶于少量的油質(zhì)(如杏仁油)中的有效成分進(jìn)行摻合。此類霜?jiǎng)┡e例 包含約40份水、約20份蜂蠟、約40份礦物油及約1份杏仁油。油膏劑可將
植物油(如杏仁油)中的有效成分與溫軟石蠟混合，而后冷卻混合物的方式 配制。這類油膏劑舉例可包含約30重量百分比杏仁油及約70重量百分比的
白色軟石蠟。
醫(yī)藥組成物的載體必須為「可接受的」，亦即可與配方中的有效成分 (較佳者為可穩(wěn)定有效成分)兼容，且對(duì)受治療的主體無(wú)害。舉例而言，如 環(huán)糊精(其可與萃取物中一至多個(gè)活性化合物形成特定且更為穩(wěn)定的錯(cuò)合 物)的穩(wěn)定劑，則可作為用來(lái)投遞活性化合物的醫(yī)藥賦形劑。其它載體的例 子包括膠狀二氧化硅、硬脂酸鎂、纖維素、月桂硫酸鈉、及D&G黃色弁10。
合適的體外分析可用于預(yù)先估量此發(fā)明萃取物對(duì)于PPARa/y的效率， 參見(jiàn)以下所述的實(shí)施例，更可檢査萃取物對(duì)于治療糖尿病、肥胖或血脂異 常的效果。例如投遞萃取物給具有疾病的動(dòng)物(如小鼠試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，而后取 得其治療效果，基于此結(jié)果，則可決定適當(dāng)?shù)膭┝糠秶巴端幫緩健?br> 不需額外詳加解釋，相信上述的描述已可適當(dāng)?shù)膶?shí)施本發(fā)明，因此以 下具體實(shí)施例僅為說(shuō)明用，并非用于限制諸如此類的其余揭露范圍。此所
引載包含專利的所有公開(kāi)物，則完整并入以供參酌。 實(shí)施例l:制備引藻萃取物
弓I藻(Chlorella 301"0^1^1^)粗萃水溶液(^￥87-10)由中華民國(guó)臺(tái)灣彰化
縣國(guó)際綠藻有限公司所提供。其制備方式如下將引藻(Cryptomonadales)接種于含營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的培養(yǎng)瓶中，持續(xù)在營(yíng)養(yǎng) 基質(zhì)中通氣，同時(shí)以震蕩器震蕩培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)引藻約1.5個(gè)月。
以ALFA-LAVEL離心機(jī)收集引藻(Cryptomonadales algae)，并以噴霧干 燥機(jī)干燥形成粉末。將70kg的水加入30kg的引藻粉末，10(TC下煮沸30分 鐘后，以離心移去未溶解的殘?jiān)⑹占锨逡海褂谜婵崭稍餀C(jī)自上清液 移除約95%的水分，過(guò)濾剩下的上清液，脫色后得到引藻粗萃溶液。
將100mL的粗萃溶液加水稀釋，直至成為原始體積的兩倍，并以EtOAc 進(jìn)行萃取(200mLx4)，然后減壓濃縮有機(jī)層，殘余物裝填于硅膠管柱，以 丙同-正己垸梯度(30°/。-100%)流洗，收集CE1-CE8等8個(gè)分液，每一分液的 干重經(jīng)測(cè)定后分別為CE1: 7.0 mg、 CE2: 17.9 mg、 CE3: 59.0 mg、 CE4: 60.9 mg、 CE5: 68.4 mg、 CE6: U5.7mg、 CE7: 33.4mg及CE8: 170.2 mg。
再使用制備式的TLC純化分液CE3，利用33% EtOAc的正己垸溶液展 開(kāi)，可獲得6個(gè)CE3-1-CE3-8等6個(gè)
次分液，每一分液的干重經(jīng)測(cè)定后分別為CE3-1: 5.3 mg、 CE3-2: 1.3 mg、 CE3-3: 25.6 mg、 CE3-4: 3.5 mg、 CE3-5: 15.5 mg及CE3-6: 5.6 mg。
于氮?dú)庀聦?.2 mg的CE3-3溶解在二氯甲烷(0.6 mL)，并與20%三氟化 硼乙醚的甲醇溶液(4mL)混合后，密封溶液且于100。C下攪伴5分鐘。待冷 卻后，添加飽和氯化鈉水溶液(IO mL)以中和溶液，然后以正己垸(2 mL) 萃取。使用MgS04干燥有機(jī)層，并減壓濃縮有機(jī)層以得到黃色油狀甲酯產(chǎn) 物(CE3-3M)。使用氣相層析系統(tǒng)(Hewlett-Packard 6890 gas chromatography system)搭配質(zhì)譜選擇偵測(cè)儀(HP5973 mass selective detector)、自動(dòng)液態(tài)樣 品取樣器(HP7673 automatic liquid sampler)及質(zhì)譜管柱(Agilent DB-5MS column, 30 cmx250 pm, 0.25 ^m膜厚)分析CE3-3M組成物，載氣使用流速為 lmL/min的氦氣。把進(jìn)口溫度維持在25(TC，將樣本(l ^L)以1:50的分流比 注入。溫箱的起始溫度維持在12(TC持續(xù)3分鐘，接著設(shè)定以l(TC/min的速 度(持續(xù)1分鐘)增加至18(TC，然后以2。C/min的速度(持續(xù)5分鐘)增加至 210°C，全部運(yùn)作時(shí)間為30分鐘。在70eV游離能及230。CMS離子源溫度下， 記錄50-500 amu范圍的質(zhì)譜，并以化學(xué)工作站軟件(HP Chem Station software)收集及整合數(shù)據(jù)，透過(guò)整合全部離子流光譜圖的訊號(hào)峰面積，并 轉(zhuǎn)成百分比來(lái)決定每一成份的含量，同時(shí)將該些成分的延遲時(shí)間與商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品及國(guó)家技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)局的MS搜尋引擎(National Institute of Standards And Technology MS Search program)進(jìn)行比較，以鑒定出各成分的身分。
由GC層析結(jié)果可觀察到10種脂肪酸，且由GC-MS搜尋庫(kù)中可確定其 中7種。下表顯示全部脂肪酸的相對(duì)比例及延遲時(shí)間
號(hào)碼化合物名
延遲時(shí)間
相對(duì)比例％
2
4
6
7
9
10
11.9
C16:2 C16:l C16:l
C14:0 十六碳二烯酸 十六碳烯酸 棕櫚烯酸 棕櫚酸 C16:0 [十六碳烷酸] 亞麻油酸 C18:2 [(Z),(Z)-9-12-十八碳二烯酸] 次亞麻油酸 C18:3 [(Z)，(Z),(Z)-9-,12-，15-[十八碳烯酸] 油酸 C18:l 21.8
十八碳烯酸 C18:l 22.0 硬脂酸 C18:0 22.7
15.6 15.9 15.9
16.6 21.5
21.7
1.7
4.3 6.0 10.1
43.6
8.8 4.0
10.0
5.9 2.6
實(shí)施例2:生物性分析
透過(guò)以下分析，研究CE3及CE3-3對(duì)于PPARoc/Y的活化效果。 PPARy配體結(jié)合分析
在E. coli中以麩胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase, GST)融合蛋 白的方式表現(xiàn)出hPPARY的配體結(jié)合區(qū)域后，使用麩胱甘肽-瓊脂糖膠體(Amersham Biosciences, NJ)透過(guò)親合純化法根據(jù)操作指南分離出重組蛋 白。制備出的GST-hPPARy^D重組蛋白，最終使用濃度約為5nM，而山羊 抗-GST抗體(商品編號(hào)27-4577-01， Amersham Biosciences, NJ)則以1:2000 稀釋使用。將蛋白A-硅酸釔閃爍迫近分析微球(Protein A-yttrium silicate scintillation proximity assay beads)懸浮于含有10 mM Tris-Cl， pH 7.2 、 1 mM EDTA、 10。/。(w/v)甘油、lOmM鉬酸鈉、1 mM二硫蘇糖醇、0.5 mM苯甲 基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride)、 2 (ig/mL苯甲脒(benzamidine)、及 0.0ln/。迭氮化鈉(sodium azide)的50 mL分析緩沖液中。
樣本萃取物溶于DMSO使其最終濃度為5 pg/mL，并使用乙醇將放射 標(biāo)定的PPAR配體[3H]羅格列酮(rosiglitazone, 60 Ci/mmol, American Radiolabeled Chemicals, MO)稀釋425倍，最終使用濃度為7.8 nM。
依序于96-孔微滴定盤(商品編號(hào)6005290, Packard Instrument, CT)加入 GST-PPAR/BD、山羊抗-GST抗體、均勻懸浮的蛋白A-硅酸釔閃爍迫近分 析微球、樣本萃取物、及經(jīng)稀釋的[SH]羅格列酮溶液(每個(gè)20)aL)后，于4"C 下輕微震蕩培養(yǎng)。待24小時(shí)后，使用微盤閃爍磷光計(jì)數(shù)器(1叩(^111^@ Microplate Scintillation & Luminescence Counter, Packard Instrument Co.， Inc, USA)定出放射量。
結(jié)果顯示，CE3及CE3-3兩者皆具結(jié)合效力，其中顯示對(duì)于結(jié)合于 PPAR,BD的卩H]羅格列酮，CE3具有大于95。/。的置換效果，而CE3-3具有大 于99.8%的置換效果。對(duì)于PPAR^BD的IC5。值，則使用8個(gè)3重復(fù)數(shù)據(jù)的劑 量反應(yīng)曲線計(jì)算，而CE3及CE3-3的IQo值分別為2.7嗎/mL及1.6嗎/mL。
PPARoc碳末結(jié)合分析(PPARa Charcoal Binding Assay)
碳末結(jié)合分析的方法相似于Mahindroo, et al., J Med Chem 2005, 48: 8194-208; Mahindroo N. et al., J Med Chem 2006, 49: 1212-6; Mahindroo N. et al., J Med Chem 2006， 49: 6421-6424; Lu， I. L. et al.， J Med Chem 2006, 49: 2703-12等所描述的方法。
配制具有或不具有樣本萃取液的含TEGM緩沖液(IO mM Tris, pH 7.2、 lmMEDTA、 10%甘油、7 |iL/100 mL的卩-巰乙醇、lOmM鉬酸鈉、1 mM 二硫蘇糖醇、2 )ig/mL苯甲脒、及0.5mM苯甲基磺酰氟)及2.5 nM [3H] L-783,483 (79 |iCi/mmol，由臺(tái)灣國(guó)家衛(wèi)生研究院生物技術(shù)與藥物研究組合成)的分析溶液，以最終體積為300 1^L在24'C下培養(yǎng)24小時(shí)后，與200 的糊精/明膠層覆的碳末在冰上培養(yǎng)10分鐘，以移除未結(jié)合的配體。以3000 rpm于4。C下離心10分鐘后，在液體閃爍計(jì)數(shù)器(TRI-CARB 2100TR liquid scintillation analyzer)中計(jì)算上清液的放射性。
取代卩H] L-783,483結(jié)合于PPARaLBD的ICs。值，貝U6個(gè)3重復(fù)數(shù)據(jù)的劑量 反應(yīng)曲線計(jì)算，其中CE3及CE3-3的IC5。值分別為5.0 ^ig/mL及2.3嗎/mL。
PPAR轉(zhuǎn)錄活性分析
在37。C且5y。 C02的潮濕環(huán)境下，24孔細(xì)胞培養(yǎng)盤中具有含有10%胎牛 血清、100單位/mL青霉素G、 100mg/mL硫酸鏈霉素、及0.25嗎/mL雙性霉 素B (amphotericin B)的高葡萄糖含量DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)，于其中培養(yǎng)人類肝癌Huh7細(xì)胞株(5 x 104個(gè)細(xì)胞/孔)。待24小時(shí)后， 根據(jù)操作指南使用轉(zhuǎn)染齊U(Fugene 6 transfection reagent, Roche, Germany) 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。具體而言，將0.5 mL的轉(zhuǎn)染劑、0.05 jig的pGAL4-PPAR^BD質(zhì) 體、0.14 pg的pG5-TK-Luc報(bào)導(dǎo)子、及0.25 ng的pRL-SV40水母熒光素酶質(zhì) 體(Renillaluciferaseplasmid)的轉(zhuǎn)染混合液，作為轉(zhuǎn)染的內(nèi)控制組，添加至 培養(yǎng)盤的每個(gè)孔中，并于37'C且5。/。 C02的環(huán)境下，將Huh7細(xì)胞在轉(zhuǎn)染混 合液中培養(yǎng)過(guò)夜。而后，在含有不同濃度樣本萃取物DMSO溶液的新鮮高 葡萄糖含量DMEM中，培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)，而對(duì)照組細(xì)胞則培養(yǎng)在DMSO。
待24小時(shí)后收集細(xì)胞，遵照操作指南使用細(xì)胞溶解緩沖液(Passive⑧ Lysis Buffer, Promega, WI)制出細(xì)胞溶解液，再使用雙熒光素酶分析組 (Dual-Luciferase Reporter Assay kit, Promega, Madison, WI)評(píng)估，并以冷 光儀(SIRIUS-0 luminometer, Berthold detection systems, Pforzheim, Germany)計(jì)算熒光素酶的活性。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將50 )iL的熒光素酶分析劑 (Luciferase Assay Reagent II， LARII)加入含5 iiL的細(xì)胞溶解產(chǎn)物的試瓶中， 測(cè)量混合液的螢火蟲(chóng)熒光素酶活性，而后加入50 pL的反應(yīng)中止劑(Stop & Glo Reagent)，并測(cè)量混合液的水母熒光素酶活性。分析中使用的DMSO， 最高濃度為0.1。/。，其對(duì)于激活作用的活性沒(méi)有影響。在全部的這些結(jié)果中， 由PPAR配體羅格列酮(2 pM)所活化者視為正反應(yīng)對(duì)照組，激活作用的結(jié) 果以螢火蟲(chóng)熒光素酶訊號(hào)/水母熒光素酶訊號(hào)的比例表示。CE3達(dá)到正反應(yīng)對(duì)照組PPARY最大活化的55.6。/。，而CE3-3達(dá)到正反應(yīng) 對(duì)照組PPARY最大活化的63.415/()。
前脂肪細(xì)胞分化分析(Preadipocyte Differentiation Assay) 在含有10%胎小牛血清、100單位/mL青霉素G、 100 mg/mL硫酸鏈霉 素、及150 nM胰島素的DMEM中，添加或未添加測(cè)試分劃，于37。C且5。/。 C02的潮濕環(huán)境下培養(yǎng)簇集脂肪細(xì)胞3T3-L1細(xì)胞3天。培養(yǎng)基每?jī)商旄鼡Q， 持續(xù)保持細(xì)胞在此狀態(tài)下，直到脂肪細(xì)胞出現(xiàn)為止(約9天)。如TroubaK.J. et al." Toxicol Appl Pharmacol 2000， 168， 25-35所述，以油紅-0 (Oil Red-O， Sigma)染色分化成脂肪細(xì)胞的細(xì)胞。簡(jiǎn)單地講，在10%福爾馬林中至少固 定1小時(shí)，然后浸入油紅-0染色2小時(shí)，再以水徹底沖洗，于32"C下干燥樣 本。
CE3及CE3-3對(duì)于3T3-L1前脂肪細(xì)胞展現(xiàn)出中度成脂分化的活性。 其它實(shí)施例
本發(fā)明已經(jīng)描述出一些實(shí)施例，不過(guò)應(yīng)可了解到在不背離本發(fā)明精神 及范疇的前提下，能夠進(jìn)行各種修改。據(jù)此，其它實(shí)施例也落入本發(fā)明的 權(quán)利要求范疇中。
上述實(shí)施例僅系為了方便說(shuō)明而舉例而已，本發(fā)明所主張的權(quán)利范圍 自應(yīng)以申請(qǐng)專利范圍所述為準(zhǔn)，而非僅限于上述實(shí)施例。
權(quán)利要求
1、一種引藻萃取物，包括肉豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚烯酸、油酸、亞麻油酸、次亞麻油酸、及硬脂酸；其中，該肉豆蔻酸、該棕櫚酸、該棕櫚烯酸、該油酸、該亞麻油酸、該次亞麻油酸、及該硬脂酸的含量分別為萃取物干重的0.1％至5％、10％至60％、2％至15％、2％至15％、2％至15％、0.8％至6％、及0.5％至5％。
2、 如權(quán)利要求l所述的萃取物，其中，該肉豆蔻酸、該棕櫚酸、該棕 櫚烯酸、該油酸、該亞麻油酸、該次亞麻油酸、及該硬脂酸的含量分別為 萃取物干重的0.5%至4%、 15%至50%、 3.5%至12%、 3.5%至12%、 3%至12%、 1.2%至5%、及0.8%至4%。
3、 如權(quán)利要求2所述的萃取物，其中，該肉豆蔻酸、該棕櫚酸、該棕 櫚烯酸、該油酸、該亞麻油酸、該次亞麻油酸、及該硬脂酸的含量分別為 萃取物干重的0.7%至1.7%、 19.2%至43.6%、 4.4%至10.1%、 4.4%至10.0%、 3.9%至8.8%、 1.8%至4.0%、及1.1%至2.6%。
4、 如權(quán)利要求l所述的萃取物，其中，包括十六碳二烯酸、十六碳烯 酸、及十八碳烯酸；其中，該十六碳二烯酸、該十六碳烯酸、及該十八碳 烯酸的含量分別為萃取物干重的0.8%至6%、 1.2%至8%、及1.2%至8%。
5、 如權(quán)利要求4所述的萃取物，其中，該十六碳二烯酸、該十六碳烯 酸、及該十八碳烯酸的含量分別為萃取物干重的1.2%至5%、 2%至7%、及 2%至7%。
6、 如權(quán)利要求4所述的萃取物，其中，該十六碳二烯酸、該十六碳烯 酸、及該十八碳烯酸的含量分別為萃取物干重的1.9%至4.3%、2.6%至6.0%、 及2.6%至5.9%。
7、 如權(quán)利要求2所述的萃取物，其中，包括十六碳二烯酸、十六碳烯酸、及十八碳烯酸；其中，該十六碳二烯酸、該十六碳烯酸、及該十八碳 烯酸的含量分別為萃取物干重的0.8%至6%、 1.2%至8%、及1.2%至8%。
8、 如權(quán)利要求7所述的萃取物，其中，該十六碳二烯酸、該十六碳烯 酸、及該十八碳烯酸的含量分別為萃取物干重的1.2%至5%、 2%至7%、及2%至7%。
9、 如權(quán)利要求8所述的萃取物，其中，該十六碳二烯酸、該十六碳烯 酸、及該十八碳烯酸的含量分別為萃取物干重的1.9%至4.3%、2.6%至6.0%、 及2.6%至5.9%。
10、 如權(quán)利要求3所述的萃取物，其中，包括十六碳二烯酸、十六碳 烯酸、及十八碳烯酸；其中，該十六碳二烯酸、該十六碳烯酸、及該十八 碳烯酸的含量分別為萃取物干重的0.8%至6%、 1.2%至8%、及1.2%至8%。
11、 如權(quán)利要求10所述的萃取物，其中，該十六碳二烯酸、該十六碳 烯酸、及該十八碳烯酸的含量分別為萃取物干重的1.2%至5%、 2%至7%、 及2%至7%。
12、 如權(quán)利要求ll所述的萃取物，其中，該十六碳二烯酸、該十六碳 烯酸、及該十八碳烯酸的含量分別為萃取物干重的1.9%至4.3%、 2.6%至 6.0%、及2.6%至5.9%。
13、 一種醫(yī)藥組成物，其包括權(quán)利要求l所述的萃取物及一醫(yī)藥上可 接受的載體。
14、 如權(quán)利要求13所述的醫(yī)藥組成物，其中，該肉豆蔻酸、該棕櫚酸、 該棕櫚烯酸、該油酸、該亞麻油酸、該次亞麻油酸、及該硬脂酸的含量分 別為萃取物干重的0.5%至4%、 15%至50%、 3.5%至12%、 3.5%至12%、 3% 至12%、 1.2%至5%、及0.8%至4%。
15、 如權(quán)利要求14所述的醫(yī)藥組成物，其中，該肉豆蔻酸、該棕櫚酸、 該棕櫚烯酸、該油酸、該亞麻油酸、該次亞麻油酸、及該硬脂酸的含量分 別為萃取物干重的0.7%至1.7%、 19.2%至43.6%、 4.4%至10.1%、 4.4%至 10.0%、 3.9%至8.8%、 1.8%至4.0%、及1.1%至2,6%。
16、 如權(quán)利要求13所述的醫(yī)藥組成物，其中，該萃取物包括十六碳二 烯酸、十六碳烯酸、及十八碳烯酸，其中，該十六碳二烯酸、該十六碳烯 酸、及該十八碳烯酸的含量分別為萃取物干重的0.8%至6%、 1.2%至8%、 及1.2%至8%。
17、 如權(quán)利要求16所述的醫(yī)藥組成物，其中，該十六碳二烯酸、該十 六碳烯酸、及該十八碳烯酸的含量分別為萃取物干重的1.2%至5%、 2%至 7%、及2%至7%。
18、權(quán)利要求13所述的醫(yī)藥組成物在制備治療糖尿病、肥胖或血脂 異常藥中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明是有關(guān)于一種引藻萃取物，其包含肉豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚烯酸、油酸、亞麻油酸、次亞麻油酸、及硬脂酸。本發(fā)明亦有關(guān)于此萃取物治療糖尿病、肥胖及血脂異常的用途。
文檔編號(hào)A61K36/02GK101444542SQ20081017293
公開(kāi)日2009年6月3日 申請(qǐng)日期2008年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月25日
發(fā)明者周友誠(chéng), 徐祖安, 王順德, 謝興邦, 趙宇生 申請(qǐng)人:國(guó)際綠藻有限公司