本發(fā)明屬于藥物化合物領(lǐng)域,具體地說(shuō),本發(fā)明涉及歐夾竹桃苷的抑制DNA修復(fù)以及降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性的用途。
背景技術(shù):
腫瘤細(xì)胞中常常出現(xiàn)染色體的異常表現(xiàn)和染色體不穩(wěn)定性。目前很多的腫瘤化療和靶向治療藥物都是針對(duì)腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)DNA損傷和基因組不穩(wěn)定性。一直以來(lái),人們都在探索中藥提取物對(duì)腫瘤的治療作用。
DNA雙鏈斷裂是最嚴(yán)重的DNA損傷形式。如果得不到有效的修復(fù),將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。DNA雙鏈斷裂損傷(DNA double-strand breaks,DSBs)修復(fù)主要利用同源重組和非同源性末端接合(Non-homologous end joining,NHEJ)機(jī)制。同源重組在其中起主要作用,通過(guò)利用未受損傷的另一條染色體作為模版,來(lái)修復(fù)與其相似的受損傷的染色體;非同源性末端接合的修復(fù)方式屬于不精確修復(fù),所產(chǎn)生的DNA往往導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定而最終引起細(xì)胞死亡。參與同源重組修復(fù)的基因包括RAD51、RAD54、BRCA1、BRCA2等。RAD51是有絲分裂細(xì)胞中催化DNA同源重組修復(fù)過(guò)程中同源配對(duì)的唯一因子。而XRCC1是非同源末端接合修復(fù)的主要因子。、
因此,本領(lǐng)域迫切需要研發(fā)能夠有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞DNA雙鏈斷裂損傷、腫瘤細(xì)胞凋亡的相關(guān)藥物。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的是提供一種能夠有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞DNA雙鏈斷裂損傷、腫瘤細(xì)胞凋亡的相關(guān)藥物。
在本發(fā)明的第一方面,提供了一種歐夾竹桃苷或其藥用鹽的用途,其特征在于,用于制備(i)用于抑制DNA修復(fù);(ii)用于降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性的組合物或制劑。
在另一優(yōu)選例中,所述的DNA修復(fù)包括同源重組DNA修復(fù)。
在另一優(yōu)選例中,所述的DNA修復(fù)為哺乳動(dòng)物細(xì)胞的DNA修復(fù)。
在另一優(yōu)選例中,所述的組合物包括:藥物組合物、和保健品組合物。
在另一優(yōu)選例中,所述的組合物或制劑的劑型包括:口服劑型、注射劑。
在另一優(yōu)選例中,所述的口服劑型包括:片劑、膠囊、顆粒劑、口服液。
在另一優(yōu)選例中,所述的組合物或制劑還用于選自下組的一種或多種用途:
(a)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞DNA雙鏈斷裂損傷;
(b)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
在另一優(yōu)選例中,所述組合物中含有0.001-99wt%,較佳地0.1-90wt%,更佳地1-80wt%的歐夾竹桃苷或其藥學(xué)上可接受的鹽,按組合物的總重量計(jì)。
在另一優(yōu)選例中,所述的制劑中含有0.001-100wt%,較佳地0.1-99wt%,更佳地1-80wt%的歐夾竹桃苷或其藥學(xué)上可接受的鹽,按制劑的總重量計(jì)。
在本發(fā)明的第二方面,提供一種非治療性的、體外抑制DNA修復(fù)的方法,其特征在于,包括步驟:
(a)將待處理的細(xì)胞與歐夾竹桃苷或其藥學(xué)上可接受的鹽接觸,從而抑制所述細(xì)胞中的DNA修復(fù)。
在另一優(yōu)選例中,所述步驟(a)中,歐夾竹桃苷或其藥學(xué)上可接受的鹽的濃度為0.02ug/ml。
在另一優(yōu)選例中,所述的接觸是在培養(yǎng)液中添加歐夾竹桃苷或其藥學(xué)上可接受的鹽。
在另一優(yōu)選例中,所述的細(xì)胞包括腫瘤細(xì)胞。
在另一優(yōu)選例中,所述的細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
在另一優(yōu)選例中,所述的細(xì)胞包括人細(xì)胞、非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
在本發(fā)明的第三方面,提供一種非治療性的、體外降低腫瘤細(xì)胞耐藥性或耐受性的方法,其特征在于,包括步驟:
(a)將所述的腫瘤細(xì)胞與歐夾竹桃苷或其藥學(xué)上可接受的鹽接觸,從而降低腫瘤細(xì)胞耐藥性或耐受性。
在另一優(yōu)選例中,所述的腫瘤細(xì)胞包括選自下組腫瘤的細(xì)胞:胃癌、肺癌、肝癌、腸癌、卵巢癌、乳腺癌。
在本發(fā)明的第四方面,提供一種抑制DNA修復(fù)和/或降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性的方法,其特征在于,包括步驟:給需要的對(duì)象施用歐夾竹桃苷或其藥用鹽。
在本發(fā)明的第五方面,提供一種用于抑制DNA修復(fù)和/或降低腫瘤細(xì)胞的藥物組合物,其特征在于,含有(A)歐夾竹桃苷或其藥用鹽;(B)藥學(xué)上可接受的載體;(C)任選的額外的抗腫瘤藥物。
在另一優(yōu)選例中,所述的“額外的抗腫瘤藥物”包括:抗體、索拉菲尼、順鉑、或其組合。
在另一優(yōu)選例中,所述的腫瘤包括:胃癌、肺癌、肝癌、腸癌、卵巢癌、乳腺癌。
應(yīng)理解,在本發(fā)明范圍內(nèi)中,本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合,從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附圖說(shuō)明
圖1顯示了歐夾竹桃苷能夠有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
圖2顯示了歐夾竹桃苷能夠?qū)е履[瘤細(xì)胞DNA單鏈相關(guān)蛋白R(shí)PA表達(dá)增加,DNA雙鏈斷裂損傷蛋白γH2AX(DNA雙鏈斷裂標(biāo)記物)表達(dá)增加。
圖3顯示了歐夾竹桃苷能夠誘導(dǎo)DNA同源重組修復(fù)蛋白R(shí)ad51表達(dá)降低,并促使DNA單鏈損傷修復(fù)蛋白XRCC1表達(dá)增加。
圖4顯示了歐夾竹桃苷抑制HBE細(xì)胞同源重組修復(fù)通路蛋白R(shí)ad51表達(dá)。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明人通過(guò)廣泛而深入的研究,首次意外地發(fā)現(xiàn),本領(lǐng)域中常用作強(qiáng)心苷的歐夾竹桃苷居然能夠非常有效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞DNA雙鏈斷裂損傷、腫瘤細(xì)胞凋亡?;谏鲜霭l(fā)現(xiàn),發(fā)明人完成了本發(fā)明。
在描述本發(fā)明之前,應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所述的具體方法和實(shí)驗(yàn)條件,因?yàn)檫@類方法和條件可以變動(dòng),還應(yīng)當(dāng)理解本文所用的術(shù)語(yǔ)其目的僅在于描述具體實(shí)施方案,并且不意圖是限制性的,本發(fā)明的范圍將僅由所附的權(quán)利要求書限制。
除非另外定義,否則本文中所用的全部技術(shù)與科學(xué)術(shù)語(yǔ)均具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。如本文所用,在提到具體列舉的數(shù)值中使用時(shí),術(shù)語(yǔ)“約”意指該值可以從列舉的值變動(dòng)不多于1%。例如, 如本文所用,表述“約100”包括99和101和之間的全部值(例如,99.1、99.2、99.3、99.4等)。
雖然在本發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試中可以使用與本發(fā)明中所述相似或等價(jià)的任何方法和材料,本文在此處例舉優(yōu)選的方法和材料。
術(shù)語(yǔ)定義
歐夾竹桃苷
歐夾竹桃苷(Oleandrin)(C32H48O9;MW 576.3)是從中草藥夾竹桃中分離、提取出來(lái)的一種單體化合物,結(jié)構(gòu)式如下:
它是夾竹桃的主要活性成分,具有較強(qiáng)的強(qiáng)心苷活性。
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)表明,歐夾竹桃苷具有抑制同源重組DNA修復(fù)的作用。
(1)歐夾竹桃苷可以作為同源重組修復(fù)的抑制劑;
(2)在某些腫瘤細(xì)胞中,由于其他DNA修復(fù)基因的突變,同源重組DNA修復(fù)方式成為這些腫瘤細(xì)胞賴以生存的信號(hào)通路,歐夾竹桃苷可以作為這一類腫瘤的靶向抗癌藥物;
(3)同源重組DNA修復(fù)幾乎是所有化療與放療耐藥或耐受的重要原因之一,歐夾竹桃苷可以與其他放療藥物共用,或與化療協(xié)同作用治療腫瘤。
組合物和施用方法
本發(fā)明還提供了一種含有歐夾竹桃苷作為活性成分的用于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞DNA雙鏈斷裂損傷、腫瘤細(xì)胞凋亡的組合物。所述的組合物包括(但并不限于):藥物組合物、食品組合物、膳食補(bǔ)充劑、飲料組合物等。
在本發(fā)明中,歐夾竹桃苷可直接用于疾病治療,例如,用于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞DNA雙鏈斷裂損傷、腫瘤細(xì)胞凋亡的治療。在使用本發(fā)明歐夾竹桃苷時(shí),還可同 時(shí)使用其他治療劑。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物,它含有安全有效量的本發(fā)明歐夾竹桃苷以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于):鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、粉劑、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式,例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物,可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無(wú)菌條件下制造。本發(fā)明的藥物組合也可以被制成粉劑用于霧化吸入?;钚猿煞值慕o藥量是治療有效量,例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外,本發(fā)明歐夾竹桃苷還可與其他治療劑一起使用。
“藥學(xué)上可以接受的載體”指的是:一種或多種相容性固體或液體填料或凝膠物質(zhì),它們適合于人使用,而且必須有足夠的純度和足夠低的毒性。“相容性”在此指的是組合物中各組份能和本發(fā)明的化合物以及它們之間相互摻和,而不明顯降低化合物的藥效。藥學(xué)上可以接受的載體部分例子有纖維素及其衍生物(如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素鈉、纖維素乙酸酯等)、明膠、滑石、固體潤(rùn)滑劑(如硬脂酸、硬脂酸鎂)、硫酸鈣、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄欖油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化劑(如吐溫)、潤(rùn)濕劑(如十二烷基硫酸鈉)、著色劑、調(diào)味劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、防腐劑、無(wú)熱原水等。
對(duì)于本發(fā)明的藥物組合物,可通過(guò)常規(guī)的方式施用于所需的對(duì)象(如人和非人哺乳動(dòng)物)。本發(fā)明化合物或藥物組合物的施用方式?jīng)]有特別限制,代表性的施用方式包括(但并不限于):口服、瘤內(nèi)、直腸、腸胃外(靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下)、和局部給藥,優(yōu)選的給藥方式為口服給藥。
用于口服給藥的固體劑型包括膠囊劑、片劑、丸劑、散劑和顆粒劑。在這些固體劑型中,活性化合物與至少一種常規(guī)惰性賦形劑(或載體)混合,如檸檬酸鈉或磷酸二鈣,或與下述成分混合:(a)填料或增容劑,例如,淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸;(b)粘合劑,例如,羥甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯膠;(c)保濕劑,例如,甘油;(d)崩解劑,例如,瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些復(fù)合硅酸鹽、和碳酸鈉;(e)緩溶劑,例如石蠟;(f)吸收加速劑,例如,季胺化合物;(g)潤(rùn) 濕劑,例如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油酯;(h)吸附劑,例如,高嶺土;和(i)潤(rùn)滑劑,例如,滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉,或其混合物。膠囊劑、片劑和丸劑中,劑型也可包含緩沖劑。
固體劑型如片劑、糖丸、膠囊劑、丸劑和顆粒劑可采用包衣和殼材制備,如腸衣和其它本領(lǐng)域公知的材料。它們可包含不透明劑,并且,這種組合物中活性化合物或化合物的釋放可以延遲的方式在消化道內(nèi)的某一部分中釋放??刹捎玫陌窠M分的實(shí)例是聚合物質(zhì)和蠟類物質(zhì)。必要時(shí),活性化合物也可與上述賦形劑中的一種或多種形成微膠囊形式。
用于口服給藥的液體劑型包括藥學(xué)上可接受的乳液、溶液、懸浮液、糖漿或酊劑。除了活性化合物外,液體劑型可包含本領(lǐng)域中常規(guī)采用的惰性稀釋劑,如水或其它溶劑,增溶劑和乳化劑,例知,乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油,特別是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油或這些物質(zhì)的混合物等。
除了這些惰性稀釋劑外,組合物也可包含助劑,如潤(rùn)濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、矯味劑和香料。
除了活性化合物外,懸浮液可包含懸浮劑,例如,乙氧基化異十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脫水山梨醇酯、微晶纖維素、甲醇鋁和瓊脂或這些物質(zhì)的混合物等。
用于腸胃外注射的組合物可包含生理上可接受的無(wú)菌含水或無(wú)水溶液、分散液、懸浮液或乳液,和用于重新溶解成無(wú)菌的可注射溶液或分散液的無(wú)菌粉末。適宜的含水和非水載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑包括水、乙醇、多元醇及其適宜的混合物。
用于局部給藥的本發(fā)明化合物的劑型包括軟膏劑、散劑、貼劑、噴射劑和吸入劑?;钚猿煞衷跓o(wú)菌條件下與生理上可接受的載體及任何防腐劑、緩沖劑,或必要時(shí)可能需要的推進(jìn)劑一起混合。
使用藥物組合物時(shí),是將安全有效量的歐夾竹桃苷施用于哺乳動(dòng)物,其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重,而且在大多數(shù)情況下不超過(guò)約8毫克/千克體重,較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然,具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素,這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括:
歐苷夾竹桃可以顯著抑制DNA修復(fù)和/或降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性。
(1)歐夾竹桃苷可以作為同源重組修復(fù)的抑制劑;
(2)在某些腫瘤細(xì)胞中,由于其他DNA修復(fù)基因的突變,同源重組DNA修復(fù)方式成為這些腫瘤細(xì)胞賴以生存的信號(hào)通路,歐夾竹桃苷可以作為這一類腫瘤的靶向抗癌藥物;
(3)同源重組DNA修復(fù)幾乎是所有化療與放療耐藥或耐受的重要原因之一,歐夾竹桃苷可以與其他放療藥物共用,或與化療協(xié)同作用治療腫瘤。
下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步陳述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明詳細(xì)條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明,否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。以下實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料和試劑如無(wú)特別說(shuō)明均可從市售渠道獲得。
實(shí)施例歐夾竹桃苷對(duì)于腫瘤細(xì)胞的處理實(shí)驗(yàn)
細(xì)胞培養(yǎng):
人體細(xì)支氣管肺泡癌細(xì)胞A549細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海分院)在37℃下培養(yǎng)在含有10%牛胎兒血清的細(xì)胞培養(yǎng)基/高葡萄糖(胰蛋白酶),且在含5%二氧化碳的氣氛下。奧拉帕尼購(gòu)自Selleck Chemicals公司。
歐夾竹桃苷溶解在DMSO中,初始濃度為5ug/ml,隨后稀釋至所需的濃度。
A549細(xì)胞分成三份,放置在六孔板過(guò)夜。
1.流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡率
(1)用不同濃度歐夾竹桃苷(0.01ug/ml,0.02ug/ml,0.04ug/ml,006ug/ml)干預(yù)A549(人支氣管上皮肺癌細(xì)胞系)24小時(shí),用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;
(2)用0.02ug/ml的歐夾竹桃苷干預(yù)A549細(xì)胞(6h,12h,18h,24h),用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
2.免疫熒光法檢測(cè)DNA損傷
用0.02ug/ml的歐夾竹桃苷干預(yù)A549細(xì)胞24h,用免疫熒光法觀察并統(tǒng)計(jì)分析DNA損傷蛋白R(shí)PA(DNA單鏈相關(guān)蛋白)、γH2AX(DNA雙鏈斷裂標(biāo)記物)的表達(dá)情況。
3.Western blot檢測(cè)腫瘤細(xì)胞DNA損傷修復(fù)
用歐夾竹桃苷干預(yù)A549細(xì)胞24h,Western blot檢測(cè)DNA損傷修復(fù)蛋白R(shí)ad51(同源重組修復(fù))、XRCC1(單鏈損傷修復(fù))表達(dá)情況。
4.Western blot檢測(cè)Oleandrin抑制同源重組修復(fù)通路
用歐夾竹桃苷干預(yù)HBE(人正常支氣管上皮細(xì)胞系)24h,Western blot檢測(cè)同源重組修復(fù)蛋白R(shí)ad51表達(dá)情況。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
1.歐夾竹桃苷能夠有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡(圖1);
2.歐夾竹桃苷能夠?qū)е履[瘤細(xì)胞DNA單鏈相關(guān)蛋白R(shí)PA表達(dá)增加,DNA雙鏈斷裂損傷蛋白γH2AX(DNA雙鏈斷裂標(biāo)記物)表達(dá)增加(圖2);
3.歐夾竹桃苷能夠誘導(dǎo)DNA同源重組修復(fù)蛋白R(shí)ad51表達(dá)降低,并促使DNA單鏈損傷修復(fù)蛋白XRCC1表達(dá)增加(圖3)。
4.歐夾竹桃苷抑制HBE細(xì)胞同源重組修復(fù)通路蛋白R(shí)AD51表達(dá)(圖4)。
結(jié)論:
歐夾竹桃苷能夠有效的抑制同源重組信號(hào)通路,并成為一種新的同源重組抑制劑。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考,就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解,在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改,這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。