本發(fā)明涉及一種天然萜類復(fù)合酯，尤其是涉及這種萜類復(fù)合酯在制備治療脂肪肝、肝硬化和腎臟疾病藥物中的用途。

背景技術(shù)：

Feroline的分子式為C₂₂H₃₀O₄，結(jié)構(gòu)式如下：

Feroline是從傘形科阿魏屬植物(Ferula genus)中提取出來的一種萜類復(fù)合酯，具有雌激素活性。迄今為止未有任何報道其藥用功能。

非酒精性脂肪肝是一種無過量飲酒史，由各種原因引起的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變性和脂質(zhì)蓄積為主要特征的臨床病理綜合征，被認(rèn)為是代謝綜合征在肝臟的一種病理表現(xiàn)。非酒精性脂肪性肝病會導(dǎo)致或增加很多重大疾病的風(fēng)險，包括心血管疾病、腎臟疾病、二型糖尿病、肝癌等，而且是肝臟移植手術(shù)失敗的普遍原因之一，因此非酒精性脂肪性肝病應(yīng)引起人們的足夠重視。

脂肪肝是肝臟中過多積累脂肪導(dǎo)致的一種肝病。過多脂肪長期積蓄于肝臟，將影響肝臟血液和氧的供應(yīng)及肝臟自身代謝，會逐漸造成大量肝臟細(xì)胞腫脹、炎癥浸潤及變性壞死，一旦有纖維增生及假小葉形成，就會成為肝硬化，大大增加患肝癌的危險。

慢性腎臟疾病是糖尿病的并發(fā)癥之一。腎臟為排泄尿素的主要器官，尿素從腎小球濾過后在各段小管均可重吸收，腎小管內(nèi)尿流速越快，重吸收就越少。當(dāng)腎功能損害時，腎小球濾過率下降，濾過率下降到正常的50％以下時，血尿素氮的濃度迅速升高。各種腎實質(zhì)性病變，如腎小球腎炎、間質(zhì)性腎炎、急慢性腎功能衰竭、腎內(nèi)占位性和破壞性病變均可使血尿素氮增高。因此，血尿素氮是腎功能主要指標(biāo)之一。血尿素氮升高也可作為尿毒癥診斷指標(biāo)之一。腎臟在人體的代謝過程中起著重要作用，慢性腎臟疾病以其低知曉率、高發(fā)病率、高 死亡率而被稱作是“沉默的殺手”。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示：我國慢性腎病的社區(qū)發(fā)病率高達(dá)11％(北京、廣東、上海等城市已接近歐美慢性腎病發(fā)病水平)。我國現(xiàn)在的尿毒癥患者數(shù)目也在不斷上升。慢性腎病嚴(yán)重威脅著人類的生命健康，腎病已成為威脅全世界公共健康的主要疾病之一，因此發(fā)現(xiàn)治療腎臟疾病的有效藥物已成為全球性的課題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種萜類復(fù)合酯Feroline在制備治療脂肪肝、肝硬化和腎臟疾病藥物中的用途。

所述萜類復(fù)合酯Feroline的分子式為C₂₂H₃₀O₄，結(jié)構(gòu)式如下：

實驗表明，化合物Feroline可在制備治療脂肪肝、肝硬化和腎臟疾病藥物中應(yīng)用。

所述脂肪肝包括但不限于非酒精性脂肪肝和/或具有肝臟組織脂肪異常積累癥狀的非酒精性脂肪肝。

所述肝硬化可以包括但不限于具有肝臟膠原過度沉積和肝纖維化表現(xiàn)的肝硬化。

所述腎臟疾病包括但不限于具有異常升高的血尿素氮癥狀的腎臟疾病、腎實質(zhì)性病變、尿毒癥。

所述腎實質(zhì)性病變包括但不限于腎小球腎炎、間質(zhì)性腎炎、急慢性腎功能衰竭、腎內(nèi)占位性和破壞性病變。

實驗表明，化合物Feroline可在制備保護(hù)腎臟功能保健品中應(yīng)用。

實驗表明，萜類復(fù)合酯Feroline作為活性組份與其它藥物、制藥中可以接受的輔料組合成Feroline藥物組合物。所述藥物組合物包含所述萜類復(fù)合酯Feroline自身和其給藥可用的鹽、給藥載體、其它治療劑?！敖o藥載體”一詞指可與本發(fā)明化合物一起用于病人且不破壞其藥理學(xué)活性的無毒藥物載體。上述藥物組合物中的可用給藥載體包括但不限于：離子交換劑，氧化鋁，硬脂酸鋁，卵磷脂，血清蛋白如人血清白蛋白，緩沖介質(zhì)如磷酸鹽，甘氨酸，山梨酸，山梨酸鉀，飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，鹽或電解質(zhì)如硫酸魚精蛋白，磷酸氫二鈉，磷酸氫鉀，氯化鈉，鋅鹽，膠體二氧化硅，三硅酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮，纖維素 制劑，聚乙二醇，羧甲基纖維素鈉，聚丙烯酸酯，蠟，聚乙烯‐聚氧丙烯嵌段聚合物，羊毛脂和自乳化藥物遞送系統(tǒng)如α生育酚、聚乙二醇1000琥珀酸酯，或其它類似的聚合物遞送模式。

所述治療脂肪肝和腎臟疾病藥物可采用口服型制劑、注射型制劑等；所述口服型制劑可采用片劑、丸劑、膠囊、沖劑或糖漿等；所述注射型制劑可采用注射液或凍干粉針劑型等。

實驗表明，F(xiàn)eroline在治療非酒精性脂肪肝中的效果，利用糖尿病肥胖癥模型小鼠db/db小鼠，腹腔注射Feroline 11天后，檢測肝臟中甘油三酯的含量；對肝臟進(jìn)行石蠟包埋、切片和蘇木精/伊紅(HE)染色，檢測肝臟細(xì)胞脂肪泡的情況；對肝臟冰凍切片和油紅染色，檢測肝臟中脂肪的積累情況；以及利用實時熒光定量PCR檢測甘油三酯合成相關(guān)的基因表達(dá)水平。結(jié)果表明，相比空白對照，F(xiàn)eroline處理的小鼠肝臟中甘油三酯的積累顯著降低。表明Feroline在非酒精性脂肪肝病中具有良好療效。

實驗證明，F(xiàn)eroline能下調(diào)肝臟中肝纖維化的標(biāo)志基因的表達(dá)，能有效消除肝臟中膠原的積累，表明Feroline對肝硬化的治療功能。

實驗表明，F(xiàn)eroline在腎臟疾病治療方面的作用，由于慢性腎臟疾病是糖尿病的并發(fā)癥之一，因此本發(fā)明采用糖尿病模型小鼠為研究對象，用Feroline處理小鼠后發(fā)現(xiàn)小鼠的血尿素氮水平顯著低于空白對照組，表明Feroline在腎臟疾病中的功能。

Feroline是一種天然產(chǎn)物，迄今為止沒有任何有關(guān)其在制藥方面的報道。因此本發(fā)明證實Feroline在非酒精性脂肪肝病和肝硬化疾病中具有治療新功能，并且對腎病也有預(yù)防和治療效果。

Feroline是從傘形科阿魏屬植物(Ferula genus)中提取出來的天然產(chǎn)物，已經(jīng)是商業(yè)化的產(chǎn)品，容易獲得藥物原材料。非酒精性脂肪肝病、肝硬化疾病和慢性腎臟疾病是影響人類健康和生命的重大疾病，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)這種已經(jīng)商業(yè)化的化合物Feroline在制備治療這些疾病方面的實用功能，具有重要的社會價值和巨大的經(jīng)濟(jì)價值。

附圖說明

圖1為Feroline能下調(diào)小鼠肝臟組織中甘油三酯的水平。

圖2為小鼠肝臟切片HE染色表明Feroline能減少肝臟中脂肪泡的量。

圖3為小鼠肝臟切片油紅染色表明Feroline能下調(diào)肝臟中脂肪的含量。

圖4為Feroline能下調(diào)小鼠肝臟組織中脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)水平。

圖5為Feroline能下調(diào)小鼠血尿素氮水平。

圖6為Masson染色顯示Feroline能減少小鼠肝臟膠原沉積。

圖7為天狼星紅染色顯示Feroline能減少小鼠肝臟膠原纖維。

圖8為Feroline能下調(diào)肝臟中肝纖維化標(biāo)志基因的表達(dá)。

在圖1、4、5和圖8中，*表示p<0.05，***表示p<0.001。

具體實施方式

實施例一、Feroline在治療非酒精性脂肪肝病的作用

試驗方法：

db/db小鼠(品系名稱BKS.Cg‐Dock7^m+/+Lepr^db/Jnju)是一種Ⅱ型糖尿病模型，動物在一個月時開始貪食及發(fā)胖，繼而產(chǎn)生高血糖、高血胰島素等癥狀，該特征與肥胖癥和Ⅱ型糖尿病的特點極為相似。脂肪肝是糖尿病患者的并發(fā)癥之一，因此該db/db小鼠適合用于脂肪肝的研究。本實施例用8～10周齡的db/db小鼠，在廈門大學(xué)實驗動物中心SPF級別動物房常規(guī)喂養(yǎng)，自由飲水。Feroline用DMSO高濃度溶解，再用40％HBC(2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin)配置成工作濃度，使DMSO濃度為10％，并且使腹腔注射100μl Feroline溶液最終工作濃度分別為10mg/kg(藥物/小鼠體重)。空白對照組直接用等量的DMSO稀釋在40％HBC溶液。每天上午9點注射，每日一次，注射11天后，禁食6h后處死小鼠。取部分肝臟組織用多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色。取部分組織冰凍切片，用于油紅染色。部分肝臟組織液氮凍存，用于檢測組織中甘油三酯的水平。部分組織用于提取RNA進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)，檢測肝臟組織中相關(guān)基因的表達(dá)。

具體實驗方法：

1.肝臟組織中甘油三酯的檢測利用北京普利萊基因技術(shù)有限公司的組織細(xì)胞甘油三酯酶法測定試劑盒(E1013)，按照說明書進(jìn)行。

2.HE染色：取適當(dāng)大小的肝臟組織浸泡在10％福爾馬林固定，按常規(guī)方法進(jìn)行包埋石蠟，切出厚度5μm的切片，常規(guī)HE方法染色。

3.油紅染色：肝臟組織在異戊烷中，在液氮中快速冷凍，嵌入最佳切削溫度，在低溫恒溫器上切削。

試劑配制：

油紅原液：油紅O 0.5g，異丙醇(含量98％以上)100ml，24h 60℃烘箱中，充分溶解后作為儲存液。臨用時取染色原液6ml，加蒸餾水4ml，稀釋，靜置5～10min后過濾，此液保存不能超過1～2h。

染色方法：

(1)冰凍切片10μm厚，10％多聚甲醛固定10～15min后進(jìn)行水洗；

(2)置于密封容器盛裝的油紅染液5h；

(3)用60％乙醇分色，浸泡切片至細(xì)胞質(zhì)為紅色，底色呈白色為止；

(4)水洗，37℃5min；

(5)蘇木精染核10～20s；水或1％磷酸氫二甲沖洗變藍(lán)；

(6)甘油混水封片。結(jié)果判斷：脂肪呈紅色，胞核呈藍(lán)色。

4.實時熒光定量PCR：Trizol試劑提取肝臟組織RNA，Takara公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，用天根生化科技有限公司的RealMasterMix(SYBR Green I)試劑盒進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)，Bio-rad公司的CFX96熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)。

所有實施例中對照組與藥物處理組之間的差異用student’s t‐test來分析。

試驗結(jié)果：相比空白對照，F(xiàn)eroline處理的db/db小鼠肝臟組織中甘油三酯水平明顯下調(diào)(圖1)。HE染色結(jié)果表明，對照組中肝臟細(xì)胞出現(xiàn)明顯的脂肪空泡，而Feroline處理的小鼠肝臟細(xì)胞中無脂肪泡形成(圖2)。

油紅O為脂溶性染料，在脂肪內(nèi)能高度溶解，可特異性的使組織內(nèi)甘油三酯等中性脂肪著色。在日常病理診斷和科研工作中，顯示組織內(nèi)的脂肪常采用油紅O進(jìn)行染色。為了進(jìn)一步證明肝臟切片HE染色的圖片中的空泡就是甘油三酯的聚集，又用油紅染色對肝臟切片進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，對照組的肝臟切片中顯示有眾多大滴的油脂顆粒，而Feroline處理的小鼠肝臟切片中的細(xì)胞的油滴顆粒顯著小于對照組，表明其脂肪含量顯著少于對照組(圖3)，該結(jié)果與圖1用甘油三酯檢測試劑盒檢測的結(jié)果一致。肝臟組織中甘油三酯合成相關(guān)基因的表達(dá)水平表明，F(xiàn)eroline下調(diào)了肝臟中SREBP-1c和CHREBP這兩個在甘油三酯合成過程中的關(guān)鍵基因的表達(dá)水平。

結(jié)論：Feroline在非酒精性脂肪肝病方面具有良好療效。

Feroline能下調(diào)小鼠肝臟組織中脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)水平參見圖4。

實施例二、Feroline在治療腎臟疾病中的作用

試驗方法：腎臟為排泄尿素的主要器官，尿素從腎小球濾過后在各段小管均可重吸收，腎小管內(nèi)尿流速越快，重吸收就越少。當(dāng)腎功能損害時，腎小球濾過率下降，濾過率下降到正常的50％以下時，血尿素氮的濃度迅速升高。各種腎實質(zhì)性病變，如腎小球腎炎、間質(zhì)性腎炎、急慢性腎功能衰竭、腎內(nèi)占位性和破壞性病變均可使血尿素氮增高。因此，血尿素氮是腎功能主要指標(biāo)之一。血尿素氮升高也可作為尿毒癥診斷指標(biāo)之一。

慢性腎臟疾病是糖尿病的并發(fā)癥之一。本實施例用8～10周齡的db/db小鼠，在廈門大學(xué) 實驗動物中心SPF級別動物房，用高脂飼料喂養(yǎng)，自由飲水。按實施例一所述方法處理小鼠，同樣劑量和方式注射Feroline 7天，禁食6h后處死小鼠。眼球取學(xué)，制備血清，用南京建成科技有限公司的尿素氮(BUN)測試盒(脲酶法，C013-2)按說明書測血清中尿素氮的水平。

試驗結(jié)果：相比空白對照組，F(xiàn)eroline處理的小鼠血尿素氮的水平顯著下調(diào)(p<0.001)(圖5)。

結(jié)論：Feroline在出現(xiàn)血尿素氮水平升高的各種腎實質(zhì)性病變，如腎小球腎炎、間質(zhì)性腎炎、急慢性腎功能衰竭、腎內(nèi)占位性和破壞性病變，以及尿毒癥等腎臟疾病中具有療效。

實施例三:Feroline對肝硬化的功效。

試驗方法：脂肪肝是肝臟中過多積累脂肪導(dǎo)致的一種肝病。過多脂肪長期積蓄于肝臟，將影響肝臟血液和氧的供應(yīng)及肝臟自身代謝，會逐漸造成大量肝臟細(xì)胞腫脹、炎癥浸潤及變性壞死，一旦有纖維增生及假小葉形成，就會成為肝硬化，大大增加患肝癌的危險。肝硬化患者肝臟組織中各種膠原含量都有增加，Ⅰ型膠原纖維增多，參與結(jié)締組織的形成。隨著肝硬化程度的發(fā)展惡化，Ⅰ型膠原沉積越來越多，Ⅰ型膠原與其它類型膠原的比率越來越大。因此本實施例通過Masson氏染色法和天狼星紅染色法鑒定Feroline處理是否能減輕肝臟有脂肪過量積累的小鼠肝臟組織中膠原沉積的癥狀，并通過熒光定量PCR方法檢測膠原蛋白的表達(dá)水平。

方法一：

Masson氏染色法師用于顯示組織中纖維的染色方法之一，是膠原纖維染色權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。Masson氏染色方法是根據(jù)不同組織和細(xì)胞的空隙和大小不同，因而組織的滲透性不同，其中膠原纖維相對來說結(jié)構(gòu)疏松，滲透性高，能讓苯胺藍(lán)(藍(lán)色)這種大分子的染料進(jìn)入著色，而組織中紅細(xì)胞、肌纖維部分的空隙較小，因而苯胺藍(lán)不能進(jìn)入著色。該方法能區(qū)分組織中膠原纖維的存在和積累程度。廣泛用于結(jié)締組織、肌肉組織和膠原蛋白的研究等。本染色方法操作簡捷，性能穩(wěn)定，顯色清晰。

本實施例采用南京建成科技有限公司的快速M(fèi)asson染液試劑盒(貨號D026)，按照該試劑盒說明書，對實施例一中處理的小鼠肝臟進(jìn)行Masson染色，染色結(jié)果為：膠原纖維呈藍(lán)色，胞漿、肌肉、纖維素、神經(jīng)膠質(zhì)呈紅色，胞核藍(lán)紫色。

方法二：

已知膠原有四型(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)區(qū)分并定量這四種膠原纖維，對于研究病變的發(fā)生機(jī)理和演變過程有一定的意義。利用膠原蛋白聚合及其纏繞螺旋排列不同的特點，使用天狼星紅苦(Sirius Red)味酸染色法，在偏振光顯微鏡下，可以根據(jù)雙折光性和著色的不同， 分別顯示出四型膠原纖維。

具體方法如下：

飽和苦味酸配置：加入純凈水進(jìn)苦味酸粉末中,自行溶解兩日，仍然有沉淀的話即為飽和溶液。天狼星紅飽和苦昧酸：0.1g Sirius Red，溶于100ml飽和苦味酸溶液。

染色步驟：中性甲醛液固定組織，石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。蘇木素染1min，蒸餾水洗3次。天狼星紅飽和苦昧酸濃染15-30min，無水乙醇直接分化與脫水。二甲苯透明，中性樹膠封固。

染色結(jié)果：染色封固后的切片，須及時用偏光顯微鏡進(jìn)行觀察和照相已保持鮮艷的色彩。在偏光顯微鏡下可以觀察到四種類型的膠原纖維。l型膠原纖維：緊密排列，顯示很強(qiáng)的雙折光性，呈黃色或紅色的纖維。ll型膠原纖維：顯示弱的雙折光，呈多種色彩的疏松網(wǎng)狀分布。皿型膠原纖維：顯示弱的雙折光，呈綠色的細(xì)纖維。lV型膠原纖維：顯示弱的雙折光的基膜，呈淡黃色。

本實施例又采用天狼星紅染色方法對對實施例一中處理的小鼠肝臟組織中的膠原纖維進(jìn)行了染色檢測。

方法三：

實時熒光定量PCR：將實施例一中小鼠部分肝臟組織液氮凍存，Trizol試劑提取肝臟組織RNA，Takara公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，用天根生化科技有限公司的RealMasterMix(SYBR Green I)試劑盒進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)，Bio-rad公司的CFX96熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)。檢測肝臟組織中膠原蛋白和肝纖維化相關(guān)基因的表達(dá)。

試驗結(jié)果：如圖6所示，在Masson染色結(jié)果中可以看出，對照組的肝臟切片中，可以看到明顯的著色藍(lán)色的膠原蛋白沉積，F(xiàn)eroline處理的小鼠肝臟切片中則無明顯的膠原沉積藍(lán)色表現(xiàn)。在天狼星紅染色結(jié)果與Masson染色結(jié)果一致(如圖7)，對照組的肝臟切片中可以看到明顯的紅色的膠原纖維，而Feroline處理的小鼠肝臟切片中則無明顯的膠原沉積紅色。熒光定量PCR結(jié)果顯示(如圖8)，肝纖維化的標(biāo)志基因α1(I)collagen、α2(I)collagen、α-SMA和MMP2基因在Feroline處理的小鼠肝臟中的表達(dá)水平明顯低于對照組。

結(jié)論：Feroline能有效消除肝臟中膠原的積累和肝纖維化，從而制止肝硬化的發(fā)生。