黑蟻中大環(huán)內酯倍半萜骨架化合物的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種黑蟻中大環(huán)內酯倍半萜骨架化合物的提取方法，黑蟻原材料先經二氯甲烷溶劑室溫冷浸提取后得到黑蟻濾渣，再將黑蟻濾渣采用質量百分比為60?80%甲醇溶液室溫冷浸提取，提取后的甲醇濃縮液經冷凍干燥處理得甲醇浸膏，然后甲醇浸膏先后經過乙酸乙酯溶液、石油醚?乙酸乙酯混合溶液洗脫后，得到的餾分經進一步分離純化最終提取出2個化合物，即大環(huán)內酯倍半萜骨架化合物。本發(fā)明采用70%的甲醇溶液浸漬提取，能夠使大環(huán)內酯倍半萜骨架的化合物高度富集后盡可能多的提取出來，并能有效分離得到單體化合物。
【專利說明】
黑蟻中大環(huán)內酯倍半萜骨架化合物的提取方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于天然產物提取技術領域，具體涉及一種黑蟻中大環(huán)內酯倍半萜骨架化 合物的提取方法。
【背景技術】
[0002] 黑蟻(Polyrhachzs vzczna Roger)是節(jié)肢動物門、昆蟲綱、缺翅目、蟻科多刺蟻屬 的昆蟲，是一種及其遠古的社會性昆蟲，是經過國家衛(wèi)生部門批準許可的唯一有作為藥用 及食用雙重價值的藥品，據文獻記載，黑蟻作為一種常見的中藥具有補腎精，壯腎陽，益精， 強腰膝的功效。臨床上主治腎虛勞損，腰膝酸痛，耳聾耳鳴，陽痿，遺精，早泄，宮冷不孕，帶 下清稀等疾病。該研究的文獻相關報道有鄭巍等人從擬黑多刺蟻的三氯甲烷中分離純化得 到化合物谷甾醇、甘油、十八烷酸單甘油酯、、十八烷酸、十八碳烯酸（油酸）、十八碳烯酸 單甘油酯、棕櫚酸等化合物。中國科學院昆明植物所程永現研究員通過對食用黑蟻的研究， 先后從其90%乙醇提取物中分離純化出了 13個含氮非肽化合物和6個新的多巴胺衍生物。進 而主要研究了這些化合物作為R0CK1/2抑制劑、神經干細胞增殖刺激劑、免疫抑制劑和抗炎 作用的功能等方面的研究，為黑蟻在中醫(yī)藥的臨床應用提供了科學依據。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種黑蟻中大環(huán)內酯倍半萜骨架化合物的提取方法，該方法 是在活性指導下的有效分離，本發(fā)明采用70%的甲醇溶液浸漬提取，能夠使大環(huán)內酯倍半萜 骨架的化合物高度富集后盡可能多的提取出來，并能有效分離得到單體化合物。
[0004] 本發(fā)明所采用的技術方案是：黑蟻中大環(huán)內酯倍半萜骨架化合物的提取方法，黑 蟻原材料先經二氯甲烷溶劑室溫冷浸提取后得到黑蟻濾渣，再將黑蟻濾渣采用質量百分比 為60-80%甲醇溶液室溫冷浸提取，提取后的甲醇濃縮液經冷凍干燥處理得甲醇浸膏，然后 甲醇浸膏先后經過乙酸乙酯溶液、石油醚-乙酸乙酯混合溶液洗脫后，得到的餾分經進一步 分離純化最終提取出2個化合物，即大環(huán)內酯倍半萜骨架化合物。
[0005] 作為本發(fā)明一種黑蟻中大環(huán)內酯倍半萜骨架化合物的提取方法的進一步優(yōu)化，所 述方法包括以下步驟： 步驟一、取黑蟻原材料，清洗干凈后放入45_50°C烘箱中鼓風干燥至恒重，粉碎，得到黑 蟻粉末，備用； 步驟二、將步驟一得到的黑蟻粉末用其重量5-10倍的二氯甲烷溶劑室溫冷浸，48-50h 后過濾，將黑蟻殘渣濾出后再次加入黑蟻殘渣重量5-10倍的二氯甲烷重復提取，過濾，分別 收集濾液和濾渣，濾渣經過干燥，得到黑蟻濾渣粉，備用； 步驟三、將步驟二得到的黑蟻濾渣粉放置通風處風干，加入質量百分比為60-80 %的甲 醇溶液室溫冷浸提取48-50h后過濾，收集濾液，濾出的黑蟻渣粉再次加入質量百分比為60-80 %甲醇溶液室溫冷浸提取，重復上述操作若干次，合并濾液，減壓下除去溶劑后得到黑蟻 60-80 %甲醇濃縮液;然后將濃縮液置于-10-20°C冰箱中冷凍至結冰狀，取出再放置于冷凍 干燥儀中，調至-40°C下冷凍干燥處理，得到黑蟻的60-80%甲醇浸膏，甲醇浸膏密封后放置 于-80°C冰箱中，備用； 步驟四、將步驟三得到的甲醇浸膏用甲醇溶劑充分溶解后，采用柱色譜法進行分離，先 用乙酸乙酯洗脫后，再將洗脫得到的餾分用石油醚-乙酸乙酯混合液進行梯度洗脫，洗脫得 到的餾分經進一步純化得到化合物1和化合物2,即大環(huán)內酯倍半萜骨架化合物，結構式如 下：
化合物2。
[0006] 作為本發(fā)明一種黑蟻中大環(huán)內酯倍半萜骨架化合物的提取方法的進一步優(yōu)化，步 驟四所述的分離提純的具體步驟為:將步驟三得到的甲醇浸膏用甲醇溶劑充分溶解后，用 硅膠拌樣后，利用濕法上柱，進行柱色譜分離;取100-200目硅膠裝入色譜柱中，上樣，用7-10倍柱體積的乙酸乙酯洗脫，收集乙酸乙酯餾分，合并濃縮后得到乙酸乙酯提取浸膏，備 用； 取上述黑蟻的乙酸乙酯提取浸膏用乙酸乙酯溶劑充分溶解，加入硅膠充分拌樣干燥， 進行柱色譜分離，取200-300目硅膠裝入色譜柱中，上樣，然后分別用石油醚-乙酸乙酯溶液 進行梯度洗脫，石油醚-乙酸乙酯洗脫液的梯度比例依次為10:1、8: 2、6:4、4:6、2: 8、1:10和 〇: 10，分別收集餾分，TLC檢測合并相同餾分，得到不同餾分段共8個組分； 取梯度比例為8:2的石油醚-乙酸乙酯餾分段，進一步通過S印hadex LH-20凝膠色譜進 行純化，收集合并餾分，經過TLC分析，分別得到化合物1和化合物2。
[0007] 作為本發(fā)明一種黑蟻中大環(huán)內酯倍半萜骨架化合物的提取方法的進一步優(yōu)化，梯 度比例為8:2的石油醚-乙酸乙酯餾分段進行5叩1^(1^1^-20凝膠色譜純化過程中，流動相 采用摩爾比例為1:1的氯仿-甲醇溶液等度洗脫，流速為〇.3ml/min。
[0008] 與現有技術相比，本發(fā)明至少具有下述優(yōu)點及有益效果： 本發(fā)明提供的黑蟻中大環(huán)內酯倍半萜骨架化合物的提取方法是基于對孳生昆蟲黑蟻 的抵抗多種致病性微生物的侵害或抗菌性能的研究，通過該方法提取得到2個大環(huán)內酯倍 半萜化合物，這兩種化合物經藥效學實驗證明，具有良好的抗金黃色葡萄球菌，枯草桿菌， 大腸桿菌，綠膿桿菌的廣譜抗菌活性。為進一步提升黑蟻的藥用價值提供了新的科學依據， 并具有重要的理論價值和開發(fā)應用前景。
[0009] 本發(fā)明提供的方法是在活性指導下的有效分離，尤其適合天然微量化合物的追蹤 獲取，本發(fā)明采用70%的甲醇溶液浸漬提取，能夠使大環(huán)內酯倍半萜骨架的化合物高度富集 后盡可能多的提取出來，并能有效分離得到單體化合物。本發(fā)明已經分離的大環(huán)內酯倍半 萜骨架的化合物具有廣譜抗菌生物活性。
【具體實施方式】
[0010] -種黑蟻中大環(huán)內酯倍半萜骨架化合物的提取方法，包括以下步驟： 步驟一、取黑蟻原材料，清洗干凈后放入45-50°C烘箱中鼓風干燥至恒重，粉碎，得到黑 蟻粉末，備用； 步驟二、將步驟一得到的黑蟻粉末用其重量5-10倍的二氯甲烷溶劑室溫冷浸，48-50h 后過濾，將黑蟻殘渣濾出后再次加入黑蟻殘渣重量5-10倍的二氯甲烷重復提取，過濾，分別 收集濾液和濾渣，濾渣經過干燥，得到黑蟻濾渣粉，備用； 步驟三、將步驟二得到的黑蟻濾渣粉放置通風處風干，加入質量百分比為60-80 %的甲 醇溶液室溫冷浸提取48-50h后過濾，收集濾液，濾出的黑蟻渣粉再次加入質量百分比為60-80 %甲醇溶液室溫冷浸提取，重復上述操作若干次，合并濾液，減壓下除去溶劑后得到黑蟻 60-80 %甲醇濃縮液;然后將濃縮液置于-10-20°C冰箱中冷凍至結冰狀，取出再放置于冷凍 干燥儀中，調至-40°C下冷凍干燥處理，得到黑蟻的60-80%甲醇浸膏，甲醇浸膏密封后放置 于-80°C冰箱中，備用； 步驟四、將步驟三得到的甲醇浸膏用甲醇溶劑充分溶解后，用硅膠拌樣后，利用濕法上 柱，進行柱色譜分離;取100-200目硅膠裝入色譜柱中，上樣，用7-10倍柱體積的乙酸乙酯洗 脫，收集乙酸乙酯餾分，合并濃縮后得到乙酸乙酯提取浸膏，備用； 取上述黑蟻的乙酸乙酯提取浸膏用乙酸乙酯溶劑充分溶解，加入硅膠充分拌樣干燥， 進行柱色譜分離，取200-300目硅膠裝入色譜柱中，上樣，然后分別用石油醚-乙酸乙酯溶液 進行梯度洗脫，石油醚-乙酸乙酯洗脫液的梯度比例依次為10:1、8: 2、6:4、4:6、2: 8、1:10和 〇: 10，分別收集餾分，TLC檢測合并相同餾分，得到不同餾分段共8個組分； 取梯度比例為8:2的石油醚-乙酸乙酯餾分段，進一步通過S印hadex LH-20凝膠色譜進 行純化，流動相采用摩爾比例為1:1的氯仿-甲醇溶液等度洗脫，流速為〇.3ml/min，收集合 并餾分，經過TLC分析，分別得到化合物1和化合物2，即大環(huán)內酯倍半萜骨架化合物，結構式 如下：
化合物2。
[0011] 這兩個大環(huán)內酯倍半萜骨架的化合物是全新的倍半萜化合物，經過波譜數據分析 和理化鑒定推斷他們的結構式如下，并被命名為： (1)化合物1，黑蟻素 A-l(/Wj^acAzSic/e U)，化學名稱為:4，10，15_三甲基，1，3_ 二甲酰氨基，8-0-(2~甲基，3^甲氧基）丙烯酯基，11-(1-甲基，（6,7)驥十五環(huán)(5.10-二烯） 戊內酯-12化合物內酯化合物。
[0012] (2)化合物2,黑蟻素為，化學名稱為：21_四甲基，1-(9)-環(huán)內酰胺基，3α-甲酰氨基，7-0-(27-甲基，3。甲氧基）丙烯酯基，13-(17，18_二甲基）異 丙基，21-甲基，雙環(huán)[3,5，0]，癸烷驥環(huán)(5.6)戊內酯-14化合物。
[0013] 化合物波譜數據結構推斷： 化合物1，黑蟻素 A-U/WjrAacAzsic/e d-乃淡黃色固體粉末。[a]D20 = -69.8°。高分 辨質譜測定分子量顯示HRESI-MS m/z [M+H]+ 463.2395 (calc. 463.2399)，可推測該化 合物的分子式為C24H34N2〇7。紅外圖譜展示有酯基吸收峰在1736，1260cm-l;酰胺基吸收信號 1663,1432和660 cm-1 ;C=C雙鍵吸收特征峰3052,1601和1493cm-l，建議該化合物分子結構 中可能含有上述官能團?；衔?的1HNMR (400MHz，CDC13)，核磁共振氫譜顯示在芳區(qū)有 2個雙鍵質子信號分別在δΗ 7.23(m，1H)和8.09(s，1H)，說明化合物中含有雙鍵;另外還 有兩個活潑財言號在3!18.00和8.11。在1!1~1?的含氧區(qū)有1個甲氧基信號在6!14.46((1(1， 3H)和在δΗ4.46和4.51處分別有一個質子信號，揭示化合物中還有兩個含氧質子或連接在 氮上的質子;在化合物的飽和信號區(qū)含有7個質子信號在δΗ 2.23~1.20,在δΗ 0.98~0.91 是含有6個甲基的18個質子信號。在化合物的13C NMR (100MHz，CDC13)核磁共振圖譜中顯 示有24個碳信號，其中羰基信號6〇175.5，174.3，167.2和163.8分別顯示有2個酯基和和 2個酰胺基的存在，這與紅外圖譜信號的分析一致。DEPT分析顯示有2個亞甲基信號分別在δ c 41.9和26.1;7個次甲基信號163·6，129·5,74·0 X 2,57·4,50·1，48·3;5個季碳信號δ c 163·6，130·3，129·7 X 2和 127.9;6個甲基信號在23.3,21.8，19.6，17.9，16.1和 11.9。經與文獻對照[1，2'3]和理化性質分析，初步判斷該化合物為大環(huán)內酯類的新化合物。 分析化合物1的1 Η- 1Η COSY及HSQC相關圖譜證明了該骨架結構應有的3個結構片段:C-2-C- 3-C-4-C-5、C-6-C-7-C-8-C-9和C-4 ' -C-2 ' -C-3 ' c^HMBC譜中，H-4 ' 與C-3 '（163 · 6)，甲氧 基Η與C-3'的相關信號表明C-3'直接和1個甲氧基相連;在HMBC譜中，還可以觀測到Η-3與C-19 0(；167.2)和(：-14(3(；16.1)相關，揭示(：-3連有1個酰胺基；甲基!1-15與(：-1(3( ； 127.9)相關和酰胺活潑氫與〇1(3(；127.9)和(：-1〇0(；13〇.3)相關信號證實(：-1連接1個甲 酰胺基。圓8(：譜另外揭示的!1-8分別與(：-12 0(；175.5)和(：-1'0(；174.3)信號相關，表明 有兩個酯鍵的存在。綜上分析，可推段該化合物為4，10，15-三甲基，1，3-二甲酰氨基，8-0-(2~甲基，3^甲氧基)丙烯酯基，11-(1-甲基，（6,7)驥十五環(huán)(5.10-二烯)戊內酯-12化合物 內酯化合物。該化合物未見文獻報道，因此為1個新的大環(huán)內酯類化合物，命名為黑蟻素 Α-1 (Polyrhachzside k_Y)。
[0014] 表1:化合物1的1H NMR和13C NMR數據歸屬
[1] ff. Hexz, P. s. Kalyanaraman and G. Rama Krishnan. J. Org. Chem. 42.2265.
[2] ff. Herz and .R. P. Sharma. J. Org. Chem. 41.1015(1976).
[3] 龔運淮天然有機化合物的13C匪R核磁共振化學位移，云南科技出版社，1986， P76. 化合物2,黑蟻素 U?)淡黃色粉末，[a]D2()= +75.6°。高分辨質譜 測定分子量顯示HRESI-MS m/z [M+H]+ 463.2394(calc. 463.2399)，可推測該化合物的 分子式為C24H34N2〇 7。核磁共振圖譜顯示化合物2和化合物1非常相似，可推斷化合物1是同類 大環(huán)內酯化合物的結構。在化合物2的1H匪R(400MHz，CDC13)圖譜中，發(fā)現化合物2相比 上述化合物明顯缺少一組芳氫，建議化合物2分子中只有一個雙鍵結構。化合物2的13C NMR (100MHz，⑶C13)及結合它的DEPT譜數據也不同于上述化合物，碳譜中有21條線代表了化 合物中的24個碳信號，其中季碳信號62.2 X 2,和130.4在碳圖譜中未出峰而僅顯示在 DEPT圖譜中。其他包括2個羰基碳信號在175.4和174.3,兩個酰胺基信號分別在 167.2和163.6,2個季碳信號在130.4和54.7;11個次甲基信號分別在163.5，62.2 X 2,54.7，50.7，49.3，48.3，41.9，38.5，31.8，25.6;兩個亞甲基信號是在41.9和 26.0; 5個甲基信號分別在δο 23.3,21.8,17.9,16.1和11.9另有1個甲氧基碳信號在 56.7。以上所述的波譜學特征結合其1Η-1Η COSY和HSQC譜證實該化合物具有典型的似化合 物1的大環(huán)飽和內酯的骨架結構。進一步化合物2的結構根據2D NMR被推斷為含有飽和庚環(huán) 骨架的大環(huán)內酯化合物。在化合物2的HMBC譜中，相關信號交叉在H-1/C-11，H-8/C-ll和H-8/C-1表明了內酰胺環(huán)與飽和庚烷的存在，相關信號交叉在H-4/C-21，H-5/C-10和H-2/C-3、 C-4證明了3-酰胺基環(huán)戊燒的結構存在，相關彳目號交叉在H-13/C-14、C_7和H_3'/C-l '，揭不 了分子中環(huán)庚烷的7-取代結構和5,6連接的內酯環(huán)結構的推斷。經與文獻對照[4]，可推斷該 化合物為大環(huán)內酯類的另一個新化合物，化學名稱為:21-四甲基，1-(9)-環(huán)內酰胺基，3α-甲酰氨基，7-0-(27-甲基，甲氧基）丙烯酯基，13-(17,18-二甲基）異丙基，21-甲基，雙 環(huán)[3，5，0]，癸烷驥環(huán)(5.6)戊內酯-14化合物。命名為黑蟻素 A-2(/?辦rAadzsic/e d-2)。
[0015] 表2:化合物2的1H NMR和13C NMR數據歸屬
[4] ff. Hexz, P. S. Kalyanaraman and G. Rama Krishnan. J. Org. Chem. 1977， 42,2265. 抗菌活性試驗： 本實驗得到的大環(huán)內酯倍半萜骨架的化合物的抗菌活性實驗的抑菌圈的大小及最小 抑菌濃度MI C值的大小如下表所示： 表3:黑蟻素 A(Poi/rAacAzsic/e d-2)最小抑菌濃度(MIC)值的測定
從表3的最小抑菌濃度MIC值測定結果可知，Polyrhachzside A-1抗枯草菌的最小抑菌 濃度MIC為156此/11^、抗金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度MIC為78狀/11^、抗大腸桿菌的最 小抑菌濃度MIC為78yg/mL、抗綠膿桿菌的最小抑菌濃度MIC為156yg/mL。
[0016] 表4:黑蟻素 A-2(Polyrhachzside A-2)。最小抑菌濃度(MIC)值的測定
從表4的最小抑菌濃度MIC值測定結果可知，Polyrhachzside A-2抗枯草桿菌的最小抑 菌濃度MIC為78狀/11^、抗金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度MIC為78狀/11^、抗大腸桿菌的最 小抑菌濃度MIC為78yg/mL、抗綠膿桿菌的最小抑菌濃度MIC為78yg/mL。
[0017] 為使本發(fā)明的內容更明顯易懂，以下結合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細描述。
[0018] 實施例1: 一種黑蟻中大環(huán)內酯倍半萜骨架化合物的提取方法，包括以下步驟： 步驟一、取黑蟻原材料1.5kg，清洗表面泥漬及除去存放處理用無機鹽，清洗干凈后放 入45°C烘箱中鼓風干燥至恒重，粉碎，得到黑蟻粉末，備用； 步驟二、將步驟一得到的黑蟻粉末用其重量5倍的二氯甲烷溶劑室溫冷浸，48h后過濾， 將黑蟻殘渣濾出后再次加入黑蟻殘渣重量5倍的二氯甲烷重復提取，過濾，分別收集濾液和 濾渣，濾渣經過干燥，得到黑蟻濾渣粉，備用； 步驟三、將步驟二得到的黑蟻濾渣粉放置通風處風干，加入質量百分比為60 %的甲醇 溶液室溫冷浸提取48h后過濾，收集濾液，濾出的黑蟻渣粉再次加入質量百分比為60 %甲醇 溶液室溫冷浸提取，重復上述操作若干次，直至濾液中全部為質量百分比為60 %甲醇溶液， 合并濾液，減壓下除去溶劑后得到黑蟻60 %甲醇濃縮液;然后將濃縮液置于-10°C冰箱中冷 凍至結冰狀，取出再放置于冷凍干燥儀中，調至-40°C下冷凍干燥處理，得到黑蟻的60%甲醇 浸膏，甲醇浸膏密封后放置于_80°C冰箱中，備用； 步驟四、將步驟三得到的甲醇浸膏用甲醇溶劑充分溶解后，用硅膠拌樣后，利用濕法上 柱，進行柱色譜分離;取100-200目硅膠裝入色譜柱中，上樣，用7倍柱體積的乙酸乙酯洗脫， 收集乙酸乙酯餾分，合并濃縮后得到乙酸乙酯提取浸膏，備用； 取上述黑蟻的乙酸乙酯提取浸膏用乙酸乙酯溶劑充分溶解，加入硅膠充分拌樣干燥， 進行柱色譜分離，取200-300目硅膠裝入色譜柱中，上樣，然后分別用石油醚-乙酸乙酯溶液 進行梯度洗脫，石油醚-乙酸乙酯洗脫液的梯度比例依次為10:1、8: 2、6:4、4:6、2: 8、1:10和 〇: 10，分別收集餾分，TLC檢測合并相同餾分，得到不同餾分段共8個組分； 取梯度比例為8:2的石油醚-乙酸乙酯餾分段，進一步通過S印hadex LH-20凝膠色譜進 行純化，流動相采用摩爾比例為1:1的氯仿-甲醇溶液等度洗脫，流速為〇.3ml/min，收集合 并餾分，經過TLC分析，分別得到化合物1和化合物2，即大環(huán)內酯倍半萜骨架化合物。
[0019] 實施例2: 一種黑蟻中大環(huán)內酯倍半萜骨架化合物的提取方法，包括以下步驟： 步驟一、取黑蟻原材料2.5kg，清洗表面泥漬及除去存放處理用無機鹽，清洗干凈后放 入50°C烘箱中鼓風干燥至恒重，粉碎，得到黑蟻粉末，備用； 步驟二、將步驟一得到的黑蟻粉末用其重量7倍的二氯甲烷溶劑室溫冷浸，49h后過濾， 將黑蟻殘渣濾出后再次加入黑蟻殘渣重量7倍的二氯甲烷重復提取，過濾，分別收集濾液和 濾渣，濾渣經過干燥，得到黑蟻濾渣粉，備用； 步驟三、將步驟二得到的黑蟻濾渣粉放置通風處風干，加入質量百分比為70 %的甲醇 溶液室溫冷浸提取49h后過濾，收集濾液，濾出的黑蟻渣粉再次加入質量百分比為70 %甲醇 溶液室溫冷浸提取，重復上述操作若干次，直至濾液中全部為質量百分比為70 %甲醇溶液， 合并濾液，減壓下除去溶劑后得到黑蟻70 %甲醇濃縮液;然后將濃縮液置于_15°C冰箱中冷 凍至結冰狀，取出再放置于冷凍干燥儀中，調至-40°C下冷凍干燥處理，得到黑蟻的7%甲醇 浸膏，甲醇浸膏密封后放置于_80°C冰箱中，備用； 步驟四、將步驟三得到的甲醇浸膏用甲醇溶劑充分溶解后，用硅膠拌樣后，利用濕法上 柱，進行柱色譜分離；取100-200目硅膠裝入色譜柱中，上樣，用10倍柱體積的乙酸乙酯洗 脫，收集乙酸乙酯餾分，合并濃縮后得到乙酸乙酯提取浸膏，備用； 取上述黑蟻的乙酸乙酯提取浸膏用乙酸乙酯溶劑充分溶解，加入硅膠充分拌樣干燥， 進行柱色譜分離，取200-300目硅膠裝入色譜柱中，上樣，然后分別用石油醚-乙酸乙酯溶液 進行梯度洗脫，石油醚-乙酸乙酯洗脫液的梯度比例依次為10:1、8: 2、6:4、4:6、2: 8、1:10和 〇: 10，分別收集餾分，TLC檢測合并相同餾分，得到不同餾分段共8個組分； 取梯度比例為8:2的石油醚-乙酸乙酯餾分段，進一步通過S印hadex LH-20凝膠色譜進 行純化，流動相采用摩爾比例為1:1的氯仿-甲醇溶液等度洗脫，流速為〇.3ml/min，收集合 并餾分，經過TLC分析，分別得到化合物1和化合物2，即大環(huán)內酯倍半萜骨架化合物。
[0020] 實施例3: 一種黑蟻中大環(huán)內酯倍半萜骨架化合物的提取方法，包括以下步驟： 步驟一、取黑蟻原材料3kg，清洗表面泥漬及除去存放處理用無機鹽，清洗干凈后放入 50°C烘箱中鼓風干燥至恒重，粉碎，得到黑蟻粉末，備用； 步驟二、將步驟一得到的黑蟻粉末用其重量10倍的二氯甲烷溶劑室溫冷浸，50h后過 濾，將黑蟻殘渣濾出后再次加入黑蟻殘渣重量10倍的二氯甲烷重復提取，過濾，分別收集濾 液和濾渣，濾渣經過干燥，得到黑蟻濾渣粉，備用； 步驟三、將步驟二得到的黑蟻濾渣粉放置通風處風干，加入質量百分比為80 %的甲醇 溶液室溫冷浸提取50h后過濾，收集濾液，濾出的黑蟻渣粉再次加入質量百分比為80 %甲醇 溶液室溫冷浸提取，重復上述操作若干次，直至濾液中全部為質量百分比為80 %甲醇溶液， 合并濾液，減壓下除去溶劑后得到黑蟻80 %甲醇濃縮液;然后將濃縮液置于-20°C冰箱中冷 凍至結冰狀，取出再放置于冷凍干燥儀中，調至-40°C下冷凍干燥處理，得到黑蟻的80%甲醇 浸膏，甲醇浸膏密封后放置于_80°C冰箱中，備用； 步驟四、將步驟三得到的甲醇浸膏用甲醇溶劑充分溶解后，用硅膠拌樣后，利用濕法上 柱，進行柱色譜分離；取100-200目硅膠裝入色譜柱中，上樣，用10倍柱體積的乙酸乙酯洗 脫，收集乙酸乙酯餾分，合并濃縮后得到乙酸乙酯提取浸膏，備用； 取上述黑蟻的乙酸乙酯提取浸膏用乙酸乙酯溶劑充分溶解，加入硅膠充分拌樣干燥， 進行柱色譜分離，取200-300目硅膠裝入色譜柱中，上樣，然后分別用石油醚-乙酸乙酯溶液 進行梯度洗脫，石油醚-乙酸乙酯洗脫液的梯度比例依次為10:1、8: 2、6:4、4:6、2: 8、1:10和 〇: 10，分別收集餾分，TLC檢測合并相同餾分，得到不同餾分段共8個組分； 取梯度比例為8:2的石油醚-乙酸乙酯餾分段，進一步通過S印hadex LH-20凝膠色譜進 行純化，流動相采用摩爾比例為1:1的氯仿-甲醇溶液等度洗脫，流速為〇.3ml/min，收集合 并餾分，經過TLC分析，分別得到化合物1和化合物2，即大環(huán)內酯倍半萜骨架化合物。
【主權項】
1. 黑蟻中大環(huán)內酯倍半萜骨架化合物的提取方法，其特征在于：黑蟻原材料先經二氯 甲烷溶劑室溫冷浸提取后得到黑蟻濾渣，再將黑蟻濾渣采用質量百分比為60-80 %甲醇溶 液室溫冷浸提取，提取后的甲醇濃縮液經冷凍干燥處理得甲醇浸膏，然后甲醇浸膏先后經 過乙酸乙酯溶液、石油醚-乙酸乙酯混合溶液洗脫后，得到的餾分經進一步分離純化最終提 取出2個化合物，即大環(huán)內酯倍半萜骨架化合物。2. 如權利要求1所述的黑蟻中大環(huán)內酯倍半萜骨架化合物的提取方法，其特征在于:包 括以下步驟： 步驟一、取黑蟻原材料，清洗干凈后放入45-50Γ烘箱中鼓風干燥至恒重，粉碎，得到黑 蟻粉末，備用； 步驟二、將步驟一得到的黑蟻粉末用其重量5-10倍的二氯甲烷溶劑室溫冷浸，48-50h 后過濾，將黑蟻殘渣濾出后再次加入黑蟻殘渣重量5-10倍的二氯甲烷重復提取，過濾，分別 收集濾液和濾渣，濾渣經過干燥，得到黑蟻濾渣粉，備用； 步驟三、將步驟二得到的黑蟻濾渣粉放置通風處風干，加入質量百分比為60-80 %的甲 醇溶液室溫冷浸提取48-50h后過濾，收集濾液，濾出的黑蟻渣粉再次加入質量百分比為60-80 %甲醇溶液室溫冷浸提取，重復上述操作若干次，合并濾液，減壓下除去溶劑后得到黑蟻 60-80 %甲醇濃縮液;然后將濃縮液置于-10-20°C冰箱中冷凍至結冰狀，取出再放置于冷凍 干燥儀中，調至-40°C下冷凍干燥處理，得到黑蟻的60-80%甲醇浸膏，甲醇浸膏密封后放置 于-80°C冰箱中，備用； 步驟四、將步驟三得到的甲醇浸膏用甲醇溶劑充分溶解后，采用柱色譜法進行分離，先 用乙酸乙酯洗脫后，再將洗脫得到的餾分用石油醚-乙酸乙酯混合液進行梯度洗脫，洗脫得 到的餾分經進一步純化得到化合物1和化合物2,即大環(huán)內酯倍半萜骨架化合物，結構式如 下：化合物1; 化合物2。3. 如權利要求2所述的一種黑蟻中大環(huán)內酯倍半萜骨架化合物的提取方法，其特征在 于:步驟四所述的分離提純的具體步驟為:將步驟三得到的甲醇浸膏用甲醇溶劑充分溶解 后，用硅膠拌樣后，利用濕法上柱，進行柱色譜分離;取100-200目硅膠裝入色譜柱中，上樣， 用7-10倍柱體積的乙酸乙酯洗脫，收集乙酸乙酯餾分，合并濃縮后得到乙酸乙酯提取浸膏， 備用； 取上述黑蟻的乙酸乙酯提取浸膏用乙酸乙酯溶劑充分溶解，加入硅膠充分拌樣干燥， 進行柱色譜分離，取200-300目硅膠裝入色譜柱中，上樣，然后分別用石油醚-乙酸乙酯溶液 進行梯度洗脫，石油醚-乙酸乙酯洗脫液的梯度比例依次為10:1、8: 2、6:4、4:6、2: 8、1:10和 〇: 10，分別收集餾分，TLC檢測合并相同餾分，得到不同餾分段共8個組分； 取梯度比例為8:2的石油醚-乙酸乙酯餾分段，進一步通過Sephadex LH-20凝膠色譜進 行純化，收集合并餾分，經過TLC分析，分別得到化合物1和化合物2。4. 如權利要求3所述的一種黑蟻中含氮化合物的提取方法，其特征在于:梯度比例為8: 2的石油醚-乙酸乙酯餾分段進行Sephadex LH-20凝膠色譜純化過程中，流動相采用摩爾比 例為1:1的氯仿-甲醇溶液等度洗脫，流速為〇.3ml/min。
【文檔編號】A61P31/04GK106008428SQ201610346184
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月24日
【發(fā)明人】尹衛(wèi)平, 李海迪, 高嘉嶼, 劉坤, 劉華清
【申請人】河南科技大學