本發(fā)明涉及中藥單體成分丹酚酸A的新的藥理作用，以及丹酚酸A在制備預防、緩解和/或治療肺動脈高壓及其并發(fā)癥產(chǎn)品中的用途，屬中藥技術(shù)領(lǐng)域。

技術(shù)背景

肺動脈高壓是一種極度嚴重的疾病。75％患者集中于20～40歲年齡段，15％患者年齡在20歲以下。臨床上右心導管法檢測肺動脈壓是診斷肺動脈高壓的金標準。血流動力學指標能夠預測肺動脈高壓患者的生存時間。在海平面狀態(tài)下，安靜狀態(tài)時肺動脈收縮壓>30mmHg(1mmHg＝0.133kPa)，肺動脈平均壓>25mmHg,或在活動狀態(tài)下肺動脈平均壓>30mmHg，即可診斷為肺動脈高壓。在右室流出道和肺動脈瓣無狹窄的情況下，右心室最大收縮壓力等同于肺動脈壓，故右心室收縮壓可作為診斷肺動脈高壓的可靠指標。

心電圖判定肺動脈高壓可在無創(chuàng)條件下完成，隨著肺循環(huán)壓力升高，右心室代償性肥厚增大，在肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖中，深S波提示右心室增大，另外也常見心臟平均電軸右偏導致的R波倒置。右心代償性肥大引起心肌供血不足，心肌釋放大量標志酶于血液中，如谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)和肌鈣蛋白。檢測血清中以上酶的相對量可作為診斷肺動脈高壓引起的心衰的依據(jù)。氨基末端前腦鈉肽(amino-terminal pro-brain natriuretic peptide，N-proBNP)是BNP前體肽分裂后的N端片段，大量研究證實，與BNP相比，N-proBNP在血漿中的濃度更高，半衰期更長，因而作為PAH導致的心室衰竭評定指標更為敏感。

丹參是常用中藥，為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根莖。丹參提取物中的有效成分可分為脂溶性和水溶性成分兩類：前者多屬于二萜醌類化合物，包括丹參酮(tanshinone)、丹參酮ⅡA(tanshinoneⅡA)、隱丹參酮(cryptotanshinone)等；后者多具有抗心肌缺血活性，主要為酚酸類化合物，有 丹參素、丹酚酸A(salvianolic acid A，SAA)、丹酚酸B(salvianolic acid B，SAB)、原兒茶醛(protocatechualdehyde)等。2010版《中國藥典》中記載丹參活血祛瘀，通經(jīng)止痛，清心除煩，涼血消癰。用于胸痹心痛，脘腹脅痛，瘕瘕積聚，熱痹疼痛，心煩不眠，月經(jīng)不調(diào)，痛經(jīng)經(jīng)閉，瘡瘍腫痛。

丹酚酸A(通式I)最早是由中國醫(yī)學科學院藥物研究所黎蓮娘教授于丹參中分離得到?，F(xiàn)代藥理學研究表明，丹酚酸A具有顯著的抗氧化、心肌缺血保護、抗血栓、神經(jīng)保護、抗肝纖維化和防治糖尿病及并發(fā)癥等藥理活性。已有實驗結(jié)果顯示丹酚酸A的多方面藥理活性并不完全與其抗氧化活性相關(guān)，抑制平滑肌細胞增殖而不抑制內(nèi)皮細胞增殖、抑制炎性因子生成等活性提示丹酚酸A可能從多個途徑發(fā)揮作用。迄今為止，我們沒有發(fā)現(xiàn)丹酚酸A治療肺動脈高壓的相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的可以通過如下技術(shù)方案來達到。采用雄性Sprague-Dawley大鼠皮下注射野百合堿(50mg/kg)建立動物肺動脈高壓模型，記錄一般體征率，實驗終點時通過記錄心電圖，測定動物血清酶、臟器指數(shù)、體循環(huán)及肺循環(huán)血流動力學變化、檢測肺組織中內(nèi)皮素-1水平、檢測血清中氨基末端前腦鈉肽水平以及組織形態(tài)學變化，判定丹酚酸A對大鼠肺動脈高壓的預防、緩解和/或治療作用。

本發(fā)明的特點與優(yōu)勢在于常用中藥丹參中提取的單體成分-丹酚酸A具有特異性延緩肺循環(huán)壓力的升高而對體循環(huán)無明顯影響的藥理作用；顯著降低肺動脈高壓的動物死亡率，具有減輕肺動脈高壓所引起的右心衰竭，改善右心室肥厚和增大癥狀，預防和/或治療肺動脈高壓所致心臟損傷、心功能衰竭的藥理作用；具有降低肺組織中內(nèi)皮素-1水平，緩解肺小動脈重構(gòu)的藥理作用，可應(yīng)用于制備 預防和/或治療肺動脈高壓及其導致的慢性阻塞性肺氣腫、慢性肺源性心臟病、右心衰竭等并發(fā)癥的產(chǎn)品。

本發(fā)明的另一方面，涉及一種用于預防和/或治療肺動脈高壓及其并發(fā)癥的藥物組合物，其含有預防和/或治療有效量(0.3～100mg/kg)的丹酚酸A，以及任選的藥學可接受的載體和/或輔料。

在本發(fā)明中，根據(jù)施用途徑，所述丹酚酸A藥物組合物可呈選自如下劑型：溶液、混懸液、凍干粉針、乳劑、丸劑、膠囊、粉末、控制釋放或持續(xù)釋放制劑。

本發(fā)明的丹酚酸A藥物組合物可以用已知的方法配制，使用幾種途徑對受試者施用，包括但不限于腸胃外、經(jīng)口、局部、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、靜脈、鼻內(nèi)途徑。

本發(fā)明中丹酚酸A可通過已知方法制備得到。

本發(fā)明的丹酚酸A藥物組合物任選的可以通過任何常規(guī)方法用一種或多種藥學可接受的載體和/或賦形劑來配制。因此，丹酚酸A和它藥學可接受的衍生物可特別配制為例如吸入或吹入(通過口或鼻)或經(jīng)口、含化、腸胃外或直腸給藥。

丹酚酸A藥物組合物也可以采用溶液、混懸液、乳劑、丸劑、膠囊、粉末、控制釋放或持續(xù)釋放制劑。這些制劑將含有治療有效量的丹酚酸A，優(yōu)選為純化形式，以及適量的載體，以提供對患者適當給藥的形式。

在本發(fā)明中，所述純化形式的丹酚酸A是指基本上純的丹酚酸A，尤其是純度大于80％，優(yōu)選的大于85％，特別優(yōu)選的大于90％，甚至更優(yōu)選的大于95％的丹酚酸A。所述純化形式的丹酚酸A純度范圍可以是例如80-98％。

所述的產(chǎn)品包括藥品、食品、保健品。

附圖說明

圖1.丹酚酸A對肺動脈高壓大鼠心電圖的改善作用。A-正常對照組；B-肺動脈高壓模型對照組；C-波生坦組；D-丹酚酸A(0.3mg/kg)；E-丹酚酸A(1mg/kg)；F-丹酚酸A(3mg/kg)。

圖2.丹酚酸A對肺動脈高壓大鼠血流動力學指標的影響。右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure，RVSP)、B-舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)、C-收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、D-心率(heart rate，HR)

圖3.丹酚酸A對肺動脈高壓大鼠臟器指數(shù)的影響。肺濕重/體重(mg/kg)、B-右心室濕重/體重(mg/kg)、C-右心濕重/全心重量(mg/mg)、D-右心室肥厚指數(shù)(右心室重/(室間隔+左室壁)，mg/mg)

圖4.丹酚酸A對肺動脈高壓大鼠乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)等心肌損傷標志酶活性的影響。

圖5.丹酚酸A對肺動脈高壓大鼠肺組織中ET-1水平的影響。

圖6.丹酚酸A對肺動脈高壓大鼠血清中氨基末端前腦鈉肽水平的影響

圖7.丹酚酸A對肺動脈高壓大鼠右心室心肌的保護作用。A-正常對照組；B-肺動脈高壓模型對照組；C-波生坦組；D-丹酚酸A(0.3mg/kg)；E-丹酚酸A(1mg/kg)；F-丹酚酸A(3mg/kg)。

圖8.丹酚酸A對肺動脈高壓大鼠肺小血管重構(gòu)的改善作用。A-正常對照組；B-肺動脈高壓模型對照組；C-波生坦組；D-丹酚酸A(0.3mg/kg)；E-丹酚酸A(1mg/kg)；F-丹酚酸A(3mg/kg)。

圖9.丹酚酸A對肺動脈高壓大鼠肺動脈增厚的改善作用。A-正常對照組；B-肺動脈高壓模型對照組；C-波生坦組；D-丹酚酸A(0.3mg/kg)；E-丹酚酸A(1mg/kg)；F-丹酚酸A(3mg/kg)。

具體實施方式

下面結(jié)合本發(fā)明進一步說明丹酚酸A在體內(nèi)預防、緩解和/或治療肺動脈高壓及其并發(fā)癥的藥理作用與藥物用途。

下述實施例更詳細地舉例說明本發(fā)明，并不是對本發(fā)明的任何限制。

實施例1：肺動脈高壓大鼠模型的建立

野百合是從豆科植物野百合中提取的一種生物堿。野百合堿本身無活性，進入體內(nèi)后，經(jīng)門靜脈吸收至肝臟，肝代謝后形成脫氫產(chǎn)物吡咯野百合堿，循環(huán)至肺動脈，損傷肺動脈內(nèi)皮細胞，致其變性、壞死、脫落，原位血栓形成，引起肺小動脈中膜增厚，最終導致肺小動脈重構(gòu)和肺動脈壓力升高。本實施例采用皮下注射野百合堿造成大鼠肺動脈高壓的動物模型，觀察記錄大鼠的心電圖，測定大鼠臟器指數(shù)、血流動力學指標，測定大鼠血清標志酶以及組織形態(tài)學變化，判定 丹酚酸A在制備預防和治療肺動脈高壓及其并發(fā)癥產(chǎn)品中的用途。

實施例選用雄性SD大鼠90只，體重170～190g，隨機分為6組，每組15只，正常對照組、模型對照組、波生坦組(30mg/kg，灌胃給藥)、丹酚酸A低、中、高劑量組(0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg，灌胃給藥)，連續(xù)給藥四周，每天一次。正常對照組給藥前一天皮下給予同體積生理鹽水，其余各組均一次皮下給予野百合堿50mg/kg，制備大鼠肺動脈高壓模型。連續(xù)記錄各組大鼠死亡情況，計算生存率。結(jié)果顯示(附表1)，丹酚酸A各劑量組和陽性藥組均可顯著降低肺動脈高壓引起的大鼠死亡，提高生存率。四周后10％水合氯醛0.2ml/kg麻醉，肢體Ⅱ?qū)?lián)記錄心電圖。實驗結(jié)束后，測定臟器指數(shù)，血清標志物。

表1.丹酚酸A對肺動脈高壓大鼠生存率的影響。

實施例2：丹酚酸A對肺動脈高壓大鼠心電圖的改善作用。

上述各組大鼠末次給藥后，10％水合氯醛0.2ml/kg麻醉，前后肢皮下插入針狀電極，肢體Ⅱ?qū)?lián)記錄心電圖，觀察S波變化。結(jié)果顯示(附圖1)，正常大鼠心電圖呈正常狀態(tài)，模型組由于右心室代償性肥厚、右心室腔增大，表現(xiàn)為S波加深，嚴重者可出現(xiàn)T波倒置。陽性藥波生坦可明顯改善肺動脈高壓所引起的心電圖變化，丹酚酸A能劑量依賴性改善上述病理性心電圖變化，說明丹酚酸A對肺動脈高壓引起的心臟損傷具有良好的改善作用。

實施例3：丹酚酸A對肺動脈高壓大鼠血流動力學指標的影響

心電圖觀察結(jié)束后，鈍性分離大鼠左側(cè)頸總動脈，經(jīng)PE50導管連接壓力換能器，生物機能實驗系統(tǒng)檢測頸總動脈壓力，記錄心率、體循環(huán)收縮壓、舒張壓。記錄完畢后，結(jié)扎該側(cè)頸總動脈。鈍性分離右側(cè)頸外靜脈，采用經(jīng)典右心導管法檢測大鼠右心室壓力，記錄并統(tǒng)計各組收縮壓平均值。體循環(huán)結(jié)果顯示(附圖2)，各組間心率、收縮壓和舒張壓均無明顯差異。說明藥物對體循環(huán)無明顯影響。右 心室壓力結(jié)果顯(附圖2)示，模型組右心室壓較正常組顯著升高，說明造模成功，陽性藥和丹酚酸A各劑量組較模型組均能顯著降低右心室壓，說明應(yīng)用丹酚酸A能改善野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠的血流動力學。

實施例4：丹酚酸A對肺動脈高壓大鼠臟器指數(shù)的影響。

血流動力學檢測結(jié)束后，處死大鼠，迅速剪下心臟，預冷的生理鹽水沖洗干凈，定性濾紙吸干殘余水分后將記錄肺重、全心重量。沿心耳下緣減掉心房，記錄左右心室合并室間隔重量，剪下右心室稱重。計算各組肺濕重/體重(mg/kg)、右心室濕重/體重(mg/kg)、右心濕重/全心重量(mg/mg)和右心室肥厚指數(shù)(右心室重/(室間隔+左室壁)，mg/mg)。結(jié)果顯示(附圖3)，丹酚酸A各劑量組可改善肺動脈壓升高所引起的肺重增加，陽性藥組和丹酚酸A較模型組均可顯著降低肺動脈高壓大鼠右心濕重/體重、右心濕重/全心重量和右心室肥厚指數(shù)(右心室重/(室間隔+左室壁))，說明丹酚酸A可改善肺循環(huán)壓力升高所引起的右心室代償性肥厚，減輕肺動脈高壓所致的肺損傷。

實施例5：丹酚酸A對大鼠心肌酶活性的影響

心電圖觀察結(jié)束后，經(jīng)腹主動脈取血，室溫凝聚，14000rpm、15min離心，分離吸取血清，全自動生化分析儀檢測心肌酶譜，包括乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)。血清中ALT、LDH和AST活性間接反映了心肌損傷程度，當心肌細胞缺血受損時，細胞膜通透性增加，細胞內(nèi)ALT、LDH和AST外漏而致血中ALT、LDH和AST升高。結(jié)果顯示(附圖4)，與正常對照組比較，模型組血清中三種酶含量顯著升高。本研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸A能夠降低肺動脈高壓引起的血清酶ALT、LDH和AST的升高，表明丹酚酸A對肺動脈高壓引起的心肌損傷和心功能衰竭具有保護作用。

實施例6：丹酚酸A對肺動脈高壓大鼠肺組織中ET-1水平的影響

大鼠處死后，取肺。剪取肺組織約0.1g，加入1mlPBS研磨裂解，反復凍融一次后離心，取上清液。根據(jù)預實驗結(jié)果10倍稀釋。使用商品化ELISA試劑盒檢測上清稀釋中內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)水平。ET-1是由內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的一種21個氨基酸的多肽，是迄今為止最強的血管收縮活性多肽。肺動脈高壓常伴隨血管收縮因子如ET-1長時間過度表達，不僅可引起肺血管收縮，還可促進 和導致肺血管重構(gòu)。實施6結(jié)果表明(附圖5)，模型組肺組織中ET-1水平明顯升高，陽性藥和丹酚酸A各劑量組均可顯著降低(P＜0.001)肺動脈高壓大鼠肺中ET-1水平，減輕肺小動脈收縮和由此繼發(fā)的肺小動脈重構(gòu)。

實施例7：丹酚酸A對肺動脈高壓大鼠血清中氨基末端前腦鈉肽水平的影響

大鼠處死后，經(jīng)腹主動脈取血，室溫凝聚，14000rpm、15min離心，分離吸取血清，-80℃凍存。重新溶解后，10000rpm再次離心15分鐘，ELISA試劑盒檢測氨基末端前腦鈉肽(amino-terminal pro-brain natriuretic peptide，N-proBNP)水平。腦鈉肽(brain natriuretic peptide)是一種主要由心室分泌的多肽類激素，具有利尿、擴張血管、拮抗腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)等作用，BNP作為肺動脈高壓導致的心力衰竭診斷和預后評估的獨立危險因子已得到廣泛認同。N-proBNP是BNP前體肽分裂后的N端片段，大量研究證實，與BNP相比，N-proBNP在血漿中的濃度更高，半衰期更長，因而作為肺動脈高壓導致的心室衰竭評定指標更為敏感。實施例5結(jié)果表明(附圖6)，模型組血清中N-proBNP水平明顯升高，陽性藥和丹酚酸A各劑量組均可降低PAH大鼠血清中N-proBNP水平，說明丹酚酸A可緩解肺動脈高壓所導致的心力衰竭。

實施例8：病理組織學觀察丹酚酸A對肺動脈高壓大鼠的影響

沿心耳下緣分離心室，用4％的多聚甲醛固定，石蠟包埋后連續(xù)切片，進行HE染色，光鏡下(40X、200X)觀察病理改變，CCD記錄右心室心肌圖像。

心肌組織病理學檢查發(fā)現(xiàn)(附圖7)，肺動脈高壓模型組右心室心肌纖維異常粗大，排列紊亂，形狀不整。短而粗的心肌纖維相互呈垂直或斜向連接，或排列成環(huán)形，有時走向各異的小肌束交織成大小不等的漩渦狀排列。應(yīng)用丹酚酸A能夠呈劑量依賴性減少病變程度，保持心肌細胞結(jié)構(gòu)正常。

分離大鼠單葉肺組織，用4％的多聚甲醛固定，石蠟包埋后連續(xù)切片，進行masson三色染色，光鏡下(40X、200X)觀察病理改變，CCD記錄50-200μm直徑血管厚度。結(jié)果顯示(附圖8)，丹酚酸A各劑量組和陽性藥組均可降低造模引起的肺小血管增厚和肺間質(zhì)膠原沉積，降低右心后負荷。

分離肺動脈，去除結(jié)締組織，用4％的多聚甲醛固定，石蠟包埋后連續(xù)切片，進行HE染色，光鏡下記錄血管三處位置圖像，各組間記錄位置相同。肺動脈組織病理學結(jié)果顯示(附圖9)，肺動脈高壓模型組各個位置血管壁顯著增厚，應(yīng) 用丹酚酸A能夠呈劑量依賴性減少增厚程度，改善血管功能。

整體動物藥效評價實驗結(jié)果表明，與肺動脈高壓模型組比較，丹酚酸A能夠明顯降低肺循環(huán)壓力而對體循環(huán)各項血流動力學指標無明顯影響。丹酚酸A明顯緩解右心室肥大癥狀，改善心功能，明顯減輕肺水腫癥狀，可降低肺動脈壓力升高損傷心肌所引起的血清酶LDH、AST、ALT的升高和氨基末端腦鈉肽升高，同時降低肺組織中ET-1的含量，避免肺小動脈持續(xù)收縮而引起的重構(gòu)現(xiàn)象。改善肺動脈高壓所引起的組織病理學變化，延緩組織非可逆性損傷。

綜上所述，丹酚酸A具有特異性延緩肺循環(huán)壓力的升高而對體循環(huán)無明顯影響的藥理作用；顯著降低肺動脈高壓的動物死亡率；具有減輕肺動脈高壓所引起的右心衰竭，改善右心室肥厚和增大癥狀，預防、緩解和/或治療肺動脈高壓所致心臟損傷、心功能衰竭的藥理作用；具有降低肺組織中內(nèi)皮素-1水平，緩解肺小動脈重構(gòu)的藥理作用。丹酚酸A為常用中藥黃連中提取的單體化合物，具有毒性低、通過轉(zhuǎn)化提取工藝相對簡單等優(yōu)點；其原材料資源常見，具有很好的應(yīng)用與開發(fā)前景，是一種理想的新型的治療肺動脈高壓及其并發(fā)癥的中藥單體，可應(yīng)用于制備預防、緩解和/或治療肺動脈高壓及其并發(fā)癥慢性阻塞性肺氣腫、慢性肺源性心臟病、心力衰竭的產(chǎn)品。