本發(fā)明涉及藥用提取物，具體涉及白肉靈芝提取物用于抗炎方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
靈芝(Ganodermalucidum(Leyss.exFr.)Karst.)隸屬于真菌門(mén)(Eumycota)、擔(dān)子菌亞門(mén)(Basidiomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、靈芝科(Gamodermataceae)、靈芝屬(Ganoderma)類(lèi)?！吨腥A本草》中記錄“其性甘；味平；無(wú)毒；歸肺、心、脾、腎經(jīng)。益氣血；安心神；健脾胃。主治虛勞、心悸、失眠、頭暈、神疲乏力、久咳氣喘、冠心病、矽肺、腫瘤。”《中國(guó)藥典》中將靈芝收錄為中藥材，其中的靈芝多糖、三萜、核苷、生物堿、氨基酸多肽、微量元素等成分是其藥效物質(zhì)的主要基礎(chǔ)，以三萜和多糖為其中主要活性成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，靈芝三萜類(lèi)化合物具有保肝、抗腫瘤、抗HIV-4及HIV-4蛋白酶活性、抗組織胺釋放、抑制血管緊張素、抗氧化等作用。靈芝分類(lèi)歷史悠久，歸類(lèi)各有不同，《本草綱目》等古籍中以“六色”將靈芝歸為：青芝、赤芝、黃芝、白芝、黑芝、紫芝。近日廣東省微生物研究所李泰輝等人在真菌學(xué)雜志《Mycoscience》發(fā)表文章宣布他們?cè)谖鞑亓种サ貐^(qū)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)靈芝新種——白肉靈芝Ganodermaleucocontextum(LiTH,HuHP,DengWQ,etal.Ganodermaleucocontextum,anewmemberoftheG.lucidumcomplexfromsouthwesternChina.Mycoscience,2015,56(1)：81-85.)。中國(guó)西藏新聞網(wǎng)2014年8月報(bào)道西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院研究人員白肉靈芝人工栽培獲得成功。針對(duì)白肉靈芝的食用及藥用價(jià)值急需進(jìn)行系統(tǒng)研究和開(kāi)發(fā)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明以白肉靈芝Ganodermaleucocontextum為研究對(duì)象，對(duì)其提取物進(jìn)行了化學(xué)和生物活性研究，發(fā)現(xiàn)白肉靈芝提取物具有很好的抗炎作用，具有很好的藥用和食用價(jià)值。為此，本發(fā)明的第一方面，提供白肉靈芝提取物在制備用于預(yù)防和/或治療炎癥的藥物中的應(yīng)用，所述提取物中含有式1和式2所示的化合物的組合，本發(fā)明的白肉靈芝Ganodermaleucocontextum提取物是按照如下的方法制備的，所述方法包括如下步驟：用提取溶劑提取白肉靈芝的子實(shí)體至少一次；和去除溶劑以獲得所述提取物。所述提取溶劑可選自水、C1～C4烷基醇、甲酸C1～C3烷基酯、乙酸C1～C3烷基酯、鹵代C1～C3烷烴、R1C(O)R2中的一種，或者兩種或更多種的混合溶劑，其中R1和R2各自獨(dú)立地為C1～C3烷基。所述提取溶劑優(yōu)選選自水、甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、甲酸甲酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、丙酮、丁酮、戊酮中的一種或多種。特別優(yōu)選所述提取溶劑為20～98％(v/v)的乙醇水溶液，更優(yōu)選40～98％(v/v)、最優(yōu)選70～95％(v/v)的乙醇水溶液。白肉靈芝的子實(shí)體與所述提取溶劑的重量體積比(g:ml或kg:L)為1:3～10；優(yōu)選為1:2～5；最優(yōu)選為1:3。為提高提取效果，優(yōu)選事先將白肉靈芝的子實(shí)體碎化。所述提取方法可以是任何適宜的方法，例如但不限于浸漬提取、超聲提取、加熱回流提取等。提取溫度為室溫～105℃，優(yōu)選20～50℃。本文中所說(shuō)室溫通常指18～30℃。根據(jù)一種實(shí)施方式，提取可進(jìn)行1～5次，優(yōu)選提取2～4次，最優(yōu)選為3次。提取時(shí)間為每次15min～2小時(shí)，優(yōu)選為30～70min。優(yōu)選地，所述提取溶劑可回收再利用。去除或回收提取溶劑的方法可根據(jù)不同溶劑靈活選取。例如可以進(jìn)行蒸餾或減壓蒸餾等。根據(jù)本發(fā)明的另一種實(shí)施方式，所述方法進(jìn)一步包括以下步驟：將所獲得的提取物分散于水中，用弱極性有機(jī)溶劑萃取以除去脂溶性雜質(zhì)；用萃取劑萃取水相；和取萃取劑層并去除萃取劑。所述萃取劑可選自乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷和正丁醇中的一種，優(yōu)選乙酸乙酯。用于除去脂溶性雜質(zhì)的弱極性有機(jī)溶劑可以是常用用萃取分離有機(jī)物的那些非極性溶劑。例如可選自C5～C12的烷烴、C5～C8的環(huán)烷烴、鹵代C1～C3烷烴、石油醚中的一種或多種。根據(jù)一種實(shí)施方式，所述有非極性機(jī)溶劑可選自正己烷、正庚烷、正辛烷、環(huán)己烷、氯仿、二氯乙烷、沸點(diǎn)60～90℃的石油醚中的一種或多種。優(yōu)選使用所述石油醚和/或環(huán)己烷。可用所述弱極性有機(jī)溶劑進(jìn)行多次萃取以盡量除去脂溶性雜質(zhì)。例如可萃取2～5次。用萃取劑的萃取也同樣可進(jìn)行多次。例如可為2～5次。所述弱極性有機(jī)溶劑以及所述萃取劑的用量分別為每次為水相體積的50～200％；優(yōu)選用與水相等體積的弱極性有機(jī)溶劑(或萃取劑)進(jìn)行萃取。根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述提取溶劑為水、或選自C1～C4烷基醇、甲酸C1～C3烷基酯、乙酸C1～C3烷基酯中的一種或多種溶劑的40％(v/v)以下(例如5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％(v/v))的水溶液，所述方法進(jìn)一步包括以下步驟：將所獲得的提取物分散于水中，用萃取劑萃取所獲得的提取液；和取萃取劑層并去除萃取劑，所述萃取劑可為選自乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷和正丁醇中的一種，優(yōu)選乙酸乙酯。同樣的，用萃取劑的萃取可進(jìn)行多次。例如可為2～5次。所述萃取劑的用量分別為每次為水相體積的50～200％；優(yōu)選用與水相等體積的萃取劑進(jìn)行萃取。該實(shí)施方式可獲得水溶性更好的提取物，以便制備水溶劑或茶飲等產(chǎn)品。所述炎癥是選自肝炎、肺炎、胃炎、腸炎中的至少一種。本發(fā)明的第二方面提供含有上述白肉靈芝提取物的可食用的產(chǎn)品用于抗炎的用途。其中白肉靈芝提取物中含有下式1和式2所示的化合物的組合。所述炎癥為肝炎、肺炎、胃炎、腸炎等。其中，胃炎例如急性、慢性胃炎，胃潰瘍等；肝炎例如細(xì)菌性肝損傷、藥物性肝損害、病毒性肝損傷、脂肪肝等；肺炎例如細(xì)菌性肺炎、病毒性肺炎等；腸炎例如細(xì)菌性腸炎、慢性腸炎等。所述可食用的產(chǎn)品具體形式可為口服液、茶飲、含片、膠囊、飲品、泡騰片等等。本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)，白肉靈芝可采用任何常規(guī)的溶劑，包括水進(jìn)行提取，提取方法簡(jiǎn)單，提取物可溶于水。提取物中含有較大量的三萜類(lèi)化合物，并經(jīng)驗(yàn)證具有顯著的抑制炎癥發(fā)生的效果。因此，白肉靈芝的提取物具有廣闊的藥用和食用的應(yīng)用前景。附圖說(shuō)明圖1為用不同有機(jī)溶劑提取白肉靈芝粗提物的HPLC指紋圖譜；和圖2為根據(jù)本發(fā)明一種實(shí)施方式獲得的白肉靈芝提取物的HPLC圖譜。具體實(shí)施方式參照附圖及以下詳細(xì)描述的優(yōu)選實(shí)施方式和具體實(shí)施例，更加詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明的各個(gè)方面和上述的及其他的優(yōu)點(diǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，下面描述的這些內(nèi)容是為了更好地理解本發(fā)明，本發(fā)明的范圍并不受限于此。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。白肉靈芝由西藏自治區(qū)農(nóng)科院蔬菜研究所提供。實(shí)施例1白肉靈芝乙醇提取物的制備將白肉靈芝子實(shí)體剪碎，稱(chēng)重5000克。用15L體積百分含量95％乙醇的水溶液回流提取3次，每次1小時(shí)。合并提取液，減壓濃縮干燥得到170克提取物，將提取物記作GL-1。進(jìn)一步將提取物用蒸餾水600ml溶解，用等體積的正己烷萃取三次，棄去有機(jī)相。再用等體積乙酸乙酯萃取水相三次，棄去水相，合并乙酸乙酯萃取液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干乙酸乙酯獲得浸膏54g，記作GL-1E。實(shí)施例2純化及鑒定實(shí)施例1GL-1E提取物中的主要化合物取40g實(shí)施例1制備的提取物GL-1E，通過(guò)硅膠柱色譜分離，以正己烷:乙酸乙酯體系和二氯甲烷:甲醇體系依次進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度洗3個(gè)保留體積，每個(gè)體積500ml。在二氯甲烷:甲醇(體積比為100:1)中得到餾分19，命名為GL-E19。GL-E19(10.5g)利用ODS反相硅膠柱分離，用體積百分含量為10％～100％甲醇的水溶液依次進(jìn)行洗脫，每個(gè)洗脫體系3個(gè)保留體積，每個(gè)保留體積為500ml，每300ml收集一個(gè)餾分。體積百分含量為40％的甲醇水溶液系統(tǒng)的第三個(gè)餾分和體積百分含量為50％的甲醇水溶液系統(tǒng)的第三個(gè)餾分，分別命名為GL-E19-23和GL-E19-27。對(duì)GL-E19-23以體積百分含量40％乙腈的酸水(此處的酸水為體積百分含量為0.01％三氟乙酸的水溶液)溶液為洗脫劑進(jìn)行HPLC制備，流速為2ml/min，收集28min的色譜峰，得到化合物1。對(duì)GL-E19-27以體積百分含量42％乙腈酸水(此處的酸水為體積百分含量為0.01％三氟乙酸的水溶液)溶液為洗脫劑進(jìn)行HPLC制備，流速為2ml/min，收集25.2min的色譜峰得到化合物2。上述HPLC色譜條件如下：以色譜純的甲醇將樣品配制為10mg/ml的溶液，上樣量為15ul每次，色譜柱為Kromasil10×250mmC18半制備柱，柱溫為25℃，210nm波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)?；衔?和化合物2通過(guò)鑒定，結(jié)構(gòu)式如下式1、式2所示，數(shù)據(jù)歸屬見(jiàn)表1和2。表1化合物1和化合物2的13CNMR數(shù)據(jù)(125MHz，CDCl3)表2化合物1和化合物2的1HNMR數(shù)據(jù)(JinHz,500MHz，CDCl3)實(shí)施例3提取物GL-1的指紋圖譜檢測(cè)高效液相化學(xué)指紋圖譜分析條件如下：使用Agilent1200高效液相色譜儀，四元梯度泵，DAD檢測(cè)器，Agilent色譜工作站。色譜柱YMCC8分析柱(4.6mm×150mm，5μm)，流動(dòng)相為乙腈-體積百分含量0.04％的三氟乙酸的水溶液，溫度室溫(20～30℃)的條件下進(jìn)行梯度洗脫(洗脫程序以及各成分的體積百分含量如下所示)，流速1.00mL/min。將粗提物G1用乙腈溶解，配成10mg/mL的溶液，進(jìn)樣量10μl，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm。梯度洗脫步驟如下表3：表3按照上述洗脫條件得到提取物GL-1的色譜圖如圖1所示，并對(duì)實(shí)施例2分離得到的2個(gè)化合物進(jìn)行指認(rèn)，這兩個(gè)化合物的峰面積占總峰面積的10.82％。實(shí)施例4用甲醇提取白肉靈芝將所述白肉靈芝子實(shí)體剪碎，按照子實(shí)體:甲醇＝1g:3ml的量加入甲醇，浸泡超聲提取3次，每次30分鐘，將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干獲得浸膏，得到提取物GL-2。甲醇純度為分析純，購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。將GL-2進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，分析條件同實(shí)施例3所述。如圖1所示，1和2標(biāo)示的峰與從GL-1E中分離得到的2個(gè)化合物一致，這兩個(gè)化合物的峰面積占總峰面積的6.58％。實(shí)施例5:用乙酸乙酯提取白肉靈芝將所述白肉靈芝子實(shí)體剪碎，按照子實(shí)體:乙酸乙酯＝1g:3ml的量加入乙酸乙酯，浸泡超聲提取3次，每次30分鐘，將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干獲得浸膏，即提取物GL-3。乙酸乙酯純度為分析純，購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。將GL-3進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，分析條件同實(shí)施例3所述。如圖1所示，1和2標(biāo)示的峰與從GL-1E中分離得到的2個(gè)化合物一致，這兩個(gè)化合物的峰面積占總峰面積的8.45％。實(shí)施例6:用二氯甲烷提取白肉靈芝將所述白肉靈芝子實(shí)體剪碎，按照子實(shí)體:二氯甲烷＝1g:3ml的量加入二氯甲烷，浸泡超聲提取3次，每次30分鐘，將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干獲得浸膏，得到粗提物GL-4。所述二氯甲烷純度為分析純，購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。將GL-4進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，分析條件同實(shí)施例3所述。如圖1所示，1和2標(biāo)示的峰與從GL-1E中分離得到的2個(gè)化合物一致，這兩個(gè)化合物的峰面積占總峰面積的12.38％。實(shí)施例7:用丙酮提取白肉靈芝將所述白肉靈芝子實(shí)體剪碎，按照子實(shí)體:丙酮＝1g:3ml的量加入丙酮，浸泡超聲提取3次，每次30分鐘，將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干獲得浸膏，得到提取物GL-5。所述丙酮純度為分析純，購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。將GL-5進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，分析條件同實(shí)施例3所述。如圖1所示，1-2標(biāo)示的峰與從GL-1E中分離得到的2個(gè)化合物一致，這兩個(gè)化合物的峰面積占總峰面積的6.31％。實(shí)施例8:用水提取白肉靈芝將所述白肉靈芝子實(shí)體剪碎，按照子實(shí)體:水＝1g:3ml的量加入去離子水，浸泡超聲提取3次，每次30分鐘，將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干獲得浸膏，得到提取物GL-6。將GL-6提取物浸膏用適量蒸餾水混懸，然后用等量乙酸乙酯萃取三次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶液獲得水提物的乙酸乙酯浸膏GL-6E。所述水為去離子水。將GL-6E進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，分析條件同實(shí)施例3所述。如圖2所示，1-2標(biāo)示的峰與從GL-1E中分離得到的2個(gè)化合物一致，這兩個(gè)化合物的峰面積占總峰面積的12.24％。實(shí)施例9白肉靈芝提取物對(duì)脂多糖LPS誘導(dǎo)的小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7釋放NO的抑制活性測(cè)試實(shí)驗(yàn)材料：被測(cè)樣品溶液為實(shí)施例1和實(shí)施例4～8所述的8個(gè)提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)，以及陽(yáng)性藥氫化可的松(sigma)。準(zhǔn)確稱(chēng)取各樣品，用DMSO(二甲亞砜)配制成50mg/ml溶液(制備時(shí)溶于少量DMSO后，再用蒸餾水稀釋至相應(yīng)濃度，控制DMSO的最終體積百分含量<1％)，用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行2倍梯度稀釋?zhuān)?個(gè)濃度，供活性測(cè)試。DMEM、胎牛血清和馬血清購(gòu)自Gibco公司。小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7(ATCCTIB-71)培養(yǎng)于含10％熱滅活(56℃,30min)胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素鈉(Gibco)、100μg/ml鏈霉素(Gibco)的RPMI1640(Gibco)培養(yǎng)液中，37℃下，5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育。脂多糖LPS購(gòu)自SIGMA公司。N-萘乙二胺鹽酸鹽(北京韻邦生物科技有限公司)，對(duì)氨基苯磺酰胺(上海士鋒科技有限公司)。實(shí)驗(yàn)方法：白肉靈芝提取物對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放NO的抑制活性參考文獻(xiàn)方法(GiangPM,JinHZ,SonPT,LeeJH,HongYS,LeeJJ.ent-KauranediterpenoidsfromCrotontonkinensisinhibitLPS-inducedNF-κBactivationandNOproduction.JournalofNaturalProducts,2003,66(9),1217-1220.)。LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌致病的主要因素，刺激體內(nèi)多種細(xì)胞合成和釋放眾多內(nèi)源性生物活性因子，導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)發(fā)生，由此引起全身炎癥反應(yīng)綜合征。RPMI1640培養(yǎng)液將RAW264.7細(xì)胞稀釋制成1×105個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，接種于96孔板中(每孔200μL)，每組設(shè)三個(gè)平行孔。CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h后每孔加入終濃度為1μg/mL的LPS(Sigma)和DMSO溶解的不同濃度的測(cè)試樣品0.4μL(或陽(yáng)性藥氫化可的松0.4μL)，同時(shí)設(shè)定LPS組(加入LPS，但不加樣品，對(duì)NO釋放的抑制率為0％)和空白對(duì)照組(不加LPS和樣品，僅加入0.4μLDMSO，對(duì)NO釋放的抑制率為100％)。37℃下，5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，吸取上清100μL到酶標(biāo)板上，離心(1000*g，4℃，3min)，加入100μLGriessreagent(GriessreagentA：0.1％N-萘乙二胺鹽酸鹽溶液；GriessreagentB：1％對(duì)氨基苯磺酰胺溶液+5％磷酸溶液，使用前1:1混合)于96孔板混合，室溫靜止10min后，用酶標(biāo)儀在540nm處測(cè)定OD值。由于NO極不穩(wěn)定，在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中代謝成為亞硝酸基NO2-,故采用Griess法測(cè)定樣品中NO2-的濃度作為衡量NO水平的指標(biāo)。用濃度分別為1、5、10、50μmol/L的NaNO2繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO2-的濃度以及對(duì)NO釋放的抑制率，抑制率計(jì)算公式為：實(shí)驗(yàn)結(jié)果：結(jié)果如表4所示，式(Ⅰ)所示化合物對(duì)小鼠單核巨噬細(xì)胞NO釋放顯示出較強(qiáng)的抑制力，即具有較強(qiáng)的抗炎活性。表4提取物IC50，μg/ml提取物IC50，μg/mlGL-1E24.6±3.25GL554.3±9.35GL159.8±4.98GL-662.8±7.06GL276.3±6.25GL-6E31.3±6.02GL388.2±12.5氫化可的松16.76±3.08GL467.9±8.72實(shí)施例10白肉靈芝提取物對(duì)藥物性肝損傷小鼠的作用材料：被測(cè)樣品溶液為實(shí)施例1和實(shí)施例4～8所述的8個(gè)提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。準(zhǔn)確稱(chēng)取各樣品，用0.5％CMC-Na溶液配制100mg/ml溶液，供活性測(cè)試。SPF級(jí)昆明種小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，溫度20～24攝氏度，恒濕50～60％，光照12小時(shí)(8:00～20:00)，隔音，自由攝食、飲水，適應(yīng)環(huán)境一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT試劑盒(批號(hào)20131006)、丙二醛MDA試劑盒(批號(hào)20140502)、谷胱甘肽GSH試劑盒(批號(hào)2040906)購(gòu)自南京建成生物工程研究所。方法：取雄性SPF級(jí)昆明種小鼠，20±2g，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為9組，每組12只。各組分別灌胃給與0.1ml的100mg/ml提取物溶液(相當(dāng)于500mg/kg)，連續(xù)10天，空白組和模型組給予等量的0.5％CMC-Na溶液。末次給藥2小時(shí)后，空白組腹腔注射給予花生油0.2ml，其余各組按照0.1ml/10g體重的給藥劑量給予四氯化碳花生油(0.2％)。禁食不禁水20小時(shí)后，麻醉處死小鼠，心臟取血和肝臟。測(cè)定血清ALT和肝臟MDA、GSH含量。結(jié)果：本模型模擬了藥物性肝損傷，主要是指環(huán)境污染、飲食飲酒及長(zhǎng)期用藥引起的肝損傷，同時(shí)也可以模擬肝細(xì)胞變性、纖維增生而導(dǎo)致的肝硬化、肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂等肝病(施彥等.沙棘籽油對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性肝硬化的保護(hù)作用及參數(shù)分析.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào),2006,19,40-42.)。與對(duì)照組比較，白肉靈芝提取物顯著的抑制了四氯化碳引起的小鼠血清ALT及肝臟MDA含量的升高及GSH含量的降低，對(duì)四氯化碳引起的肝損傷具有保護(hù)作用，見(jiàn)表5。表5分組ALTU/LMDAnmol/gGSHnmol/g空白組37.56±5.85412.58±15.693.98±0.67模型組152.07±26.02##1537.46±240.07##3.12±0.52#GL-1E49.85±15.98**628.74±120.36**4.48±0.54**GL196.67±14.89**1322.58±315.083.69±0.71GL2108.51±25.02*1472.44±222.683.72±0.63GL390.24±17.36**1327.85±231.093.92±0.28*GL4109.4±18.02*1409.37±130.083.61±0.43GL5118.7±27.04*1398.45±317.723.79±0.57GL696.52±12.58**1425.58±265.873.87±0.49GL-6E62.9±15.91**916.28±134.28*4.18±0.46**P<0.05，**P<0.01與模型組相比#P<0.05，##P<0.01與空白組相比實(shí)施例11白肉靈芝提取物對(duì)細(xì)菌性肝損傷小鼠的作用材料：被測(cè)樣品溶液為實(shí)施例1和實(shí)施例4～8所述的8個(gè)提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。準(zhǔn)確稱(chēng)取各樣品，用0.5％CMC-Na溶液配制100mg/ml溶液，供活性測(cè)試。SPF級(jí)昆明種小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，溫度20～24攝氏度，恒濕50～60％，光照12小時(shí)(8:00～20:00)，隔音，自由攝食、飲水，適應(yīng)環(huán)境一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT試劑盒(批號(hào)20131006)購(gòu)自南京建成生物工程研究所。MouseTNF-αELISA試劑盒購(gòu)自R&D公司(美國(guó))。方法：取雄性SPF級(jí)昆明種小鼠，20±2g，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為9組，每組12只。各組分別灌胃給與0.1ml的100mg/ml提取物溶液(相當(dāng)于500mg/kg)，連續(xù)10天，空白組和模型組給予等量的0.5％CMC-Na溶液。末次給藥2小時(shí)后，空白組腹腔注射給予RPMI-1640培養(yǎng)基0.2ml，其余各組按照0.1ml/10g體重的給藥劑量給予LPS(4mg/kg)。禁食不禁水6小時(shí)后，麻醉處死小鼠，心臟取血和肝臟。測(cè)定血清ALT和肝臟TNF-α。結(jié)果：LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌致病的主要因素，本模型用LPS模擬了細(xì)菌性肝損傷，同時(shí)也有報(bào)道表明LPS可加重酒精性肝損傷、四氯化碳肝病及肝硬化引起的肝損傷(VishnyakovaTG,etal.JBiolChem,2003,278(25):22771-22780)。在我們的研究中，與空白對(duì)照組比較，白肉靈芝提取物顯著的抑制了LPS引起的小鼠血清ALT含量的升高及肝臟TNF-α含量的的降低，對(duì)LPS引起的肝損傷具有保護(hù)作用，見(jiàn)表6。表6分組ALTU/LTNF-α(pg/mL)空白對(duì)照組27.56±6.2587.53±10.58模型組102.05±23.08##61.28±12.28GL-1E39.28±6.48**98.25±16.11**GL194.57±12.69*71.47±14.28*GL288.42±24.24*68.55±9.42GL364.24±17.44*65.27±4.72GL479.37±18.22*70.55±5.69GL578.45±27.84*72.29±4.39*GL-664.58±19.25*74.26±5.71*GL-6E52.65±15.11**85.47±14.28***P<0.05，**P<0.01與模型組相比#P<0.05，##P<0.01與空白組相比實(shí)施例12白肉靈芝提取物對(duì)病毒性肝損傷小鼠的作用測(cè)試用腫瘤細(xì)胞：將人肝癌細(xì)胞HepG2.2.15細(xì)胞購(gòu)自解放軍(北京)第302醫(yī)院，用含體積百分含量10％的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)條件均為37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，隔天傳代。被測(cè)樣品溶液：實(shí)施例1和實(shí)施例4～8所述的8個(gè)提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。準(zhǔn)確稱(chēng)取各樣品，用DMSO(二甲亞砜)配制成50mg/ml溶液(制備時(shí)溶于少量DMSO后，再用蒸餾水稀釋至相應(yīng)濃度，控制DMSO的最終體積百分含量<1％)，用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行2倍梯度稀釋?zhuān)?個(gè)濃度，供活性測(cè)試。陽(yáng)性對(duì)照拉米夫定(葛蘭素史克，拉米夫定是核苷類(lèi)似物，抗病毒藥物，對(duì)病毒DNA鏈的合成和延長(zhǎng)有競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，對(duì)體外及實(shí)驗(yàn)性感染動(dòng)物體內(nèi)的乙型肝炎病毒(HBV)有較強(qiáng)的抑制作用。)配制成50mg/ml水溶液(制備時(shí)溶于少量DMSO后，再用蒸餾水稀釋至相應(yīng)濃度，控制DMSO的最終體積百分含量<1％)，用DMEM培養(yǎng)基溶液進(jìn)行2倍梯度稀釋?zhuān)?個(gè)濃度。采用細(xì)胞增殖抑制活性測(cè)試方法(MTT法)測(cè)試樣品的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性。乙肝表面抗原及e抗原檢測(cè)試劑盒為華美生物工程公司產(chǎn)品。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2.2.15，用胰酶消化，制成每毫升含3×104個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，接種于96孔板內(nèi)(每孔100μL)，每組設(shè)3個(gè)平行孔。在37℃下24小時(shí)后加入1μl上述不同濃度的被測(cè)樣品溶液，作為給藥組，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組(1μlDMSO替代上述的被測(cè)樣品溶液)和陽(yáng)性對(duì)照組(1μl不同濃度的拉米夫定溶液替代上述的被測(cè)樣品溶液)，培養(yǎng)11天，收集上清液。用酶聯(lián)免疫法，按照乙肝表面抗原及e抗原檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。藥物對(duì)抗原的抑制率＝(1-給藥組OD值/空白對(duì)照組OD值)×100％，計(jì)算IC50。吸去上清后的細(xì)胞孔中加入100μL含0.4g/L的MTT的RPMI-1640溶液，再培養(yǎng)4小時(shí)，移出培養(yǎng)液后加入150μLDMSO溶解甲臜，在540nm處測(cè)定其吸收度，檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的毒性(％)。抑制率(％)(I)＝(1-給藥組OD值/空白對(duì)照組OD值)×100％，并計(jì)算CC50(藥物半數(shù)毒性濃度，即試驗(yàn)孔存活細(xì)胞為50％時(shí)的藥物濃度)。結(jié)果如表7所示，白肉靈芝提取物具有一定的抗乙肝病毒活性，對(duì)HBsAg和HBeAg都有一定的抑制作用。表7提取物CC50(μg/ml)HBsAgIC50(μg/ml)HBeAgIC50(μg/ml)GL-1E307.9±65.835.72±3.85159.67±16.30GL1>500239.24±34.06383.9±28.91GL2382±39.1268.27±12.09425.8±30.75GL3408.96±29.07305.75±29.87459.8±42.09GL4451.08±35.80325.84±26.70391.7±30.28GL5403.08±12.39401.8±36.54408.7±40.29GL6458.93±18.97368.15±28.79368.47±36.97GL-6E429.85±20.58369.57±29.80261.08±26.30拉米夫定>50037.25±7.8298.28±10.08實(shí)施例13白肉靈芝提取物對(duì)脂肪肝大鼠的作用材料：被測(cè)樣品溶液為實(shí)施例1和實(shí)施例4～8所述的8個(gè)提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。準(zhǔn)確稱(chēng)取各樣品，用0.5％CMC-Na溶液配制100mg/ml溶液，供活性測(cè)試。SD大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，溫度20～24攝氏度，恒濕50～60％，光照12小時(shí)(8:00～20:00)，隔音，自由攝食、飲水，適應(yīng)環(huán)境一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT試劑盒(批號(hào)20131006)、丙二醛MDA試劑盒(批號(hào)20140506)均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。方法：取雄性健康SD大鼠，200±20g，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為8組，每組10只?？瞻讓?duì)照組給予蒸餾水灌胃(10ml/kg)，模型組和給藥組給予脂肪乳劑灌胃(10ml/kg)(脂肪乳劑：豬油25g，膽固醇10g，1g丙賽優(yōu)，加熱融化充分?jǐn)噭颍尤?5ml吐溫80，制成油相。另2g脫氧膽酸鈉、30ml蒸餾水、1，2丙二醇20ml，加熱溶解，制成水相。然后水相和油相充分混勻，即制成脂肪乳劑。)，每天一次，連續(xù)3周。同時(shí)各組大鼠分別每天在給予脂肪乳劑6小時(shí)后，灌胃給與1ml的100mg/ml提取物溶液(相當(dāng)于500mg/kg)，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等量的0.5％CMC-Na溶液。末次給藥后，取血，4攝氏度3000rpm離心，測(cè)定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT、肝勻漿丙二醛MDA含量。結(jié)果：與對(duì)照組比較，上述提取物可以顯著改善大鼠高血脂脂肪肝的情況，對(duì)大鼠血清ALT和肝勻漿MDA也有很好的逆轉(zhuǎn)作用，提示可以保護(hù)高血脂性脂肪肝，結(jié)果見(jiàn)表8。表8*P<0.05，**P<0.01與模型組相比#P<0.05，##P<0.01與空白組相比實(shí)施例14白肉靈芝提取物對(duì)慢性胃炎的作用材料：被測(cè)樣品溶液為實(shí)施例1和實(shí)施例4～8所述的8個(gè)提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。準(zhǔn)確稱(chēng)取各樣品，用0.5％CMC-Na溶液配制100mg/ml溶液，供活性測(cè)試。SPF級(jí)SD大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，溫度20～24攝氏度，恒濕50～60％，光照12小時(shí)(8:00～20:00)，隔音，自由攝食、飲水，適應(yīng)環(huán)境一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。一氧化氮NO試劑盒(批號(hào)20140105)、NOS試劑盒(批號(hào)20130507)購(gòu)自南京建成生物工程研究所、胃泌素試劑盒購(gòu)自解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放免所(批號(hào)130815)。方法：取雄性SPF級(jí)SD大鼠，220±20g，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)取出10只作為空白對(duì)照組，其他大鼠以1.5ml/100g的劑量灌胃給予1.5％的脫氧膽酸鈉，連續(xù)60天，同時(shí)每周灌胃60％乙醇一次。60天后，各給藥組分別灌胃給與1ml的100mg/ml提取物溶液(相當(dāng)于500mg/kg)，連續(xù)30天，空白組和模型組給予等量的0.5％CMC-Na溶液。末次給藥后禁食禁水12小時(shí)，眼眶取血。離心留取血清，采用試劑盒測(cè)定血清NOS、NO和胃泌素的含量。結(jié)果：與對(duì)照組比較，白肉靈芝提取物顯著的改善了胃組織炎癥的病理生化環(huán)境，具有改善胃腸炎癥和消化分泌功能的作用趨勢(shì)，見(jiàn)表9。表9*P<0.05，**P<0.01與模型組相比#P<0.05，##P<0.01與空白組相比實(shí)施例15白肉靈芝提取物對(duì)大鼠乙醇型胃潰瘍的作用材料：被測(cè)樣品溶液為實(shí)施例1和實(shí)施例4～8所述的8個(gè)提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。準(zhǔn)確稱(chēng)取各樣品，用0.5％CMC-Na溶液配制100mg/ml溶液，供活性測(cè)試。SPF級(jí)SD大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，溫度20～24攝氏度，恒濕50～60％，光照12小時(shí)(8:00～20:00)，隔音，自由攝食、飲水，適應(yīng)環(huán)境一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。。方法：取雄性SPF級(jí)SD大鼠，200±20g，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分為9組，各給藥組分別灌胃給與1ml的100mg/ml提取物溶液(相當(dāng)于500mg/kg)，連續(xù)10天，空白組和模型組給予等量的0.5％CMC-Na溶液。末次給藥后禁食禁水2小時(shí)后，大鼠灌胃給予無(wú)水乙醇1ml/200g，1小時(shí)后處死大鼠。剖腹，結(jié)扎賁門(mén)和幽門(mén)，向胃內(nèi)注入4％福爾馬林溶液10ml。取胃，浸入4％福爾馬林溶液固定0.5小時(shí)后，沿胃大彎剖開(kāi)，觀察胃黏膜潰瘍形成情況，并測(cè)量胃潰瘍面積，計(jì)算胃潰瘍抑制率：潰瘍抑制率(％)＝(對(duì)照組潰瘍面積-給藥組潰瘍面積)/對(duì)照組潰瘍面積×100％。結(jié)果：與對(duì)照組比較，白肉靈芝提取物對(duì)無(wú)水乙醇造成的胃潰瘍有顯著的對(duì)抗作用，見(jiàn)表10。表10*P<0.05，**P<0.01與模型組相比#P<0.05，##P<0.01與空白組相比實(shí)施例16白肉靈芝提取物對(duì)致敏小鼠抗原攻擊后支氣管肺灌流液中炎癥細(xì)胞的作用材料：被測(cè)樣品溶液為實(shí)施例1和實(shí)施例4～8所述的8個(gè)提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。準(zhǔn)確稱(chēng)取各樣品，用0.5％CMC-Na溶液配制100mg/ml溶液，供活性測(cè)試。SPF級(jí)昆明種小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，溫度20～24攝氏度，恒濕50～60％，光照12小時(shí)(8:00～20:00)，隔音，自由攝食、飲水，適應(yīng)環(huán)境一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。。方法：取雄性SPF級(jí)昆明種小鼠，20±2g，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分為9組，各給藥組分別灌胃給與0.1ml的100mg/ml提取物溶液(相當(dāng)于500mg/kg)，連續(xù)10天，空白組和模型組給予等量的0.5％CMC-Na溶液。小鼠乙醚麻醉，0.1％卵白蛋白(sigmachemicalCo.,gradeV；用10％的氫氧化鋁凝膠配制)于兩后足掌，兩腹股溝，兩腋下，頸部以及背部共八點(diǎn)皮下注射0.4mL，致敏第10天腹腔注射0.1％卵白蛋白氫氧化鋁凝膠0.2mL再次致敏1次，第2次致敏11天后，用1％的卵白蛋白(生理鹽水配制)霧化吸入進(jìn)行攻擊，每次30分鐘，連續(xù)攻擊6天。每次攻擊前1小時(shí)根據(jù)分組給藥，末次攻擊后24小時(shí)后取出小鼠支氣管進(jìn)行肺泡灌洗。脫臼處死小鼠，縱行剪開(kāi)頸部皮膚，分離暴露氣管，行氣管插管，用灌洗液(Thornwell-Mcdowell溶液：NaCl6.6g,KCl0.46g,CaCl20.05g,NaHCO32.52g,MgCl20.09g,Na2HPO40.1g,加水至1000mL)灌洗，每次0.5mL，共3次，收集支氣管肺泡灌洗液，搖勻后取出50微升，用白細(xì)胞稀釋液稀釋4倍，取少量滴于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，在顯微鏡下計(jì)數(shù)白細(xì)胞總數(shù)。將支氣管肺泡灌洗液低溫1000rpm離心10min后，棄去上清液，用移液器打勻后涂片。涂片室溫干燥，染色6-8min，復(fù)染1分鐘。用自來(lái)水將染料沖洗干凈，在光學(xué)顯微鏡40倍鏡下進(jìn)行白細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算淋巴單核細(xì)胞以及嗜酸性粒細(xì)胞的百分比。結(jié)果：如表11，表明白肉靈芝提取物對(duì)小鼠哮喘模型支氣管肺泡的炎癥細(xì)胞聚集有明顯的抑制作用。表11*P<0.05，**P<0.01與模型組相比#P<0.05，##P<0.01與空白組相比。