專利名稱：一種評價靈芝提取物質量的新方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種評價藥用真菌子實體提取物(固態(tài))質量的方法，特別是靈芝提取物的質量評價指標及其檢測方法，適用于對不同提取方法或制備工藝獲得的靈芝提取物(干膏或干粉狀)進行質量方面的(檢測)評價。
背景技術：
近十多年來，國內基于靈芝提取物及其制劑的藥理學和保健功能學的研究，研發(fā)出許多利用靈芝子實體提取物作為中間原料(intermediate，或稱中間體)的中藥或保健食品類產品；同時，靈芝提取物這類產品還作為藥用植物提取物出口至一些國家。按國家有關規(guī)定，中藥或保健食品類產品均需要建立相應的質量標準和檢測方法。而對產品質量的檢 測與控制的關鍵之一，就是對原材料或中間原料的質量“安全、有效、穩(wěn)定、可控”四大方面進行評價和追溯。2004年4月起實施的《藥用植物及制劑外經貿綠色行業(yè)標準》(WM/T2-2004)規(guī)定了藥用植物及制劑的外經貿綠色行業(yè)標準品質，將重金屬元素和農藥殘留等的限量要求及其檢測方法，作為藥用植物提取物的質量“安全”評價方法。2010版《中華人民共和國藥典(一部)》中收載了連翹、黃芩、銀杏葉和顛茄等48種植物油脂和提取物，建立鑒別、檢查和含量測定等項，進行質量“有效、穩(wěn)定、可控”方面的評價，并規(guī)定相應指標成分的含量下限要求及其測定方法；但不包括靈芝提取物。指紋圖譜(Fingerprint)作為中藥或藥用植物提取這樣復雜樣品體系的質量評價與控制的有效技術手段，已經得到近二十年的應用和發(fā)展。指紋圖譜是建立在中藥化學成分系統(tǒng)研究的基礎上，借助于單用和聯用的色譜或波譜分析技術，獲得能夠標示其化學特征的色譜圖或波譜圖。構建一種中藥指紋圖譜，涉及圖譜信息的提取方法研究、圖譜間相似度計算與比較、以及最終應用時評價標準的制定等。在實際應用中，必須事先建立一個能表征中藥產品化學組成特征的主觀的特征指紋圖譜作為標準指紋圖譜，然后通過計算和比較待測樣品指紋圖譜與標準指紋圖譜之間的相似度，對待測樣品質量(有效、穩(wěn)定、可控)進行評價(如判別真?zhèn)?、品質好壞或質量穩(wěn)定等情況)。而實際上，不同中藥或藥用植物提取物中的指標成分或有效成分的種類和結構各不相同，其指紋圖譜千差萬別，可以說每一種中藥各有各自的指紋圖譜法。因此，指紋圖譜評價方法基于繁雜而系統(tǒng)的研究過程，具有較強的專業(yè)性、較高的技術難度，同時存在一定的偏向性或針對性(特定對象，缺乏通用性)，在實際應用中存在局限性問題。發(fā)明專利CN101676717A (申請?zhí)?00810151484)公開了一種評價中藥制品質量的新方法，提出采用等同度(Equivalence degree)這一可量化的指標參數及其計算公式。實際上，該方法是對現有中藥指紋圖譜各種相似度計算方法的一種改進；在計算獲得目標中藥制品指紋圖譜的等同度E值之后，與設定的標準閾值進行相似性或者趨同性的比較并做出質量評價；還是屬于指紋圖譜法技術范疇。陳體強等報道靈芝浸膏粉中微量元素與氨基酸兩類化學成分的檢測分析(中國中藥雜志.1994，19(2) :97-98)。朱培根等報道生產原料對靈芝浸膏粉質量的影響，檢測比較了不同靈芝提取物多糖和三萜酸成分含量(福建農業(yè)學報.1997，12(3) :39-43)。發(fā)明專利CN1785023A(申請?zhí)?00510019176. 2)分開了一種多糖肽標準品及其制備方法與應用，可用于測定靈芝或靈芝孢子的產品多糖肽含量，從而控制靈芝產品的質量。楊敏和果德安(通訊作者)等在美國質譜學會雜志上發(fā)表SCI論文，提出采用液相色譜質譜聯用方法分析靈芝中的三職酸類成分(Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 2007，18(5) :927-939). 丁平等也報道建立靈芝藥材三萜類化學成分高效薄層色譜(HPTLC)和高效液相(HPLC)的指紋圖譜，并以此評價靈芝藥材的質量(中國藥學雜志，2009，34(17)55-58)以上方法探討利用靈芝提取物中的某類化學成分進行質量檢測與評價，不能直觀地評價不同靈芝提取物或靈芝產品在天然產物活性物質活性差異和變化情況。弓曉峰等報道采用DPPH自由基清除法、鄰苯三酚自氧化法檢測(評價)了赤靈芝和黑靈芝(Ganoderma atrum)不同溶劑提取物(液)的抗氧化作用(食品科學· 2006，27(4) :44-47)。發(fā)明專利 CN 1939351A (申請?zhí)?200510030272. 7)公開了一種檢測靈芝產品質量的方法，以牛血清蛋白為對照品通過對“雙靈堂固” 口服制劑中靈芝多糖肽成分的含量測定，來嚴格控制“雙靈堂固本” 口服制劑生產過程和監(jiān)控產品貯藏期質量。發(fā)·明專利CN 11895296A (申請?zhí)?00510027796. 0)公開了一種檢測靈芝產口服制劑質量的方法，以靈芝多糖和靈芝總三萜含量測定，來嚴格控制“雙靈堂固本” 口服制劑生產過程和監(jiān)控產品貯藏期質量。上述方法適用于液態(tài)的靈芝產品或制劑質量評價與控制，但不適用于固態(tài)的靈芝提取物(中藥制藥或保健食品生產的中間體)。針對靈芝提取物，由于在提取方法、提取物的最終干燥方法上存在的差異，靈芝子實體中多糖等天然活性物質在提取及干燥過程受到熱力學作用的影響而產生的活性損失或降低。同時，在生產后期保存過程(貯藏期)中，多糖等天然活性物質的活性會發(fā)生變化情況。而常規(guī)的理化指標檢測如選擇代表天然活性物質的某種或某類化學成分進行含量測定，是不能直觀地對天然活性物質本身活性上的變化做出量化評價。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供操作簡單，適用性廣的一種評價靈芝提取物質量的新方法。研究證實靈芝的中的天然活性物質如靈芝多糖、靈芝三萜酸等都具有體外抗氧化活性(Antioxidant activity in vitro,簡稱A0A),本發(fā)明方法克服了現有技術中只能針對靈芝中某一些成分對靈芝質量作出評價的局限性，將體外抗氧化活性作為評價靈芝提取物質量的一項通用的理化指標，并建立相對簡單而直觀的檢測方法，能有效的、全面的評價靈芝提取物的質量。為了實現上述目的，本發(fā)明的技術方案為該評價靈芝提取物質量的新方法包括如下步驟(I)體外抗氧化活性AOA的檢測A、樣品溶液的配制稱取靈芝提取物樣品，溶解于80%甲醇溶液或重蒸水中配成靈芝提取物樣品濃度為100-5000 μ g/mL的樣品溶液；B、樣品溶液AOA的值的測定所述的AOA的值包括DPPH ·陽離子自由基清除能力-AOApABTS’+陽離子自由基清除能力-AOA2、超氧陰離子自由基清除能力或羥基陰離子自由基清除能力-A0A3、總抗氧化能力-AOA4和鐵離子還原能力或亞鐵離子螯合能力-AOA5 ；(2)建立樣品溶液的濃度與AOA的清除率的回歸方程或關系曲線根據步驟(I)中B得到的AOA的值，分別建立樣品溶液的濃度與清除率、總抗氧化能力和還原能力五項AOA相應的回歸方程或關系曲線；(3) AOA的半數有效濃度EC5tl的計算根據回歸方程或關系曲線分別計算五項AOA的EC50的值；⑷EC5tl與參考標準值Kkv的比較分別將EC5tl值與相應的參考標準值Kkv比較，做出靈芝提取物的質量定性的初步評價；所述的參考標準值Kkv包括好-趨向性指標為I、合格-趨向性指標為O和不合格_趨向性指標-I， 所述的好-趨向性指標為I的Kev值分別為4(^〈330，A0A2〈2200，A0A3〈870，AOA4 ^ 1400, AOA5 彡 450 ;單位μ g/mL ；所述的合格-趨向性指標為O的Kkv值分別為330 ( AOA1 ( 390，2200 ( AOA2 ( 2600，985 ( A0A3 ( 1185，1600 ( AOA4 ( 1900，525 ( AOA5 ( 615 ;單位μ g/mL ；所述的不合格-趨向性指標為-I的Kev值分別為^>390，A0A2>2600,A0A3>1185, A0A4>1900, A0As>615 ;單位μ g/mL ；(5)靈芝提取物的質量評價根據公式對靈芝提取物質量作出評價，所述的公式為分項評價公式Wi=(Kwi-Kx) / Km,其中，Kx是某項抗氧化活性AOAx, X=I 5的EC50 值,Km 為 300 μ g/mL, Kkv2 為 2000 μ g/mL, Kw3 為 870 μ g/mL, Kev4 為 1400 μ g/mL, Kev5 為450 μ g/mL ；質量評價公式Μ= Σ Mi，其中Mi中到的i的值為I 5，根據質量評價公式計算出M值，按M值大小，可將質量評價結果分為好M > O. 2、合格0. 2彡M彡-O. 2、基本合格-0. 2 > M > -I. 5、不合格M ( -I. 5，根據Mi的正負可以進行定性判定。所述的樣品溶液AOA的值的測定方法為(I)DPPH ·陽離子自由基清除能力-AOA1的測定樣品組取樣品溶液加入新鮮配制的O. 2mmol/L DPPH甲醇溶液，室溫25°C避光反應30min，所述的樣品溶液與DPPH甲醇溶液兩種溶液的體積比為1:1 ;空白對照組用重蒸水代替樣品溶液，其余同樣品組；以80%甲醇溶液為空白調零，在517nm波長處分別測定樣品組和空白對照組的吸光值，按公式清除率/%=[1_4 / AJ X 100計算清除率(％)，平行測定三次取平均值，式中A0為空白對照組的吸光值，A1為樣品組的吸光值；(2)ABTS‘+陽離子自由基清除能力-AOA2的測定ABTS ·+陽離子自由基溶液的制備取7mmol/L的ABTS與2. 45mmol/L的過硫酸鉀等體積混合，23°C暗處反應12 16h，即得ABTS ·+陽離子自由基溶液；樣品組用80%乙醇稀釋ABTS ·+陽離子自由基溶液，稀釋后的溶液在30°C、734nm波長處的吸光值在O. 7±0. 02之間，得ABTS ‘+工作溶液，取ABTS ‘+工作溶液加入樣品溶液中，搖勻后于23°C放置6min，所述的ABTS‘+工作溶液與樣品溶液兩種溶液的體積比為3. 9:0. I ;空白對照組用80%乙醇代替樣品溶液，其余同樣品組；以80%甲醇溶液為空白調零，在734nm波長處分別測定樣品組和空白對照組的吸光值，按公式清除率AzKl-A1 / AJ X 100計算清除率(％)，平行測定三次取平均值，式中Atl為空白對照組的吸光值，A1為樣品組的吸光值；(3)超氧陰離子自由基清除能力或羥基陰離子自由基清除能力-AOA3的測定超氧陰離子自由基清除能力的測定采用NBT還原法或鄰苯三酚自氧化法測定超氧陰離子自由基清除能力。NBT還原法樣品組取樣品溶液，依次加入均由pH 7. 4的O. lmol/L磷酸鹽緩沖液配制的156 μ mol/L NBT溶液和468 μ mol/L還原性輔酶I溶液混勻，從加入由pH 7. 4的O. lmol/L磷酸鹽緩沖液配制的60 μ mol/L吩嗪二甲酯硫酸鹽PMS溶液開始計時，室溫25°C反應5min，所述的樣品溶液、NBT溶液、還原性輔酶I溶液和吩嗪二甲酯硫酸鹽PMS溶液四種溶液的體積比為1:1:1:1 ;其中，樣品對照組用磷酸鹽緩沖液代替NBT溶液；空白對照 組用80%甲醇溶液代替樣品溶液，其余同樣品組；并以80%甲醇溶液和磷酸鹽緩沖液分別代替樣品溶液和NBT溶液，進行空白調零，在560nm波長處分別測定樣品組、樣品對照組和空白對照組的吸光值，按公式清除率AcFtl-Mi-Aj / AJ X100計算清除率(％)，平行測定三次取平均值，式中Atl為空白對照組的吸光值，A1為樣品組的吸光值，A2為樣品對照組的吸光值；鄰苯三酚自氧化法樣品組取樣品溶液加入pH 8. 2的0. lmol/L Tris-HCl緩沖液，于25°C水浴20min,加入25°C預熱過的10mmol/L鄰苯三酹溶液,迅速混均后每隔30s在325nm波長處測定樣品組的吸光值，共測4min，推遲30s后加入I滴lOmmol/L HCl溶液中止反應并測定樣品組的終止吸光值，所述的樣品溶液、Tris-HCl緩沖液和鄰苯三酚溶液三種溶液的體積比為1:4. 5:0. 5 ;空白對照組用lOmmol/L HCl溶液替代鄰苯三酚溶液，其余同樣品組；以重蒸水調零，按公式清除率(W) = Iil-(AAci-AAx) / AAJ X 100計算清除率(%)，平行測定三次取平均值，式中AAtl為空白對照組的吸光值在4min的變化量；AAx為樣品組加入樣品溶液后的吸光值在4min的變化量；羥基陰離子自由基清除能力的測定樣品組依序加入等體積的9mmol/L 必04溶液、9mmol/L水楊酸-乙醇溶液、樣品溶液和9mmol/L過氧化氫溶液，于37 V反應30min.；其中，樣品對照組用重蒸水代替水楊酸-乙醇溶液；空白對照組用重蒸水代替樣品溶液；以重蒸水調零，在510nm波長處分別測定樣品組和空白對照組的吸光值，按公式清除率(%) = [I-(A1-A2)] / AtlX 100計算清除率(％)，平行測定三次取平均值，式中Atl為空白對照組的吸光值，A1為樣品組的吸光值，A2為樣品對照組的吸光值；(4)總抗氧化能力-AOA4的測定采用磷鑰絡合物法，樣品組取樣品溶液加入反應液混勻得混合液，所述的樣品溶液與反應液兩種溶液的體積比為0. I: I,混勻后的混合液在95°C反應90min,冷卻至室溫，所述的反應液為0. 6mmol/L的硫酸、28mmol/L的磷酸鈉和4mmol/L的鑰酸銨；空白對照組用80%甲醇溶液代替樣品溶液調零，在695nm波長處分別測定樣品組和空白對照組的吸光值，平行測定三次取平均值，以吸光值表示總抗氧化能力；(5)鐵離子還原能力或亞鐵離子螯合能力-AOA5的測定鐵離子還原能力的測定采用普魯士藍法，樣品組取樣品溶液加PH6. 6的磷酸鹽緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液混勻后50°c水浴20min，然后加10%的三氯乙酸溶液，搖勻后靜置IOmin得混合液，所述的樣品溶液、磷酸鹽緩沖液、鐵氰化鉀溶液和三氯乙酸溶液四種溶液的體積比為1:1:1:1 ;取混合液依序加重蒸水和O. 1%氯化鐵溶液，搖勻，靜置lOmin，混合液、重蒸水和氯化鐵溶液體積比為5:5:1 ;空白對照組用80%甲醇溶液代替樣品溶液；以重蒸水調零，在700nm波長處分別測定樣品組和空白對照組的吸光值，平行測定三次取平均值，以吸光值表示還原能力；螯合亞鐵離子能力的測定樣品組取樣品溶液依序加入O. lmmol/L硫酸亞鐵溶液，O. 25mmol/L菲洛嗪甲醇溶液混勻，暗處放置lOmin，所述的樣品溶液、硫酸亞鐵溶液和菲洛嗪(Ferrozin)甲醇溶液三種溶液的體積比為1:1:1 ;其中樣品對照組用等體積重蒸水代替Ferrozine溶液代替；空白對照組用重蒸水代替樣品溶液；以重蒸水調零，在562nm波長處分別測定樣品組和對照組的吸光值，按公式螯合率/^[I-(A1-A2)AJ XlOO計算螯合率(%)，式中A0為空白對照組吸光值,A1為樣品組吸光值， A2為樣品對照組吸光值。所述的靈芝提取物包括赤芝(Ganoderma Iucidum)子實體的干膏或浸膏粉類提取物產品。由于在靈芝提取物中添加一種以上的抗氧化劑，會影響檢測結果，因此如果檢測結果出現I 2項AOA指標趨向合格，而其它3-4項均趨向不合格，需警惕摻假或以次充好的行為，而在不合格的靈芝提取物中加入微量的天然抗氧化劑，情況又會變得復雜，因此本發(fā)明僅針對真實的靈芝提取物，不針對摻雜或摻假的靈芝提取物進行檢測。本發(fā)明采用以上技術方案，通過建立系統(tǒng)的靈芝提取物的質量評價方法，直觀地評價了不同靈芝提取物或靈芝產品在天然產物活性物質的活性差異和變化情況，克服了現有技術中只能針對靈芝中某一些成分對靈芝質量作出評價的局限性，將體外抗氧化活性作為評價靈芝提取物質量的一項通用的理化指標，并建立相對簡單而直觀的檢測方法，能有效的、全面的評價靈芝提取物的質量。可為目前靈芝的生產、加工以及制成的產品等提供一種周期短、簡單易行、操作簡便、適用范圍廣的質量評價方法。


圖I為靈芝提取物中粗多糖成分的檢測報告I ;圖2為靈芝提取物中粗多糖含量的檢測報告2 ；圖3為靈芝提取物中總三萜酸成分的高效液相圖譜。
具體實施例方式本發(fā)明的技術方案為準備試劑①DPPH · (1，I-二苯基-2-苦基肼自由基)，②ABTS (2，2-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)和過硫酸鉀(potassium persulfate, K2S2O8) ;@NBT(氯化硝基四氮唑藍)、NADH(還原性輔酶I)和PMS(吩嗪二甲酯硫酸鹽)磷酸鈉、鑰酸銨；⑤鐵氰化鉀、氯化鐵和三氯乙酸等。通用試劑重蒸水、甲醇、80%甲醇、磷酸鹽緩沖液(pH6.6和ρΗ7· 4)分析儀器為進口或國產的紫外掃描分光光度計或紫外可見分光光度計，波長范圍190 900nm或190 llOOnm，分辨率為0. Inm或準確度±0. 3nm (開機自動校準)。
該評價靈芝提取物質量的新方法包括如下步驟(I)體外抗氧化活性AOA的檢測A、樣品溶液的配制稱取靈芝提取物樣品，溶解于80%甲醇溶液或重蒸水中配成靈芝提取物樣品濃度為100-5000 μ g/mL的樣品溶液；B、樣品溶液AOA的值的測定所述的AOA的值包括DPPH 陽離子自由基清除能力-AOApABTS’+陽離子自由基清除能力-AOA2、超氧陰離子自 由基清除能力或羥基陰離子自由基清除能力-Α0Α3、總抗氧化能力-AOA4和鐵離子還原能力或亞鐵離子螯合能力-AOA5 ；(2)建立樣品溶液的濃度與AOA的清除率的回歸方程或關系曲線根據步驟(I)中B得到的AOA的值，分別建立樣品溶液的濃度與清除率、總抗氧化能力和還原能力五項AOA相應的回歸方程或關系曲線；(3) AOA的半數有效濃度EC5tl的計算根據回歸方程或關系曲線分別計算五項AOA的EC50的值；⑷EC5tl與參考標準值Kkv的比較分別將EC5tl值與相應的參考標準值Kkv比較，做出靈芝提取物的質量定性的初步評價；所述的參考標準值Kkv包括好-趨向性指標為I、合格-趨向性指標為O和不合格_趨向性指標-I，所述的好-趨向性指標為I的Kev值分別為4(^〈330，A0A2〈2200，A0A3〈870,AOA4 ^ 1400, AOA5 彡 450 ;單位μ g/mL ；所述的合格-趨向性指標為O的Kkv值分別為330 ( AOA1 ( 390，2200 ( AOA2 ( 2600，985 ( A0A3 ( 1185，1600 ( AOA4 ( 1900,525 ( AOA5 ( 615 ;單位μ g/mL ；所述的不合格-趨向性指標為-I的Kev值分別為^>390，A0A2>2600,A0A3>1185, A0A4>1900, A0As>615 ;單位μ g/mL ；(5)靈芝提取物的質量評價根據公式對靈芝提取物質量作出評價，所述的公式為分項評價公式Wi=(Kwi-Kx) / Km,其中，Kx是某項抗氧化活性AOAx, X=I 5的EC50 值,Km 為 300 μ g/mL, Kkv2 為 2000 μ g/mL, Kw3 為 870 μ g/mL, Kev4 為 1400 μ g/mL, Kev5 為450 μ g/mL ；質量評價公式Μ= Σ Mi，其中Mi中到的i的值為I 5，根據質量評價公式計算出M值，按M值大小，可將質量評價結果分為好M > O. 2、合格0. 2彡M彡-O. 2、基本合格-0. 2 > M > -I. 5、不合格M ( -I. 5，根據Mi的正負可以進行定性判定。所述的樣品溶液AOA的值的測定方法為(I)DPPH ·陽離子自由基清除能力-AOA1的測定樣品組取樣品溶液加入新鮮配制的O. 2mmol/L DPPH甲醇溶液，室溫25°C避光反應30min，所述的樣品溶液與DPPH甲醇溶液兩種溶液的體積比為1:1 ;空白對照組用重蒸水代替樣品溶液，其余同樣品組；以80%甲醇溶液為空白調零，在517nm波長處分別測定樣品組和空白對照組的吸光值，按公式清除率/%=[1_4 / AJ X 100計算清除率(％)，平行測定三次取平均值，式中A0為空白對照組的吸光值，A1為樣品組的吸光值；(2)ABTS‘+陽離子自由基清除能力-AOA2的測定
ABTS ·+陽離子自由基溶液的制備取7mmol/L的ABTS與2. 45mmol/L的過硫酸鉀等體積混合，23°C暗處反應12 16h，即得ABTS ·+陽離子自由基溶液；樣品組用80%乙醇稀釋ABTS ·+陽離子自由基溶液，稀釋后的溶液在30°C、734nm波長處的吸光值在O. 7±0. 02之間，得ABTS ‘+工作溶液，取ABTS ‘+工作溶液加入樣品溶液中，搖勻后于23°C放置6min，所述的ABTS‘+工作溶液與樣品溶液兩種溶液的體積比為3. 9:0. I ;空白對照組用80%乙醇代替樣品溶液，其余同樣品組；以80%甲醇溶液為空白調零，在734nm波長處分別測定樣品組和空白對照組的吸光值，按公式清除率AzKl-A1 / AJ X 100計算清除率(％)，平行測定三次取平均值，式中Atl為空白對照組的吸光值，A1為樣品組的吸光值；(3)超氧陰離子自由基清除能力或羥基陰離子自由基清除能力-AOA3的測定超氧陰離子自由基清除能力的測定采用NBT還原法或鄰苯三酚自氧化法測定超氧陰離子自由基清除能力。
NBT還原法樣品組取樣品溶液，依次加入均由pH 7. 4的O. lmol/L磷酸鹽緩沖液配制的156 μ mol/L NBT溶液和468 μ mol/L還原性輔酶I溶液混勻，從加入由pH 7. 4的
O.lmol/L磷酸鹽緩沖液配制的60 μ mol/L吩嗪二甲酯硫酸鹽PMS溶液開始計時，室溫25°C反應5min，所述的樣品溶液、NBT溶液、還原性輔酶I溶液和吩嗪二甲酯硫酸鹽PMS溶液四種溶液的體積比為1:1:1:1 ;其中，樣品對照組用磷酸鹽緩沖液代替NBT溶液；空白對照組用80%甲醇溶液代替樣品溶液，其余同樣品組；并以80%甲醇溶液和磷酸鹽緩沖液分別代替樣品溶液和NBT溶液，進行空白調零，在560nm波長處分別測定樣品組、樣品對照組和空白對照組的吸光值，按公式清除率/%=[1-%-4) / AJ X100計算清除率(％)，平行測定三次取平均值，式中Atl為空白對照組的吸光值，A1為樣品組的吸光值，A2為樣品對照組的吸光值；鄰苯三酚自氧化法樣品組取樣品溶液加入pH 8. 2的0. lmol/L Tris-HCl緩沖液，于25°C水浴20min,加入25°C預熱過的10mmol/L鄰苯三酹溶液,迅速混均后每隔30s在325nm波長處測定樣品組的吸光值，共測4min，推遲30s后加入I滴lOmmol/L HCl溶液中止反應并測定樣品組的終止吸光值，所述的樣品溶液、Tris-HCl緩沖液和鄰苯三酚溶液三種溶液的體積比為1:4. 5:0. 5 ;空白對照組用IOmmoI/L HCl溶液替代鄰苯三酚溶液，其余同樣品組；以重蒸水調零，按公式清除率(W) = Iil-(AAci-AAx) / AAJ X 100計算清除率(%)，平行測定三次取平均值，式中AAtl為空白對照組的吸光值在4min的變化量；AAx為樣品組加入樣品溶液后的吸光值在4min的變化量；羥基陰離子自由基清除能力的測定樣品組依序加入等體積的9mmol/L 必04溶液、9mmol/L水楊酸-乙醇溶液、樣品溶液和9mmol/L過氧化氫溶液，于37 V反應30min.；其中，樣品對照組用重蒸水代替水楊酸-乙醇溶液；空白對照組用重蒸水代替樣品溶液；以重蒸水調零，在510nm波長處分別測定樣品組和空白對照組的吸光值，按公式清除率(% ) = [I-(A1-A2)] / AtlX 100計算清除率(％)，平行測定三次取平均值，式中Atl為空白對照組的吸光值，A1為樣品組的吸光值，A2為樣品對照組的吸光值；(4)總抗氧化能力-AOA4的測定采用磷鑰絡合物法，樣品組取樣品溶液加入反應液混勻得混合液，所述的樣品溶液與反應液兩種溶液的體積比為0. I: I,混勻后的混合液在95°C反應90min,冷卻至室溫，所述的反應液為O. 6mmol/L的硫酸、28mmol/L的磷酸鈉和4mmol/L的鑰酸銨；空白對照組用80%甲醇溶液代替樣品溶液調零，在695nm波長處分別測定樣品組和空白對照組的吸光值，平行測定三次取平均值，以吸光值表示總抗氧化能力；(5)鐵離子還原能力或亞鐵離子螯合能力-AOA5的測定鐵離子還原能力的測定采用普魯士藍法，樣品組取樣品溶液加PH6. 6的磷酸鹽緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液混勻后50°C水浴20min，然后加10%的三氯乙酸溶液，搖勻后靜置IOmin得混合液，所述的樣品溶液、磷酸鹽緩沖液、鐵氰化鉀溶液和三氯乙酸溶液四種溶液的體積比為1:1:1:1 ;取混合液依序加重蒸水和O. 1%氯化鐵溶液，搖勻，靜置lOmin，混合液、重蒸水和氯化鐵溶液體積比為5:5:1 ;空白對照組用80%甲醇溶液代替樣品溶液；以重蒸水調零，在700nm波長處分別測定樣品組和空白對照組的吸光值，平行測定三次取平均值，以吸光值表示還原能力；
螯合亞鐵離子能力的測定樣品組取樣品溶液依序加入O. lmmol/L硫酸亞鐵溶液，O. 25mmol/L菲洛嗪甲醇溶液混勻，暗處放置lOmin，所述的樣品溶液、硫酸亞鐵溶液和菲洛嗪(Ferrozin)甲醇溶液三種溶液的體積比為1:1:1 ;其中樣品對照組用等體積重蒸水代替Ferrozine溶液代替；空白對照組用重蒸水代替樣品溶液；以重蒸水調零，在562nm波長處分別測定樣品組和對照組的吸光值，按公式螯合率/^[I-(A1-A2)AJ X 100計算螯合率(%)，式中A0為空白對照組吸光值,A1為樣品組吸光值，A2為樣品對照組吸光值。所述的靈芝提取物包括赤芝(Ganoderma Iucidum)子實體的干膏或浸膏粉類提取物產品。實施例I :本發(fā)明在不同保存期的靈芝提取物質量評價上的應用。I.體外抗氧化活性AOA的檢測。配制待測定樣品溶液采用雙超提取法(超微粉碎后超聲波循環(huán)提取法)提取靈芝，靈芝提取物樣品為浸膏粉，采用噴霧干燥工藝；封口包裝后于陰涼避光處(18°C)保存。樣品I保存3個月，樣品2保存6個月，樣品3保存12個月，樣品4保存18個月。分別進行DPPH 陽離子自由基清除能力-AOAp ABTS·+陽離子自由基清除能力-AOA2、超氧陰離子自由基清除能力或羥基陰離子自由基清除能力-Α0Α3、總抗氧化能力-AOA4和鐵離子還原能力或亞鐵離子螯合能力-AOA5的測定。2.分別建立樣品溶液的濃度和AOA的清除率的回歸方程或關系曲線。3.根據上述建立的回歸方程或關系曲線計算得到不同保存期的半數有效濃度(EC5tl值)。結果如表I所示
表I不同保存期靈芝提取物的體外抗氧化活性ECw值(MgZmL)~ft i'l'i AOA1AOA2AOA3AOA4 ~AOA5~
~ 24519788671384448______
230620878781394455
~33662773Π09 789596
~4427326212381950672 4.將上述步驟得到的5項AOA指標的EC5tl值(表I)與參考標準值Kkv進行比較，做出質量初步評價(I)樣品I (保存3個月)的趨向性指數為1，質量較好。(2)樣品2(保存6個月)的質量趨向性略低于樣品1，但指數仍然為1，質量完全合格。其中，除AOAJg標值(DPPH·自由基EC5tl值)增大較明顯外，AOA2 (ABTS ·+自由基EC50值)、AOA3 ( · 02_自由基EC5tl值)、AOA4 (總抗氧化能力EC5tl值)和AOA5 (還原力抗氧化能力EC50值)等其它4項體外抗氧化活性指標的增長并不明顯。(3)樣品3 (保存12個月)的質量趨向性指數為0，質量基本合格。隨著保存期的增長，其5項體外抗氧化活性指標較樣品2均有明顯的下降(EC5tl值增大)。(4)樣品4 (保存18個月)的趨向性指數為-1，質量不合格；其5項指標均明顯超出參考標準值。5.在上述步驟基礎上進行公式計算，根據結果(表2)并做出質量評價結論
權利要求
1.一種評價靈芝提取物質量的新方法，其特征在于該方法包括如下步驟 (1)體外抗氧化活性AOA的檢測 A、樣品溶液的配制稱取靈芝提取物樣品，溶解于80%甲醇溶液或重蒸水中配成靈芝提取物樣品濃度為100-5000 μ g/mL的樣品溶液； B、樣品溶液AOA的值的測定所述的AOA的值包括DPPH·陽離子自由基清除能力-AOApABTS’+陽離子自由基清除能力-AOA2、超氧陰離子自由基清除能力或羥基陰離子自由基清除能力-Α0Α3、總抗氧化能力-AOA4和鐵離子還原能力或亞鐵離子螯合能力-AOA5 ； (2)建立樣品溶液的濃度與AOA的清除率的回歸方程或關系曲線根據步驟⑴中B得到的AOA的值，分別建立樣品溶液的濃度與清除率、總抗氧化能力和還原能力五項AOA相應的回歸方程或關系曲線； (3)AOA的半數有效濃度EC5tl的計算根據回歸方程或關系曲線分別計算五項AOA的EC50的值； (4)EC50與參考標準值Kw的比較分別將EC5tl值與相應的參考標準值Kkv比較，做出靈芝提取物的質量定性的初步評價； 所述的參考標準值Kkv包括好-趨向性指標為I、合格-趨向性指標為O和不合格-趨向性指標-1，所述的好-趨向性指標為I的Kkv值分別為4(^〈330，A0A2<2200, A0A3〈870，AOA4 ^ 1400, AOA5 彡 450 ;單位μ g/mL ； 所述的合格-趨向性指標為O的Kkv值分別為330 ( AOA1 ( 390，2200 ( AOA2 ( 2600，985 ( A0A3 ( 1185，1600 ( AOA4 ( 1900,525 ( AOA5 ( 615 ;單位μ g/mL ； 所述的不合格-趨向性指標為-I的Kkv值分別為4(^>390，A0A2>2600, A0A3>1185,A0A4>1900, A0A5>615 ;單位μ g/mL ； (5)靈芝提取物的質量評價根據公式對靈芝提取物質量作出評價，所述的公式為分項評價公式=Mi= (Km-Kx) / Km，其中，Kx是某項抗氧化活性AOAx，x=l 5的EC5tl值，Kkvi為300 μ g/mL, Kev2 為 2000 μ g/mL, KEV3 為 870 μ g/mL, Kev4 為 1400 μ g/mL, Kev5 為 450 μ g/mL ； 質量評價公式Μ= Σ Mi，其中Mi中到的i的值為I 5，根據質量評價公式計算出M值，按M值大小，可將質量評價結果分為好M>0. 2、合格0. 2彡M彡-O. 2、基本合格-0.2> M > -I. 5、不合格M ( -I. 5，根據Mi的正負可以進行定性判定。
2.根據權利要求I所述的一種評價靈芝提取物質量的新方法，其特征在于所述的樣品溶液AOA的值的測定方法為 (1)DPPH·陽離子自由基清除能力-AOA1的測定 樣品組取樣品溶液加入新鮮配制的O. 2mmol/L DPPH甲醇溶液，室溫25°C避光反應30min，所述的樣品溶液與DPPH甲醇溶液兩種溶液的體積比為1:1 ;空白對照組用重蒸水代替樣品溶液，其余同樣品組；以80%甲醇溶液為空白調零，在517nm波長處分別測定樣品組和空白對照組的吸光值，按公式清除率AzKl-A1 / AJ X 100計算清除率(％)，平行測定三次取平均值，式中Atl為空白對照組的吸光值，A1為樣品組的吸光值； (2)ABTS‘+陽離子自由基清除能力-AOA2的測定 ABTS ·+陽離子自由基溶液的制備取7mmol/L的ABTS與2. 45mmol/L的過硫酸鉀等體積混合，23°C暗處反應12 16h，即得ABTS ·+陽離子自由基溶液；樣品組用80%乙醇稀釋ABTS ·+陽離子自由基溶液，稀釋后的溶液在30°C、734nm波長處的吸光值在O. 7±O. 02之間，得ABTS ‘+工作溶液，取ABTS ‘+工作溶液加入樣品溶液中，搖勻后于23°C放置6min，所述的ABTS‘ +工作溶液與樣品溶液兩種溶液的體積比為3. 9:0. I ;空白對照組用80%乙醇代替樣品溶液，其余同樣品組；以80%甲醇溶液為空白調零，在734nm波長處分別測定樣品組和空白對照組的吸光值，按公式清除率/%=[1_4 / AJ X 100計算清除率(％)，平行測定三次取平均值，式中A0為空白對照組的吸光值，A1為樣品組的吸光值； (3)超氧陰離子自由基清除能力或羥基陰離子自由基清除能力-AOA3的測定 超氧陰離子自由基清除能力的測定采用NBT還原法或鄰苯三酚自氧化法測定超氧陰離子自由基清除能力。
NBT還原法樣品組取樣品溶液，依次加入均由pH 74的O. lmol/L磷酸鹽緩沖液配制的156ymol/L NBT溶液和468 μ mol/L還原性輔酶I溶液混勻，從加入由pH 7. 4的O. Imol/L磷酸鹽緩沖液配制的60 μ mol/L吩嗪二甲酯硫酸鹽PMS溶液開始計時，室溫25°C反應5min，所述的樣品溶液、NBT溶液、還原性輔酶I溶液和吩嗪二甲酯硫酸鹽PMS溶液四種溶液的體積比為1:1:1:1 ;其中，樣品對照組用磷酸鹽緩沖液代替NBT溶液；空白對照組用80%甲醇溶液代替樣品溶液，其余同樣品組；并以80%甲醇溶液和磷酸鹽緩沖液分別代替樣品溶液和NBT溶液，進行空白調零，在560nm波長處分別測定樣品組、樣品對照組和空白對照組的吸光值，按公式清除率/%=[1-(4-4) / AJ X 100計算清除率(％)，平行測定三次取平均值，式中A0為空白對照組的吸光值，A1為樣品組的吸光值，A2為樣品對照組的吸光值； 鄰苯三酚自氧化法樣品組取樣品溶液加入PH 8. 2的O. lmol/L Tris-HCl緩沖液，于25°C水浴20min，加入25°C預熱過的10mmol/L鄰苯三酚溶液，迅速混均后每隔30s在325nm波長處測定樣品組的吸光值，共測4min，推遲30s后加入I滴10mmol/L HCl溶液中止反應并測定樣品組的終止吸光值，所述的樣品溶液、Tris-HCl緩沖液和鄰苯三酚溶液三種溶液的體積比為1:4. 5:0. 5 ;空白對照組用IOmmoI/L HCl溶液替代鄰苯三酚溶液，其余同樣品組；以重蒸水調零，按公式清除率(t5Zo) = Iil-(AAci-AAx) / Δ Aj X 100計算清除率(％),平行測定三次取平均值，式中AAtl為空白對照組的吸光值在4min的變化量；AAx為樣品組力口入樣品溶液后的吸光值在4min的變化量； 羥基陰離子自由基清除能力的測定樣品組依序加入等體積的9mmol/L FeSO4溶液、9mmol/L水楊酸-乙醇溶液、樣品溶液和9mmol/L過氧化氫溶液，于37°C反應30min.;其中，樣品對照組用重蒸水代替水楊酸-乙醇溶液；空白對照組用重蒸水代替樣品溶液；以重蒸水調零，在510nm波長處分別測定樣品組和空白對照組的吸光值，按公式清除率(%)=[I-(A1-A2)] / AtlXlOO計算清除率(％)，平行測定三次取平均值，式中AO為空白對照組的吸光值，A1為樣品組的吸光值，A2為樣品對照組的吸光值； (4)總抗氧化能力-AOA4的測定 采用磷鑰絡合物法，樣品組取樣品溶液加入反應液混勻得混合液，所述的樣品溶液與反應液兩種溶液的體積比為0. 1: 1，混勻后的混合液在95°C反應90min，冷卻至室溫，所述的反應液為0. 6mmol/L的硫酸、28mmol/L的磷酸鈉和4mmol/L的鑰酸銨；空白對照組用80%甲醇溶液代替樣品溶液調零，在695nm波長處分別測定樣品組和空白對照組的吸光值，平行測定三次取平均值，以吸光值表示總抗氧化能力； (5)鐵離子還原能力或亞鐵離子螯合能力-AOA5的測定· 鐵離子還原能力的測定采用普魯士藍法，樣品組取樣品溶液加PH6.6的磷酸鹽緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液混勻后50°C水浴20min，然后加10%的三氯乙酸溶液，搖勻后靜置IOmin得混合液，所述的樣品溶液、磷酸鹽緩沖液、鐵氰化鉀溶液和三氯乙酸溶液四種溶液的體積比為1:1:1:1 ;取混合液依序加重蒸水和O. 1%氯化鐵溶液，搖勻，靜置lOmin，混合液、重蒸水和氯化鐵溶液體積比為5:5:1 ;空白對照組用80%甲醇溶液代替樣品溶液；以重蒸水調零，在700nm波長處分別測定樣品組和空白對照組的吸光值，平行測定三次取平均值，以吸光值表示還原能力； 螯合亞鐵離子能力的測定樣品組取樣品溶液依序加入O. lmmol/L硫酸亞鐵溶液，O. 25mmol/L菲洛嗪甲醇溶液混勻，暗處放置lOmin，所述的樣品溶液、硫酸亞鐵溶液和菲洛嗪(Ferrozin)甲醇溶液三種溶液的體積比為1:1:1 ;其中樣品對照組用等體積重蒸水代替Ferrozine溶液代替；空白對照組用重蒸水代替樣品溶液；以重蒸水調零，在562nm波長處分別測定樣品組和對照組的吸光值，按公式螯合率X 100計算螯合率(%)，式中A0為空白對照組吸光值，A1為樣品組吸光值，A2為樣品對照組吸光值?！?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及一種評價靈芝提取物質量的新方法，該方法包括如下步驟(1)體外抗氧化活性AOA的檢測；(2)建立樣品溶液的濃度與AOA的清除率的回歸方程或關系曲線；(3)AOA的半數有效濃度EC50的計算；(4)EC50與參考標準值KRV的比較；(5)靈芝提取物的質量評價。本發(fā)明通過建立系統(tǒng)的靈芝提取物的質量評價方法，直觀地評價了不同靈芝提取物或靈芝產品在天然產物活性物質的活性差異和變化情況，克服了現有技術中只能針對靈芝中某一些成分對靈芝質量作出評價的局限性，將體外抗氧化活性作為評價靈芝提取物質量的一項通用的理化指標，并建立相對簡單而直觀的檢測方法，能有效的、全面的評價靈芝提取物的質量。
文檔編號G01N21/31GK102914506SQ20121038219
公開日2013年2月6日 申請日期2012年10月9日 優(yōu)先權日2012年10月9日
發(fā)明者陳體強, 吳錦忠, 黃啟東, 吳巖斌, 吳建國 申請人:福建省農業(yè)科學院食用菌研究所