專利名稱：一種靈芝水提物的質(zhì)量控制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥品或保健品質(zhì)量分析方法，具體涉及一種靈芝水提物的質(zhì)量控制方法。
背景技術(shù)：
靈芝為多孔菌科真菌赤芝fefloofe/ma lucidum (Leyss. ex Fr. ) Karst.或紫芝Ganoderma sinense Zhao, Xu et Zhang 或松杉靈芝 fefloofe/ma tsugae Murr.的干燥子實(shí)體，具有補(bǔ)氣安神、止咳平喘等功效。靈芝提取工藝主要有水提與醇提，而多數(shù)采用水提工藝，即米用多孔菌科真菌赤芝(fefloofe/ma lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst.)、紫芝{Ganoderma sinnese Zhao, Xu et Zhang)及松杉靈芝(fefloofe/ma tsugae Murr·)的干 燥子實(shí)體經(jīng)水提取、濃縮、干燥后制得。故本發(fā)明采用靈芝水提物命名。研究表明，靈芝中主要含有多糖、三萜、核苷、生物堿、黃酮、氨基酸及微量元素等多種化學(xué)成分。目前，對(duì)靈芝藥理活性研究主要集中在靈芝多糖和靈芝三萜類成分，因此，靈芝多糖和三萜類成分作為靈芝的最主要功效成分，很有必要對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定。本發(fā)明在一系列實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)保健食品原料靈芝水提物標(biāo)志性成分的測(cè)定方法進(jìn)行了研究。靈芝多糖是靈芝中的主要活性成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、降血糖等多種藥理活性。目前，某些企業(yè)為了達(dá)到干燥甚至虛報(bào)靈芝多糖含量的目的，常在靈芝水提物中加入糊精、淀粉等各種輔料。若按2010年版中國(guó)藥典的方法測(cè)定，將造成靈芝多糖測(cè)定結(jié)果偏高。本研究通過水提醇沉法提取靈芝粗多糖，用銅試劑沉淀其中具有葡聚糖結(jié)構(gòu)的多糖，采用紫外分光光度法測(cè)定其含量，排除了輔料對(duì)測(cè)定的影響，為靈芝水提物質(zhì)量控制提供依據(jù)。靈芝三萜類化合物是靈芝的另一主要藥效成分，由于具有抗癌，抗炎，抗氧化等藥理活性而備受關(guān)注。本發(fā)明人在采用高效液相色譜法對(duì)靈芝水提物三萜類成分進(jìn)行研究中發(fā)現(xiàn)，靈芝水提物中含有含量相對(duì)較高的靈芝酸A、B、C2。對(duì)比目前常用的比色法測(cè)定總?cè)坪康姆椒?，特異性?qiáng)，可達(dá)到鑒別和質(zhì)量控制的目的。

發(fā)明內(nèi)容
為了有針對(duì)性地控制產(chǎn)品質(zhì)量，本發(fā)明采用粗多糖含量和靈芝酸八3、(2含量之和作為靈芝水提物的質(zhì)量控制指標(biāo)，提供了一種靈芝水提物的質(zhì)量控制方法。本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下
以靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸C2含量之和以及粗多糖含量作為靈芝水提物的質(zhì)量控制指標(biāo)。所述靈芝酸A、B含量的檢測(cè)方法如下
(I)對(duì)照品溶液的制備
取減壓干燥至恒重的靈芝酸A、B對(duì)照品，加入甲醇制成每Iml含164 μ g靈芝酸A和含52 μ g靈芝酸B的混標(biāo)溶液。
( 2 )供試品溶液的制備
取靈芝水提物O. 5 g，置25 ml容量瓶中，加甲醇適量超聲處理10 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過。(3)高效液相色譜檢測(cè) 以辛烷基鍵合硅膠為填充劑，乙腈為流動(dòng)相A，O. I %醋酸水溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為257 nm;柱溫為22 °C ;流速為I. O ml/min ;理論板數(shù)按靈芝酸A計(jì)算，應(yīng)不低于5000 ;分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μ 1，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。所述靈芝酸C2含量的檢測(cè)方法如下
(I)對(duì)照品溶液的制備
取減壓干燥至恒重的靈芝酸C2對(duì)照品，加甲醇制成每I ml含33 μ g靈芝酸C2的對(duì)照品溶液。(2)供試品溶液的制備
取靈芝水提物O. 5 g，置25 ml容量瓶中，加甲醇適量超聲處理10 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過。(3)高效液相色譜檢測(cè)
以十八烷基鍵合硅膠為填充劑，乙腈為流動(dòng)相A，O. I %醋酸水溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為257 nm ;柱溫為20°C ;流速為I. O ml/min ;理論板數(shù)按靈芝酸C2計(jì)算，應(yīng)不低于5000 ;分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μ 1，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。所述粗多糖含量的檢測(cè)方法如下
(I)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
取干燥至恒重的葡聚糖對(duì)照品適量，精密稱量，加水制成每I ml含葡聚糖I mg的溶液。分別精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液O. 1,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8、I. O ml至10. O ml量瓶中，加水稀釋至刻度，分別吸取上述溶液2. O ml至25 ml比色管中，加入50 g/L苯酚溶液I. O ml，混勻，精密加入濃硫酸10. O ml，混勻，置水浴中煮沸2 min，混勻，冷卻至室溫后用分光光度計(jì)在485 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以相應(yīng)的試劑為空白，以葡聚糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)供試品溶液的制備
取靈芝水提物O. 4 g，置50 ml錐形瓶中，加水25. O ml，超聲10 min，濾過；吸取濾液
5.0ml至50 ml離心管中，緩慢加入無水乙醇20 ml，邊加邊搖勻，4 °C放置12 h，取出，3000 r/min離心8 min,棄去上清液,沉淀加水溶解并轉(zhuǎn)移至10. O ml容量瓶中，加水定容，搖勻；吸取上述定容后的溶液2. O ml,置于15 ml離心管中，加入100 g/L氫氧化鈉溶液
2.0ml、銅試劑2. O ml,置于沸水浴中煮沸3 min,冷卻至室溫，3000 r/min離心8 min,棄去上清液；沉淀用10 %硫酸溶液2. O ml溶解并轉(zhuǎn)移至10. O ml容量瓶中，加水定容，搖勻，即得。(3)樣品測(cè)定
吸取供試品溶液2. O ml，照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下，自“加入50 g/L苯酚溶液I. O ml”起，依法測(cè)定吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到葡聚糖的含量。
標(biāo)志性成分指標(biāo)為測(cè)定的粗多糖含量> 30. 7mg/g,以葡聚糖計(jì)；靈芝酸A、B、C2含量之和，以干燥品計(jì)，赤芝、松杉靈芝水提物彡13. 3mg/g，紫芝水提物彡I. 8mg/g。本研究通過水提醇沉法提取靈芝粗多糖，用銅試劑沉淀其中具有葡聚糖結(jié)構(gòu)的多糖，采用紫外分光光度法測(cè)定其含量，排除了輔料對(duì)測(cè)定的影響，為靈芝水提物質(zhì)量控制提供依據(jù)。赤芝、紫芝及松杉靈芝均含有相對(duì)含量較高的特征成分靈芝酸A、B、C2。對(duì)比目前常用的比色法測(cè)定總?cè)坪康姆椒?，特異性?qiáng)，可達(dá)到鑒別和質(zhì)量控制的目的。


圖I為靈芝酸A、B混標(biāo)溶液色譜圖，峰I :靈芝酸B,峰2 :靈芝酸A。
圖2為供試品溶液色譜圖，峰I :靈芝酸B，峰2 :靈芝酸A。圖3為靈芝酸C2對(duì)照品溶液色譜圖，峰3 :靈芝酸C2。圖4為供試品溶液色譜圖，峰3 :靈芝酸C2。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中的本品指的是靈芝水提物的供試樣品。實(shí)施例I粗多糖含量的測(cè)定 Al. I原理
試樣中相對(duì)分子質(zhì)量大于I X IO4的高分子物質(zhì)在80%乙醇溶液中沉淀，與水溶液中單糖和低聚糖分離，用堿性二價(jià)銅試劑選擇性地從其他高分子物質(zhì)中沉淀具有葡聚糖結(jié)構(gòu)的多糖，用苯酚-硫酸反應(yīng)生成橙紅色化合物，通過比色測(cè)定其含量，其顯色強(qiáng)度與粗多糖中葡聚糖的含量成正比，以此計(jì)算本產(chǎn)品中粗多糖的含量。Al. 2 試劑
Al. 2. I試劑與材料 Al. 2. I. I乙醇分析純。Al. 2. I. 2濃硫酸分析純。Al. 2. I. 3氫氧化鈉溶液(100 g/L):稱取25 g氫氧化鈉，加水溶解并稀釋至250ml ο加入固體無水硫酸鈉至飽和，備用。Al. 2. I. 4銅試劑儲(chǔ)備液稱取O. 75 g CuSO4 ·5Η20，7. 5g檸檬酸鈉，加水溶解并稀釋至250 ml,混勻備用。Al. 2. I. 5銅試劑溶液取銅試劑儲(chǔ)備液50 ml，加水50 ml，混勻后加入固體無水硫酸鈉12. 5 g并使其溶解。臨時(shí)配用。Al. 2. 1.6苯酚(50 g/L):稱取苯酚5. O g，加水稀釋至100 ml，混勻，其溶液置于
冰箱中可保存一個(gè)月。Al. 2. I. 7葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液取分子量500000、干燥至恒重的葡聚糖對(duì)照品適量，精密稱量，加水制成每I ml含葡聚糖I mg的溶液。Al. 3 儀器
Al. 3. I紫外分光光度計(jì)。Al. 3. 2超聲波清洗器。
Al. 3· 3 離心機(jī)(3000 r/min)。Al. 4分析步驟
Al. 4. I標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
分別精密吸取葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液O. 1、0. 2、0.4、0. 6、0.8、1.0 ml至10. O ml量瓶中，加水稀釋至刻度，分別吸取上述溶液2. O ml至25 ml比色管中，加入50 g/L苯酚溶液I. Oml，混勻，精密加入濃硫酸10. O ml，混勻，置水浴中煮沸2 min,混勻，冷卻至室溫后用分光光度計(jì)在485 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以相應(yīng)的試劑為空白，以葡聚糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。Al. 4. 2樣品溶液的制備
精密稱取本品O. 4 g，置50 ml錐形瓶中，加水25. O ml，超聲10 min，濾過。吸取濾液
5.0ml至50 ml離心管中，緩慢加入無水乙醇20 ml，邊加邊搖勻，4 °C放置12 h，取出，以3000 r/min離心8 min，棄去上清液，沉淀加水溶解并轉(zhuǎn)移至10. O ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。吸取上述溶液2.0 ml，置于15 ml離心管中，加入100 g/L氫氧化鈉溶液
2.0ml、銅試劑2. O ml,置于沸水浴中煮沸3 min,冷卻至室溫，以3000 r/min離心8 min,棄去上清液。沉淀用10 %硫酸溶液2.0 ml溶解并轉(zhuǎn)移至10. O ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。同時(shí)按上述步驟做樣品空白。Al. 4. 3樣品測(cè)定
吸取樣品溶液2.0 ml置25 ml比色管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下，自“加入50 g/L苯酚溶液I. O ml ”起，依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出葡聚糖的重量，計(jì)算，即得。Al. 4. 4結(jié)果計(jì)算
r (Wa-ITO)X Vix Vsx Vs ~TOxV2xV4x￥e~
X—樣品中粗多糖的含量(以葡聚糖計(jì))，mg/g
In1一樣品測(cè)定液中葡聚糖的質(zhì)量，mg
m2—樣品空白液中葡聚糖質(zhì)量，mg
m3—樣品質(zhì)量，g
V1 一樣品提取液總體積，ml
V2—沉淀粗多糖所用樣品提取液體積，ml
V3—粗多糖溶液體積，ml
V4—沉淀葡聚糖所用粗多糖溶液體積，ml
V5—樣品測(cè)定液總體積，ml
V6—測(cè)定用樣品溶液體積，ml
Al. 4. 5允許差
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的10 %。實(shí)施例2靈芝酸A、B、C2鑒別及總量的測(cè)定 A2. I原理
試樣以甲醇作為溶劑，超聲提取，靈芝酸A、靈芝酸B經(jīng)高效液相色譜柱(C8)分離；靈芝酸C2經(jīng)高效液相色譜柱(C18)分離，分別用紫外檢測(cè)器(UV)檢測(cè)，根據(jù)色譜峰的保留時(shí)間定性，峰面積外標(biāo)法定量，分別測(cè)定試樣中靈芝酸A、B和靈芝酸C2的含量，并計(jì)算其總量。A2. 2 試劑
A2. 2. I 水純化水。A2.2.2 乙腈色譜純。A2.2.3冰乙酸分析純。A2.2.4甲醇分析純。A2. 2. 5靈芝酸A、B、C2對(duì)照品純度彡98 %，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所提供。A2. 3 儀器
A2. 3. I高效液相色譜儀(紫外檢測(cè)器)。A2. 3. 2超聲波清洗器。A2. 4分析步驟
A2. 4. I靈芝酸A、B測(cè)定 A2. 4. I. I色譜條件
以辛烷基鍵合硅膠為鍵合相(色譜柱Agilent Zorbax-SB C8 150 mm X 4.6 mm,3.5 μ m或同類規(guī)格色譜柱)，乙腈為流動(dòng)相A，O. I %醋酸水溶液為流動(dòng)相B，按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為257 nm ;柱溫為22 V ;流速為I. O ml/min。表I流動(dòng)相梯度洗脫方式
權(quán)利要求
1.一種靈芝水提物的質(zhì)量控制方法，其特征在于以靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸C2含量之和以及粗多糖含量作為靈芝水提物的質(zhì)量控制指標(biāo)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的靈芝水提物的質(zhì)量控制方法，其特征在于 所述靈芝酸A、B含量的檢測(cè)方法如下 (1)對(duì)照品溶液的制備 取減壓干燥至恒重的靈芝酸A、B對(duì)照品，加入甲醇制成每I ml含164 Ug靈芝酸A和含52 μ g靈芝酸B的混標(biāo)溶液； (2)供試品溶液的制備 取靈芝水提物O. 5 g，置25 ml容量瓶中，加甲醇超聲處理10 min，冷卻，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過； (3)高效液相色譜檢測(cè) 以辛烷基鍵合硅膠為填充劑，乙腈為流動(dòng)相A，O. I %醋酸水溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為257 nm;柱溫為22 °C ;流速為I. O ml/min ;理論板數(shù)按靈芝酸A計(jì)算，應(yīng)不低于5000 ;分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μ 1，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得; 所述靈芝酸C2含量的檢測(cè)方法如下 (1)對(duì)照品溶液的制備 取減壓干燥至恒重的靈芝酸C2對(duì)照品，加甲醇制成每I ml含33 yg靈芝酸C2的對(duì)照品溶液； (2)供試品溶液的制備 取靈芝水提物O. 5 g，置25 ml容量瓶中，加甲醇超聲處理10 min，冷卻，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過； (3)高效液相色譜檢測(cè) 以十八烷基鍵合硅膠為填充劑，乙腈為流動(dòng)相A，O. I %醋酸水溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為257 nm ;柱溫為20°C ;流速為I. O ml/min ;理論板數(shù)按靈芝酸C2計(jì)算，應(yīng)不低于5000 ;分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μ 1，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的靈芝水提物的質(zhì)量控制方法，其特征在于所述粗多糖含量的檢測(cè)方法如下 (1)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制取干燥至恒重的葡聚糖對(duì)照品，加水制成每I ml含葡聚糖I mg的溶液，分別精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液O. 1、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1.0 ml至10. O ml量瓶中，加水稀釋至刻度，分別吸取上述溶液2. O ml至25 ml比色管中，加入50 g/L苯酚溶液I. O ml，混勻，精密加入濃硫酸10. O ml，混勻，置水浴中煮沸2 min，混勻，冷卻至室溫后用分光光度計(jì)在485 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以相應(yīng)的試劑為空白，以葡聚糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； (2)供試品溶液的制備 取靈芝水提物O. 4 g，置50 ml錐形瓶中，加水25. O ml，超聲10 min，濾過；吸取濾液.5.0ml至50 ml離心管中，緩慢加入無水乙醇20 ml，邊加邊搖勻，4 °C放置12 h，取出，.3000 r/min離心8 min,棄去上清液,沉淀加水溶解并轉(zhuǎn)移至10. 0 ml容量瓶中，加水定容，搖勻；吸取上述定容后的溶液2. O ml,置于15 ml離心管中，加入100 g/L氫氧化鈉溶液.2.0ml、銅試劑2. O ml,置于沸水浴中煮沸3 min,冷卻至室溫，3000 r/min離心8 min,棄去上清液；沉淀用10 %硫酸溶液2. O ml溶解并轉(zhuǎn)移至10. O ml容量瓶中，加水定容，搖勻，即得； (3)樣品測(cè)定 吸取供試品溶液2. O 1111，根據(jù)步驟(1)，自“加入50 g/L苯酚溶液I. O ml”起，依法測(cè)定吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到葡聚糖的含量。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的靈芝水提物的質(zhì)量控制方法，其特征在于測(cè)定的粗多糖含量≥30. 7mg/g,以葡聚糖計(jì)；靈芝酸A、B、C2含量之和，以干燥品計(jì)，赤芝、松杉靈芝水提物≥13. 3mg/g,紫芝水提物≥I. 8mg/g。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種藥品或保健品質(zhì)量分析方法，具體涉及一種靈芝水提物的質(zhì)量控制方法。為了有針對(duì)性地控制產(chǎn)品質(zhì)量，本發(fā)明采用粗多糖含量和靈芝酸A、B、C2含量之和作為靈芝水提物的質(zhì)量控制指標(biāo)本研究通過水提醇沉法提取靈芝粗多糖，用銅試劑沉淀其中具有葡聚糖結(jié)構(gòu)的多糖，采用紫外分光光度法測(cè)定其含量，排除了輔料對(duì)測(cè)定的影響，為靈芝水提物質(zhì)量控制提供依據(jù)。赤芝、紫芝及松杉靈芝均含有相對(duì)含量較高的特征成分靈芝酸A、B、C2。對(duì)比目前常用的比色法測(cè)定總?cè)坪康姆椒ǎ禺愋詮?qiáng)，可達(dá)到鑒別和質(zhì)量控制的目的。
文檔編號(hào)G01N21/31GK102735772SQ20121022276
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月2日
發(fā)明者盧端萍, 吳長(zhǎng)輝, 李曄, 王勇, 范明, 蔣婷婷, 陳碩 申請(qǐng)人:福建仙芝樓生物科技有限公司, 福建省藥品檢驗(yàn)所