白肉靈芝提取物的制備抗病毒藥物的用途及抗病毒藥物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種白肉靈芝提取物的新用途，具體涉及一種白肉靈芝提取物的用于制備抗病毒藥物的用途。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供一種白肉靈芝的新用途，能有效抑制皰疹病毒，用于制備抗病毒藥物特別是用于制備抗皰疹病毒藥物，具有很好的藥用價值。CCTCC NO：M201608720160307
【專利說明】
白肉靈芝提取物的制備抗病毒藥物的用途及抗病毒藥物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種白肉靈芝提取物的新用途，具體涉及一種白肉靈芝提取物的抗病 毒用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 靈芝(Ganoderma)在中國有悠久的藥用歷史，長期被人們用于氣管炎、肝炎、高血 壓、腫瘤、免疫力紊亂等病癥的輔助治療?，F(xiàn)代的藥理和臨床研究結(jié)果也表明靈芝含有抑制 腫瘤和調(diào)節(jié)免疫的活性成分。自D0NK(1948)建立靈芝科(Ganodermataceae)以來，目前全世 界已報道的靈芝科大型真菌共200余種，我國有記載的靈芝有103種，其中14種已被人們所 利用。目前在國內(nèi)應(yīng)用廣泛的品種包括赤芝（Ganoderma lucidum)，紫芝（Ganoderma sinense)等，靈芝屬的許多其它種類也具有類似的效果，值得進一步研究。
[0003] 單純皰疹病毒(Herpes simple Virus，HSV)是一個發(fā)病率高、全球廣泛分布的人 類皰疹病毒，人類是唯一的天然寄主。感染后可以造成皮膚、口腔和生殖器等部位的原發(fā)/ 復(fù)發(fā)性皰疹，出現(xiàn)皮膚潰瘍、丘疹、炎癥等現(xiàn)象。單純皰疹病毒屬于皰疹病毒科中的α-皰疹 病毒亞科，有HSV-1和HSV-2兩個血清型。HSV病毒顆粒由內(nèi)核、衣殼、被膜和囊膜組成。HSV-1 主要感染軀體上半部，典型癥狀為口腔皰疹、皰疹性角膜炎脫落和皰疹性腦炎。免疫缺陷者 或新生兒被感染會導(dǎo)致嚴重疾病如中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。HSV-1導(dǎo)致的腦炎若不及時治療可 能會危及生命?？笻SV藥物經(jīng)歷50多年的發(fā)展，早期的抗HSV藥物以碘苷為代表，其選擇性 低，對正常細胞毒性大?，F(xiàn)在臨床上用于治療HSV的藥物常為阿昔洛韋(ACV，ac ycl〇Vir)，但 因其抗病毒譜窄，易產(chǎn)生耐藥性且價格昂貴，嚴重的限制了臨床應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] -方面，本發(fā)明提供一種白肉靈芝提取物的用于制備抗病毒藥物用途。
[0005] 優(yōu)選的，上述提取物為有機溶劑提取物。
[0006] 優(yōu)選的，上述提取物為醇提取物，進一步優(yōu)選為乙醇提取物。
[0007] 優(yōu)選的，上述病毒為皰疹病毒，進一步優(yōu)選為HSV病毒，例如HSV-1病毒。
[0008] 優(yōu)選的，上述白肉靈芝為白肉靈芝Ganoderma leucocontextum HMGIM-Z110122， 保藏編號為CCTCC NO: Μ 2016087。
[0009] 本發(fā)明上述的白肉靈芝采自西藏林芝地區(qū)波密縣扎西崗鄉(xiāng)的闊葉林中，經(jīng)鑒定為 白肉靈芝新菌種，并且組織分離獲得原始菌株，命名為白肉靈芝Ganoderma leucocontextum HMG頂-Z110122,已于2016年3月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（簡 稱CCTCC，地址為：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路珞珈山），保藏編號為CCTCC Ν0:Μ 2016087)。
[0010] 上述白肉靈芝CCTCC Μ 2016087新菌種的栽培方法，包括組織分離菌種后制作母 種，制作原種，制作生產(chǎn)種，栽培培養(yǎng)及出芝管理。
[0011] 在一個優(yōu)選的實施例中，上述白肉靈芝新菌種的栽培方法中制作母種的培養(yǎng)基為 綜合PDA培養(yǎng)基，所述綜合PDA斜面的配方按質(zhì)量百分比計為馬鈴薯18-20%、葡萄糖1.5-2%、瓊脂2-2.5%、磷酸二氫鉀0.15-0.3%、硫酸鎂0.05-0.15%、維生素 B1微量，其余為水。
[0012] 在一個優(yōu)選的實施例中，上述白肉靈芝新菌種的栽培方法中制作原種的原種料的 原料組成按質(zhì)量百分比計為高粱75-79%、小米16-20%、CaC0 3l-2%、含水量55-60%。
[0013] 在一個優(yōu)選的實施例中，上述白肉靈芝新菌種的栽培方法中制作生產(chǎn)種的生產(chǎn)種 料的原料組成按質(zhì)量百分比計為棉籽殼87-89%、麩皮10-12%、CaC0 3l-2%或棉籽殼48-52%、木肩25-30%、麩皮18-20%、碳酸鈣1-2%、硫酸鈣1-2%，含水量55-60%。
[0014] 在一個優(yōu)選的實施例中，上述白肉靈芝新菌種的栽培方法中栽培料的原料組成按 質(zhì)量百分比計為木肩75-78%、麩皮20-22%、CaC0 3l-2%，含水量60-65%
[0015]本發(fā)明提供一種優(yōu)選的白肉靈芝CCTCC Μ 2016087新菌種的栽培方法，包括以下 步驟：
[0016] (1)制作母種:采集組織分離的菌種白肉靈芝，將菌種無菌接至綜合roA斜面，置于 20-25Γ培養(yǎng)箱中恒溫暗培養(yǎng)，直至菌絲長滿斜面即得生產(chǎn)母種，其中所述綜合TOA斜面的 配方按質(zhì)量百分比計為馬鈴薯18-20%、葡萄糖1.5-2%、瓊脂2-2.5%、磷酸二氫鉀0.15_ 0.3%、硫酸鎂0.05-0.15%、維生素 B1微量，其余為水；
[0017] (2)制作原種：將生產(chǎn)母種無菌接入原種袋中，置于25°C培養(yǎng)箱中恒溫暗培養(yǎng)，至 菌絲吃滿料后即得原種，其中原種料的原料組成按質(zhì)量百分比計為高粱75-79%、小米16_ 20%、0&0)31-2%、含水量55-60%，將所述原種料裝入菌種袋中，制得原種袋 ；
[0018] (3)制作生產(chǎn)種：將原種無菌接入生產(chǎn)種袋中，置于25°C培養(yǎng)箱中恒溫暗培養(yǎng)，至 菌絲吃滿料后即得生產(chǎn)種，其中生產(chǎn)種料的原料組成按質(zhì)量百分比計為棉籽殼87-89%、麩 皮10-12%、CaC03l-2%或棉籽殼48-52%、木肩25-30%、麩皮18-20%、碳酸鈣1-2%、硫酸 鈣1-2%，含水量55-60%，將所述將生產(chǎn)種料裝入菌種袋中，制得生產(chǎn)種袋；
[0019] (4)接種栽培:將生產(chǎn)種無菌接入栽培料袋中，在25°C±rC培養(yǎng)室中避光培養(yǎng)，待 栽培袋中的菌絲長滿栽培料后，繼續(xù)遮光后熟培養(yǎng)至菌絲完成后熟期，其中栽培料的原料 組成按質(zhì)量百分比計為木肩75-78 %、麩皮20-22 %、CaC03l-2%，含水量60-65 %，將所述栽 培料裝入菌種袋中，制得栽培袋；
[0020] (5)出芝管理：調(diào)節(jié)溫度為20-21°C、濕度85-90%、光照100-2001UX，不通氣，保持 C〇2含量在2000ppm以上至長出原基，調(diào)整溫度為26-28°C、空氣相對濕度85-90%、光照約 200-3001ux，不通氣，繼續(xù)保持C0 2含量在2000ppm以上，待菌柄伸長期結(jié)束并進入菌蓋生長 期時，通氣，調(diào)整溫度為26-28°C，濕度85-95 %，光照300-5001ux，通氣，保持⑶2含量小于 1200ppm，至菌蓋的白邊完全變黃時，采摘。
[0021] 優(yōu)選的，上述步驟(4)中的培養(yǎng)室的空氣相對濕度為60-70%。
[0022] 本發(fā)明的白肉靈芝CCTCC Μ 2016087子實體具有以下的形態(tài)特征和外觀特征： [0023] 菌蓋10-20*5-10cm,近柄處厚2_3cm，扇形或半圓形扇形，大部分紅至紅褐色，幼嫩 時及成熟時邊緣白至淺黃色，漸變黃至紅褐色，成熟后接近菌柄部分呈暗紅褐色、暗紫紅褐 色或幾乎黑紅褐色，具漆樣光澤，具同心環(huán)紋，常有弱的放射狀皺紋。
[0024] 孔口表面新鮮時白色至奶油色，受傷處帶褐色至褐色?？卓诮鼒A形，每毫米4-6個。 菌管長達4-6_，不分層，赭色到淡灰褐色或灰褐色。
[0025]菌肉厚達2.2cm，白色，干后白至近白色或微帶奶油色，軟木栓質(zhì)至木栓質(zhì)，近表皮 有一薄的帶褐色緊密層(皮殼）。
[0026] 菌柄5-8*3.5-5.5cm，圓柱形至略扁，側(cè)生至偏生，有時近無柄，暗紅褐色至暗紫褐 色，具光澤，內(nèi)部白色。
[0027] 孢子廣橢圓形，頂端平截，淺褐色，雙層壁，內(nèi)壁具小刺，非淀粉質(zhì)，包括最外孢層 時為9.5-12.5*7-9μπι，不包括最外孢層時為8.0-9.0*5-6.5μπι。
[0028] 本發(fā)明的另一方面還提供一種抗病毒藥物，包括上述的白肉靈芝提取物和藥學(xué)上 可接受的載體。
[0029] 本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明提供一種白肉靈芝的新用途，能有效抑制皰疹病毒， 用于制備抗病毒藥物，特別是用于制備抗皰疹病毒藥物，具有很好的藥用價值。
【附圖說明】
[0030] 圖1是實施例1的白肉靈芝的栽培得到的子實體圖。
【具體實施方式】
[0031] 以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步說明。
[0032] 實施例1:
[0033]白肉靈芝(CCTCC Μ 2016087)的人工栽培方法，包括以下步驟：
[0034] 1)按質(zhì)量百分比計為馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂2%、磷酸二氫鉀0.3%、硫酸鎂 0.15 %及微量維生素 Β1、其余為水的原料組成常規(guī)制作綜合PDA斜面，0.1 IMPa大氣壓、121 °C高溫高壓濕熱滅菌30min;
[0035] 2)按質(zhì)量百分比計為高粱78%、小米20%、CaC032%的原料組成，含水量60%，制 作原種料，將原種料裝入13cmX25cm的耐高溫透明聚丙烯菌種袋中，用小木棒在袋料中打 洞，洞深至袋底，再在袋口套上塑料環(huán)，并扣上配套的蓋子，制得原種袋，折合每原種袋裝干 料300g;
[0036] 3)按質(zhì)量百分比計為棉籽殼89%、麩皮10%、CaC03l %的原料組成，含水量55%， 制作生產(chǎn)種料，將生產(chǎn)種料裝入15cmX3〇Cm的耐高溫透明聚丙烯菌種袋中，用小木棒在袋 料中打洞，洞深至袋底，再在袋口套上塑料環(huán)，并扣上配套的蓋子，制得生產(chǎn)種袋，折合每生 產(chǎn)種袋裝干料350g;
[0037] 4)按質(zhì)量百分比計為木肩78%、麩皮20%、CaC032%的原料組成，含水量60%，制 作栽培料，將栽培料裝入17cmX 35cm的耐高溫透明聚丙烯菌種袋中，用小木棒在袋料中打 洞，洞深至袋底，再在袋口套上塑料環(huán)，并扣上配套的蓋子，制得栽培袋，折合每袋裝干料 500g；
[0038] 5)制作母種:采集組織分離的菌種白肉靈芝CCTCC Μ 2016087,將菌種無菌接至綜 合PDA斜面，置于25°C培養(yǎng)箱中恒溫暗培養(yǎng)，直至菌絲長滿斜面(約7天左右）即得生產(chǎn)母種；
[0039] 6)制作原種:將生產(chǎn)母種無菌接入原種袋中，接種時確保母種料塊埋入原種料中， 然后置于25°C培養(yǎng)箱中恒溫暗培養(yǎng)，至菌絲吃滿料后(約25天左右）即得原種；
[0040] 7)制作生產(chǎn)種:將原種無菌接入生產(chǎn)種袋中，置于25°C培養(yǎng)箱中恒溫暗培養(yǎng)，至菌 絲吃滿料后即得生產(chǎn)種；
[0041 ] 8)接種栽培:將生產(chǎn)種無菌接入栽培料袋中，在25 °C ± 1°C、空氣相對濕度60-70 % 的培養(yǎng)室中避光培養(yǎng)，待栽培袋中的菌絲長滿栽培料后(大約30-35d)，繼續(xù)遮光后熟培養(yǎng) 15d至菌絲完成后熟期，切下套環(huán)及老種塊；
[0042] 9)出芝管理：調(diào)節(jié)溫度為20-2TC、濕度85-90%、光照100-20011^，不通氣，保持 C〇2含量在2000ppm以上至長出原基，調(diào)節(jié)溫度為26-28°C、空氣相對濕度85-90%、光照約 200-3001ux，不通氣，繼續(xù)保持C02含量在2000ppm以上，待菌柄伸長期結(jié)束并進入菌蓋生長 期時，通氣，調(diào)整溫度為26-28°C，濕度85-95 %，光照300-5001ux，通氣，保持⑶2含量小于 1200ppm，至菌蓋的白邊完全變黃時，采摘。
[0043] 本實施例栽培得到的白肉靈芝如圖1所示。
[0044] 實施例2:抗病毒試驗
[0045] 1、試劑及儀器
[0046] 非洲綠猴腎細胞（African green monkeykidney，Vero)(ATCC CCL-81TM)來源于 美國菌種保藏中心(ATCC);
[0047] HSV-1 病毒受贈于COHEN和EISENBERG(University of Pennsylvania)，保存于中 國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院實驗室；
[0048] Dulbecco's Modified Eagle Media(DMEM)培養(yǎng)液、胰酶和乙二胺四乙酸(EDTA); 組織培養(yǎng)板;胎牛血清(FBS);噻唑藍(MTT)二甲基亞砜(DMS0)均為商購；
[0049] Olympus 1X71顯微鏡;Synergy HT多功能微孔板檢測儀。
[0050] 2、試驗方法
[00511 2.1乙醇提取物的獲得:將待提取樣品以粉碎機粉碎后，用95 %乙醇在80 °C回流提 取3小時、2小時及1小時，合并三次濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至膏狀，60°C以下烘干，得到待提取 樣品的乙醇提取物。
[0052] 2.2非洲綠猴腎細胞細胞(代仰細胞)培養(yǎng):加入10%質(zhì)量百分比的?83至01^1培養(yǎng) 液中，接種非洲綠猴腎細胞至培養(yǎng)液中，接種濃度為每毫升1.5 X 105個，將接種的細胞懸液 再接種于96孔組織培養(yǎng)板上，每孔100yL，置于37 °C、5 % C02的組織培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;
[0053] 2.3病毒抑制率測定方法：
[0054]將待側(cè)樣品的乙醇提取物用DMEM培養(yǎng)液倍比稀釋成5個濃度(分別為5000ug/ml、 2500ug/ml、1250ug/ml、625ug/ml和312 · 5ug/ml)，得到稀釋好的樣品液，陽性對照ACV為 12.5ug/ml濃度的抗病毒藥物阿昔洛韋，），陰性對照為不加入提取物的培養(yǎng)液(空白溶劑）。 [0055]取對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的Vero細胞以1.5 X104個/孔的密度接種96孔細胞 培養(yǎng)板，過夜培養(yǎng)，至長成細胞單層。
[0056] 將病毒HSV-1用DMEM培養(yǎng)液稀釋成0.5M0I/50ul溶液。向上述得到的細胞單層中分 別加入稀釋好的樣品液或?qū)φ?，每孔加?0ul，隨后立即加入稀釋好的病毒液，每孔50ul。 輕輕振蕩均勻。37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后進行β-Gal糖苷酶活性檢測。
[0057] β-Gal糖苷酶活性檢測：吸棄混合液，每孔加入100ul 1 %NP40細胞裂解液，放置5- 10min，中途十字振蕩三次。每孔吸取50ul裂解物加到96孔酶標板或96孔細胞培養(yǎng)板上，隨 后加入50ul的β-Gal活性檢測底物緩沖液，輕輕振動混勻。超級酶標儀上進行570nm動態(tài)光 吸收的測定。測定條件為37°C，測570nm光吸收值，每2min讀數(shù)一次，連續(xù)25次讀數(shù)，中途振 蕩。結(jié)果單位為milli-optical density units per min(m0D/min)。根據(jù)公式計算每個濃 度樣品乙醇提取物對病毒的抑制率：
[0058] 抑制率=(陰性對照孔測量值一樣品孔測量值)/陰性對照孔測量值X 100%
[0059] 利用SPSS19的probit regression計算樣品乙醇提取物對HSV-1病毒的半數(shù)抑制 濃度IC50。
[0060] 3、抑制病毒試驗：
[0061] 本實施例的樣品分別為：
[0062] 樣品1:實施例1栽培得到的白肉靈芝Ganoderma leucocontextum;
[0063] 樣品2:商購的靈芝Ganoderma lingzhi(廣東粵微）；
[0064] 樣品3:人工栽培得到的赤芝Ganoderma lucidum
[0065] 樣品4:人工栽培得到的重傘靈芝Ganoderma multipileum
[0066] 樣品5:人工栽培得到的銅色靈芝Ganoderma cupreum。
[0067] 采用2.1的乙醇提取物的方法分別對樣品1至樣品5分別進行乙醇提取物的提取， 得到樣品1至樣品5的乙醇提取物。
[0068] 采用2.2的方法對￥6仰細胞進行培養(yǎng)，再將批￥_1病毒和培養(yǎng)的￥6仰細胞共培養(yǎng) 72h后，收集細胞于-80°C保存。
[0069]采用2.3的方法測定病毒抑制率，計算得到各樣品乙醇提取物的半數(shù)抑制濃度 IC50,結(jié)果如表1所示。
[0070] 表1:5個樣品的乙醇提取物的IC50結(jié)果
[0071]
[0072]表1可以發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的白肉靈芝乙醇提取物對HSV-1的半數(shù)抑制濃度顯著低于靈 芝和赤芝的乙醇提取物及其他的重傘靈芝及銅色靈芝等的乙醇提取物，與其他四個樣品相 比，本發(fā)明的白肉靈芝乙醇提取物均顯示出更強的對HSV-1的抑制性能，這表明，白肉靈芝 乙醇提物抗HSV-1病毒的活性遠大于赤芝、靈芝、重傘靈芝及銅色靈芝等乙醇提取物的抗 HSV-1病毒的活性。
[0073]以上所述，僅為本發(fā)明的較佳的具體實施例，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其 構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 白肉靈芝提取物的用于制備抗病毒藥物的用途。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的所述的白肉靈芝提取物的用于制備抗病毒藥物的用途，其特征在 于，所述提取物為有機溶劑提取物。3. 根據(jù)權(quán)利要求2的所述的白肉靈芝提取物的用于制備抗病毒藥物的用途，其特征在 于，所述提取物為醇提取物。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的白肉靈芝提取物的用于制備抗病毒藥物的用途，其特征在于， 所述醇為乙醇。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一權(quán)利要求所述的白肉靈芝提取物的用于制備抗病毒藥物 的用途，其特征在于，所述病毒為皰疹病毒。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的白肉靈芝提取物的用于制備抗病毒藥物的用途，其特征在于， 所述皰疹病毒為HSV病毒。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的白肉靈芝提取物的用于制備抗病毒藥物的用途，其特征在于， 所述皰疹病毒為HSV-1病毒。8. 根據(jù)權(quán)利要求1至權(quán)利要求7中任一權(quán)利要求所述的白肉靈芝提取物的用于制備抗 病毒藥物的用途，其特征在于，所述白肉靈芝為白肉靈芝Ganoderma leucocontextum HMG頂-Z110122,保藏編號為CCTCC Μ 2016087。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的白肉靈芝提取物的用于制備抗病毒藥物的用途，其特征在于， 所述白肉靈芝的栽培方法包括組織分離菌種后制作母種，制作原種，制作生產(chǎn)種，栽培培養(yǎng) 及出芝管理。10. -種抗病毒藥物，包括如權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所述的白肉靈芝提取物和藥 學(xué)上可接受的載體。
【文檔編號】A61K36/074GK105832777SQ201610246680
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月20日
【發(fā)明人】胡惠萍, 謝意珍, 黃龍花, 李向敏, 劉遠超
【申請人】廣東省微生物研究所, 廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司