專利名稱：知母總皂苷提取物用于制備心肌缺血產(chǎn)品的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥、食品和飲料技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是涉及中藥提取物的用途，更具體地說是涉及知母總皂苷提取物用于制備心肌缺血產(chǎn)品的用途。
背景技術(shù)：
(一)知母的研究概況知母(Rhizoma Anemarrhenae)為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bunge的根莖，別名蒜瓣子草、連母，生于山地、干燥丘陵或草原地帶，主產(chǎn)河北。每年春、秋季采挖，除去須根及泥土，曬干，習(xí)稱“毛知母”；除去外皮，曬干稱“知母肉”。
知母是多年生草本。葉基生，線形，質(zhì)稍硬，長(zhǎng)20～70cm，寬0.3～0.6cm?；ㄇo高40～60cm，散生鱗片狀小苞片；花2～6朵一簇散生地花序軸上，花被片6，黃色或紫堇色；雄蕊3，與內(nèi)輪花被片對(duì)生。蒴果長(zhǎng)卵形，具6縱棱?；ㄆ?～8月，果期8～9月。
知母性寒，味苦、甘，具有滋陰降火、潤(rùn)燥滑腸的功效，清熱瀉火，生津潤(rùn)燥；傳統(tǒng)上用于外感熱病、肺熱燥咳、骨蒸潮熱、內(nèi)熱消渴、腸燥、便秘。用量6～12g。
知母的化學(xué)成分主要為知母皂苷A-I、知母皂苷A-II、知母皂苷A-III、知母皂苷A-IV、知母皂苷B-I、知母皂苷B-II、知母皂苷H1、知母皂苷H2、知母皂苷I1、知母皂苷I2等，并含芒果苷、異芒果苷、膽堿、煙酸、泛酸、多糖類成分等。經(jīng)國內(nèi)外學(xué)者的研究，知母皂苷是知母中的主要活性成分。
知母皂苷類成分的藥理作用文獻(xiàn)有如下報(bào)道1、知母皂苷元(簡(jiǎn)稱ZMS)、知母皂苷B能顯著改善老齡大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能(中藥藥理與臨床，1995；11(3)18-21；現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2000；9(18)1755-6；中國老年學(xué)雜志，21(5)379-80；中國發(fā)明專利申請(qǐng)《用于治療阿爾茨海默病的甾類皂苷及其衍生物》，申請(qǐng)日1999年03月26日，進(jìn)入國家日期2000年11月14日，申請(qǐng)?zhí)?9806158.1，公開號(hào)CN 1301166)。
中國發(fā)明專利申請(qǐng)《用于治療阿爾茨海默病的甾類皂苷及其衍生物》公開了許多皂苷和皂苷元，特別是那些甾類結(jié)構(gòu)的皂苷和皂苷元在治療認(rèn)知機(jī)能失常和類似疾病中的用途，還公開了治療方法和藥物組合物。
知母中甾體皂苷具有治療老年性癡呆作用(中國發(fā)明專利申請(qǐng)《甾體皂苷防治老年性癡呆的用途及新的甾體皂苷》，申請(qǐng)日1997年09月26日，申請(qǐng)?zhí)?7119680.X，公開號(hào)CN1212966)。
中國發(fā)明專利申請(qǐng)《甾體皂苷防治老年性癡呆的用途及新的甾體皂苷》公開了式I甾體皂苷類化合物防治老年性癡呆的用途，新的式II甾體皂苷及含有所述式I甾體皂苷的藥物組合物。
2、知母皂苷D具有保護(hù)心肌I/R損傷的作用，這一作用可能與其抗PAF、抗血小板聚集和清除自由基等機(jī)理有關(guān)(首都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1994；15(2)138)。
知母皂苷I1、知母皂苷B-I、知母皂苷B-II、知母皂苷B-III、知母皂苷A-III具有顯著的抗人血小板聚集及延長(zhǎng)凝血時(shí)間的活性(Clin Chim Acta，1999；289(1-2)79-88)。
3、知母甾體總皂苷具有雌激素樣抗骨質(zhì)疏松作用、抗炎、抑制中性粒細(xì)胞過氧化物產(chǎn)生的作用(中國發(fā)明專利申請(qǐng)《中藥知母中甾體總皂苷的醫(yī)藥新用途及其制備方法》，申請(qǐng)日2001年02月26日，申請(qǐng)?zhí)?1106195.2，公開號(hào)CN 1370537)。
中國發(fā)明專利申請(qǐng)《中藥知母中甾體總皂苷的醫(yī)藥新用途及其制備方法》提供了中藥知母中甾體總皂苷的醫(yī)藥新用途及其制備方法，提出了知母甾體總皂苷具有雌性激素樣抗骨質(zhì)疏松作用、抗炎活性及具有抑制中性粒細(xì)胞過氧化物產(chǎn)生的作用，可為知母資源的利用提供新的途徑。知母藥材經(jīng)浸泡及煎煮，濾渣取液后再經(jīng)液體濃縮，直至其重量與所述知母藥材重量之比為1～3∶1止，然后再吸附洗脫、脫色、去雜質(zhì)、經(jīng)回收干燥后得成品。本發(fā)明的工藝路線成本低，重金屬含量和農(nóng)藥殘留量小，生產(chǎn)過程對(duì)環(huán)境無污染。
4、知母總皂苷提取物用于制備治療腦卒中藥物的用途(中國發(fā)明專利申請(qǐng)《知母總皂苷用于制備防治腦卒中藥物的用途》，申請(qǐng)日2003年05月09日，申請(qǐng)?zhí)?3116824.8，公開號(hào)CN 1451384A)。
中國發(fā)明專利申請(qǐng)《知母總皂苷用于制備防治腦卒中藥物的用途》公開了將知母總皂苷提取物用于制備防治腦卒中(即腦中風(fēng))藥物或食品的用途。該公開文件指出，經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)，知母總皂苷提取物可明顯改善大鼠腦缺血再灌注損傷引起的行為癥狀、縮小腦梗塞體積、降低腦缺血大鼠腦水腫。并認(rèn)為拓展了知母總皂苷提取物的用途，為防治腦卒中提供了一種新的藥物來源。
(二)常用中草藥有效成分的提取分離方法1、溶劑提取法(1)原理溶劑提取法是根據(jù)中草藥中各種成分在溶劑中的溶解性質(zhì)，選用對(duì)活性成分溶解度大，對(duì)不需要溶出成分溶解度小的溶劑，而將有效成分從藥材組織內(nèi)溶解出來的方法。當(dāng)溶劑加到中草藥原料(需適當(dāng)粉碎)中時(shí)，溶劑由于擴(kuò)散、滲透作用逐漸通過細(xì)胞壁透入到細(xì)胞內(nèi)，溶解了可溶性物質(zhì)，而造成細(xì)胞內(nèi)外的濃度差，于是細(xì)胞內(nèi)的濃溶液不斷向外擴(kuò)散，溶劑又不斷進(jìn)入藥材組織細(xì)胞中，如此多次往返，直至細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，將此飽和溶液濾出，繼續(xù)多次加入新溶劑，就可以把所需要的成分近于完全溶出或大部溶出。中草藥成分在溶劑中的溶解度直接與溶劑性質(zhì)有關(guān)。溶劑可分為親水性有機(jī)溶劑及親脂性有機(jī)溶劑，被溶解物質(zhì)也有親水性及親脂性的不同。有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)中親水性基團(tuán)多，其極性大而疏于油；有的親水性基團(tuán)少，其極性小而疏于水。各類溶劑的性質(zhì)，同樣也與其分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。這樣，發(fā)明人就可以通過對(duì)中草藥成分結(jié)構(gòu)分析，去估計(jì)它們的此類性質(zhì)和選用的溶劑?？偟恼f來，只要中草藥成分的親水性和親脂性與溶劑的此項(xiàng)性質(zhì)相當(dāng)，就會(huì)在其中有較大的溶解度，即所謂“相似相溶”的規(guī)律。這是選擇適當(dāng)溶劑自中草藥中提取所需要成分的依據(jù)之一。
(2)溶劑的選擇運(yùn)用溶劑提取法的關(guān)鍵，是選擇適當(dāng)?shù)娜軇?。溶劑選擇適當(dāng)，就可以比較順利地將需要的成分提取出來。選擇溶劑要注意以下三點(diǎn)①溶劑對(duì)有效成分溶解度大，對(duì)雜質(zhì)溶解度小②溶劑不能與中藥的成分起化學(xué)變化；③溶劑要經(jīng)濟(jì)、易得、使用安全等。常見的提取溶劑可分為以下三類①水水是一種強(qiáng)的極性溶劑。中草藥中親水性的成分，如無機(jī)鹽、糖類、分子不太大的多糖類、鞣質(zhì)、氨基酸、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸鹽、生物堿鹽及苷類等都能被水溶出。為了增加某些成分的溶解度，也常采用酸水及堿水作為提取溶劑。
②親水性的有機(jī)溶劑也就是一般所說的與水能混溶的有機(jī)溶劑，如乙醇(又稱酒精)、甲醇(又稱木精)、丙酮等，以乙醇最常用。乙醇的溶解性能比較好，對(duì)中草藥細(xì)胞的穿透能力較強(qiáng)。親水性的成分除蛋白質(zhì)、粘液質(zhì)、果膠、淀粉和部分多糖等外，大多能在乙醇中溶解。難溶于水的親脂性成分，在乙醇中的溶解度也較大。還可以根據(jù)被提取物質(zhì)的性質(zhì)，采用不同濃度的乙醇進(jìn)行提取。用乙醇提取比用水量較少，提取時(shí)間短，溶解出的水溶性雜質(zhì)也少。乙醇為有機(jī)溶劑，雖易燃，但毒性小，價(jià)格便宜，來源方便，有一定設(shè)備即可回收反復(fù)使用，而且乙醇的提取液不易發(fā)霉變質(zhì)。由于這些原因，用乙醇提取的方法是歷來最常用的方法之一。甲醇的性質(zhì)和乙醇相似，沸點(diǎn)較低(64℃)，但有毒性，使用時(shí)應(yīng)注意。
③親脂性的有機(jī)溶劑也就是一般所說的與水不能混溶的有機(jī)溶劑，如石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷等。這些溶劑的選擇性能強(qiáng)，不能或不容易提出親水性雜質(zhì)。但這類溶劑揮發(fā)性大，多易燃(氯仿除外)，一般有毒，價(jià)格較貴，設(shè)備要求較高，且它們透入植物組織的能力較弱，往往需要長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)提取才能提取完全。如果藥材中含有較多的水分，用這類溶劑就很難浸出其有效成分，因此，大量提取中草藥原料時(shí)，直接應(yīng)用這類溶劑有一定的局限性。
(3)提取方法用溶劑提取中草藥成分，常用浸漬法、滲漉法、煎煮法、回流提取法及連續(xù)回流提取法等。同時(shí)，原料的粉碎度、提取時(shí)間、提取溫度、設(shè)備條件等因素也都能影響提取效率，必須加以考慮。
①浸漬提取法(簡(jiǎn)稱浸漬法)浸漬法系將中草藥粉末或碎塊裝入適當(dāng)?shù)娜萜髦?，加入適宜的溶劑(如乙醇、稀醇或水)，浸漬藥材以溶出其中成分的方法。本法比較簡(jiǎn)單易行，但浸出率較差，且如用水為溶劑，其提取液易發(fā)霉變質(zhì)，須注意加入適當(dāng)?shù)姆栏瘎?br> ②滲漉提取法(簡(jiǎn)稱滲漉法)滲漉法是將中草藥粉末裝在滲漉器中，不斷添加新溶劑，使其滲透過藥材，自上而下從滲漉器下部流出浸出液的一種浸出方法。當(dāng)溶劑滲進(jìn)藥粉、溶出成分比重加大而向下移動(dòng)時(shí)，上層的溶液或稀浸液便置換其位置，造成良好的濃度差，使擴(kuò)散能較好地進(jìn)行，故浸出效果優(yōu)于浸漬法。但應(yīng)控制流速，在滲渡過程中隨時(shí)自藥面上補(bǔ)充新溶劑，使藥材中有效成分充分浸出為止。或當(dāng)滲滴液顏色極淺或滲涌液的體積相當(dāng)于原藥材重的10倍時(shí)，便可認(rèn)為基本上已提取完全。在大量生產(chǎn)中常將收集的稀浸出液作為另一批新原料的溶劑之用。
③煎煮提取法(簡(jiǎn)稱煎煮法)煎煮法是中國最早使用的傳統(tǒng)的浸出方法。所用容器一般為陶器、砂罐或銅制、搪瓷器皿，不宜用鐵鍋，以免藥液變色。直火加熱時(shí)最好時(shí)常攪拌，以免局部藥材受熱太高，容易焦糊。有蒸汽加熱設(shè)備的藥廠，多采用大反應(yīng)鍋、大銅鍋、大木桶，或水泥砌的池子中通入蒸汽加熱。還可將數(shù)個(gè)煎煮器通過管道互相連接，進(jìn)行連續(xù)煎浸。
④加熱回流提取法應(yīng)用有機(jī)溶劑加熱提取，需采用回流加熱裝置，以免溶劑揮發(fā)損失。小量操作時(shí)，可在圓底燒瓶上連接回流冷凝器。瓶?jī)?nèi)裝藥材約為容量的20％～60％，溶劑浸過藥材表面約1～2cm。在水浴中加熱回流，一般保持沸騰3～6小時(shí)，放冷過濾，再在藥渣中加溶劑，作第二、三次加熱回流分別約半小時(shí)，或至基本提盡有效成分為止。此法提取效率較冷浸法高，大量生產(chǎn)中多采用連續(xù)提取法。
⑤連續(xù)回流提取法應(yīng)用揮發(fā)性有機(jī)溶劑提取中草藥有效成分，不論小型實(shí)驗(yàn)或大型生產(chǎn)，均以連續(xù)提取法為好，而且需用溶劑量較少，提取成分也較完全。實(shí)驗(yàn)室常用脂肪提取器或稱索氏提取器。連續(xù)提取法，一般需數(shù)小時(shí)才能提取完全。提取成分受熱時(shí)間較長(zhǎng)，遇熱不穩(wěn)定易變化的成分不宜采用此法。
2、分離和純化方法上述提取法所得到的中草藥提取液或提取物仍然是混合物，需進(jìn)一步除去雜質(zhì)，分離并進(jìn)行精制。
(1)溶劑分離法一般是將上述總提取物，選用三、四種不同極性的溶劑，由低極性到高極性分步進(jìn)行提取分離。水浸膏或乙醇浸膏常為膠狀物，難以均勻分散在低極性溶劑中，故不能提取完全，可拌入適量惰性填充劑，如硅藻土或纖維粉等，然后低溫或自然干燥，粉碎后，再以選用溶劑依次提取，使總提取物中各組成成分，依其在不同極性溶劑中溶解度的差異而得到分離。利用中草藥化學(xué)成分，在不同極性溶劑中的溶解度進(jìn)行分離純化，是最常用的方法。
(2)溶劑萃取法①萃取法溶劑提取萃取法又簡(jiǎn)稱萃取法，是利用混合物中各成分在兩種互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同而達(dá)到分離的方法。萃取時(shí)如果各成分在溶劑中分配系數(shù)相差越大，則分離效率越高；如果在水提取液中的有效成分是親脂性的物質(zhì)，一般多用親脂性有機(jī)溶劑，如苯、氯仿或乙醚進(jìn)行萃取，如果有效成分是偏于親水性的物質(zhì)，在親脂性溶劑中難溶解，就需要改用弱親脂性的溶劑，例如乙酸乙酯、丁醇等。還可以在氯仿、乙醚中加入適量乙醇或甲醇以增大其親水性。提取黃酮類成分時(shí)，多用乙酸乙脂和水萃取。提取親水性強(qiáng)的皂苷則多選用正丁醇、異戊醇和水作萃取。不過，一般有機(jī)溶劑親水性越大，與水作萃取的效果就越不好，因?yàn)槟苁馆^多的親水性雜質(zhì)伴隨而出，對(duì)有效成分進(jìn)一步精制影響很大。
②逆流連續(xù)萃取法是一種連續(xù)的溶劑萃取法。其裝置可具有一根、數(shù)根或更多的萃取管。管內(nèi)用小瓷圈或小的不銹鋼絲圈填充，以增加溶劑萃取時(shí)的接觸面。如果一種中草藥的水浸液需要用比水輕的苯、乙酸乙酯等進(jìn)行萃取，則需將水提濃縮液裝在萃取管內(nèi)，而苯、乙酸乙酯貯于高位容器內(nèi)。萃取是否完全，可取樣品用薄層層析、紙層析及顯色反應(yīng)或沉淀反應(yīng)進(jìn)行檢查。
③逆流分配法逆流分配法又稱逆流分溶法、逆流分布法或反流分布法。逆流分配法與溶劑逆流萃取法原理一致，但加樣量一定，并不斷在一定容量的溶劑中，經(jīng)多次移位萃取分配而達(dá)到混合物的分離。
④液滴逆流分配法液滴逆流分配法又稱液滴逆流層析法。為近年來在逆流分配法基礎(chǔ)上改進(jìn)的溶劑萃取法。對(duì)溶劑系統(tǒng)的選擇基本同逆流分配法，但要求能在短時(shí)間內(nèi)分離成，并可生成有效的液滴。由于移動(dòng)相形成液滴，在細(xì)的分配萃取管中與固定相有效地接觸、摩擦不斷形成新的表面，促進(jìn)溶質(zhì)在溶劑中的分配，故其分離效果往往比逆流分配法好。
(3)大孔吸附樹脂法大孔吸附樹脂是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的一類有機(jī)高聚物吸附劑，具有良好的吸附性能，近十余年來逐漸被應(yīng)用于中草藥化學(xué)成分的提取分離和中藥新藥的開發(fā)研制。
大孔吸附樹脂為吸附和篩選原理相結(jié)合的分離材料。它的吸附性是由于范德華引力或生成氫鍵的結(jié)果。篩選原理是由于其本身多孔性結(jié)構(gòu)所決定。由于吸附和篩選原理，有機(jī)化合物根據(jù)吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附樹脂上經(jīng)一定的溶劑洗脫而分開。這使得有機(jī)化合物尤其是水溶性化合物的提純得以大大簡(jiǎn)化。大孔吸附樹脂的骨架由苯乙烯和二乙烯苯縮聚而生成，由于改性劑的加入，大孔吸附樹脂的極性發(fā)生改變，按照樹脂的表面性質(zhì)，吸附樹脂一般分為非極性、中極性和極性三類。
非極性吸附樹脂是由偶極矩很小的單體聚合物制得的不帶任何功能基的吸附樹脂。典型的例子是苯乙烯-二乙烯苯體系的吸附樹脂，如D101、XAD-1、DiaionHP-10大孔吸附樹脂。
中極性吸附樹脂指含酯基的吸附樹脂，如丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯與雙甲基丙烯酸酯等交聯(lián)的一類共聚物。它是在非極性大孔吸附樹脂的基礎(chǔ)上，加入丙烯酸甲酯或丙烯腈縮聚而成，如中國國內(nèi)經(jīng)常使用的AB-8大孔吸附樹脂。
極性吸附樹脂是指含酰胺基、腈基、酚羥基等含氮、氧、硫極性功能基的吸附樹脂。此外，有時(shí)把含氮、氧、硫等配體基團(tuán)的離子交換樹脂稱作強(qiáng)極性吸附樹脂，強(qiáng)極性吸附樹脂與離子交換樹脂的界限很難區(qū)別。極性大孔吸附樹脂可以由甲基丙烯酸甲酯、丙烯酰胺或亞砜類縮聚而成，如日本三菱化工的Diaion HP 2MG、美國Rohm-hass公司的XAD-10，XAD-9大孔吸附樹脂。
與活性炭和其它吸附劑相比，大孔吸附樹脂具有很多的優(yōu)點(diǎn)，如對(duì)某種物質(zhì)的吸附選擇性較高；物理化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度較好；品種規(guī)格較多，可根據(jù)需要改變樹脂物理或化學(xué)結(jié)構(gòu)；吸附樹脂一般為球狀顆粒，流體阻力較小等等。因而被廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域，近年來關(guān)于大孔吸附樹脂在天然產(chǎn)物提取分離中的應(yīng)用研究報(bào)道越來越多。大孔吸附樹脂對(duì)中草藥化學(xué)成分如生物堿、黃酮、皂苷、香豆素及其他一些苷類成分都有一定的吸附作用。對(duì)糖的吸附能力很差，對(duì)色素的吸附能力較強(qiáng)。
(4)沉淀法是在中草藥提取液中加入某些試劑使產(chǎn)生沉淀，以獲得有效成分或除去雜質(zhì)的方法。如鉛鹽沉淀法鉛鹽沉淀法為分離某些中草藥成分的經(jīng)典方法之一。由于醋酸鉛及堿式醋酸鉛在水及醇溶液中，能與多種中草藥成分生成難溶的鉛鹽或絡(luò)鹽沉淀，故可利用這種性質(zhì)使有效成分與雜質(zhì)分離。然后將鉛鹽沉淀懸浮于新溶劑中，通以硫化氫氣體，使分解并轉(zhuǎn)為不溶性硫化鉛而沉淀。
(5)鹽析法鹽析法是在中草藥的水提液中，加入無機(jī)鹽至一定濃度，或達(dá)到飽和狀態(tài)，可使某些成分在水中的溶解度降低沉淀析出，而與水溶性大的雜質(zhì)分離。常用作鹽析的無機(jī)鹽有氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨等。
(6)透析法透析法是利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過半透膜，而大分子物質(zhì)不能通過半透膜的性質(zhì)，達(dá)到分離的方法。反之也可將大分子的雜質(zhì)留在半透膜內(nèi)，而將小分子的物質(zhì)通過半透膜進(jìn)入膜外溶液中，而加以分離精制。
(7)結(jié)晶、重結(jié)晶和分步結(jié)晶法鑒定中草藥化學(xué)成分，研究其化學(xué)結(jié)構(gòu)，必須首先將中草藥成分制備成單體純品。在常溫下，物質(zhì)本身性質(zhì)是液體的化合物，可分別用分餾法或?qū)游龇ㄟM(jìn)行分離精制。一般地說，中草藥化學(xué)成分在常溫下多半是固體的物質(zhì)，都具有結(jié)晶體的通性，可以根據(jù)溶解度的不同用結(jié)晶法來達(dá)到分離精制的目的。
3、常用干燥方法(1)真空干燥是基于這樣一基本原理水的飽和蒸氣壓與溫度緊密相關(guān)，在真空狀態(tài)下，水的沸點(diǎn)降低，即在真空下操作也就是在低溫下操作，可避免在高溫下營養(yǎng)成分如維生素等的破壞，同時(shí)提高了干燥速度。真空干燥在食品、制藥、化工等行業(yè)有廣泛的應(yīng)用，中國也開發(fā)和引進(jìn)了各種真空干燥設(shè)備，其結(jié)構(gòu)形式多種多樣。常用的形式主要有箱式真空干燥器、雙錐式真空干燥器、帶式真空干燥器等。這些傳統(tǒng)的真空干燥裝置主要采用熱風(fēng)，蒸汽或電等加熱，利用熱傳導(dǎo)、對(duì)流或輻射原理將熱量從外部傳到物料內(nèi)部。真空干燥具有干燥溫度低，干燥室內(nèi)相對(duì)缺氧，可避免脂肪氧化，色素褐變等一系列優(yōu)點(diǎn)，適合于熱敏感性食品物料的干燥，此外設(shè)備成本、干燥費(fèi)用也相對(duì)較低。
(2)噴霧干燥是流化技術(shù)用于液態(tài)物料干燥的一種方法。因是瞬間干燥，特別適用于熱敏性物料，故所得產(chǎn)品質(zhì)量好，保持原來的色香味，且易溶解。利用噴霧干燥來制備微囊的研究正在進(jìn)行，它是將心料混懸在衣料的溶液中，經(jīng)離心噴霧器將其噴入熱氣流中，所得的產(chǎn)品是衣料包心料而成的微囊，這種微囊粉末可采用于直接壓片，也可制備膠囊劑、糖漿劑或混懸劑。
(3)冷凍干燥是將干燥液體物料冷凍成固體，在低溫減壓條件下利用冰的升華性能，使物料低溫脫水而達(dá)到干燥的一種方法。由于物料在高度真空及低溫條件下干燥，故對(duì)某些極不耐熱物品的干燥很適合。王大林報(bào)道了一種噴霧通氣凍干新技術(shù)，是利用冷的空氣或氮?dú)庾鳛榻橘|(zhì)，迅速流經(jīng)凍結(jié)物使水升華，噴霧凍干制得的產(chǎn)品微粒小、干燥快、時(shí)間短、均勻、流動(dòng)性好，并具良好的速溶性。近年來，對(duì)膏狀物料和粘稠物料干燥的研究取得了較大進(jìn)展，流態(tài)化技術(shù)、噴射技術(shù)、惰性載體技術(shù)，則是在此研究基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。旋轉(zhuǎn)閃蒸干燥機(jī)、熱噴射氣流干燥機(jī)、惰性載體干燥機(jī)均適合熱敏性物料和膏狀物料的干燥。這些新的研究成果用于中藥制劑生產(chǎn)，將大大改善中藥加工的技術(shù)水平，提高生產(chǎn)效率。
(4)遠(yuǎn)紅外加熱干燥法是一項(xiàng)新的干燥技術(shù)，其干燥原理是將電能轉(zhuǎn)變?yōu)檫h(yuǎn)紅外輻射，從而被藥材的分子吸收，產(chǎn)生共振，引起分子和原子的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)，導(dǎo)致物體變熱，經(jīng)過熱擴(kuò)散、蒸發(fā)和化學(xué)變化，最終達(dá)到干燥的目的。遠(yuǎn)紅外干燥可節(jié)省電能20％～50％，效果較好。
(5)微波干燥法是一項(xiàng)20世紀(jì)60年代迅速發(fā)展起來的新技術(shù)，微波干燥實(shí)際上是通過感應(yīng)加熱和介質(zhì)加熱，使被干燥物中的水分和脂肪不同程度地吸收微波能量，并把它轉(zhuǎn)變?yōu)闊崃繌亩_(dá)到干燥的目的。微波干燥可殺滅微生物和霉菌，并具有消毒作用。目前中國生產(chǎn)的微波加熱成套設(shè)備有915mhz和2450mhz兩個(gè)頻率。
(三)心肌缺血的研究概況心肌缺血定義為相對(duì)氧需(或稱氧耗)來說，心肌氧供下降。也就是說，心肌缺血是指心臟的血液灌注減少，導(dǎo)致心臟的供氧減少，心肌能量代謝不正常，不能支持心臟正常工作的一種病理狀態(tài)。心臟的供血不是一成不變的，而是始終存在著波動(dòng)，但這種波動(dòng)經(jīng)過機(jī)體自身調(diào)節(jié)，促使血液供需相對(duì)恒定，保證心臟正常工作。如果任何一種原因引起心肌缺血，經(jīng)機(jī)體調(diào)節(jié)不能滿足心臟工作需要，這就構(gòu)成了真正意義上的心肌缺血。
缺乏足夠的血流亦不利于清除有害的代謝產(chǎn)物。此外，血流恢復(fù)可能進(jìn)一步加重?fù)p傷的程度(簡(jiǎn)稱再灌注)。
心臟缺血的原因血壓降低、主動(dòng)脈供血減少、冠狀動(dòng)脈阻塞，可直接導(dǎo)致心臟供血減少；心瓣膜病、血粘度變化、心肌本身病變也會(huì)使心臟供血減少。還有一種情況，心臟供血沒有減少，但心臟氧需求量增加了，這是一種相對(duì)心肌缺血。
臨床顯示，引起心肌缺血最主要、最常見的病因，是冠狀動(dòng)脈狹窄。而冠狀動(dòng)脈狹窄的主要原因是動(dòng)脈粥樣硬化。因冠狀動(dòng)脈粥樣硬化引起的心臟病就是大家常說的冠心病，即心絞痛及急性心肌梗死。所以，冠心病是心肌缺血的“罪魁禍?zhǔn)住薄?br> 1、心肌缺血的代謝與生理機(jī)制越來越多的實(shí)驗(yàn)室和臨床研究表明，心肌缺血主要是一種代謝病。正常情況下，脂肪酸是心肌氧化磷酸化作用的主要供能方式，其它底物包括葡萄糖、氨基酸、丙酮酸和乳酸。心臟可攝取乳酸(動(dòng)脈乳酸的20％)作為其備用能源。因此，缺血乏氧代謝情況下，所產(chǎn)生的乳酸亦是心肌缺血的一項(xiàng)重要代謝指標(biāo)。隨著缺血加重，細(xì)胞內(nèi)pH值降低，細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物蓄積后的滲透作用可引起心肌細(xì)胞水腫。
(1)急性心肌缺血可影響心臟的收縮與舒張功能。舒張功能障礙往往早于收縮功能的變化。心肌缺血對(duì)心室順應(yīng)性的即刻影響與缺血的病因?qū)W有關(guān)。氧供下降開始時(shí)伴有心室順應(yīng)性增加，而氧需增加與心室順應(yīng)性即刻顯著下降有關(guān)(即心室變成僵硬)。心室需要較高的充盈壓(簡(jiǎn)稱LVEDP)，以維持一定的每搏量。此時(shí)病人可能表現(xiàn)出室壁運(yùn)動(dòng)異常，心律失常和傳導(dǎo)阻滯。如果冠狀血流下降80％，則可引起心室收縮無力；冠狀血流下降95％，則出現(xiàn)心室動(dòng)力障礙。心肌缺血嚴(yán)重時(shí)，LVEDP升高可引起肺水腫。以往認(rèn)為缺血心肌可呈不可逆性損傷(簡(jiǎn)稱梗死)或立即恢復(fù)。
目前認(rèn)為，缺血心肌還有其它的生理途徑。短暫性嚴(yán)重心肌缺血后，心肌收縮功能可逐漸恢復(fù)(簡(jiǎn)稱心肌頓抑)。
(2)慢性心肌缺血慢性心肌缺血時(shí)隨著缺血程度不同，心肌細(xì)胞表現(xiàn)出一系列對(duì)缺血的適應(yīng)過程，如心肌頓抑、冬眠、預(yù)缺血及凋亡。急性缺血加重時(shí)，出現(xiàn)心肌梗死。這些過程相互重疊、相互影響，在不同程度上影響心臟功能。
慢性嚴(yán)重缺血可引起心臟收縮作功下降如慢性室壁運(yùn)動(dòng)異常(簡(jiǎn)稱心肌冬眠)，冬眠心肌普遍存在于可逆的缺血性心肌病患者，也可見于急性冠脈綜合征和嚴(yán)重左心衰竭。研究發(fā)現(xiàn)，20％～60％的缺血性心肌病患者在血運(yùn)重建后心功能改善，說明缺血區(qū)域的心肌細(xì)胞并沒有完全壞死，而是由于缺血缺氧處于適應(yīng)性低活性狀態(tài)，在恢復(fù)血供后這些細(xì)胞的功能可以恢復(fù)。因此，存活心肌的檢測(cè)對(duì)患者危險(xiǎn)性的評(píng)估和治療方法的選擇具有十分重要的意義，是近年來研究的熱點(diǎn)。
(3)無癥狀性心肌缺血無癥狀心肌缺血是指患者雖然有心臟病，但無癥狀和體征，而臨床檢查有心肌缺血的證據(jù)，如ST段改變、心肌灌注缺損和室壁運(yùn)動(dòng)異常等。通常在發(fā)生冠狀動(dòng)脈阻塞后，即出現(xiàn)下述改變冠狀動(dòng)脈血流量減少，局部供血量和需血量比例發(fā)生了改變，冠狀竇血氧含量降低；心肌收縮功能和舒張功能減弱；左心室舒張壓升高；ECG改變，例如ST段抬高或壓低；胸部不適等。但這些異常往往在較短時(shí)間內(nèi)發(fā)生，患者有可能永遠(yuǎn)不出現(xiàn)胸部不適。
也就是說，無癥狀性心肌缺血是冠心病的一種特殊類型，可以存在于各種冠心病類型之中，也可單獨(dú)存在，即冠心病人存在心肌缺血發(fā)作的客觀證據(jù)，而不伴有心絞痛或心絞痛等同癥狀。
有關(guān)無癥狀心肌缺血假說缺血面積較??；有側(cè)支循環(huán)；缺血時(shí)間較短；心絞痛警報(bào)系統(tǒng)有缺陷；患者否認(rèn)；疼痛閾較高等。
無癥狀心肌缺血的預(yù)后與心絞痛相似，可引起急性心梗，以至猝死，且由于其無癥狀常不為醫(yī)生及患者重視。
2、心肌缺血的后果心肌缺血對(duì)心臟和全身都可能帶來許多不利影響。心肌缺血可引起心臟功能的明顯變化，并誘發(fā)一系列嚴(yán)重事件，如心肌梗死、心律失常、肺水腫，甚至死亡。
氧是心肌細(xì)胞活動(dòng)必不可少的物質(zhì)，而氧是通過血液輸送給細(xì)胞的。心臟沒有“氧倉庫”，完全依賴心肌血供，所以一旦缺血，立刻會(huì)引起缺氧。缺氧的直接后果是心肌細(xì)胞有氧代謝減弱，產(chǎn)能減小，使心臟活動(dòng)時(shí)必需的能量供應(yīng)不足，引起心絞痛、心律失常、心功能下降。同時(shí)，代謝的廢物也不能被有效及時(shí)地清除，易產(chǎn)生不利影響。
缺血、缺氧、缺能量，最終會(huì)影響心臟的收縮功能。若有20％～25％的心肌停止收縮，通常會(huì)出現(xiàn)左室功能衰竭；若有40％以上的心肌不能收縮，就會(huì)有重度心泵功能衰竭。如果這種情況突然發(fā)生，就會(huì)出現(xiàn)非常危險(xiǎn)的心源性休克。急性心肌梗死就常與這種情況相關(guān)。
心肌缺血性胸痛是臨床上一種很兇險(xiǎn)的癥狀，處理不及時(shí)很可能會(huì)有生命危險(xiǎn)。心肌缺血性胸痛的易發(fā)人群①中年以上的男性或更年期以后的女性；②有高血壓病、高脂血癥(尤其高膽固醇血癥)、糖尿病、吸煙及肥胖者；③有家族史者，如父親55歲以前或母親65歲以前發(fā)生了冠心病，其子女即屬于有冠心病家族史的人。具有以上危險(xiǎn)因素越多越容易發(fā)病。
心肌缺血還會(huì)損害舒張功能。收縮不良和舒張不良結(jié)合起來，易導(dǎo)致心室充盈壓升高，引起肺充血，還可引起復(fù)雜的物質(zhì)代謝紊亂和心肌電活動(dòng)失常。
因此，一旦出現(xiàn)心肌缺血，應(yīng)找準(zhǔn)病因?qū)ΠY治療，才可避免潛在的嚴(yán)重后果。
目前人們?cè)絹碓秸J(rèn)識(shí)到心肌缺血的嚴(yán)重后果。
圍手術(shù)期處理集中在應(yīng)用β阻滯劑。一般認(rèn)為許多急性心肌梗死的病因與冠狀動(dòng)脈不穩(wěn)定性粥樣斑塊破裂有關(guān)。開始時(shí)，斑塊破裂引起缺血事件，繼而導(dǎo)致冠狀血管血栓形成。一般認(rèn)為高電子束CT上呈現(xiàn)的鈣性斑塊為斑塊破裂高危對(duì)象。
3、心肌缺血的監(jiān)測(cè)心肌缺血需要早期診斷和及時(shí)治療的認(rèn)識(shí)已經(jīng)深入人心。臨床檢查心肌缺血的方法有病史、ECG(靜息、運(yùn)動(dòng)或動(dòng)態(tài)ECG監(jiān)測(cè))、收縮期的局部室壁運(yùn)動(dòng)、心肌的舒張功能、心肌代謝。
有研究提出，PCWP的升高及其特征性波型是缺血的指標(biāo)。但是，多數(shù)研究認(rèn)為PAC并不是一個(gè)敏感性指標(biāo)，不應(yīng)作為主要的監(jiān)測(cè)方法。
TEE是監(jiān)測(cè)心肌缺血的高度敏感性指標(biāo)。TEE時(shí)心肌缺血表現(xiàn)為新的區(qū)域性室壁運(yùn)動(dòng)異常(簡(jiǎn)稱RWMAs)、收縮期室壁增厚減少以及心室擴(kuò)張。CABG手術(shù)中體外循環(huán)停機(jī)后，如果出現(xiàn)RWMAs，則臨床后果不良。相反，ECG檢測(cè)出的缺血或體外循環(huán)前的RWMAs與圍手術(shù)期心臟事件發(fā)生率無關(guān)。TEE的缺點(diǎn)或問題包括費(fèi)用高；不能獲取插入TEE前的變化；術(shù)中實(shí)時(shí)分析TEE圖像可降低分析結(jié)果的準(zhǔn)確性；TEE檢測(cè)可能會(huì)分散麻醉醫(yī)生對(duì)更重要生命體征的注意力；麻醉醫(yī)生是否有資格出示超聲結(jié)果。
亦有一些學(xué)者應(yīng)用諸多指數(shù)來評(píng)價(jià)心肌氧耗(簡(jiǎn)稱MVO2)和心肌缺血，但是其評(píng)價(jià)麻醉病人的意義尚有待深入研究。
4、心肌缺血的治療正常心肌的能量(簡(jiǎn)稱ATP)供給60％～70％來自游離脂肪酸β氧化，20％～25％為葡萄糖氧化，5％～10％為糖酵解。游離脂肪酸氧化產(chǎn)生等量ATP的耗氧量比葡萄糖氧化的耗氧量高，而且高水平游離脂肪酸氧化可明顯抑制葡萄糖氧化的速率。心肌缺血時(shí)交感神經(jīng)興奮，兒茶酚胺水平升高，繼而導(dǎo)致血中游離脂肪酸水平升高；心肌能源供給中游離脂肪酸氧化增加至80％～90％；葡萄糖酵解和葡萄糖氧化的耦聯(lián)失調(diào)，致使心肌細(xì)胞內(nèi)H+、Ca2+及Na+超載，引起細(xì)胞酸中毒和損害，使心肌工作效率降低，同時(shí)耗能增加。因此，優(yōu)化心肌能量代謝，尤其是抑制游離脂肪酸氧化，加強(qiáng)心肌葡萄糖代謝有利于減輕心肌缺血引起的組織損傷，改善心肌功能。
缺血性心臟病的傳統(tǒng)治療以對(duì)癥處理為主，硝酸酯類、腎上腺素β受體阻滯劑、鈣通道拮抗劑等通過改善心臟和全身的血流動(dòng)力學(xué)，起到增加心肌供能、減少心肌耗能的目的，是治療心肌缺血的主要藥物。隨著對(duì)心肌缺血代謝過程的進(jìn)一步研究和認(rèn)識(shí)，提出了通過干預(yù)心肌能量產(chǎn)生的代謝環(huán)節(jié)、完善線粒體能量代謝而治療缺血性心臟病的新概念。
曲美他嗪(trimetazidine)是一種抗心肌缺血的新藥，主要通過抑制游離脂肪酸代謝，增加葡萄糖代謝，增加心肌能量供應(yīng)。曲美他嗪可減輕心絞痛癥狀，改善運(yùn)動(dòng)耐量，在心絞痛、缺血性心肌病等的治療中發(fā)揮作用；對(duì)穩(wěn)定型心絞痛，曲美他嗪可單獨(dú)用于輕度心絞痛患者，減少冠心病患者心絞痛的發(fā)作次數(shù)和硝酸甘油用量，改善運(yùn)動(dòng)耐量；對(duì)中、重度心絞痛，曲美他嗪可作為輔助藥物，與其他傳統(tǒng)抗心肌缺血藥物合并使用。單用β受體阻滯劑、鈣通道拮抗劑、硝酸鹽控制心絞痛不佳時(shí)，合用曲美他嗪可明顯提高療效。對(duì)急性心肌梗死，曲美他嗪可能減輕急性前壁心肌梗死患者溶栓后的再灌注損傷，減少梗死面積，影響急性心肌梗死后心室重構(gòu)。
目前對(duì)于改善冬眠心肌的研究主要有三個(gè)方面一是積極進(jìn)行血運(yùn)重建，其療效已得到肯定。二是干預(yù)心肌代謝。此類藥物主要有脂肪分解抑制劑，如煙酸及其衍生物、胰島素等；肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶-1(簡(jiǎn)稱CPT-1)抑制劑，如L-肉毒堿、哌克西林、乙莫克舍等；脂肪酸β氧化抑制劑，如曲美他嗪、雷洛嗪等。三是細(xì)胞移植，當(dāng)前還停留在臨床前的實(shí)驗(yàn)階段。
目前，已有一些小規(guī)模的臨床試驗(yàn)對(duì)于預(yù)心肌代謝的藥物在不同臨床情況下的療效進(jìn)行了觀察。DIGAMI研究將620例糖尿病合并急性心梗的患者隨機(jī)分為兩組，在常規(guī)治療基礎(chǔ)上，一組給予胰島素和葡萄糖治療，另一組給予安慰劑，觀察12個(gè)月后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，胰島素組患者死亡的相對(duì)危險(xiǎn)降低29％(P＝0.027)。Diaz等也發(fā)現(xiàn)利用GIK治療3個(gè)月可顯著降低AMI后患者的病死率，但該研究的規(guī)模也比較小。
一些藥物可以通過改善冬眠心肌的功能達(dá)到心肌保護(hù)的目的，如卡維地洛。CHRIST-MAS發(fā)現(xiàn)，卡維地洛治療穩(wěn)定性心力衰竭患者4個(gè)月，可明顯改善存活心肌功能，提高射血分?jǐn)?shù)。此外，大量研究顯示，ACEI、ARB類藥物用于急性心肌梗死早期，也可顯著改善患者的住院病死率和心血管事件的發(fā)生率，作用機(jī)制之一是通過阻斷腎素血管緊張素系統(tǒng)而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。
他汀類藥物可能通過穩(wěn)定斑塊、保護(hù)內(nèi)皮、改善纖溶-凝血系統(tǒng)功能發(fā)揮心肌保護(hù)作用。臨床研究同樣發(fā)現(xiàn)在急性冠脈綜合征早期應(yīng)用他汀類可以顯著改善患者預(yù)后。有關(guān)他汀類藥物心肌保護(hù)的確切機(jī)制、是否具有膜穩(wěn)定和細(xì)胞器保護(hù)作用還有待進(jìn)一步研究。
經(jīng)文獻(xiàn)檢索等，到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)有知母皂苷B-II為主要成分的知母總皂苷提取物在用于預(yù)防、診斷、檢測(cè)、保護(hù)、治療和研究心肌缺血及其相關(guān)疾病方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問題是公開了一種中藥知母總皂苷提取物的新用途，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。
也就是說，本發(fā)明意在明確知母總皂苷提取物在心肌缺血應(yīng)用方面的活性，進(jìn)而將知母總皂苷提取物用于制備心肌缺血產(chǎn)品；所述的心肌缺血產(chǎn)品是指用于預(yù)防、診斷、檢測(cè)、保護(hù)、治療和研究心肌缺血及其相關(guān)疾病的產(chǎn)品，是包括藥物、試劑、食品等中的一種或多種，優(yōu)選藥物。
(一)技術(shù)構(gòu)思自主開發(fā)創(chuàng)新藥物是中國目前的一項(xiàng)緊迫任務(wù)，中國中醫(yī)藥學(xué)具有悠久的歷史，用中草藥預(yù)防和治療疾病方面也積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，因此從中藥中尋找有效的活性成分是一條有效的途徑，也是中國創(chuàng)新藥物研制的優(yōu)勢(shì)之所在。
發(fā)明人通過對(duì)單味知母藥材的總皂苷提取物進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，篩選并證明該總皂苷提取物的活性和用途。
根據(jù)文獻(xiàn)檢索，發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)活性部位知母總皂苷提取物具有多種顯著的藥理活性。而經(jīng)過化學(xué)成分研究，證明知母活性部位知母總皂苷提取物中的主要成分為知母皂苷B-II化合物。發(fā)明人從而推測(cè)知母的在預(yù)防、診斷、保護(hù)和治療心肌缺血等方面活性的臨床藥效，也應(yīng)主要是通過活性部位知母總皂苷提取物特別是知母皂苷B-II的藥效來發(fā)揮的，研究結(jié)果也證明和證實(shí)了知母總皂苷提取物特別是知母皂苷B-II具有顯著的藥理活性。
心血管疾病已成為中國人口的重要死亡原因，研制治療心血管疾病藥物，尤其是預(yù)防、診斷、保護(hù)和治療心肌缺血等方面產(chǎn)品特別是藥物具有顯著的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益。
(二)知母總皂苷提取物的制備及其鑒定方法本發(fā)明所說的知母總皂苷提取物的制備方法包括如下步驟(1)提取取知母原料若干，提取，得提取液，即知母總提取物；(2)分離純化將提取液分離純化，即得知母總皂苷提取物。
所述的提取方法包括溶劑提取法等本領(lǐng)域公知的所有可以使用的方法。
上文所述的溶劑提取法的提取方法是本領(lǐng)域的常規(guī)提取方法，也就是說包括常用的超聲提取法、浸漬提取法、滲漉提取法、煎煮提取法、加熱回流提取法或連續(xù)回流提取法等中的一種或多種；提取次數(shù)可以是一次或者是多次。同時(shí)，原料的粉碎度、提取時(shí)間、提取溫度、設(shè)備條件等因素也都能影響提取效率，必須加以考慮。各種提取方法包括技術(shù)細(xì)節(jié)在內(nèi)的所有技術(shù)資料，均可以參見有關(guān)的教材和相關(guān)的技術(shù)文獻(xiàn)等。
上文所述的溶劑提取法所使用的提取溶劑是本領(lǐng)域的常規(guī)提取溶劑，也就是說包括常見的水、親水性的有機(jī)溶劑或親脂性的有機(jī)溶劑等三類提取溶劑的一種或多種；所述的水是包括水、酸水或堿水等中的一種；所述的親水性的有機(jī)溶劑是一般所說的與水能混溶的有機(jī)溶劑，包括乙醇、乙醇水溶液、甲醇或丙酮等中的一種或多種，優(yōu)選乙醇或不同濃度的乙醇水溶液等中的一種或多種，進(jìn)一步優(yōu)選不同濃度的乙醇水溶液；所述的親脂性的有機(jī)溶劑是一般所說的與水不能混溶的有機(jī)溶劑，包括石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷或二氯乙烷等中的一種或多種，優(yōu)選石油醚、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷或二氯乙烷等中的一種或多種，進(jìn)一步優(yōu)選氯仿、乙醚、乙酸乙酯或二氯甲烷等中的一種或多種。
上述提取方法所得到的知母總提取物，需進(jìn)一步分離純化。
所述的分離純化方法是本領(lǐng)域公知的所有可以使用的方法，包括溶劑分離法，溶劑萃取法(包括萃取法、逆流連續(xù)萃取法、逆流分配法或液滴逆流分配法等中的一種或多種)，大孔吸附樹脂法，沉淀法，鹽析法，柱層析法或結(jié)晶與重結(jié)晶和分步結(jié)晶法等中的一種或多種；這些方法均是本領(lǐng)域的公知技術(shù)，在需要進(jìn)一步確證的時(shí)候，很容易從有關(guān)的教材和相關(guān)的技術(shù)文獻(xiàn)等查閱到包括技術(shù)細(xì)節(jié)在內(nèi)的所有技術(shù)資料。
為了使產(chǎn)品性質(zhì)穩(wěn)定，便于使用和保存，還可增加一個(gè)優(yōu)化的步驟，即步驟三(3)干燥。
所述的干燥方法是本領(lǐng)域公知的可以使用的方法，包括常壓干燥法如經(jīng)烘箱烘干、減壓干燥法、真空干燥法、噴霧干燥法、冷凍干燥法、遠(yuǎn)紅外加熱干燥法或微波干燥法等中的一種或多種。
在具體實(shí)施時(shí)，需要根據(jù)現(xiàn)有的資金、技術(shù)和有關(guān)的要求，采用其中合適的方法，并選取合適的條件等必要的措施以達(dá)到預(yù)期的目標(biāo)。而這些方法也均是本領(lǐng)域的公知技術(shù)，在需要進(jìn)一步確證的時(shí)候，都是很容易從有關(guān)的教材和相關(guān)的技術(shù)文獻(xiàn)等查閱到包括技術(shù)細(xì)節(jié)在內(nèi)的所有技術(shù)資料。
例如，本發(fā)明所說知母總皂苷提取物的制備方法可以為(1)提取按常規(guī)將知母藥材粉碎成粗粉，以10～95％乙醇滲漉提取，收集5～30倍藥材體積量滲漉液，即為提取液。
(2)分離純化提取液濃縮到濃度為0.5～10∶1(藥材重量∶溶液體積)，即為樣品液。將樣品液通過非極性或弱極性大孔樹脂吸附(非極性或弱極性大孔樹脂為以苯乙烯為架橋材料的聚苯乙烯型多孔性吸附樹脂，如D101、D201、ZTC-1、AB-8、1300-1型大孔樹脂等)，用水淋洗除去雜質(zhì)；再用含水低級(jí)醇洗脫，低級(jí)醇為甲醇、乙醇或丙醇等C1～C5醇類，其濃度為10～40％，體積用量為樹脂床體積的5～24倍，收集低級(jí)醇洗脫液，濃縮至干，并粉碎；粉末用1.5～2.5倍量(丙酮體積/粉末重量)丙酮溶解，再加入2～12倍量(丙酮體積/粉末重量)丙酮，濾過，將濾液回收溶劑至2～8倍量(丙酮體積/粉末重量)，靜置，析出結(jié)晶，過濾，以丙酮洗滌結(jié)晶，即得本發(fā)明的知母總皂苷提取物。
本發(fā)明綜合應(yīng)用質(zhì)譜(簡(jiǎn)稱MS)，核磁共振氫譜(簡(jiǎn)稱1H-NMR)，核磁共振碳譜(簡(jiǎn)稱13C-NMR)以及核磁共振二維譜(簡(jiǎn)稱2D-NMR)等分析技術(shù)對(duì)知母總皂苷提取物中的知母皂苷B-II進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，其含量范圍是在30％～70％。
(三)知母總皂苷提取物的藥理活性本發(fā)明對(duì)知母總皂苷提取物在心肌缺血的預(yù)防、診斷、保護(hù)、治療和研究等方面的活性進(jìn)行了多方面的試驗(yàn)。
供試樣品均是采取以上制備方法獲得，具體如下(1)知母總皂苷提取物中含總皂苷為40％～80％；(2)知母總皂苷提取物主要成分知母皂苷B-II含量為30％～70％；知母總皂苷提取物心肌缺血預(yù)防、診斷、保護(hù)和治療活性的體外試驗(yàn)1、對(duì)犬冠狀動(dòng)脈結(jié)扎造成心肌梗塞模型的治療作用采用麻醉犬冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎造成心肌梗塞模型，觀察知母總皂苷提取物的治療作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，知母總皂苷提取物20mg/kg、60mg/kg、120mg/kg灌胃給藥可顯著降低犬冠脈結(jié)扎后心肌缺血的程度，縮小心肌缺血的范圍，作用強(qiáng)度與劑量有一定的關(guān)系；定量組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果與心外膜電圖測(cè)定結(jié)果一致，與生理鹽水對(duì)照組比較，知母總皂苷提取物可顯著減小梗塞范圍。知母總皂苷提取物還能顯著降低犬冠脈結(jié)扎后血清乳酸和肌酸激酶升高的程度；提示其可減輕心肌缺血時(shí)的細(xì)胞損害，對(duì)心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，知母總皂苷提取物能顯著減輕犬心肌梗塞時(shí)的心肌缺血程度和范圍，減小梗死范圍。
2、對(duì)麻醉犬心肌耗氧量的影響實(shí)驗(yàn)旨在觀察知母總皂苷提取物灌胃給藥對(duì)麻醉犬心肌耗氧量的影響。結(jié)果顯示知母總皂苷提取物低劑量組灌胃給藥后心肌耗氧量同生理鹽水組相比無顯著差異，中、高劑量組可顯著降低麻醉犬心肌耗氧量；三個(gè)劑量組均可明顯降低心肌氧攝取率，增加冠脈流量，降低冠脈阻力，作用強(qiáng)度與劑量有一定的關(guān)系。知母總皂苷提取物高劑量組及陽性對(duì)照藥地奧心血康膠囊可顯著降低總外周阻力，各劑量組對(duì)犬心輸出量無明顯影響。
3、對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)觀察了知母總皂苷提取物灌胃給藥對(duì)SD大鼠心臟缺血再灌注所致心肌損傷的影響。用3％戊巴比妥鈉腹腔麻醉SD大鼠后，左側(cè)第4-5肋間開胸，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，制成急性心臟缺血再灌注模型。灌胃給予知母總皂苷提取物，測(cè)定急性心肌缺血60min再灌注損傷120min后血清肌酸激酶(簡(jiǎn)稱CK)、乳酸脫氫酶(簡(jiǎn)稱LDH)活性和心肌梗塞范圍。結(jié)果顯示知母總皂苷提取物低劑量組(60mg/kg)血清LDH、CK活性、心肌梗塞區(qū)/心臟重量百分比明顯低于模型組(P＜0.05)；中、高劑量組(120，360mg/kg)血清LDH、CK活性、心肌梗塞區(qū)/心臟重量百分比非常明顯低于模型組(P＜0.01)；地奧心血康膠囊組血清LDH、CK活性、心肌梗塞區(qū)/心臟重量百分比非常顯著低于模型組(P＜0.01)。結(jié)果表明知母總皂苷提取物灌胃給藥對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。
(四)知母總皂苷提取物的用途1、概述本發(fā)明的目的是提供一種用于預(yù)防、診斷、檢測(cè)、保護(hù)、治療和研究心肌缺血及其相關(guān)疾病的產(chǎn)品，包括藥物、試劑、食品等中的一種或多種，優(yōu)選藥物。
通過藥理活性篩選證明，采用大孔吸附樹脂5～75％乙醇洗脫部位得到的知母總皂苷提取物為其預(yù)防、診斷、檢測(cè)、保護(hù)、治療和研究心肌缺血及其相關(guān)疾病的活性部位。
經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究表明，知母總皂苷提取物灌胃給藥可顯著降低犬冠脈結(jié)扎后心肌缺血的程度，減小梗死范圍；可顯著降低麻醉犬心肌耗氧量，增加冠脈流量，降低冠脈阻力；灌胃給藥對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。已完成的急性毒性實(shí)驗(yàn)證明，小鼠灌胃給藥對(duì)該活性部位的最大耐受量超過2.0g/kg，相當(dāng)于臨床推薦用藥劑量的440倍，表明該有效部位安全可靠，解決了中藥復(fù)方中成分復(fù)雜、有效成分含量低且含有有毒成分的問題。
綜上所述，發(fā)明人對(duì)知母總皂苷提取物進(jìn)行了理論探索，經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)研究特別是長(zhǎng)期的藥理學(xué)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)所述及的知母總皂苷提取物有顯著的預(yù)防、診斷、檢測(cè)、保護(hù)、治療和研究心肌缺血及其相關(guān)疾病的活性。因此，知母總皂苷提取物及其組合物可用于制備心肌缺血產(chǎn)品，優(yōu)選以本發(fā)明知母總皂苷提取物為原料制備而成的藥物。
2、知母總皂苷提取物及其組合物的使用方法與要求本發(fā)明知母總皂苷提取物可以單獨(dú)或與其它活性組分聯(lián)合使用，包括用于制備用于預(yù)防、診斷、檢測(cè)、保護(hù)、治療和研究心肌缺血及其相關(guān)疾病的產(chǎn)品，包括藥物、試劑、食品等，尤其是藥物。
在具體使用方面，本發(fā)明所述的知母總皂苷提取物能夠單獨(dú)使用，還能夠與其他許多化學(xué)物質(zhì)一起使用。無論這些化學(xué)物質(zhì)是否具有生物活性或具有治療疾病的功能，包括輔助功能如協(xié)同放大作用、拮抗或緩解知母總皂苷提取物的副作用等，這些化學(xué)物質(zhì)是包括醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體、食品、天然產(chǎn)物、化學(xué)合成藥物或人類用藥等中的一種或多種；優(yōu)選包括醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體或者食品等中的一種或多種；進(jìn)一步優(yōu)選醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體。
本文使用的“醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體”包括任何和所有的生理適用的溶劑、分散介質(zhì)、胞衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑或吸收延遲劑等中的一種或多種。醫(yī)藥學(xué)上可接受載體的例子包括一種或多種的水、鹽水、磷酸緩沖鹽水、葡萄糖、甘油或乙醇等及其組合物中的一種或多種。在許多情況下，在該組合物中最好包括等滲劑，例如，糖、諸如甘露醇、山梨醇、山梨醇的多元醇或氯化鈉等中的一種或多種。醫(yī)藥學(xué)上可接受載體還可以包含少量的輔助物質(zhì)，例如潤(rùn)濕劑或乳化劑、防腐劑或緩沖液等中的一種或多種，它們?cè)鰪?qiáng)了該知母總皂苷提取物的有效期或效力。
從具體的分類上看，所說的醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體是指醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，包括賦形劑，如淀粉或水等中的一種或多種；潤(rùn)滑劑，如甘油或硬脂酸鎂等中的一種或多種；崩解劑，如微晶纖維素等；填充劑，如淀粉或乳糖等中的一種或多種；粘接劑，如預(yù)膠化淀粉、糊精、纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠或聚乙烯吡咯烷酮等中的一種或多種；滲透壓調(diào)節(jié)劑，如葡萄糖、蔗糖、山梨醇或甘露醇等中的一種或多種；稀釋劑，如水等；崩解劑，如瓊脂、碳酸鈣或碳酸氫鈉等中的一種或多種；吸收促進(jìn)劑，如季銨化合物等；表面活性劑，如十六烷醇等；吸附載體，如高嶺土或皂粘土等中的一種或多種；潤(rùn)滑劑，如滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂或聚乙二醇等中的一種或多種；另外，還可以在組合物中加入其它輔劑，如香味劑或甜味劑等中的一種或多種。
例如，將活性組分知母總皂苷提取物溶解、混懸或乳化于適宜的水性溶劑中(例如，蒸餾水、生理鹽水或格林溶液等中的一種或多種)或油性溶劑中(例如，植物油例如橄欖油、芝麻油、棉籽油、玉米油或丙二醇等中的一種或多種)中，即可制得注射制劑，其中溶劑中可含有分散劑(例如，聚山梨酯80、聚氧乙烯硬化蓖麻油60、聚乙二醇、苯甲醇、氯代丁醇或苯酚等中的一種或多種)、滲透壓調(diào)節(jié)劑(例如，氯化鈉、甘油、D9-甘露糖、D-山梨醇或葡萄糖等中的一種或多種)。在這種情況下，如有必要，可加入添加劑，例如增溶劑(例如，水楊酸鈉或醋酸鈉等中的一種或多種)、穩(wěn)定劑(例如，人血清白蛋白等)、止痛劑(例如，苯甲醇等)等。
本發(fā)明所述及的知母總皂苷提取物還可以以組合物的形式聯(lián)合使用，特別是與用其它化學(xué)物質(zhì)如藥物對(duì)動(dòng)物尤其是哺乳動(dòng)物包括人或其他動(dòng)物進(jìn)行治療所用的組合物或者是類似的組合物。所述哺乳動(dòng)物，包括人、小鼠、大鼠、羊、猴、牛、豬、馬、兔、犬、黑猩猩、狒狒、狨、獼猴或恒河猴等中的一種或多種，優(yōu)選人、小鼠、大鼠、猴、豬、兔或犬等中的一種或多種，進(jìn)一步優(yōu)選人、大鼠或猴等中的一種或多種。例如，可以將本發(fā)明知母總皂苷提取物加入適于給與受治療者的藥用組合物中。通常，該藥用組合物包含本發(fā)明知母總皂苷提取物和藥學(xué)上可接受的載體。
知母總皂苷提取物的組合物特別是藥物組合物可以有各種形式，包括例如液體、半固體和固體等劑量形式中的一種或多種；其中所說的藥物組合物包括治療有效量的知母總皂苷提取物為活性成分，以及一種或多種醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體。
知母總皂苷提取物的藥物組合物可以采用本領(lǐng)域公知的常規(guī)生產(chǎn)方法制成各種劑型，例如使活性成分與一種或多種載體混合，然后將其制成所需的劑型。所述的劑型包括片劑、膠囊劑、顆粒劑、混懸劑、乳劑、溶液劑、糖漿劑或注射劑等中的一種或多種，采取口服或注射(包括靜脈注射、靜脈滴注、肌肉注射或皮下注射等中的一種或多種)、粘膜透析等中的一種或多種給藥途徑進(jìn)行心肌缺血及其相關(guān)疾病的預(yù)防、診斷、檢測(cè)、保護(hù)、治療或科學(xué)研究。
藥物組合物優(yōu)選含有重量比為0.5％～99％的活性成分知母總皂苷提取物，進(jìn)一步優(yōu)選含有重量比為1％～95％的活性成分知母總皂苷提取物，最優(yōu)選含有重量比為5％～90％的活性成分知母總皂苷提取物。
知母總皂苷提取物的藥物組合物一般必須無菌且在生產(chǎn)儲(chǔ)存條件下穩(wěn)定?？梢詫⒃摻M合物配制成溶液、微乳液、分散液、脂質(zhì)體或其它適合于高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。通過將所需量的該知母總皂苷提取物與所需上述成分的一種或組合一起加入適當(dāng)?shù)娜軇┲胁⒔又M(jìn)行除菌過濾制備無菌注射液。一般而言，通過將該知母總皂苷提取物加入含有基本分散介質(zhì)和所需的上述其它成分的無菌溶媒中制備分散液。在用于制備無菌注射液的無菌粉劑的情況下，推薦的制備方法是真空干燥和冷凍干燥劑。例如，通過諸如卵磷脂的包衣、在分散液的情況下通過保持所需顆粒大小和通過使用表面活性劑，可以保持溶液的適當(dāng)流動(dòng)性。通過在該組合物中包括延遲吸收的藥劑(例如單硬脂酸鹽或明膠)可以達(dá)到注射組合物的延長(zhǎng)吸收。
用于患者時(shí)，本發(fā)明所述的知母總皂苷提取物劑量為5～20mg/kg·d，該劑量或用量通常根據(jù)患者或使用者的年齡和體重以及身體狀況或患者癥狀的狀況來決定。
本發(fā)明知母總皂苷提取物及其藥用組合物可以包括“治療有效量”或“預(yù)防有效量”的本發(fā)明知母總皂苷提取物?！爸委熡行Я俊笔侵冈诒匾膭┝亢蜁r(shí)間下有效達(dá)到所需治療效果的量。知母總皂苷提取物的治療有效量可以根據(jù)諸如個(gè)體的病況、年齡、性別和體重以及該知母總皂苷提取物在該個(gè)體引起所需反應(yīng)的能力等因素而變化。治療有效量亦指該知母總皂苷提取物的有益治療效果超過其任何毒性或有害效果的量?！邦A(yù)防有效量”是指在必要?jiǎng)┝亢蜁r(shí)間下有效達(dá)到所需預(yù)防效果的量。因?yàn)轭A(yù)防劑量用于患病前或疾病早期的受治療者，預(yù)防有效量通常小于治療有效量。本發(fā)明知母總皂苷提取物的治療或預(yù)防有效量的典型的非限制性范圍是5～20mg/kg，更優(yōu)選為5～10mg/kg。應(yīng)注意，劑量值將根據(jù)欲減輕的疾病類型和嚴(yán)重性變化，也就是說用于患者時(shí)，本發(fā)明所述的知母總皂苷提取物劑量或用量，通常根據(jù)患者或使用者的年齡和體重以及身體狀況或患者癥狀的狀況來決定。另外，應(yīng)理解，對(duì)于任何特定受治療者，應(yīng)隨著時(shí)間根據(jù)個(gè)體需要和給與或監(jiān)督給與所述組合物的人的專業(yè)判斷調(diào)整特定劑量制度，并且本文設(shè)定的劑量范圍僅為例證性的，并不會(huì)限制要求保護(hù)的組合物的范圍或?qū)嵺`。
也就是說，需要根據(jù)治療的對(duì)象、給藥途徑、所治療疾病和狀況等，變化本發(fā)明知母總皂苷提取物的每次和/或每日的劑量或用量。例如，經(jīng)靜脈給予哺乳動(dòng)物，尤其是成年人(如體重60kg)，所述知母總皂苷提取物的單劑量約為50～200mg，優(yōu)選約100mg，優(yōu)選每日給藥1～3次?？梢哉{(diào)整劑量單位，以提拱最佳所需反應(yīng)(例如，治療或預(yù)防應(yīng)答)。例如，可以單次大劑量給藥，可以在一段時(shí)間內(nèi)給予幾個(gè)均分量或根據(jù)治療情況的迫切性按比例降低或增加劑量。配制易于給藥和劑量統(tǒng)一的劑量單位形式的非腸道組合物尤其有利。本文使用的劑量單位形式，指適于欲治療的哺乳動(dòng)物受治療者的單元?jiǎng)┝康奈锢矸蛛x單位；每個(gè)單位含有預(yù)定量的計(jì)算用于與所需藥用載體一同產(chǎn)生所需治療效果的活性物知母總皂苷提取物。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格，由以下確定并直接取決于以下(a)該知母總皂苷提取物的獨(dú)特特征和欲達(dá)到的特定治療或預(yù)防效果，和(b)在混合這種用于治療個(gè)體敏感性知母總皂苷提取物的技術(shù)中的內(nèi)在限制。
3、知母總皂苷提取物及其組合物的藥物劑型和給藥途徑本發(fā)明所述的知母總皂苷提取物及其組合物制備的用于預(yù)防、診斷、檢測(cè)、保護(hù)、治療和研究心肌缺血及其相關(guān)疾病的產(chǎn)品，其中按照飲料、食品技術(shù)領(lǐng)域的要求制備的產(chǎn)品能夠用于預(yù)防、保護(hù)和治療心肌缺血及其相關(guān)疾病；按照醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域的要求制備的產(chǎn)品能夠用于患者的治療或保健，既能夠單獨(dú)直接用于制備治療或保健的藥物，也能夠與許多化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行混合或組合，直接或間接用于制備治療或保健的藥物。這里所述的化學(xué)物質(zhì)與本節(jié)上文中所述的相同。
在本發(fā)明中，所需物料包括本發(fā)明的原料、上述配套使用的化學(xué)物質(zhì)等，均應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況和需要，采用食品級(jí)或藥用級(jí)的物料。
本發(fā)明所述的知母總皂苷提取物及其組合物，可以用本領(lǐng)域已知的各種方法給藥，盡管在許多治療用途中推薦的給藥途徑/給藥方式是噴霧劑或口服給藥。但是，技術(shù)人員會(huì)理解給藥途徑/給藥方式隨所需的結(jié)果而變化。在某些具體實(shí)施中，該活性化合物可以與保護(hù)該化合物免于快速釋放的載體一同制備例如空釋制劑，包括移植物傳遞系統(tǒng)、透皮貼傳遞系統(tǒng)或微囊傳遞系統(tǒng)等中的一種或多種。此外，還可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚羥基乙酸、膠原蛋白、聚正酯或聚乳酸等中的一種或多種。制備這種制劑的許多方法均已申請(qǐng)專利或一般為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知(參見例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson編輯，Marcel Dekker，Inc.，紐約，1978)。
本發(fā)明所述的知母總皂苷提取物及其組合物，通常通過口服、鼻吸入、直腸或腸胃外給藥等中的一種或多種方式，施用于需要這種治療的患者。
用于口服時(shí)，可將其制成常規(guī)的固體制劑如片劑、粉劑、粒劑或膠囊等中的一種或多種。在實(shí)施時(shí)，本發(fā)明知母總皂苷提取物可以與例如惰性稀釋劑或可同化的食用載體一同口服。該知母總皂苷提取物(和共它成分，如果需要)亦可以包于硬或軟殼明膠膠囊、壓制成片劑或直接加入受治療者的膳食中。關(guān)于口服治療給藥，可以將所述知母總皂苷提取物與賦形劑一起加入并以可食片劑、頰含片劑、錠劑、膠囊、懸液、糖漿或糯米紙囊劑等等中的一種或多種形式使用。
為了以非腸道給藥之外給予本發(fā)明知母總皂苷提取物，可能需要用防止其失活的材料對(duì)該知母總皂營提取物包衣或與該知母總皂苷提取物一同給予。亦可以將補(bǔ)充的活性化合物加入該組合物中。在具體實(shí)施時(shí)，將本發(fā)明知母總皂苷提取物與一種或多種可以用于治療疾病的其它治療藥物共配制和/或共給予。這種聯(lián)合使用，可以優(yōu)越地利用較低劑量的該給予的治療藥物，因此避免可能的毒性或與各種單一療法相關(guān)的并發(fā)癥。
制成液體制劑如水劑、油懸浮劑或其它液體制劑中的一種或多種，如糖漿、酊劑或酏劑等中的一種或多種；用于腸胃外給藥時(shí)，可將其制成注射用的溶液劑、水劑或油性懸浮劑等中的一種或多種。
以上所述的使用形式中，優(yōu)選的形式是片劑、包衣片劑、膠囊、栓劑或注射劑等中的一種或多種，進(jìn)一步優(yōu)選片劑、膠囊或注射劑等中的一種或多種，特別優(yōu)選注射劑。
此外，知母總皂苷提取物所使用的藥材原料在某些情況下也能夠單獨(dú)直接用于制備用于預(yù)防、診斷、檢測(cè)、保護(hù)、治療和研究心肌缺血及其相關(guān)疾病的產(chǎn)品，也能夠與許多化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行混合或組合，以組合物的形式直接或間接用于制備用于預(yù)防、診斷、檢測(cè)、保護(hù)、治療和研究心肌缺血及其相關(guān)疾病的產(chǎn)品。這里所述的化學(xué)物質(zhì)與本節(jié)上文中所述的相同。
例如，知母總皂苷提取物所使用的藥材原料的粉末用于制備用于心肌缺血預(yù)防、診斷、保護(hù)和治療產(chǎn)品特別是藥物的各種劑型，或者是知母總皂苷提取物所使用的藥材原料的粉末與有關(guān)的輔料用于制備用于預(yù)防、診斷、檢測(cè)、保護(hù)、治療和研究心肌缺血及其相關(guān)疾病的產(chǎn)品尤其是藥物的各種劑型，或者是知母總皂苷提取物所使用的藥材原料的粉末與有關(guān)的制備用于預(yù)防、診斷、檢測(cè)、保護(hù)、治療和研究心肌缺血及其相關(guān)疾病的產(chǎn)品如藥物一起用于制備用于預(yù)防、診斷、檢測(cè)、保護(hù)、治療和研究心肌缺血及其相關(guān)疾病的產(chǎn)品如藥物的各種劑型，或者是知母總皂苷提取物所使用的藥材原料的粉末與有關(guān)的輔助藥物一起用于制備用于預(yù)防、診斷、檢測(cè)、保護(hù)、治療和研究心肌缺血及其相關(guān)疾病的產(chǎn)品如藥物的各種劑型，如片劑、膠囊劑或混懸劑等中的一種或多種，優(yōu)選膠囊劑。
所述的方法之一是將知母總皂苷提取物所使用的藥材原料的粉末灌裝為膠囊劑，方法之二是將知母總皂苷提取物所使用的藥材原料的粉末與有關(guān)的制備用于預(yù)防、診斷、檢測(cè)、保護(hù)、治療和研究心肌缺血及其相關(guān)疾病的產(chǎn)品如藥物一起灌裝為膠囊劑，方法之三是將知母總皂苷提取物所使用的藥材原料的粉末與有關(guān)的輔助藥物一起灌裝為膠囊劑；方法之四是將知母總皂苷提取物所使用的藥材原料的粉末與有關(guān)的輔料一起按常規(guī)方法直接壓為片劑，方法之五是將知母總皂苷提取物所使用的藥材原料的粉末、有關(guān)的制備用于預(yù)防、診斷、檢測(cè)、保護(hù)、治療和研究心肌缺血及其相關(guān)疾病的產(chǎn)品如藥物一起與有關(guān)的輔料按常規(guī)方法直接壓為片劑，方法之六是將知母總皂苷提取物所使用的藥材原料的粉末、有關(guān)的輔助藥物一起與有關(guān)的輔料按常規(guī)方法直接壓為片劑等。
除上述的六種基本方法外，還能夠選擇知母總皂苷提取物所使用的藥材原料的其他形式或?qū)χ缚傇碥仗崛∥锼褂玫乃幉脑线M(jìn)行本領(lǐng)域公知的方法處理后，制備各種劑型的含有知母總皂苷提取物所使用的藥材原料的產(chǎn)品如藥物。但是，需要注意的是，在上述直接使用知母總皂苷提取物所使用的藥材原料的時(shí)候，應(yīng)先根據(jù)所使用的知母總皂苷提取物的劑量要求，換算得到所需要使用的知母總皂苷提取物所使用的藥材原料的用量。
綜上所述，本發(fā)明知母總皂苷提取物及其組合物可用于預(yù)防、診斷、檢測(cè)、保護(hù)、治療和研究心肌缺血及其相關(guān)疾病的產(chǎn)品，優(yōu)選藥物和食品，進(jìn)一步優(yōu)選藥物。
(四)技術(shù)特長(zhǎng)本發(fā)明對(duì)以皂苷為主要成分的知母總皂苷提取物拓展了新的醫(yī)藥用途，也為預(yù)防、診斷、檢測(cè)、保護(hù)、治療和研究心肌缺血及其相關(guān)疾病提供了一種新的藥物來源。本發(fā)明的知母總皂苷提取物安全低毒，藥理作用較強(qiáng)，其原料來源豐富、價(jià)廉，制備工藝簡(jiǎn)單，可用于制備預(yù)防、診斷、檢測(cè)、保護(hù)、治療和研究心肌缺血及其相關(guān)疾病的產(chǎn)品。
本發(fā)明有針對(duì)性地研究知母總皂苷提取物，知母總皂苷提取物藥理作用較強(qiáng)，其原料來源豐富，制備工藝簡(jiǎn)單，得率高；且使用安全，一物多用，最大限度地發(fā)揮了作用，而且使用范圍特別廣，因此容易推廣應(yīng)用，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
知母總皂苷提取物性質(zhì)穩(wěn)定，使用制備的制劑質(zhì)量穩(wěn)定，預(yù)防、診斷、檢測(cè)、保護(hù)、治療和研究心肌缺血及其相關(guān)疾病的效果明顯，故其更適于預(yù)防、診斷、檢測(cè)、保護(hù)、治療和研究心肌缺血及其相關(guān)疾病產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)。
總之，本發(fā)明積極適應(yīng)了現(xiàn)代醫(yī)療和科研領(lǐng)域的工作需要和人性化服務(wù)的需要，是用于預(yù)防、診斷、檢測(cè)、保護(hù)、治療和研究心肌缺血及其相關(guān)疾病等方面的安全原料。


圖1表示知母總皂苷提取物對(duì)犬冠脈結(jié)扎心外膜電圖ST段總和(∑ST)的影響；圖2表示知母總皂苷提取物對(duì)犬冠脈結(jié)扎心肌梗塞范圍(N-ST)的影響；圖3表示知母總皂苷提取物對(duì)犬心肌耗氧量(mL/min.100g-1)的影響；圖4表示知母總皂苷提取物對(duì)犬心肌氧攝取率(％)的影響；圖5表示知母總皂苷提取物對(duì)犬冠脈流量(ml/min)的影響；圖6表示知母總皂苷提取物對(duì)犬冠脈阻力(Kpa/ml/min)的影響。
其中 表示溶劑對(duì)照組 表示陽性對(duì)照組 表示小劑量組 表示中劑量組 表示大劑量組具體實(shí)施方式
本發(fā)明研究了現(xiàn)有的知母總皂苷提取物的新的藥理作用和新的用途，提供了一種能夠用于制備心肌缺血預(yù)防、診斷、保護(hù)和治療等產(chǎn)品的原料，便于醫(yī)療行業(yè)和相關(guān)行業(yè)如食品、飲料等領(lǐng)域的安全使用。
(一)制備方法本發(fā)明知母總皂苷提取物的制備方法為(1)提取按常規(guī)將粉碎的知母藥材用20～95％乙醇熱提，首次溶媒體積用量約為生藥的4～8倍；或?qū)⒎鬯榈闹杆幉挠?0～95％乙醇滲漉提取，溶媒體積用量約為生藥的4～12倍；得提取液；將提取液過濾、濃縮，濃縮液離心或過濾；(2)分離純化濃縮液的離心上清液或過濾液通過非極性或弱極性大孔樹脂吸附(非極性或弱極性大孔樹脂為以苯乙烯為架橋材料的聚苯乙烯型多孔性吸附樹脂，如D101、D201、ZTC-1、AB-8、1300-1型大孔樹脂等)，用水及20％以下的乙醇淋洗除去雜質(zhì)；再用含水低級(jí)醇洗脫，低級(jí)醇為甲醇、乙醇或丙醇等C1～C5醇類，其濃度為30～95％，體積用量為生藥的5～15倍，收集低級(jí)醇洗脫液，濃縮至無醇；(3)干燥干燥粉碎或噴霧干燥，即為本發(fā)明的知母總皂苷提取物，成品收率為生藥量的1.5％以上。
本發(fā)明知母總皂苷提取物成分分析經(jīng)硅膠、sephadexLH-20、ODS等反相色譜擔(dān)體柱色譜獲得了6個(gè)化合物，用化學(xué)、波譜法測(cè)定了結(jié)構(gòu)，分別為薩爾薩皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷(簡(jiǎn)稱知母皂苷A-III)、嗎爾考皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷、26-O-β-D-吡喃葡萄糖基呋甾-20(22)-烯-3β，26-二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷(簡(jiǎn)稱知母皂苷B)、薩爾薩皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→3)-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷(簡(jiǎn)稱西陵皂苷B)、26-O-β-D-吡喃葡萄糖基呋甾-22，3β，26-三醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷(簡(jiǎn)稱知母皂苷B-II)、薩爾薩皂苷元。經(jīng)HPLC檢測(cè)，知母總皂苷提取物中知母皂苷B-II、知母皂苷B的含量之和≥50％，知母皂苷B-II含量≥30％，該提取物的最優(yōu)比例為知母皂苷B-II、知母皂苷B含量百分比例為75～95∶15～5。
(二)常用的實(shí)用劑型本發(fā)明制備粉針劑一般采用常規(guī)的冷凍干燥法，以水作為溶媒，其步驟為取知母總皂苷提取物，加入賦形劑，加水溶解，加入活性炭，過濾除菌，灌裝，半軋塞，冷凍干燥，壓塞軋蓋即可。所用的賦形劑選自甘露醇、水解明膠、葡萄糖、乳糖、右旋糖苷等中的一種或幾種。每瓶含知母總皂苷提取物10～100mg。
本發(fā)明制備粉針劑也可采用噴霧干燥法，以水作為溶媒，其步驟為取知母總皂苷提取物，加或不加賦形劑(賦形劑同上)，加水溶解，加入活性炭，過濾除菌，噴霧干燥，無菌分裝，壓塞軋蓋即可。每瓶含知母總皂苷提取物10～100mg。
本發(fā)明制備小針劑時(shí)，以注射用水作為溶媒配制即可，也可加適量輔料，輔料選自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸芐酯、二甲基乙酰胺中的一種或幾種。每支含知母總皂苷提取物10～100mg。
本發(fā)明制備葡萄糖輸液或氯化鈉輸液，以注射用水作為溶媒，加入適量葡萄糖或氯化鈉配制即可，也可加適量輔料，輔料選自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸芐酯、二甲基乙酰胺中的一種或幾種。每瓶含知母總皂苷提取物10～100mg。
本發(fā)明制備片劑、膠囊、顆粒劑、口服液等口服制劑，輔料可以是乳糖、淀粉、糊精、硬脂酸鹽等，按常規(guī)技術(shù)制備。
在本發(fā)明中，以上所述的具體實(shí)施方式
和以下所述的實(shí)例均是為了更好地闡述本發(fā)明，并不是用來限制發(fā)明的范圍。
下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述。
實(shí)施例1、知母總皂苷提取物的制備方法100公斤粉碎后的知母藥材，投入提取罐，在90～100℃依次用70％乙醇400升熱提3次，每次提取時(shí)間為90分鐘，合并3次提取液，濃縮至80升，過濾，將濾液用蒸餾水調(diào)節(jié)至100升。再緩緩?fù)ㄟ^裝有350升ZTC-1型大孔樹脂(天津正天成澄清技術(shù)有限公司生產(chǎn))的吸附柱，用500升蒸餾水、1000升20％乙醇洗脫除去雜質(zhì)，再用1000升45％乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，干燥粉碎后得黃色粉末，即為本發(fā)明的知母總皂苷提取物，共重2.7公斤，按生藥量計(jì)得率為2.7％。
實(shí)施例2、知母總皂苷提取物的另一種制備方法將知母藥材切成薄片，取100kg，以30％乙醇300L浸潤(rùn)12小時(shí)后滲漉提取，收集2400L滲漉液。將滲漉液濃縮到150L；濃縮液過濾，濾液通入裝有200L的D101型樹脂的色譜柱中，依次用蒸餾水3000L、20％乙醇3000L、60％乙醇1200L洗脫，收集60％乙醇洗脫部分，濃縮至干，干燥粉碎后得黃色粉末，即為本發(fā)明的知母總皂苷提取物，共重3.1公斤，按生藥量計(jì)得率為3.1％。
實(shí)施例3、知母總皂苷提取物的再一種制備方法知母干燥藥材2.5kg，用75％乙醇溶液50升回流提取2次，每次2小時(shí)，合并兩次提取液，減壓回收至無醇味，過濾得濾液，濾液用蒸餾水調(diào)至相對(duì)密度1.05左右，上AB-8大孔吸附樹脂柱，用水洗去水溶性雜質(zhì)，繼用不同濃度乙醇洗脫，收集50％乙醇洗脫部位，即得富含酚酸苷類和二萜苷類成分的洗脫液，減壓回收至干，得知母總皂苷提取物45g。
實(shí)施例4、知母總皂苷提取物對(duì)犬冠狀動(dòng)脈結(jié)扎造成心肌梗塞模型的治療作用本發(fā)明對(duì)知母總皂苷提取物通過灌胃給藥對(duì)犬冠狀動(dòng)脈結(jié)扎造成心肌梗塞模型的治療作用進(jìn)行了試驗(yàn)。
(1)試驗(yàn)方法將雜種犬(第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供)隨機(jī)分為5組陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組、知母總皂苷提取物低劑量組、知母總皂苷提取物中劑量組及知母總皂苷提取物高劑量組，每組5只。陰性對(duì)照組即犬冠狀動(dòng)脈結(jié)扎造成心肌梗塞模型，給予等量的生理鹽水；陽性對(duì)照組用地奧心血康膠囊(成都地奧制藥有限公司，批號(hào)0402061)作為知母總皂苷提取物療效的對(duì)照，臨床推薦劑量為0.6g/天/人(相當(dāng)于甾體總皂苷210mg)，人以60公斤體重計(jì)算，為3.5mg/kg/人(甾體總皂苷量)，折算為犬的劑量為7mg/kg，設(shè)計(jì)陽性對(duì)照藥劑量相當(dāng)于受試藥的中劑量，故給藥劑量為21mg/kg。知母總皂苷提取物犬低劑量為20mg/kg，中劑量為60mg/kg，高劑量為120mg/kg。
根據(jù)新藥審評(píng)要求，制備犬冠狀動(dòng)脈結(jié)扎造成心肌梗塞模型(制備方法詳見《西藥新藥臨床前研究指導(dǎo)原則匯編》的藥理學(xué)部分，中華人民共和國衛(wèi)生部藥政管理局，199361；《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》第二版，人民衛(wèi)生出版社，1991830、1113)，各組均用該模型犬試驗(yàn)。各組在冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后后灌胃給藥，陰性對(duì)照組給同體積生理鹽水。然后觀察以下指標(biāo)①對(duì)心肌缺血程度(心外膜電圖∑ST)及心肌缺血范圍(心外膜電圖N-ST)的影響分別在給藥后15min、30min、60min、90min、120min、180min記錄心外膜電圖的變化。心外膜電圖觀察指標(biāo)以ST段升高或降低2mV以上的導(dǎo)聯(lián)數(shù)(NST)和ST段升高值的總和(∑ST)為指標(biāo)觀察給藥前后的變化，并計(jì)算心肌缺血程度(∑ST)和范圍(NST)。以用藥后不同時(shí)間實(shí)測(cè)值與用藥前進(jìn)行比較，以用藥后不同時(shí)間變化百分率(用藥前為100％)進(jìn)行組間比較。
②對(duì)心肌梗塞范圍的定量組織學(xué)檢測(cè)的影響結(jié)扎3小時(shí)后取心臟，稱取全心重量；切去心房及右心室，稱出左心室重量，并在冠脈結(jié)扎線下，平行于冠狀溝將左心室切成等厚的4～6片，用生理鹽水洗凈，置0.05％氯化硝基四氮唑藍(lán)(N-BT)液37℃染色30分鐘。染色過程中不時(shí)搖動(dòng)染色液使之與心肌充分接觸。染色后立即用水沖去多余染料。梗死區(qū)不著色，非梗死區(qū)著暗藍(lán)色，剪去著色部分，將未著色的梗死區(qū)稱重，計(jì)算出梗塞區(qū)重量占全心及左心室重量的百分比。
③對(duì)冠脈結(jié)扎后血清生化指標(biāo)的影響冠脈結(jié)扎前及給藥后3小時(shí)各取右心室血3ml，3000rpm離心15分鐘，取血清測(cè)乳酸脫氫酶(簡(jiǎn)稱LDH)、血清肌酸激酶(簡(jiǎn)稱CK)。LDH的測(cè)定采用LDH測(cè)試盒方法(批號(hào)20040719，南京建成生物工程研究所)，CK(批號(hào)20040802，南京建成生物工程研究所)。在UV751GD型紫外/可見光分光光度計(jì)上進(jìn)行(上海分析儀器廠)。
(2)試驗(yàn)結(jié)果①對(duì)心肌缺血程度(心外膜電圖∑ST)的影響結(jié)果詳見圖1。從圖1看出，知母總皂苷提取物組20～120mg/kg靜脈給藥后能劑量依賴性地減輕心肌缺血程度，∑ST顯著下降(P＜0.01)，小劑量組60～90min與生理鹽水組差異非常顯著(P＜0.01)；中劑量組從15min起即有顯著性差異(P＜0.05)，各時(shí)間點(diǎn)與生理鹽水組比較，30min時(shí)有顯著性差異，60～90min有非常顯著差異(P＜0.01)；高劑量組60～120min差異非常顯著(P＜0.01)。知母總皂苷提取物20～120mg/kg灌胃對(duì)狗冠脈結(jié)扎引起的急性心肌缺血程度有顯著的治療作用。
②對(duì)心肌缺血范圍(心外膜電圖N-ST)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。從圖2看出，知母總皂苷提取物能劑量依賴性地縮小心肌缺血范圍，降低N-ST值。低劑量組20mg/kg各時(shí)間點(diǎn)N-ST值降低率與生理鹽水組同時(shí)間點(diǎn)比較，30min時(shí)差異顯著(P＜0.05)；中劑量組60mg/kg從15～90min時(shí)N-ST值降低率與生理鹽水組同時(shí)間點(diǎn)比較，有顯著差異(P＜0.05)；高劑量組(120mg/kg)從30～180min降低心肌缺血范圍與生理鹽水組比較，有非常顯著差異(P＜0.01)。
③知母總皂苷提取物對(duì)心肌梗塞范圍的定量組織學(xué)檢測(cè)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。從表1看出，知母總皂苷提取物20～120mg/kg灌胃能劑量依賴性地減少心肌梗塞范圍。知母總皂苷提取物低、中、高劑量組(20、60、120mg/kg)梗塞區(qū)/全心的比值和梗塞區(qū)/左心室的比值與生理鹽水組比較下降顯著(P＜0.05，P＜0.01)。其中高劑量組(120mg/kg)心肌梗塞區(qū)與全心重量的比值和梗塞區(qū)與左心室重量的比值分別由生理鹽水組的15.13±1.51％，26.30±2.94％下降到11.20±1.82％，19.32±1.34％。
表1、知母總皂苷提取物對(duì)N-BT染色測(cè)定心肌梗塞范圍的影響(x±s，n＝5只/組)

*P＜0.05，**P＜0.01與生理鹽水組比較④對(duì)冠脈結(jié)扎后血清生化指標(biāo)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2、3。
表2、知母總皂苷提取物對(duì)冠脈結(jié)扎動(dòng)脈血清生化指標(biāo)的影響(x±s，n＝5只/組)

*P＜0.05，**P＜0.01與生理鹽水組比較表3、知母總皂苷提取物對(duì)冠脈結(jié)扎動(dòng)脈血清生化指標(biāo)的影響(x±s，n＝5只/組)

*P＜0.05，**P＜0.01與生理鹽水組比較知母總皂苷提取物低、中、高劑量組及陽性對(duì)照藥地奧心血康膠囊組均能顯著的降低血清LDH和CK的升高程度(P＜0.05)。其中高劑量組(120mg/kg)血清LDH、CK可分別由239.4±72.0、297.7±63.8上升到487.2±145.3、612.0±94.7，僅分別上升了2.05±0.27和2.09±0.29倍。
以上試驗(yàn)結(jié)果說明，知母總皂苷提取物可明顯改善犬冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后造成心肌梗塞引起的減輕心肌缺血程度與范圍、減少心肌梗塞范圍、降低血清LDH和CK的升高程度。另外，知母總皂苷提取物還可顯著降低麻醉犬心肌耗氧量、對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。這些作用都有利于預(yù)防和治療心肌缺血，因此，知母總皂苷提取物可用于制備治療心肌缺血的藥物或食品。
實(shí)施例5、知母總皂苷提取物對(duì)麻醉犬心肌耗氧量的影響本發(fā)明對(duì)知母總皂苷提取物灌胃對(duì)麻醉犬心肌耗氧量的影響進(jìn)行了試驗(yàn)。
(1)試驗(yàn)方法將雜種犬(第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供)隨機(jī)分為5組陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組、知母總皂苷提取物低劑量組、知母總皂苷提取物中劑量組及知母總皂苷提取物高劑量組，每組5只。陰性對(duì)照組即犬冠狀動(dòng)脈結(jié)扎造成心肌梗塞模型，給予等量的生理鹽水；陽性對(duì)照組用地奧心血康膠囊(成都地奧制藥有限公司，批號(hào)0402061)作為知母總皂苷提取物療效的對(duì)照，臨床推薦劑量為0.6g/天/人(相當(dāng)于甾體總皂苷210mg)，人以60公斤體重計(jì)算，為3.5mg/kg/人(甾體總皂苷量)，折算為犬的劑量為7mg/kg，設(shè)計(jì)陽性對(duì)照藥劑量相當(dāng)于受試藥的中劑量，故給藥劑量為21mg/kg。知母總皂苷提取物犬低劑量為20mg/kg，中劑量為60mg/kg，高劑量為120mg/kg。
實(shí)驗(yàn)方法詳見《西藥新藥臨床前研究指導(dǎo)原則匯編》的藥理學(xué)部分，中華人民共和國衛(wèi)生部藥政管理局，1993；《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》第二版，人民衛(wèi)生出版社，1991)。
(2)試驗(yàn)結(jié)果①對(duì)麻醉犬心肌耗氧量的影響知母總皂苷提取物低劑量組灌胃后心肌耗氧量同生理鹽水組相比無顯著性差異(P＞0.05)；中劑量組60～90min可非常顯著降低犬心肌耗氧量(P＜0.01)，120min時(shí)差異仍顯著；高劑量組15min即有顯著差異(P＜0.05)，30min-180min差異非常顯著(P＜0.01)；地奧心血康組15～120min起耗氧量與給藥前相比差異非常顯著(P＜0.01)，180min時(shí)仍可顯著降低心肌耗氧量(P＜0.05)(結(jié)果見圖3)。
②對(duì)麻醉犬心肌氧攝取率的影響知母總皂苷提取物灌胃后可顯著降低心肌氧攝取率。降低率與生理鹽水組同時(shí)間點(diǎn)相比，小劑量組在30min起即有顯著差異(P＜0.05)，60～120min時(shí)差異非常顯著(P＜0.01)；中劑量組15min即降低麻醉犬心肌氧攝取率，30min至180min各時(shí)間點(diǎn)差異均非常顯著(P＜0.01)；高劑量組從30min至180min與生理鹽水組比心肌氧攝取率均非常顯著降低(P＜0.01)；陽性對(duì)照藥地奧心血康15min起即有顯著差異(P＜0.05)，30min至180min非常顯著降低心肌氧攝取率(P＜0.01)。(結(jié)果見圖4)。
③對(duì)麻醉犬冠脈流量的影響知母總皂苷提取物各劑量組可增加冠脈流量；增加率與生理鹽水組同時(shí)間點(diǎn)相比，小劑量組從30min至90min差異非常顯著(P＜0.01)；120min時(shí)仍有顯著差異(P＜0.05)；中、高劑量組則從30～180min差異均非常顯著(P＜0.01)。陽性對(duì)照藥地奧心血康組也可明顯增加冠脈流量，從30～180min增加率與生理鹽水組同時(shí)間點(diǎn)相比差異非常顯著(P＜0.01)。(結(jié)果見圖5)。
④對(duì)麻醉犬冠脈阻力的影響知母總皂苷提取物各劑量組可降低冠脈阻力，降低率與生理鹽水組同時(shí)間點(diǎn)相比，低劑量組(20mg/kg)在30min差異顯著(P＜0.05)，60～180min差異非常顯著(P＜0.01)；中劑量組(60mg/kg)從30～180min差異非常顯著(P＜0.01)；高劑量組(120mg/kg)與陽性對(duì)照藥地奧心血康從15min起即可顯著降低冠脈阻力，30～180min時(shí)冠脈阻力降低率與生理鹽水組同時(shí)間點(diǎn)相比差異非常顯著(P＜0.01)(結(jié)果見圖6)。
以上試驗(yàn)結(jié)果說明，知母總皂苷提取物可明顯增加麻醉犬冠脈流量，降低冠脈阻力，降低總外周阻力，可明顯降低心肌氧攝取率，降低心肌耗氧量。這些作用都有利于預(yù)防和治療心肌缺血，因此，知母總皂苷提取物可用于制備治療心肌缺血的藥物或食品。
實(shí)施例6、知母總皂苷提取物對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用本發(fā)明對(duì)知母總皂苷提取物通過灌胃給藥對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用進(jìn)行了試驗(yàn)。
(1)試驗(yàn)方法將SD大鼠(第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供)隨機(jī)分為6組假手術(shù)組、生理鹽水對(duì)照組、陽性對(duì)照組、知母總皂苷提取物低劑量組、知母總皂苷提取物中劑量組及知母總皂苷提取物高劑量組，每組10只。陽性對(duì)照組用地奧心血康膠囊(成都地奧制藥有限公司，批號(hào)0402061)作為知母總皂苷提取物療效的對(duì)照，臨床推薦劑量為0.6g/天/人(相當(dāng)于甾體總皂苷210mg)，人以60公斤體重計(jì)算，為3.5mg/kg/人(甾體總皂苷量)，折算為大鼠的劑量為21mg/kg，設(shè)計(jì)陽性對(duì)照藥劑量相當(dāng)于受試藥的中劑量，故給藥劑量為63mg/kg。知母總皂苷提取物犬低劑量為60mg/kg，中劑量為180mg/kg，高劑量為360mg/kg。各組冠脈結(jié)扎完畢后灌胃給藥，給藥體積與缺血再灌注模型組給生理鹽水量一致。
實(shí)驗(yàn)方法詳見《西藥新藥臨床前研究指導(dǎo)原則匯編》的藥理學(xué)部分，中華人民共和國衛(wèi)生部藥政管理局，1993；《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》第二版，人民衛(wèi)生出版社，1991)。
(2)試驗(yàn)結(jié)果心肌缺血再灌注后，血清LDH、CK活性明顯增加，心肌梗塞區(qū)重量明顯增加，與假手術(shù)對(duì)照組比較有非常顯著性差異(P＜0.01)；知母總皂苷提取物低劑量組(60mg/kg)血清CK活性、心肌梗塞區(qū)/全心重量百分比低于模型組，差異具有顯著性意義(P＜0.05)；知母總皂苷提取物中、高劑量組(120、360mg/kg)血清LDH、CK活性、心肌梗塞區(qū)/全心重量百分比低于模型組，差異具有非常顯著性意義(P＜0.01)；地奧心血康膠囊組血清LDH、CK活性、心肌梗塞區(qū)/全心重量百分比明顯低于模型組(P＜0.01)(見表4)。
表4、知母總皂苷提取物對(duì)大鼠心臟缺血再灌注損傷的影響(x±s，n＝10)

*P＜0.05，**P＜0.01與生理鹽水組比較；ΔΔP＜0.01與假手術(shù)組比較。
知母總皂苷提取物灌胃對(duì)缺血再灌注所致SD大鼠心肌損傷有保護(hù)作用，可明顯抑制缺血再灌注所致大鼠心肌損傷時(shí)LDH、CK溢出，降低血清LDH、CK活性，縮小心肌梗塞區(qū)重量，并有一定的量效關(guān)系。與實(shí)驗(yàn)劑量的地奧心血康膠囊比較，中劑量知母總皂苷提取物的效果與地奧心血康膠囊相似。
實(shí)施例7、知母總皂苷提取物粉針劑的制備取知母總皂苷提取物30g，加入右旋糖苷30g，加500ml注射用水，攪拌使其溶解；加注射用水至2000ml，加3.0g針用活性炭，充分?jǐn)嚢?0分鐘；脫炭過濾；用0.22μm微孔濾膜過濾；灌裝到無菌的西林瓶中，每瓶2ml，半軋塞；冷凍干燥，再壓塞軋蓋即可。
實(shí)施例8、知母總皂苷提取物粉針劑的制備取知母總皂苷提取物60g，加500ml注射用水，攪拌使其溶解；加注射用水至1000ml，加1g針用活性炭，充分?jǐn)嚢?0分鐘；脫炭過濾；用0.22μm微孔濾膜過濾；冷凍干燥得無菌粉末，分裝成1000瓶。
實(shí)施例9、知母總皂苷提取物粉針劑的制備取知母總皂苷提取物40g，加入乳糖50g，加100ml注射用水，攪拌使其溶解；加注射用水至1000ml，加1.5g針用活性炭，充分?jǐn)嚢?0分鐘；脫炭過濾；用0.22μm微孔濾膜過濾；噴霧干燥得無菌粉末，分裝成1000瓶。
實(shí)施例10、知母總皂苷提取物粉針劑的制備(1)處方

(2)制備工藝按以上處方稱取處方量知母總皂苷提取物，加入到適量注射用水中，攪拌使其溶解；加入處方量甘露醇，攪拌使完全溶解，加注射用水至全量；加入液體量的0.1％針用活性炭，充分?jǐn)嚢?0分鐘；脫炭過濾；用0.22μm微孔濾膜過濾；灌裝，半軋塞；冷凍干燥，壓塞軋蓋。共制得9735瓶，成品率為97.35％。
實(shí)施例11、知母總皂苷提取物小針劑的制備取知母總皂苷提取物5g，加100ml注射用水，攪拌使其溶解；加注射用水至1000ml，用0.22μm微孔濾膜過濾；分裝灌封，每瓶10ml，滅菌即可。
實(shí)施例12、知母總皂苷提取物小針劑的制備取知母總皂苷提取物10g，加入丙二醇30g，加200ml注射用水，攪拌使其溶解；加注射用水至1000ml，加1.5g針用活性炭，充分?jǐn)嚢?0分鐘；脫炭過濾；用0.22μm微孔濾膜過濾；分裝灌封，每瓶5ml，滅菌即可。
實(shí)施例13、知母總皂苷提取物葡萄糖輸液的制備取知母總皂苷提取物2g，加入聚乙二醇10g，加入葡萄糖500g，加2000ml注射用水，攪拌使其溶解；加注射用水至5000ml；用0.22μm微孔濾膜過濾；分裝灌封，每瓶100ml，滅菌即可。
實(shí)施例14、知母總皂苷提取物葡萄糖輸液的制備取知母總皂苷提取物2g，加入葡萄糖250g，加1000ml注射用水，攪拌使其溶解；加注射用水至5000ml；用0.22μm微孔濾膜過濾；分裝灌封，每瓶250ml，滅菌即可。
實(shí)施例15、知母總皂苷提取物氯化鈉輸液的制備取知母總皂苷提取物1g，加入氯化鈉90g，加1000ml注射用水，攪拌使其溶解；加注射用水至10000ml；用0.22μm微孔濾膜過濾；分裝灌封，每瓶250ml，滅菌即可。
實(shí)施例16、知母總皂苷提取物片劑的制備(1)處方

(2)制備工藝按以上處方分別稱取處方量的主藥與輔料，按等量遞加法混合均勻后照處方工藝項(xiàng)下進(jìn)行制軟材、制顆粒，干燥，整粒等過程，計(jì)算好片重后用單沖壓片機(jī)和10.5mm淺凹沖模壓片，控制裸片硬度5～7kg，共制得片劑9698片，成品率為96.98％。
采用滾轉(zhuǎn)噴霧法包衣，包衣工藝如下包衣液的配制胃溶薄膜衣料85G61235，由上?？房蛋录夹g(shù)有限公司提供包衣工藝將待包衣裸片(硬度5～7kg)放入包衣鍋中，啟動(dòng)攪拌裝置和鼓風(fēng)加熱裝置，待裸片溫度升至40℃時(shí)，開始打開噴槍對(duì)準(zhǔn)片床的上1/3處噴入包衣液包衣，控制片床溫度38～42℃，氣磅壓力6kg，包衣液流速為50mL/min，包衣膜重占包衣片重的3％。
實(shí)施例17、知母總皂苷提取物片劑的制備取知母總皂苷提取物100g，微晶纖維素80g、乳糖15g、預(yù)膠化淀粉60g，過篩，混合均勻，用適量10％PVP乙醇溶液制軟材，制粒，干燥，加入硬脂酸鎂3g，整粒，壓片，制成1000片。
實(shí)施例18、知母總皂苷提取物膠囊劑的制備(1)處方

(2)制備工藝 按以上處方分別取原料藥知母總皂苷提取物及處方中其它輔料分別過100目篩，置60℃烘干，稱取處方量知母總皂苷提取物與微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉等量遞加法混合均勻，用適量無水乙醇制軟材，30目篩制粒，50～60℃干燥2小時(shí)，用30目篩整粒，加入處方量的滑石粉和羧甲基淀粉鈉混合均勻。
實(shí)施例19、知母總皂苷提取物膠囊劑的制備取知母總皂苷提取物100g、微晶纖維素100g、羧甲基淀粉鈉14g、滑石粉8g，分別過100目篩，置60℃烘干，取知母總皂苷提取物與微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉等量遞加法混合均勻，用適量無水乙醇制軟材，30目篩制粒，50～60℃干燥2小時(shí)，用30目篩整粒，加入處方量的滑石粉和羧甲基淀粉鈉混合均勻。
權(quán)利要求
1.知母總皂苷提取物在制備心肌缺血產(chǎn)品中的應(yīng)用。
2.知母總皂苷提取物的組合物在制備心肌缺血產(chǎn)品中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的知母總皂苷提取物的主要成分為知母皂苷B-II化合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的知母皂苷B-II化合物在知母總皂苷提取物中含量范圍是30％～70％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的心肌缺血產(chǎn)品是指用于預(yù)防、診斷、檢測(cè)、保護(hù)、治療和研究心肌缺血及其相關(guān)疾病的產(chǎn)品。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的知母總皂苷提取物的制備方法包括如下步驟(1)提取取知母原料若干，提取，得提取液，即知母總提取物；(2)分離純化將提取液分離純化，即得知母總皂苷提取物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的提取方法是包括溶劑提取法在內(nèi)的本領(lǐng)域公知的所有可以使用的方法。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的提取方法是溶劑提取法。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的提取方法是取知母藥材若干，加入提取溶劑混合，提取，將提取液過濾、濃縮，即得知母藥材總提取物。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的分離純化方法是包括溶劑分離法、溶劑萃取法、大孔吸附樹脂法、沉淀法、鹽析法、柱層析法或結(jié)晶與重結(jié)晶和分步結(jié)晶法中的一種或多種。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的分離純化方法是包括溶劑萃取法或大孔吸附樹脂法中的一種。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的大孔吸附樹脂法的操作包括如下步驟(1)將樣品液通過大孔吸附樹脂柱，用水淋洗除去雜質(zhì)；(2)用含水低級(jí)醇洗脫，收集低級(jí)醇洗脫液；(3)濃縮至干，并粉碎；粉末用丙酮溶解、濾過、回收，靜置，析出結(jié)晶，過濾，洗滌結(jié)晶，即得知母總皂苷提取物。
13.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的知母總皂苷提取物的制備方法還包括干燥的步驟。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的干燥方法是包括常壓干燥法、減壓干燥法、真空干燥法、噴霧干燥法、冷凍干燥法、遠(yuǎn)紅外加熱干燥法或微波干燥法中的一種或多種。
全文摘要
本發(fā)明涉及中藥知母總皂苷提取物的新用途，該總皂苷提取物的主要成分為知母皂苷B－II化合物，含量范圍是30％～70％；采取本領(lǐng)域常規(guī)的提取、分離純化等方法和步驟，即可得到該提取物。該提取物藥理作用較強(qiáng)，診斷和治療心肌缺血及其相關(guān)疾病的效果明顯，藥材原料來源豐富，制備工藝簡(jiǎn)單，得率高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，使用安全，一物多用，且使用范圍特別廣，能夠最大限度地發(fā)揮其作用，因此容易推廣應(yīng)用。此外，心血管疾病為臨床常見病、多發(fā)病，發(fā)病率正不斷攀升，已成為中國人口的重要死亡原因，研制治療心血管疾病藥物，尤其是預(yù)防、診斷、保護(hù)、治療和研究心肌缺血等方面產(chǎn)品特別是藥物，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生顯著的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)A61P9/10GK1682873SQ20051002431
公開日2005年10月19日 申請(qǐng)日期2005年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月10日
發(fā)明者婁子洋, 陳萬生 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)