專利名稱：一種以加熱調(diào)控細(xì)胞因子表達(dá)的方法及其在腫瘤治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種以加熱調(diào)控細(xì)胞因子表達(dá)的方法，尤其是采用局部加熱控制免疫刺激細(xì)胞因子基因表達(dá)的方法，及其在腫瘤治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前惡性腫瘤仍然是威脅人類健康和生命的最主要的疾病?，F(xiàn)有的各種治療方法(包括手術(shù)、放療和化療)僅對(duì)局限的腫瘤病灶有效，而對(duì)于播散或復(fù)發(fā)的腫瘤療效不佳。因此，迫切需要建立新的腫瘤治療方法，這也是當(dāng)今人類所面臨的最大挑戰(zhàn)之一。
基因治療為解決惡性腫瘤的治療問題提供了許多良機(jī)，其中最主要是因?yàn)榛蛑委熌茱@著拓寬腫瘤的治療窗。隨著人類基因組計(jì)劃和后基因組計(jì)劃的實(shí)施，治療基因的選擇更廣泛，調(diào)控治療基因表達(dá)的方法也會(huì)更多。因此，有可能做到選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞和組織損傷較小。不僅可改善治療效果，還能減輕毒、副作用。
為了達(dá)到最大限度殺傷腫瘤細(xì)胞同時(shí)又不損傷或很少損傷正常組織細(xì)胞的目的，在設(shè)計(jì)腫瘤基因治療策略和方法時(shí)必須考慮以下三點(diǎn)。
1.強(qiáng)效的抗腫瘤治療基因；2.高效地將治療基因輸送到腫瘤內(nèi)；3.有效地調(diào)控治療基因在腫瘤內(nèi)表達(dá)；目前已發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因中，受調(diào)控最強(qiáng)的基因是熱休克蛋白(heatshock protein)基因家族。這些基因具有廣泛的功能，是護(hù)送新合成的蛋白質(zhì)到它們的亞細(xì)胞部位的護(hù)衛(wèi)者；并且在環(huán)境重壓(stress)時(shí)如熱壓力、化學(xué)壓力或外源微生物感染時(shí)被激活的壓力反應(yīng)蛋白(stress response protein)。熱休克蛋白的最突出的特征是當(dāng)溫度超過正常生理溫度5-6℃時(shí)其表達(dá)可上調(diào)數(shù)千倍，此時(shí)細(xì)胞中90％以上的蛋白合成器都轉(zhuǎn)而產(chǎn)生熱休克蛋白。已有研究證實(shí)，熱休克蛋白的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，位于熱休克蛋白基因5’端的啟動(dòng)子起著關(guān)鍵作用。熱休克蛋白啟動(dòng)子是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最強(qiáng)的啟動(dòng)子之一，為調(diào)控治療基因表達(dá)提供了最佳的選擇。熱療(hyperthermia)和熱消融(thermalablation)技術(shù)目前已應(yīng)用于各種實(shí)體瘤的治療，但迄今尚無將上述因素有機(jī)結(jié)合用于醫(yī)療實(shí)踐的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以加熱調(diào)控細(xì)胞因子表達(dá)的方法，尤其是采用局部加熱控制免疫刺激細(xì)胞因子基因表達(dá)的方法。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供所述方法在腫瘤治療中的應(yīng)用。
本發(fā)明方法的技術(shù)方案包括使用熱休克蛋白基因啟動(dòng)子和免疫刺激細(xì)胞因子基因構(gòu)建人工基因，所述人工基因具有將免疫刺激基因靶向在腫瘤內(nèi)表達(dá)的潛力，然后采用微波或超生或射頻等方式加熱腫瘤，使腫瘤局部溫度增加3-5度，使得免疫調(diào)控基因在腫瘤局部選擇性、高效表達(dá)，達(dá)到清除局部和全身腫瘤的目的。本發(fā)明所述的免疫刺激細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素2、12、18和21如IL2、IL12、18、21；干擾素α、β、γ(Interferonsα、β、γ)；腫瘤壞死因子α(TNF-α)、粒、巨細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、及其他腫瘤殺傷基因如TRAIL。
本方法將治療基因置于熱休克蛋白基因啟動(dòng)子下構(gòu)建人工基因，通過對(duì)腫瘤局部進(jìn)行加熱調(diào)控治療基因在腫瘤局部表達(dá)進(jìn)而實(shí)現(xiàn)治療腫瘤的效果。所述方法對(duì)于那些既有強(qiáng)烈的抗腫瘤作用又對(duì)正常細(xì)胞和組織有較大毒性的治療基因尤為有利和重要。本方法可用于清除局部腫瘤并激發(fā)全身抗腫瘤反應(yīng)。可單獨(dú)使用，也可與放射治療、化療或熱療(包括熱消融)結(jié)合用于腫瘤的治療。
本發(fā)明優(yōu)先選用免疫刺激基因?yàn)橹委熁颍渚哂幸韵聝?yōu)點(diǎn)1.強(qiáng)效；2.具旁觀者效應(yīng)；3.在局部應(yīng)用時(shí)也能有較激發(fā)全身抗腫瘤反應(yīng)。
熱誘導(dǎo)的細(xì)胞因子基因治療和免疫治療的關(guān)鍵是設(shè)計(jì)并構(gòu)建人工基因，即將細(xì)胞因子編碼基因置于熱誘導(dǎo)的啟動(dòng)子調(diào)控之下，然后進(jìn)一步將人工基因插入到病毒或非病毒基因治療載體中，再將病毒或非病毒載體直接應(yīng)用到腫瘤塊或腫瘤周圍的正常組織，采用局部加熱處理腫瘤。所述局部加熱的方法包括微波、射頻、高強(qiáng)度超聲等，使腫瘤及其周圍組織的溫度上升3℃以上，在這種溫度條件下熱休克蛋白基因的啟動(dòng)子高度活化，激活高水平的治療基因表達(dá)。
本發(fā)明采用的熱休克蛋白基因啟動(dòng)子包括下述基因，但不限于下述基因，即Hsp70、Hsp70B，可使用的細(xì)胞因子基因包括但不局限于下述基因的單獨(dú)或聯(lián)合使用，即IL2，IL4、IL12、IL18、Interferons、TNF-α、TRAIL、FasL、GM-CSF等。
在上述技術(shù)方案中局部加熱、熱調(diào)控的治療基因表達(dá)和熱調(diào)控的其他基因表達(dá)的結(jié)合，將對(duì)局部和全身腫瘤起到強(qiáng)效的抗腫瘤效果。
本發(fā)明方法包括下述步驟1.采用PCR或其他已知的方法分離并克隆人熱休克蛋白基因的啟動(dòng)子順序；2.克隆免疫刺激/腫瘤殺傷細(xì)胞因子基因cDNA；3.將免疫刺激/腫瘤殺傷細(xì)胞因子基因cDNA置于熱休克蛋白基因啟動(dòng)子之下，構(gòu)建人工基因；4.將帶有polyA尾的人工基因插入到病毒或非病毒載體中，所述病毒載體包括腺病毒、慢病毒等，非病毒載體包括裸質(zhì)粒DNA和脂質(zhì)體-質(zhì)粒DNA復(fù)合物等；5.將上述載體注入到腫瘤內(nèi)或腫瘤周圍的組織中；6.對(duì)腫瘤局部及其周圍組織進(jìn)行加熱，加熱可采用熱墊、微波、射頻或局部超聲等方式。
上述方法也可與現(xiàn)存的治療方法如化療、放療及外科治療等結(jié)合，本發(fā)明加熱調(diào)控的細(xì)胞因子表達(dá)基因的方法其最突出優(yōu)點(diǎn)如下1.治療基因靶向性在腫瘤及腫瘤周圍組織中表達(dá)，明顯降低了對(duì)身體其他部位正常組織的毒、副作用——靶向性；2.可根據(jù)需要啟動(dòng)或關(guān)閉細(xì)胞因子基因的表達(dá)——可調(diào)控性；3.盡管治療基因在腫瘤局部表達(dá)，免疫刺激細(xì)胞因子不僅具有殺傷局部腫瘤的作用，還能夠誘導(dǎo)全身抗腫瘤免疫反應(yīng)——系統(tǒng)作用與強(qiáng)效。


圖1是加熱調(diào)控的mIL12表達(dá)載體構(gòu)建示意圖，和熱誘導(dǎo)細(xì)胞因子基因表達(dá)實(shí)施示意圖。
圖2由腺病毒介道的報(bào)道基因綠色熒光蛋白在腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織中的經(jīng)熱引發(fā)的表達(dá)。
其中，A是體外培養(yǎng)的小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1經(jīng)20MOI Ad-HSP-GFP感染，24小時(shí)后42℃水浴中加熱30分鐘，37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)。感染及加熱后細(xì)胞表達(dá)GFP明顯增加。
B是.將1×106小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1注射到Balb/c小鼠背部腫瘤視窗模型，待腫瘤生長(zhǎng)至直徑1mm大小時(shí)，用1ml注射器將50ul含1×108pfu Ad-HSP-GFP注射到視窗內(nèi)。24小時(shí)后將視窗浸入42℃水浴中加熱45分鐘。加熱后24小時(shí)后麻醉小鼠，在熒光顯微鏡下觀察，加熱后GFP表達(dá)量明顯增加。
圖3是體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞或體內(nèi)生長(zhǎng)的腫瘤組織經(jīng)Ad-HSP-mIL12感染及加熱后表達(dá)mIL12的情況。
其中A是.體外培養(yǎng)的小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1經(jīng)20MOI Ad-HSP-mIL12感染，24小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，然后在42℃水浴中加熱30分鐘，37℃繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，再次收集細(xì)胞培養(yǎng)液。采用R&D公司的mIL12 Elisa檢測(cè)試劑盒檢測(cè)加熱前后細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)mIL12含量，可見加熱后細(xì)胞表達(dá)mIL12明顯增加，mIL12甚至可增加104倍以上。
B是.加熱誘導(dǎo)的mIL12在腫瘤組織內(nèi)表達(dá)，將1×106小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1注射到Balb/c小鼠后腿皮下，待腫瘤生長(zhǎng)至直徑7～8mm大小時(shí)，用1ml注射器將100ul含1×108pfu Ad-HSP-mIL12注射到腫瘤內(nèi)。24小時(shí)后將皮下腫瘤浸入42℃水浴中加熱45分鐘。加熱后48小時(shí)麻醉小鼠，取出腫瘤，勻漿后Elisa檢測(cè)mIL12含量，并與未注射組或未加熱組進(jìn)行比較。注射病毒并加熱組mIL12表達(dá)量明顯增加，其中mIL12表達(dá)水平可增加80倍。
圖4是，Ad-HSP-mIL12抑制小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)圖。
其中，將5×106小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1接種到小鼠后腿皮下，待腫瘤生長(zhǎng)至直徑5～7mm時(shí)，將2×108Ad-HSP-mIL12或Ad-hsp-GFP注射到腫瘤內(nèi)，24小時(shí)后將腫瘤浸入42℃水浴中加熱45分鐘。隔天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小一次。繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，可見治療組腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制。圖中，實(shí)心三角為注射Ad-hsp-GFP病毒不加熱組。實(shí)心圓圈為注射Ad-hsp-mIL12不加熱組?？招姆娇?yàn)樽⑸銩d-hsp-GFP加熱組?？招娜菫樽⑸銩d-hsp-mIL12加熱組?？梢钥闯?，只有Ad-hsp-mIL12加熱組的生長(zhǎng)速度受到明顯限制。
圖5是，聯(lián)合應(yīng)用熱誘導(dǎo)的基因治療和放射治療小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)曲線。
具體實(shí)施例方式
下面列舉的是如何將本發(fā)明付諸實(shí)施的具體實(shí)例。在下面的實(shí)例中HSP70B基因的啟動(dòng)子被用于調(diào)控報(bào)告基因GFP，以及治療基因mIL12的表達(dá)。所構(gòu)建的攜帶GFP及mIL12的腺病毒經(jīng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)可受加熱調(diào)控表達(dá)，并具有抗腫瘤效果。
實(shí)施例11.PCR擴(kuò)增HSP70B基因啟動(dòng)子以HEK-293細(xì)胞DNA作為模板，采用下述引物，PCR擴(kuò)增HSP70B基因5’端調(diào)控順序。PCR擴(kuò)增條件為94℃1分鐘，58℃1分鐘，72℃1分鐘，25個(gè)周期。PCR產(chǎn)物長(zhǎng)420bp，測(cè)序結(jié)果表明，具有序列1的序列。
上游引物5’-GGTCGAGGCGCGTCCTCAGAGCCA-3’下游引物5’-AGGTCGACTAGAAGCTTCTTGTCG-3’2.加熱調(diào)控的GFP表達(dá)載體的構(gòu)建將PCR產(chǎn)物先插入TA cloning載體pCR-Blunt內(nèi)，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI消化后，連接到載體pEGFP-1(Clontech，Carlbad，CA)的多克隆位點(diǎn)內(nèi)的EcoRI位點(diǎn)處，構(gòu)建pHSP-EGFP表達(dá)載體。
3.加熱調(diào)控的GFP及mIL12表達(dá)載體的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶Sal I和Not I消化mIL12表達(dá)質(zhì)粒pNGVL-mIL12，瓊脂糖凝膠電泳后分離mIL-12編碼基因片段，取代pHSP-EGFP表達(dá)載體GFP編碼基因，構(gòu)建pHSP-mIL-12表達(dá)載體。所述mIL12基因的cDNA具有序列2，3的序列。
4.構(gòu)建帶目的基因的穿梭載體先采用限制性內(nèi)切酶AflII消化pHSP-GFP及pHSP-mIL12表達(dá)載體，然后補(bǔ)齊。再用EcoRI消化，瓊脂糖凝膠電泳后分離含有HSP70啟動(dòng)子和報(bào)告基因GFP或治療基因mIL12，以及polyA尾的完整表達(dá)盒。插入經(jīng)SalI及EcoRI消化的穿梭載體pENTR1A(Invitrogen公司產(chǎn)品)內(nèi)。構(gòu)建含GFP及mIL12的穿梭載體，pENTR1A-HSP-GFP及pENTR1A-HSP-mIL12。
5.構(gòu)建腺病毒載體
將穿梭質(zhì)粒pENTR1A-HSP-GFP及pENTR1A-HSP-mIL12與腺病毒骨架載體pAd-PL/DEST反應(yīng)后轉(zhuǎn)染受體菌Top10，在含氨芐青霉素的平板上挑選抗性克隆。抽提質(zhì)粒DNA后酶切及電泳鑒定，確定含有目的基因片段HSP-GFP或HSP-mIL12后，大量抽提并純化后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。
6.腺病毒的包裝將純化的腺病毒DNA pAd-HSP-GFP或pAd-HSP-mIL12轉(zhuǎn)染腺病毒包裝細(xì)胞HEK293(ATCC產(chǎn)品)，待細(xì)胞出現(xiàn)病變后收集細(xì)胞，反復(fù)凍融3次。再次感染293細(xì)胞。經(jīng)3輪空斑篩選后，選出復(fù)制效率高、沒有野毒的腺病毒種Ad-HSP-GFP及Ad-HSP-mIL12。
7.腺病毒的擴(kuò)增與純化進(jìn)一步采用HEK293細(xì)胞大量擴(kuò)增腺病毒pAd-HSP-GFP及pAd-HSP-mIL12。氯化銫密度梯度離心純化腺病毒，或采用BD公司的腺病毒純化試劑盒純化，病毒量可達(dá)3～20×1011pfu/ml。
8.Ad-HSP-GFP及Ad-HSP-mIL12在體內(nèi)外培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)的檢測(cè)分析純化的病毒接20MOI(multiplicity of infection)感染小鼠乳腺癌細(xì)胞株4T1，感染后24小時(shí)熒光顯微鏡觀察(Ad-HSP-GFP感染)或收集細(xì)胞培養(yǎng)液(Ad-HSP-mIL12)。然后將含被感染細(xì)胞的培養(yǎng)板用石蠟?zāi)し忾]后，放入42℃水浴中加熱30分鐘，再放入37℃的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。24小時(shí)后再次收集細(xì)胞培養(yǎng)液，熒光顯微鏡觀察，比較加熱前后細(xì)胞表達(dá)GFP的強(qiáng)度，或采用R&D公司的mIL12 Elisa檢測(cè)試劑盒檢測(cè)加熱前后細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)mIL12含量，結(jié)果顯示，加熱后表達(dá)GFP或mIL12明顯增加，mIL12甚至可增加104倍以上。
9.Ad-HSP-GFP及Ad-HSP-mIL12在小鼠體內(nèi)腫瘤組織內(nèi)的表達(dá)選擇小鼠乳腺癌作為模型。將1×106小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1注射到Balb/c小鼠后腿皮下，待腫瘤生長(zhǎng)至直徑7～8mm大小時(shí)，用1ml注射器將100ul含1×108pfu Ad-HSP-GFP或Ad-HSP-mIL12注射到腫瘤內(nèi)。24小時(shí)后將皮下腫瘤浸入42℃水浴中加熱45分鐘。加熱后48小時(shí)麻醉小鼠，取出腫瘤，振蕩切片后熒光顯微鏡觀察，或勻漿后Elisa檢測(cè)mIL12含量，并與未注射組或未加熱組進(jìn)行比較。結(jié)果表明，注射病毒并加熱后GFP及mIL12表達(dá)量明顯增加，其中mIL12表達(dá)水平可增加80倍。
10.Ad-HSP-mIL12對(duì)小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用選擇小鼠前列腺癌作為模型。將5×106小鼠前列腺癌細(xì)胞Tramp-C接種到小鼠后腿皮下，待腫瘤生長(zhǎng)至直徑5～7mm時(shí)，將2×108Ad-HSP-mIL12注射到腫瘤內(nèi)，24小時(shí)后將腫瘤浸入42℃水浴中加熱45分鐘。隔天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小一次。繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，治療組腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制。
11.聯(lián)合應(yīng)用熱誘導(dǎo)的基因治療和放射治療處理小鼠前列腺癌動(dòng)物模型先將2×106前列腺癌腫瘤細(xì)胞TrampC注射到C57/BL6小鼠右后退皮下，3周后腫瘤生長(zhǎng)至直徑5-7mm大小。將小鼠分為6組第一組為基因治療對(duì)照組又稱AdhspGFP處理組，僅在腫瘤局部注射攜帶熱誘導(dǎo)基因Hsp70啟動(dòng)子及GFP編碼基因的腺病毒。腺病毒用量為每只小鼠2×108pfu，體積50μl。注射方法為腫瘤內(nèi)多點(diǎn)注射。
第二組為基因治療實(shí)驗(yàn)組又稱AdhspmIL12處理組，僅在腫瘤局部注射攜帶熱誘導(dǎo)基因Hsp70啟動(dòng)子及mIL12編碼基因的腺病毒。
第三組為基因治療+熱療對(duì)照組又稱AdhspGFP+HT處理組，腫瘤局部注射攜帶熱誘導(dǎo)基因Hsp70啟動(dòng)子及GFP編碼基因的腺病毒，腺病毒用量為及注射方法同上。注射后24小時(shí)給予加熱處理，加熱方法如下先準(zhǔn)備好水溫為42℃的水浴箱，將小鼠麻醉后固定，然后將攜帶腫瘤的右后腿浸泡在42℃的水中，加熱30分鐘。待小鼠蘇醒后再送回動(dòng)物房飼養(yǎng)。
第四組為基因治療+熱療實(shí)驗(yàn)組又稱Adhsp mIL12+HT處理組，腫瘤局部注射攜帶熱誘導(dǎo)基因Hsp70啟動(dòng)子及mIL12編碼基因的腺病毒，腺病毒用量為及注射方法同上。注射后24小時(shí)給予加熱處理，加熱方法同上。
第五組為基因治療+熱療+放療對(duì)照組又稱Adhsp GFP+HT+RT處理組。于注射病毒前先作放射治療，方法如下放療3次，周期為5天，即分別在放療開始后第1、3、5天，腫瘤局部給予6Gyγ射線照射，第2、4天休息，不照射。于第3次放療后，腫瘤局部注射攜帶熱誘導(dǎo)基因Hsp70啟動(dòng)子及GFP編碼基因的腺病毒，腺病毒用量為及注射方法同上。注射后24小時(shí)給予加熱處理，加熱方法同上。
第六組為基因治療+熱療+放療實(shí)驗(yàn)組又稱Adhsp mIL12+HT+RT處理組。于注射病毒前先作放射治療，方法同上。于第3次放療后，腫瘤局部注射攜帶熱誘導(dǎo)基因Hsp70啟動(dòng)子及mIL12編碼基因的腺病毒，腺病毒用量為及注射方法同上。注射后24小時(shí)給予加熱處理，加熱方法同上。
經(jīng)上述處理后每周用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最大徑、最小徑及高度二次，計(jì)算腫瘤容積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。結(jié)果可見，聯(lián)合應(yīng)用熱誘導(dǎo)的基因治療和放射治療，小鼠體內(nèi)腫瘤體積明顯縮小，然后緩慢生長(zhǎng)。與其他各組比較有明顯差異，表明聯(lián)合應(yīng)用熱誘導(dǎo)的基因治療和放射治療對(duì)腫瘤有協(xié)同作用。
本發(fā)明所采用的人白細(xì)胞介素2基因的cDNA順序如序列4，人白細(xì)胞介素12基因的cDNA順序其中IL12p35如序列5，IL12 p40如序列6，人干擾素α基因的cDNA順序如序列7，人干擾素β基因的cDNA順序如序列8，人干擾素γ基因的cDNA順序如序列9，人TNFα基因的cDNA順序如序列10，人GM-CSF基因的cDNA順序如序列11，人細(xì)胞死亡因子TRAIL的cDNA順序如序列12。
李川源1.txtSEQUENCE LISTING<110>李，川源黃，倩<120>一種以加熱調(diào)控細(xì)胞因子表達(dá)的方法及其在腫瘤治療中的應(yīng)用<130>FD2005002<160>12<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>420<212>DNA<213>human<400>1ggtcgaggcg cgtcctcaga gccagccggg aggagctaga accttccccg cgtttctttc 60agcagccctg agtcagaggc gggctggcct ggcatagccg cccagcctct cggctcacgg120cccgatccgc ccgaaccttc tcccggggtc agcgccgcgc tgcgccgccc ggctgactca180gcccgggcgg gcgggcggga ggctctcgac tgggcgggaa ggtgcgggaa ggttcgcggc240ggcggggtcg gggaggtgca aaaggatgaa aagcccgtgg aagcggagct gagcagatcc300gagccgggct ggcggcagag aaaccgcagg gagagcctca ctgctgagcg cccctcgacg360gcggagcggc agcagcctcc gtggcctcca gcatccgaca agaagctctc tagtcgacct420<210>2<211>648<212>DNA<213>human<400>2atgtgtcaat cacgctacct cctctttttg gccacccttg ccctcctaaa ccacctcagt 60ttggccaggg tcattccagt ctctggacct gccaggtgtc ttagccagtc ccgaaacctg120ctgaagacca cagatgacat ggtgaagacg gccagagaaa aactgaaaca ttattcctgc180actgctgaag acatcgatca tgaagacatc acacgggacc aaaccagcac attgaagacc240tgtttaccac tggaactaca caagaacgag agttgcctgg ctactagaga gacttcttcc300acaacaagag ggagctgcct gcccccacag aagacgtctt tgatgatgac cctgtgcctt360ggtagcatct atgaggactt gaagatgtac cagacagagt tccaggccat caacgcagca420cttcagaatc acaaccatca gcagatcatt ctagacaagg gcatgctggt ggccatcgat480gagctgatgc agtctctgaa tcataatggc gagactctgc gccagaaacc tcctgtggga540gaagcagacc cttacagagt gaaaatgaag ctctgcatcc tgcttcacgc cttcagcacc600cgcgtcgtga ccatcaacag ggtgatgggc tatctgagct ccgcctga 648<210>3<211>1008<212>DNA<213>human<400>3atgtgtcctc agaagctaac catctcctgg tttgccatcg ttttgctggt gtctccactc 60atggccatgt gggagctgga gaaagacgtt tatgttgtag aggtggactg gactcccgat120gcccctggag aaacagtgaa cctcacctgt gacacgcctg aagaagatga catcacctgg180
李川源1.txtacctcagacc agagacatgg agtcataggc tctggaaaga ccctgaccat cactgtcaaa240gagtttctag atgctggcca gtacacctgc cacaaaggag gcgagactct gagccactca300catctgctgc tccacaagaa ggaaaatgga atttggtcca ctgaaatttt aaaaaatttc360aaaaacaaga ctttcctgaa gtgtgaagca ccaaattact ccggacggtt cacgtgctca420tggctggtgc aaagaaacat ggacttgaag ttcaacatca agagcagtag cagttcccct480gactctcggg cagtgacatg tggaatggcg tctctgtctg cagagaaggt cacactggac540caaagggact atgagaagta ttcagtgtcc tgccaggagg atgtcacctg cccaactgcc600gaggagaccc tgcccattga actggcgttg gaagcacggc agcagaataa atatgagaac660tacagcacca gcttcttcat cagggacatc atcaaaccag acccgcccaa gaacttgcag720atgaagcctt tgaagaactc acaggtggag gtcagctggg agtaccctga ctcctggagc780actccccatt cctacttctc cctcaagttc tttgttcgaa tccagcgcaa gaaagaaaag840atgaaggaga cagaggaggg gtgtaaccag aaaggtgcgt tcctcgtaga gaagacatct900accgaagtcc aatgcaaagg cgggaatgtc tgcgtgcaag ctcaggatcg ctattacaat960tcctcatgca gcaagtgggc atgtgttccc tgcagggtcc gatcctag1008<210>4<211>405<212>DNA<213>human<400>4atgcctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc120acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa180gaagaactca aacctctgaa ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta240agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa300acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga360tggattacct tttctcaaag catcatctca acactgactt gataa405<210>5<211>762<212>DNA<213>human<400>5atgtggcccc ctgggtcagc ctcccagcca ccgccctcac ctgccgcggc cacaggtctg 60catccagcgg ctcgccctgt gtccctgcag tgccggctca gcatgtgtcc agcgcgcagc120ctcctccttg tggctaccct ggtcctcctg gaccacctca gtttggccag aaacctcccc180gtggccactc cagacccagg aatgttccca tgccttcacc actcccaaaa cctgctgagg240gccgtcagca acatgctcca gaaggccaga caaactctag aattttaccc ttgcacttct300gaagagattg atcatgaaga tatcacaaaa gataaaacca gcacagtgga ggcctgttta360ccattggaat taaccaagaa tgagagttgc ctaaattcca gagagacctc tttcataact420aatgggagtt gcctggcctc cagaaagacc tcttttatga tggccctgtg ccttagtagt480atttatgaag acttgaagat gtaccaggtg gagttcaaga ccatgaatgc aaagcttctg540atggatccta agaggcagat ctttctagat caaaacatgc tggcagttat tgatgagctg600
李川源1.txtatgcaggccc tgaatttcaa cagtgagact gtgccacaaa aatcctccct tgaagaaccg660gatttttata aaactaaaat caagctctgc atacttcttc atgctttcag aattcgggca720gtgactattg atagagtgat gagctatctg aatgcttcct aa 762<210>6<211>987<212>DNA<213>human<400>6atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat120gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg180accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa240gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg300ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag360aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc420acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga480ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc540agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca600gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat660gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac720ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac780acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag840agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc900cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc960gaatgggcat ctgtgccctg cagttag987<210>7<211>570<212>DNA<213>human<400>7atggcctcgc cctttgcttt actgatggtc ctggtggtgc tcagctgcaa gtcaagctgc 60tctctgggct gtgatctccc tgagacccac agcctggata acaggaggac cttgatgctc120ctggcacaaa tgagcagaat ctctccttcc tcctgtctga tggacagaca tgactttgga180tttccccagg aggagtttga tggcaaccag ttccagaagg ctccagccat ctctgtcctc240catgagctga tccagcagat cttcaacctc tttaccacaa aagattcatc tgctgcttgg300gatgaggacc tcctagacaa attctgcacc gaactctacc agcagctgaa tgacttggaa360gcctgtgtga tgcaggagga gagggtggga gaaactcccc tgatgaatgc ggactccatc420ttggctgtga agaaatactt ccgaagaatc actctctatc tgacagagaa gaaatacagc480ccttgtgcct gggaggttgt cagagcagaa atcatgagat ccctctcttt atcaacaaac540ttgcaagaaa gattaaggag gaaggaataa 570
李川源1.txt<210>8<211>564<212>DNA<213>human<400>8atgaccaaca agtgtctcct ccaaattgct ctcctgttgt gcttctccac tacagctctt 60tccatgagct acaacttgct tggattccta caaagaagca gcaattttca gtgtcagaag120ctcctgtggc aattgaatgg gaggcttgaa tactgcctca aggacaggat gaactttgac180atccctgagg agattaagca gctgcagcag ttccagaagg aggacgccgc attgaccatc240tatgagatgc tccagaacat ctttgctatt ttcagacaag attcatctag cactggctgg300aatgagacta ttgttgagaa cctcctggct aatgtctatc atcagataaa ccatctgaag360acagtcctgg aagaaaaact ggagaaagaa gatttcacca ggggaaaact catgagcagt420ctgcacctga aaagatatta tgggaggatt ctgcattacc tgaaggccaa ggagtacagt480cactgtgcct ggaccatagt cagagtggaa atcctaagga acttttactt cattaacaga540cttacaggtt acctccgaaa ctga 564<210>9<211>438<212>DNA<213>human<400>9atgcaggacc catatgtaaa agaagcagaa aaccttaaga aatattttaa tgcaggtcat 60tcagatgtag cggataatgg aactcttttc ttaggcattt tgaagaattg gaaagaggag120agtgacagaa aaataatgca gagccaaatt gtctcctttt acttcaaact ttttaaaaac180tttaaagatg accagagcat ccaaaagagt gtggagacca tcaaggaaga catgaatgtc240aagtttttca atagcaacaa aaagaaacga gatgacttcg aaaagctgac taattattcg300gtaactgact tgaatgtcca acgcaaagca atacatgaac tcatccaagt gatggctgaa360ctgtcgccag cagctaaaac agggaagcga aaaaggagtc agatgctgtt tcgaggtcga420agagcatccc agtaatga 438<210>10<211>702<212>DNA<213>human<400>10atgagcactg aaagcatgat ccgggacgtg gagctggccg aggaggcgct ccccaagaag60acaggggggc cccagggctc caggcggtgc ttgttcctca gcctcttctc cttcctgatc 120gtggcaggcg ccaccacgct cttctgcctg ctgcactttg gagtgatcgg cccccagagg 180gaagagttcc ccagggacct ctctctaatc agccctctgg cccaggcagt cagatcatct 240tctcgaaccc cgagtgacaa gcctgtagcc catgttgtag caaaccctca agctgagggg 300cagctccagt ggctgaaccg ccgggccaat gccctcctgg ccaatggcgt ggagctgaga 360gataaccagc tggtggtgcc atcagagggc ctgtacctca tctactccca ggtcctcttc 420aagggccaag gctgcccctc cacccatgtg ctcctcaccc acaccatcag ccgcatcgcc 480gtctcctacc agaccaaggt caacctcctc tctgccatca agagcccctg ccagagggag 540
李川源1.txtaccccagagg gggctgaggc caagccctgg tatgagccca tctatctggg aggggtcttc600cagctggaga agggtgaccg actcagcgct gagatcaatc ggcccgacta tctcgacttt660gccgagtctg ggcaggtcta ctttgggatc attgccctgt ga 702<210>11<211>435<212>DNA<213>human<400>11atgtggctgc agagcctgct gctcttgggc actgtggcct gcagcatctc tgcacccgcc 60cgctcgccca gccccagcac gcagccctgg gagcatgtga atgccatcca ggaggcccgg120cgtctcctga acctgagtag agacactgct gctgagatga atgaaacagt agaagtcatc180tcagaaatgt ttgacctcca ggagccgacc tgcctacaga cccgcctgga gctgtacaag240cagggcctgc ggggcagcct caccaagctc aagggcccct tgaccatgat ggccagccac300tacaagcagc actgccctcc aaccccggaa acttcctgtg caacccagac tatcaccttt360gaaagtttca aagagaacct gaaggacttt ctgcttgtca tcccctttga ctgctgggag420ccagtccagg agtga 435<210>12<211>846<212>DNA<213>human<400>12atggctatga tggaggtcca ggggggaccc agcctgggac agacctgcgt gctgatcgtg 60atcttcacag tgctcctgca gtctctctgt gtggctgtaa cttacgtgta ctttaccaac120gagctgaagc agatgcagga caagtactcc aaaagtggca ttgcttgttt cttaaaagaa180gatgacagtt attgggaccc caatgacgaa gagagtatga acagcccctg ctggcaagtc240aagtggcaac tccgtcagct cgttagaaag atgattttga gaacctctga ggaaaccatt300tctacagttc aagaaaagca acaaaatatt tctcccctag tgagagaaag aggtcctcag360agagtagcag ctcacataac tgggaccaga ggaagaagca acacattgtc ttctccaaac420tccaagaatg aaaaggctct gggccgcaaa ataaactcct gggaatcatc aaggagtggg480cattcattcc tgagcaactt gcacttgagg aatggtgaac tggtcatcca tgaaaaaggg540ttttactaca tctattccca aacatacttt cgatttcagg aggaaataaa agaaaacaca600aagaacgaca aacaaatggt ccaatatatt tacaaataca caagttatcc tgaccctata660ttgttgatga aaagtgctag aaatagttgt tggtctaaag atgcagaata tggactctat720tccatctatc aagggggaat atttgagctt aaggaaaatg acagaatttt tgtttctgta780acaaatgagc acttgataga catggaccat gaagccagtt ttttcggggc ctttttagtt840ggctaa 84權(quán)利要求
1.一種以加熱調(diào)控細(xì)胞因子表達(dá)的方法，其特征是采用熱誘導(dǎo)表達(dá)基因的啟動(dòng)子調(diào)控免疫刺激基因表達(dá)，包括下述步驟(1)分離并克隆人熱休克蛋白基因的啟動(dòng)子順序；(2)克隆免疫刺激/腫瘤殺傷細(xì)胞因子基因cDNA；(3)將上述免疫刺激/腫瘤殺傷細(xì)胞因子基因cDNA置于熱休克蛋白基因啟動(dòng)子之下，構(gòu)建人工基因；(4)將上述人工基因插入病毒或非病毒載體中；(5)將上述載體注入到腫瘤內(nèi)或腫瘤周圍的組織中；(6)對(duì)腫瘤局部及其周圍組織進(jìn)行加熱。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的啟動(dòng)子是任何在比正常生理溫度增加3℃或3℃以上后便被激活的啟動(dòng)子。
3.按權(quán)利要求1或2的方法，其中所述的啟動(dòng)子可由Hsp70B基因的啟動(dòng)子衍生。
4.按權(quán)利要求3的方法，其中所述的啟動(dòng)子具有序列1的序列。
5.按權(quán)利要求1的方法，其中所述的免疫刺激細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素2、12、18和21如IL2、IL12、18、21；干擾素α、β、γ(Interferonsα、β、γ)；腫瘤壞死因子α(TNF-α)、粒、巨細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、及其他腫瘤殺傷基因如TRAIL。
6.按權(quán)利要求1的方法，其中所述的病毒載體包括腺病毒和慢病毒，非病毒載體包括裸質(zhì)粒DNA和脂質(zhì)體-質(zhì)粒DNA復(fù)合物。
7.按權(quán)利要求1的方法，其中所述的加熱其方式采用熱墊、微波、射頻或局部超聲加熱方式。
8.按權(quán)利要求1或2或3的方法，其中所述的啟動(dòng)子采用局部加熱方式激活。
9.按權(quán)利要求1或2或3的方法，其中所述的啟動(dòng)子采用聚焦超聲加熱裝置激活。
10.按權(quán)利要求1或2或3的方法，其中所述的啟動(dòng)子采用微波加熱裝置激活。
11.按權(quán)利要求1或2或3的方法，其中所述的啟動(dòng)子采用射頻加熱裝置激活。
12.權(quán)利要求1所述的以加熱調(diào)控細(xì)胞因子表達(dá)的方法在制備治療實(shí)體瘤藥物中的用途。
13.權(quán)利要求1所述的以加熱調(diào)控細(xì)胞因子表達(dá)的方法在制備與放射治療結(jié)合治療實(shí)體瘤藥物中的用途。
14.權(quán)利要求1所述的以加熱調(diào)控細(xì)胞因子表達(dá)的方法在制備與化學(xué)治療結(jié)合治療實(shí)體瘤藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種以加熱調(diào)控細(xì)胞因子表達(dá)的方法及其在腫瘤治療中的應(yīng)用。本發(fā)明采用局部加熱調(diào)控免疫刺激細(xì)胞因子基因表達(dá)，使基因靶向地在腫瘤及其周圍組織中表達(dá)。本方法通過構(gòu)建人工基因表達(dá)盒實(shí)現(xiàn)，將熱誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子置于細(xì)胞因子編碼基因上游調(diào)控細(xì)胞因子基因表達(dá)。在人工基因表達(dá)盒輸送到腫瘤及其周圍區(qū)域后，再采用局部加熱誘導(dǎo)細(xì)胞因子基因表達(dá)，達(dá)到消除局部腫瘤并誘導(dǎo)全身抗腫瘤免疫的目的。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1692946SQ20051002406
公開日2005年11月9日 申請(qǐng)日期2005年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月25日
發(fā)明者李川源, 黃倩 申請(qǐng)人:李川源, 黃倩