專利名稱：預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎疾病的包含混合草藥金銀花和知母提取物的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種組合物，該組合物包含一種混合草藥金銀花(Lonicera japonica THUNB)和知母(Anemarrhena asphodeloides BUNGE)的提取物，用于預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎疾病。
背景技術(shù)：
關(guān)節(jié)炎是一種自身免疫性疾病，以它們的癥狀如關(guān)節(jié)中的疼痛、腫脹和僵直為特 征。在哺乳動物中兩種主要類型的關(guān)節(jié)炎是炎癥性關(guān)節(jié)炎如類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和骨關(guān) 節(jié)炎(OA)，一種經(jīng)常繼發(fā)于機械應(yīng)激、衰老、發(fā)育異常情況和/或破壞的軟骨漸近的、退化 的損失。關(guān)節(jié)炎的癥狀一般與脊柱關(guān)節(jié)有關(guān)，例如，趾僵化、關(guān)節(jié)化膿性銀屑病或者風濕性 關(guān)節(jié)炎。骨關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)出與類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)相似的癥狀。特別地，雖然骨關(guān)節(jié)炎以關(guān) 節(jié)軟骨的退化開始，但是類風濕性關(guān)節(jié)炎以滑膜中的炎癥開始。在骨關(guān)節(jié)炎中，隨著軟骨惡 化，后來經(jīng)常發(fā)展為反應(yīng)性的滑膜炎。相反地，隨著類風濕性關(guān)節(jié)炎侵蝕軟骨，繼發(fā)的骨關(guān) 節(jié)炎改變骨和軟骨的發(fā)育。在骨關(guān)節(jié)炎和類風濕性關(guān)節(jié)炎的最后階段，患有兩種疾病的關(guān) 節(jié)相互之間出現(xiàn)相同的現(xiàn)象。骨關(guān)節(jié)炎通常表示伴隨運動惡化的疼痛或簡單X-射線輻射清晰地顯示出減薄的 軟骨。一般受影響的關(guān)節(jié)是膝關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)、脊柱關(guān)節(jié)、指關(guān)節(jié)、拇指或大腳趾的底部等等。 該疾病涉及到由MMPs (基質(zhì)金屬蛋白激酶)引起的關(guān)節(jié)軟骨的破環(huán)，該酶主要使軟骨缺失， 其以關(guān)節(jié)軟骨中的退化改變?yōu)樘卣骱陀裳装Y性細胞因子(例如，白介素-l(IL-l)，腫瘤壞 死因子-α (TNF-α)等等)的過度產(chǎn)生導(dǎo)致，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)、肌腱、肌肉和韌帶中極嚴重的 疼痛(Fernandes J. C. , The role of cytokines in osteoarthritis pathophysiology, 39, pp237-246，2002)。類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種常見的自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)的腫脹、變 形和破壞為特征，達到極點時會造成嚴重的身體殘疾。類風濕性疾病包括發(fā)生在肌肉、肌 腱、關(guān)節(jié)、骨或竇處的疾病，其一般以炎癥和/或退化為特征?；加蓄愶L濕性關(guān)節(jié)炎的患者 表現(xiàn)出免疫系統(tǒng)中的失衡，其導(dǎo)致前炎癥性細胞因子例如，TNF-α、IL-I等等的過度產(chǎn)生， 和抗炎癥性細胞因子的缺乏例如，IL-10、IL-I等等。類風濕性關(guān)節(jié)炎的特征是滑膜炎癥， 其可進展為軟骨破壞，骨侵蝕和隨后的關(guān)節(jié)變形。在炎癥的過程期間，從關(guān)節(jié)中釋放出多形 核細胞，巨噬細胞和淋巴細胞。被激活的T-淋巴細胞產(chǎn)生細胞毒素和前炎癥性細胞因子， 而巨噬細胞則刺激前列腺素和細胞毒素的釋放。在炎癥的位點釋放血管活性物質(zhì)如組胺、 激肽和前列腺素，它們在發(fā)炎的關(guān)節(jié)區(qū)域?qū)е滤[、紅斑和疼痛。受影響的滑膜組織的主要病理是增生和T和B淋巴細胞的內(nèi)膜下浸潤?；そM織 增生在血管翳組織中形成，其在不可逆地破壞受影響關(guān)節(jié)中的軟骨和骨。類風濕性關(guān)節(jié)炎 的進展是與巨噬細胞和樹突狀細胞產(chǎn)生的TNF-α和IL-I β的提高的水平、Thl/Th2的失 衡和抗原特異性免疫球蛋白的過度產(chǎn)生相關(guān)的。尤其地，TNF-α和IL-I β直接誘導(dǎo)蛋白質(zhì)水解酶如基質(zhì)金屬蛋白激酶(MMPs)的合成，該酶可以分解細胞外的基質(zhì)大分子。在正常 情況下，金屬蛋白酶的組織抑制劑(TIMPs)以1 1的比例與MMPs正常地結(jié)合。由于MMPs 水平的上調(diào)而引起TIMPs與MMPs的失衡比例(其一般由MMPs的上調(diào)導(dǎo)致)導(dǎo)致類風濕性 關(guān)節(jié)炎中持續(xù)的基質(zhì)破壞。用于治療關(guān)節(jié)炎的急救藥物包括用于減輕疼痛和炎癥的藥物，其被分類為非甾體 類抗炎癥性藥(NSAIDs)，例如，阿司匹林、布洛芬、萘普生、甲氨蝶呤等等。次級急救藥物包 括皮質(zhì)類固醇類，慢效抗風濕藥物(SAARDs)或緩解疾病的藥物(DMs)，例如，青霉胺、環(huán)磷 酰胺、金鹽、硫唑嘌啉、左旋咪唑等等。由FDA批準的第一組用于治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的生 物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(BRMs)是TNF-α拮抗劑，該拮抗劑通過與它的受體結(jié)合或直接與TNF-α蛋 白結(jié)合而起作用。然而，各種弊端阻礙了對DMARDs的利用，例如，潛在的長期的副作用和毒 性，成本高，對藥物的超敏反應(yīng)和由于TNF-α阻塞而引起的感染等等。退行性關(guān)節(jié)炎，作為代表性骨關(guān)節(jié)疾病的一種，是一種慢性關(guān)節(jié)炎。臨床中用常規(guī) 有效的抗炎癥性藥物很難治療這種疾病。而且，藥物引起全身的不良反應(yīng)如消化紊亂、胃 腸道紊亂和腎臟功能紊亂，以及隨著患者年齡的增長會更加頻繁地發(fā)生藥物的不良反應(yīng)， 其在老年人中進行長期全身治療的情況下會導(dǎo)致很多問題。因此，與以前的全身治療療法 相比，最近更迫切地需要開發(fā)出靶向抗炎癥作用、對軟骨具有保護和再生作用的新的藥物。 藥物開發(fā)的最新理念已經(jīng)聚焦到關(guān)節(jié)組織裂解酶抑制劑，自由基清除劑如S0D，通過對關(guān)節(jié) 組織組分(如軟骨素或氨基葡萄糖等等)的長期治療而使用的保守治療(Badger A.M.等 人，J. Pharmacol. Exp. Ther. ,290, pp587-593,1999 ；Choi J. H.等人，Osteoarthritis Cartilage,10(6)，pp471~478,2002)。在體內(nèi)，各種生物化學機理，特別是，產(chǎn)生一氧化氮的一氧化氮合成酶(NOS)酶和 其它涉及前列腺素(PGs)合成的酶在關(guān)節(jié)炎的病因中起了重要的作用。因此，從L-精氨酸 中產(chǎn)生NO的NOS酶或涉及各種前列腺素合成的環(huán)氧合酶(COX)成為阻斷關(guān)節(jié)炎炎癥的主 要靶點。根據(jù)最新報道，人體內(nèi)存在幾種NOS酶例如存在于腦中的bNOS(腦N0S)、在神經(jīng)系 統(tǒng)中的nNOS(神經(jīng)N0S)、在內(nèi)皮系統(tǒng)中的eN0S(內(nèi)皮N0S)等等，其在人體中以有規(guī)律的水 平進行表達。因而所產(chǎn)生的少量NO在維持穩(wěn)態(tài)如神經(jīng)傳輸或誘導(dǎo)血管舒張等等中起著重 要作用。然而，通過各種細胞因子或外界刺激物誘導(dǎo)的iN0S(誘導(dǎo)型N0S)使過量的NO突然 發(fā)生會引起細胞毒性或炎癥性反應(yīng)。慢性炎癥與增加的iNOS的活性相關(guān)(Chan P. S.等人， Osteoarthritis cartilage, 13 (5), ρρ387~394, 2005 ；Appleton I. ^Α Adv. Pharmacol., 35, pp27-28,1996)。一般來說，軟骨惡化和通過軟骨中蛋白聚糖或膠原的晚期產(chǎn)生速率引起的關(guān)節(jié)炎 發(fā)生，其導(dǎo)致緩沖功能的喪失。關(guān)節(jié)軟骨由對潤滑和生長而言必需的水(70 80%)、膠原 (10 15% )、蛋白聚糖(5 10% )和軟骨細胞組成，其中蛋白聚糖具有附上數(shù)個粘多糖 (GAG)的核心蛋白的特殊結(jié)構(gòu)(Hardingham 等人，J. Rheum(Suppl)，43 (2)，pp86~90,1995)。金銀花(Lonicerae Japonicae)是金銀花屬(屬于忍冬科)的花蕾部分。它們味 甜并對解毒是有用的，其傳統(tǒng)地用于痢疾、疼痛和腫脹。已知它們具有抗?jié)?、抗細菌、抗?毒、抗痙攣、利尿、抗炎癥和止痛的生物活性。主要成分是毛地黃黃酮、肌糖、皂甙、丹寧、異 綠原酸、綠原酸等等(B. S. Chung 等人 HyangYakDaeSaJeon，Youngrimsa，pp939-940，1989)。
知母屬于仙茅(Haemodoraceae)。它們味酸，其傳統(tǒng)地用于發(fā)熱、渴甚、咳嗽和糖尿 病。已知它們具有降血糖、解熱、抗血小板聚集、抑制應(yīng)激性潰瘍、鎮(zhèn)靜、抑制cAMP磷酸二酯 酶和Na/K-ATPase、溶血、抗腫瘤的生物活性。主要成分是各種皂甙如知母皂甙A_I、知母皂 甙A-II、知母皂甙A-III、知母皂甙A-IV、知母皂甙B-I和知母皂甙B-II、煙酸、芒果甙、異 芒果甙等等(B. S. Chung 等人 HyangYakDaeSaJeon，Youngrimsa, pp203_204，1989)。然而，在以上列舉的文獻中尚未報道或披露關(guān)于混合草藥金銀花和知母提取物對 關(guān)節(jié)炎疾病的治療作用，其中的公開通過引用并入本文。因此，本發(fā)明者通過各種實驗確認混合草藥金銀花和知母提取物具有有效的抗 炎癥作用，也就是，在軟骨組織中對蛋白聚糖和II型膠原的分解的抑制作用；通過由于 MMP-I、MMP-3和MMP-13活性的抑制而對軟骨的保護作用；和對軟骨組織的修復(fù)作用；在水 腫動物模型中的抗炎癥和消炎作用；通過對PEG2活性、GAG降解的抑制實驗和各種遺傳毒 性實驗確認的抗炎癥作用，因此，它可用作治療和預(yù)防關(guān)節(jié)炎疾病的有效而安全的治療法 或健康食品。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎疾病的包含混 合草藥金銀花和知母提取物的組合物及其應(yīng)用。技術(shù)方案因此，本發(fā)明的目的是提供一種包含混合草藥金銀花和知母提取物的藥物組合 物，作為治療和預(yù)防關(guān)節(jié)炎疾病的活性成分，特別是通過刺激軟骨組織的修復(fù)，由于刺激軟 骨組分和抑制軟骨分解而保護軟骨不受破壞，以及抑制炎癥和疼痛。本發(fā)明提供一種包含混合草藥金銀花和知母提取物的藥物組合物，作為預(yù)防和治 療關(guān)節(jié)炎疾病的活性成分。此處所述的術(shù)語“提取物”包括可溶于水、C1至C4的低級醇及其混合物的粗提取 物；和通過使用丁醇溶液從粗提取物中分級分離獲得的可溶于丁醇的提取物。此處所述的術(shù)語“混合草藥金銀花和知母”包括的混合草藥的混合比例按重量計 算)為0. 5 3 1，優(yōu)選地，按重量計算)為1 2 1，最優(yōu)選地，按重量 計算(w/w% )為 1. 5 2 1。此處所述的術(shù)語“提取物”還包含金銀花提取物中作為標準組分的綠原酸和知母 提取物中作為標準組分的芒果甙，這二者作為標準組分在總提取物中所占的比例優(yōu)選為 0. 5 6 (w/w% )綠原酸和0. 5 4 (w/w% )芒果甙，更優(yōu)選比例為1. 5 5 (w/w% )綠原 酸和0. 5 3.)芒果甙，最優(yōu)選比例為3 4.)綠原酸和0. 5 2. 5 (w/ w% )芒果甙。此處所述的術(shù)語“關(guān)節(jié)炎疾病”包括退行性關(guān)節(jié)炎、風濕性關(guān)節(jié)炎或者狼瘡性關(guān)節(jié) 炎，優(yōu)選風濕性關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用混合草藥金銀花和知母提取物來制備用于治療和預(yù)防 哺乳動物或人類中關(guān)節(jié)炎疾病的治療制劑。本發(fā)明的目的是提供一種治療或預(yù)防人類或哺乳動物中關(guān)節(jié)炎疾病的方法，所述的方法包含給予作為有效成分的混合草藥金銀花和知母提取物的治療有效劑量及其藥學 上可接受的載體。在下文中，本發(fā)明進行詳細地說明。本發(fā)明的發(fā)明提取物可以詳細地通過下列方法進行制備。例如，將金銀花和知母干燥、切割、粉碎，混合在一起并加入到1至20倍，優(yōu)選地， 大約5至10倍體積的蒸餾水、C1至C4的低級醇或其混合物中，優(yōu)選地水和醇的混合物以大 約1 0. 1至1 10，更優(yōu)選地以1 0.5至1 5的混合比例(ν/ν)混合；將所述的溶液 用10°C 100°C溫度范圍的熱水處理，優(yōu)選地，60°C 100°C的熱水進行1至6個小時的時 間范圍的處理，優(yōu)選地，為2至4個小時，其提取方法可以通過用熱水、冷水、回流提取或超 聲波處理提取的提取，優(yōu)選為用熱水提??；通過過濾收集提取液，在減壓情況下將其濃縮、 干燥以獲得本發(fā)明的發(fā)明粗提取物。另外，將等量的丁醇可溶性溶液加入到上述的粗提取物中，然后將混懸液進行分 級分離以獲得本發(fā)明的發(fā)明純提取物。如前文所述提供一種制備本發(fā)明粗提取物和丁醇可溶性提取物的方法是本發(fā)明 的另一目的。按照以上所訴的方法制備的本發(fā)明粗提取物和純提取物中包含金銀花提取物中 作為標準組分的綠原酸和知母提取物中作為標準組分的芒果甙，這二者在總提取物中作為 標準組分所占的比例優(yōu)選為0. 5 )綠原酸和0. 5 4(w/w% )芒果甙，更優(yōu)選比 例為1. 5 )綠原酸和0. 5 3.)芒果甙，最優(yōu)選比例為3. 0 4. 5 (w/ w% )綠原酸和0. 5 2. 5 (w/w% )芒果甙。此外，對以上所描述的方法也可以進一步修飾或增加其步驟，通過本領(lǐng)域中已知 的常規(guī)方法來分級分離或分離獲得更多有效的餾分或化合物，比如可以利用文獻中報道的 方法(Harborne J. B. Phytochemical methods :A guide to modern techniques of plant analysis, 3rd Ed. pp6_7，1998)。因此，本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用以上所述的制備方法制備的混合草藥金銀花和知 母的提取物用于制備治療和預(yù)防哺乳動物或人類中關(guān)節(jié)炎疾病的治療制劑。本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎疾病的包含通過以上所述的制備方 法制備的混合草藥金銀花和知母的提取物作為活性成分的藥物組合物及其藥學上可接受 的載體。本發(fā)明的目的是提供一種治療或預(yù)防人類或哺乳動物中關(guān)節(jié)炎疾病的方法，其中 所述的方法包含給予通過以上所述方法制備的混合草藥金銀花和知母提取物的治療有效 劑量，其中所述的提取物是作為有效成分的及其藥學上可接受的載體。本發(fā)明的用于預(yù)防和治療關(guān)節(jié)炎疾病的組合物可以包含基于組合物總重量的 0. 1 50%重量的上述提取物。本發(fā)明的組合物還額外地包含本領(lǐng)域已知使用方法中的常規(guī)載體、佐劑或稀釋 劑。所述載體優(yōu)選的根據(jù)它的用途和應(yīng)用方法用作適當?shù)奈镔|(zhì)，但不限于此。適當?shù)南?釋劑列在雷明思藥學(Remington' s Pharmaceutical Science)的書面文本里(Mark Publishing co. , Easton ΡΑ)。在下文中，下列制備方法和賦形劑僅僅是示例性的而絕不限制本發(fā)明。
根據(jù)本發(fā)明的組合物可以作為一種藥學組合物來提供，所述的藥物組合物包含藥 學上可接受的載體、佐劑或稀釋劑的藥物組合物，例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露 醇、木糖醇、赤丁四醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯橡膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、 甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥甲基苯甲酸、羥丙基苯甲酸、滑石粉、硬脂酸鎂和礦物 油。這些制劑另外可以包括填料、抗凝劑、潤滑劑、濕潤劑、調(diào)味劑、乳化劑、防腐劑等等。本 發(fā)明的組合物可以通過利用本領(lǐng)域任何已知方法制成，以使病人用藥后能提供快速、持久 或緩慢釋放的活性成分。例如，本發(fā)明的組合物可以溶解在油、丙烯乙二醇或其它通常用于制備注射劑的 溶劑中，適合的載體實例包括生理鹽水、聚乙烯乙二醇、乙醇、植物油、異丙基十四酸酯等 等，但不限于它們。作為表皮給藥，本發(fā)明的提取物還可以被制成軟膏和乳膏。包含本發(fā)明組合物的藥物制劑可以任何形式進行制備，如口服劑型(粉劑、片劑、 膠囊、軟膠囊、液體藥物、糖漿、酏丸、散劑、囊劑、粒劑)，或表皮制劑(乳膏、軟膏、洗劑、凝 膠、香脂、膏藥、糊劑、噴霧劑、氣霧劑等等)，或注射制劑(溶液、懸浮劑、乳劑)。本發(fā)明的組合物在藥物劑型中可以采用其藥學上可接受的鹽的形式，也可以單獨 使用或適當?shù)慕M合，也可以與其它藥學上有活性的化合物聯(lián)合使用。本發(fā)明提取物或組合物的想要的劑量根據(jù)個體的情況和重量、病情的嚴重程度、 藥物形式、給藥途徑以及給藥周期的不同而不同，其也可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員進行選擇。然 而，為了獲得想要的作用，對本發(fā)明的發(fā)明提取物，通常建議給藥劑量范圍按重量/天計算 為0. 1至1000毫克/千克，優(yōu)選地，為1至100毫克/千克。劑量可以是每天單次給藥或 每天分多次給藥。本發(fā)明中的藥物組合物通過各種途徑給藥至個體動物如哺乳動物(大鼠、小鼠、 馴化動物或人類)，所有的給藥方式均是預(yù)期的，例如，給藥可以是口服、直腸給藥或經(jīng)靜 脈、肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、鞘膜內(nèi)、硬膜外或腦室內(nèi)注射。因此，本發(fā)明另一目的是提供一種包含混合草藥金銀花和知母提取物的功能性健
康食品。此處的術(shù)語“功能性健康食品”定義為“通過在常規(guī)食物中添加本發(fā)明的提取物， 來增強功能如身體功能或生理功能的功能性食物，以預(yù)防或改善人類或哺乳動物中的目標
疾病”。本發(fā)明的另一目的是提供一種包含本發(fā)明提取物的保健食品，及營養(yǎng)學上可接受 的添加劑，以預(yù)防和減輕目標疾病。此處的術(shù)語“保健食品”定義為“包含本發(fā)明提取物的食品，所述的食品沒有特異 性的預(yù)期作用但有一般的預(yù)期作用，可以用其少量作為添加劑，或以全量作為膠囊、粒劑、 片劑等等的形式”。此處的術(shù)語“營養(yǎng)學上可接受的添加劑”定義為“任何具有預(yù)期用途的物質(zhì)，所述 物質(zhì)將成為或合理地期望直接或間接地成為任何食物的組分或否則可以影響任何食物的 特征”，例如，稠化劑、成熟劑、漂白劑、多價螯合劑、保濕劑、抗凝劑、澄清劑、食品加工劑、乳 化齊 、穩(wěn)定劑、濃縮劑、堿和酸、發(fā)泡劑、營養(yǎng)素、著色劑、調(diào)味劑、甜味劑、防腐劑、抗氧劑等 等，其在本領(lǐng)域中已知的物質(zhì)。如果一種物質(zhì)出于特殊目的被添加到食品中，它可被稱作為直接添加劑和間接食品添加劑，這些添加劑由于包裝、儲藏或其它處理而以微量用量成為食品的一部分。上述健康食品可以包含于食物中、健康飲料中、膳食療法中等等，并且可以使用其 粉劑、粒劑、片劑、咀嚼片、膠囊、飲料等等形式用于預(yù)防或改善目標疾病。本發(fā)明的提取物還可以被添加到食物或飲料中用于預(yù)防和改善目標疾病。作為功 能性健康食品或保健食品，本發(fā)明提取物在食物或飲料中的數(shù)量一般為作為功能性健康食 品組分的食物總重量的大約0. 01至15 / %的范圍。特別的，盡管本發(fā)明的發(fā)明提取物在 功能性健康食品、保健食品或特殊營養(yǎng)食品中優(yōu)選用量根據(jù)每一個食品的預(yù)期目的不同而 變化，一般來說本發(fā)明的發(fā)明提取物優(yōu)選地使用作為添加劑的用量在食物(如面條等等) 中是約0. 01至5%的范圍，在保健食品中以100%的食物組分的比率表示為40至100%的 范圍。只要本發(fā)明中的健康飲料組合物在所示比率中包含作為基本成分的本發(fā)明提取 物，那么對其它的液體組分則沒有特別的限制，其中其它成分可以是各種除臭劑或天然碳 酸等等，如常規(guī)的飲料。上述天然碳酸的例子為單糖如葡萄糖、果糖等等；雙糖如麥芽糖、蔗 糖等等；常規(guī)糖如糊精、環(huán)糊精；以及糖醇如木糖醇和赤丁四醇等等。除了上述提到的除臭 劑以外的其它除臭劑，還有天然除臭劑如索嗎甜、甜葉菊提取物如當歸皂甙A、甘草酸等等， 和合成除臭劑如糖精、阿斯巴甜等等，這些除臭劑也許是有利地使用的。上述天然碳酸的用 量一般為100毫升的本發(fā)明飲料組合物的比例中約為1至20克，優(yōu)選為5至12克的范圍。除了上文所述組合物以外的其它組分是各種營養(yǎng)素、維生素、礦物質(zhì)或電解液、合 成調(diào)味劑、著色劑和奶酪巧克力等中的改進劑，果膠酸及其鹽，藻原酸及其鹽，有機酸，保護 性膠體粘著劑，PH調(diào)節(jié)劑，穩(wěn)定劑，防腐劑，丙三醇，醇，碳酸飲料中的碳化劑等等。除了上 文所述的組分以外的其它的組分還有用于制備天然果汁、果汁飲料和蔬菜飲料的水果汁， 其中的組分可以單獨或聯(lián)合使用。所述組分的比例并不是如此重要，但一般每100 / %本 發(fā)明組合物中約0至20 / %的范圍。這里提到的包含上述提取物的可添加的食品的例子 是各種食物、飲料、口香糖、維生素復(fù)合物、健康改善食物等等。本領(lǐng)域技術(shù)人員會發(fā)現(xiàn)可以在不脫離本發(fā)明實質(zhì)或范圍的情況下對本發(fā)明的組 合物、用法和制品可以進行各種修飾和改變。本發(fā)明將通過以下的實施例更具體地進行說明，但是應(yīng)該理解本發(fā)明在任何方法 中并不限于這些實施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員會發(fā)現(xiàn)可以在不脫離本發(fā)明實質(zhì)或范圍的情況下對本發(fā)明的組 合物、用法和制品可以進行各種修飾和改變。有益效果包含一種混合草藥金銀花和知母的提取物的本發(fā)明通過各種實驗顯示出有效的 抗炎作用，例如，對軟骨組織中蛋白多糖和II型膠原的分解的抑制作用；由于抑制MMP-1、 MMP-3和MMP-13活性對軟骨的保護作用；對軟骨組織的恢復(fù)作用；在水腫動物模型中的抗 炎和消炎的作用；通過對PEG2活性和GAG的降解以及各種遺傳毒性實驗的抑制實驗證明抗 炎作用，因此，該提取物可以作為有效安全的治療制劑或健康食品用于治療和預(yù)防關(guān)節(jié)炎 疾病。本發(fā)明將通過以下的附圖和實施例更具體地說明，但是，應(yīng)該理解的是本發(fā)明并 不限于這些實施例。


從以下結(jié)合附圖的具體實施方式
中，將更清晰地理解前文提到的以及本發(fā)明其它 的內(nèi)容、特點和其它優(yōu)點，其中圖1顯示綠原酸的色譜分析結(jié)果，綠原酸是包含在金銀花提取物中的標準組分；圖2顯示芒果甙的色譜分析結(jié)果，芒果甙是包含在知母提取物中的標準組分；圖3顯示綠原酸的色譜分析結(jié)果，綠原酸為KM-3中的標準組分；圖4顯示芒果甙的色譜分析結(jié)果，芒果甙為KM-3中的標準組分；圖5-A表示經(jīng)KM-I處理后對NO生成的抑制作用；圖5-B表示經(jīng)KM-3處理后對NO生成的抑制作用；圖6-A表示經(jīng)KM-I處理后對PGE2生成的抑制作用；圖6-B表示經(jīng)KM-3處理后對PGE2生成的抑制作用；圖7-A表示經(jīng)KM-I處理后對IL-I β生成的抑制作用；圖7-Β表示經(jīng)ΚΜ-3處理后對IL-I β生成的抑制作用；圖7-C表示經(jīng)ΚΜ-3處理后對IL_6生成的抑制作用；圖8表示KM-I和KM-3對膠原酶誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎(CIA)動物模型腫脹的抑制作 用；圖9表示KM-I和KM-3在膠原酶誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎(CIA)動物模型中對增加的淋巴 細胞數(shù)量的抑制作用；圖10表示KM-I和KM-3在膠原酶誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎(CIA)動物模型中對軟骨侵蝕 的抑制作用；圖11表示KM-I和KM-3在膠原酶誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎(CIA)動物模型實驗中對膠原 特異性IgG抗體生成的抑制作用；圖12-A描述KM-I對蛋白聚糖降解的抑制作用；圖12-B描述KM-3、芒果甙和綠原酸對蛋白聚糖降解的抑制作用；圖13-A描述應(yīng)用KM-I處理后，通過RT-PCR方法檢驗出的，患有骨關(guān)節(jié)炎患者的 軟骨組織中蛋白聚糖和II型膠原的增加的mRNA基因表達；圖13-B描述應(yīng)用KM-3處理后，通過RT-PCR方法檢驗出的，患有骨關(guān)節(jié)炎患者的 軟骨組織中蛋白聚糖和II型膠原的增加的mRNA基因表達；圖13-C描述應(yīng)用芒果甙和綠原酸處理后，通過RT-PCR方法檢驗出的，患有骨關(guān)節(jié) 炎患者的軟骨組織中蛋白聚糖和II型膠原的增加的mRNA基因表達；圖14-A描述KM-I對患有骨關(guān)節(jié)炎患者的軟骨組織中MMP-13活性水平的抑制作 用；圖14-B描述KM-3對患有骨關(guān)節(jié)炎患者的軟骨組織中MMP-13活性水平的抑制作 用；圖15-A描述KM-I對患有骨關(guān)節(jié)炎患者的軟骨組織中MMP-I活性水平的抑制作 用；圖15-B描述KM-3、芒果甙和綠原酸對患有骨關(guān)節(jié)炎患者的軟骨組織中MMP-I活性 水平的抑制作用；
圖16描述應(yīng)用KM-I (A)和KM_3 (B)處理后，對骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨組織的MMP_1、 MMP-3和MMP-13的mRNA基因表達水平的抑制作用；圖17描述應(yīng)用KM-I (A)和KM_3⑶處理后，患有骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨組織的細胞毒 性的測定；圖18-A描述在骨關(guān)節(jié)炎軟骨的軟骨保護中所涉及的KM-3對一些絲裂原活化的蛋 白激酶(MAPK)磷酸化的抑制作用；圖18-B描述在骨關(guān)節(jié)炎軟骨的軟骨保護中所涉及的芒果甙對一些絲裂原活化的 蛋白激酶(MAPK)磷酸化的抑制作用；圖18-C描述在骨關(guān)節(jié)炎軟骨的軟骨保護中綠原酸對一些絲裂原活化的蛋白激酶 (MAPK)磷酸化的抑制作用；圖19表示對膠原酶誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎(CIA)動物模型中的關(guān)節(jié)的KM-I㈧和 KM-3(B)的腫脹和活動性恢復(fù)作用；圖20-A表示通過對膠原酶誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎(CIA)動物模型關(guān)節(jié)中通過形態(tài)學分 析獲得的KM-I的軟骨保護作用；圖20-B表示通過對膠原酶誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎(CIA)動物模型關(guān)節(jié)中通過形態(tài)學分 析獲得的KM-3的軟骨保護作用；圖21-A描述通過對膠原酶誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎(CIA)動物模型關(guān)節(jié)中通過番紅精氧 染色分析獲得的KM-I對蛋白聚糖表達的恢復(fù)作用；圖21-B描述通過對膠原酶誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎(CIA)動物模型關(guān)節(jié)中通過番紅精氧 染色分析獲得的KM-3對蛋白聚糖表達的恢復(fù)作用；圖22-A描述通過對膠原酶誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎(CIA)動物模型關(guān)節(jié)中通過馬森三色 染劑分析獲得的KM-I對膠原表達的恢復(fù)作用；圖22-B描述通過對膠原酶誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎(CIA)動物模型關(guān)節(jié)中通過馬森三色 染色分析獲得的KM-3對膠原表達的恢復(fù)作用；圖23描述KM-3對膠原酶誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎(CIA)動物模型關(guān)節(jié)中來自軟骨下骨和 聚集蛋白聚糖的組織的分化間充質(zhì)干細胞(⑶105，⑶73)表達的軟骨再生作用；圖24-A表示KM-3對GAG降解實驗的抑制作用，該實驗是通過從骨關(guān)節(jié)炎患者的 軟骨組織和軟骨下骨組織中分離獲得的正常區(qū)(NSC)中共同培養(yǎng)軟骨細胞和軟骨下骨組 織進行的；圖24-B表示KM-3對GAG降解實驗的抑制作用，該實驗是通過從骨關(guān)節(jié)炎患者的 軟骨組織和軟骨下骨組織中分離獲得的異常區(qū)(SC)中共同培養(yǎng)軟骨細胞和軟骨下骨組織 進行的；
具體實施例方式實施本發(fā)明的最好模式本領(lǐng)域技術(shù)人員會發(fā)現(xiàn)可以在不脫離本發(fā)明實質(zhì)或范圍的情況下對本發(fā)明的組 合物、用法和制品進行各種修飾和改造，本發(fā)明將通過以下的實施例特別說明，但是應(yīng)該理解的是本發(fā)明并不限于這些實 施例。
發(fā)明模式以下的比較實施例、參考實施例、實施例和實驗實施例是為了進一步證明本發(fā)明， 但并不限于它的范圍。比較實施例1 金銀花花苞提取物的制備將從韓國慶熙醫(yī)學中心(Kyunghee Medical Center in Korea)購買的金銀花花 苞100克干燥，切割成小塊，并加入到0. 7升的50%的乙醇中。將所述的溶液在85°C下攪 拌回流4小時并將殘余物過濾。將所述的濾液濃縮并干燥獲得35克金銀花花苞提取物，該 提取物被用作對照實驗的樣品(如下文所指定的“U提取物”)。如圖1所示，已經(jīng)通過色譜分析證明LJ提取物包含2. 2%的綠原酸)(見 圖1)。比較實施例2 知母提取物的制備將從韓國慶熙醫(yī)學中心(Kyunghee Medical Center in Korea)購買的知母100 克氣干，切割成小塊，并加入到0. 7升的50%的乙醇中。將所述的溶液在85°C下攪拌回流4 小時并將殘余物過濾。將所述的濾液濃縮、干燥獲得50克知母提取物，該提取物被用作對 照實驗的樣品(如下文指定的“AA提取物”)。如圖2所示，已經(jīng)通過色譜分析證明AA提取物中包含2. 3 %的芒果甙)(見 圖1)。實施例1 混合草藥(KM-I)提取物的制備將從韓國慶熙醫(yī)學中心(Kyunghee Medical Center in Korea)購買的50克金銀 花花苞和50克知母干燥、混合在一起、切割成小塊，并加入到0. 7升的50%的乙醇中。將所 述的溶液在85°C下攪拌回流4小時并將殘余物過濾。將所述的濾液濃縮至溶液體積達到 0. 1升的程度，然后將等體積的正丁醇加入其中以進行分級分離。經(jīng)過反復(fù)分級分離，收集 正丁醇可溶性餾分，將其濃縮并干燥獲得9克混合草藥提取物，該提取物用作實驗樣品(如 下文指定的“KM-1”)。如在色譜分析中所示，已經(jīng)通過色譜分析證明KM-I提取物包含3%的綠原酸(w/ w% )和3. 5%的芒果甙)。實施例2 混合草藥(KM-2)提取物的制備將從韓國慶熙醫(yī)學中心(Kyunghee Medical Center in Korea)購買的50克金銀 花花苞和50克知母干燥、混合在一起、切割成小塊，并加入到0. 7升的50%的乙醇中。將所 述的溶液在85°C下攪拌回流4小時并將殘余物過濾。將所述的濾液濃縮并干燥獲得40克 混合草藥提取物，該提取物用作實驗樣品(如下文指定的“KM-2”)。如在色譜分析中所示，已經(jīng)通過色譜分析證明KM-2提取物包含1. 5%的綠原酸 (w/w% )和 1. 8% 的芒果甙(w/w% )。實施例3 混合草藥(KM-3)提取物的制備將從韓國慶熙醫(yī)學中心(Kyunghee Medical Center in Korea)購買的100克金 銀花花苞和50克知母干燥、混合在一起、切割成小塊，并加入到0. 7升的50%的乙醇中。將 所述的溶液在85°C下攪拌回流4小時并將殘余物過濾。將所述的濾液濃縮至溶液體積達 到0. 1升的程度，然后將等體積的正丁醇加入其中以進行分級分離。經(jīng)過反復(fù)分級分離，收 集正丁醇可溶性餾分，將其濃縮并干燥獲得11克混合草藥提取物，該提取物用作實驗樣品(如下文指定的“KM-3”)。如圖3和圖4中所示，已經(jīng)通過色譜分析證明KM-3提取物包含4. 5%的綠原酸(w/ w% )和2. 的芒果甙(w/w% )(見圖3和4)。實施例4 混合草藥(KM-4)提取物的制備將從韓國慶熙醫(yī)學中心(Kyunghee Medical Center in Korea)購買的100克金 銀花花苞和50克知母干燥、混合在一起、切割成小塊，并加入到0. 7升的50%的乙醇中。將 所述的溶液在85°C下攪拌回流4小時并將殘余物過濾。將所述的濾液濃縮并干燥獲得56 克混合草藥提取物，該提取物用作實驗樣品(如下文指定的“KM-4” )。如色譜分析中所示，已經(jīng)通過色譜分析證明KM-4提取物包含2. 2%的綠原酸(w/ w% )和1. 4%的芒果甙)。參考實施例1 巨噬細胞的培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)基(10% FBS, 2mM 1-谷氨酰胺，100單位/毫升青霉素鈉，100 單位/毫升硫酸鏈霉素和250納克/毫升兩性霉素B)中培養(yǎng)小鼠巨噬細胞株(Raw264. 7， 從ATCC購買)。將培養(yǎng)細胞接種在24孔板上(IO6細胞/孔)，并用KM-I (10，50，100，200 微克/毫升)，KM-3(10，20，40微克/毫升)，陽性對照組，即，塞來考昔(CEL，100微克/毫 升)和ETCP (SK化學)(100，200，400微克/毫升)處理30分鐘。向其中加入1微克/毫 升的LPS和1納克/毫升的IFN-，在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，并在2000rpm下離心 5分鐘，收集上清，所述的上清用作以下實驗的樣品。參考實施例2 膠原誘導(dǎo)的風濕性關(guān)節(jié)炎(CIA)模型從中央實驗云力物(Chungang Experiment Animals) (www, labanimals. co. kr.韓 國)購買DBA/1J小鼠。將等體積的CFA(弗氏佐劑)滴入到2毫升膠原溶液(2毫克/毫 升)中并混合均勻。取100微升混合液皮下注射到小鼠尾根上方2. 5厘米部位。注射后3 周，將2毫升膠原溶液和等體積IFA(不完全弗氏佐劑)的混合液以100微升劑量注射在小 鼠尾根部上方1厘米部位。再經(jīng)過3周，小鼠經(jīng)口服給予溶解于CMC溶液中的KM-I (200毫 克/千克)、KM-3(200毫克/千克)和塞來考昔(100毫克/千克)。給予CMC (羧甲基纖 維素，Sigma)溶液作為陰性對照組。參考實施例3 軟骨組織的制備人類關(guān)節(jié)軟骨由已經(jīng)做了人造關(guān)節(jié)手術(shù)(慶熙醫(yī)學中心整形外科Orthopedics Surgery Dep. of Kyunghee Medical Center)的患者提供。在無菌條件下通過外科手術(shù)取 得關(guān)節(jié)表面后，將約200-220毫克從人類和兔關(guān)節(jié)軟骨制備的關(guān)節(jié)表面組織浸泡在DMEM培 養(yǎng)基中(FBS，GIBC0 BRL，USA)，向其中補加5%的胎牛血清和100單位/毫升的青霉素-鏈 霉素。將組織用該培養(yǎng)基清洗數(shù)次，然后在37°C增濕95%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)所述的 關(guān)節(jié)組織。培養(yǎng)1或2天后，將培養(yǎng)基用新的堿性培養(yǎng)基替換，然后將30毫克的軟骨細胞 轉(zhuǎn)移至48孔板，該新堿性培養(yǎng)基包含經(jīng)加熱處理失活的5%胎牛血清，IOmM HEPES和100 單位/毫升的青霉素-鏈霉素。經(jīng)1小時培養(yǎng)后，將5納克/微升的白介素-1 α (IL-1 α，R&D System, USA)加入 到培養(yǎng)基中誘導(dǎo)炎癥，將各種濃度的實驗樣品KM-I，ETCP (SK化學)，塞來考昔(CEL，Pfizer Co.，USA)和氨基葡萄糖(GLUC0，Sigma Co.，USA)，S卩，0. 1,0. 2和0. 4毫克/毫升分別加入 此培養(yǎng)基中。所述培養(yǎng)基在37°C下再經(jīng)過7天的培養(yǎng)，收集上清，將其儲存在-20°C以用作
13對照性實驗和實驗的樣品。 參考實施例4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)將根據(jù)參考實施例1中公開的方法培養(yǎng)的軟骨細胞用TRIzoI試劑(Invitrogen Corporation, CA, USA)處理來分離RNA，通過向培養(yǎng)基中加入包含寡(dT) 12引物、三磷酸堿 基脫氧核苷酸(Dntp) (IOmM),0. IM 二硫蘇糖醇(DDT)的緩沖液，逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶抑制劑 來進行對1微克總RNA的逆轉(zhuǎn)錄。將所述的培養(yǎng)基在42°C培養(yǎng)60分鐘。通過使用表1和 序列(SEQ) I. D. 1至16中公開的引物進行PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))，該PCR應(yīng)用1微克的每 一個由上述方法制備的cDNA，2. 5單位的嗜熱水生菌(Taq)聚合酶(TaKaRa Taq , Takara, Japan), 1. 5mM dNTP, IX 的緩沖液(IOmM Tris-HCl pH 8. 3,50mM KCl, TritonX-100)和 20pM的表1和序列I. D. 1至16中每一配對引物來進行。將所述溶液用蒸餾水調(diào)節(jié)至10微 升的總體積，然后通過使用熱循環(huán)裝置(Bio-Rad，USA)按照如下的方法進行聚合酶鏈式反 應(yīng)(PCR)經(jīng)過94°C 5分鐘的變性后，PCR按照94°C反應(yīng)60秒，55°C反應(yīng)60秒和72°C反應(yīng) 90秒的順序進行。該循環(huán)重復(fù)30次，最后的延伸是在72°C進行5分鐘。通過PCR獲得的 產(chǎn)物在1. 8%瓊脂糖凝膠上進行電泳(5V/厘米)，并用2微克/毫升的溴化乙錠(EtBr)染 色5分鐘。染色產(chǎn)物用蒸餾水洗10分鐘，其結(jié)果在紫外波長(260nm)處進行檢測。表 權(quán)利要求
一種包含混合草藥金銀花Lonicera japonica THUNB和知母Anemarrhena asphodeloides BUNGE提取物的藥物組合物，該組合物作為治療和預(yù)防關(guān)節(jié)炎疾病的活性成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述的提取物是指一種粗提取物或丁醇可 溶性提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其中所述的粗提取物是用選自水、C1至C4的低 級醇或二者混合物的溶劑進行提取的。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其中所述的丁醇可溶性提取物是通過將權(quán)利要 求3所述的粗提取物用丁醇分級分離獲得的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述的混合草藥金銀花Lonicera japonica THUNB 和知母 Anemarrhena asphodeloides BUNGE 是按重量計算 0. 5 3 1 的 混合比例范圍進行混合的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述的提取物包含綠原酸和芒果甙作為標 準組分。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其中所述的提取物包含0.5 )綠原 酸和0. 5 )芒果甙作為標準組分。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述的關(guān)節(jié)炎疾病是退行性關(guān)節(jié)炎、風濕 性關(guān)節(jié)炎或狼瘡性關(guān)節(jié)炎。
9.、混合草藥金銀花Lonicera japonica THUNB 禾口知母 Anemarrhena asphodeloides BUNGE的提取物在制備用于治療和預(yù)防哺乳動物或人類中關(guān)節(jié)炎疾病的治療制劑中的用 途。
10.一種治療或預(yù)防人類或哺乳動物中關(guān)節(jié)炎疾病的方法，其中所述的方法包括 給予治療有效量的作為有效成分的混合草藥金銀花Lonicera japonica THUNB和知母 Anemarrhena asphodeloides BUNGE提取物及其藥學上可接受的載體。
11.一種保健食品，其包含作為活性成分的混合草藥金銀花Lonicera japonica THUNB 和知母Anemarrhena asphodeloides BUNGE的提取物以及營養(yǎng)學上可接受的添加劑，用于 預(yù)防和減輕關(guān)節(jié)炎疾病。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的保健食品，其中所述的提取物是一種粗提取物或丁醇可溶 性提取物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的保健食品，其中所述的粗提取物是用選自水、C1至C4的低 級醇或二者混合物的溶劑進行提取的。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的保健食品，其中所述的丁醇可溶性提取物是通過將權(quán)利要 求13的粗提取物用丁醇分級分離獲得的。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的保健食品，其中所述的混合草藥金銀花Lonicera japonica THUNB 和知母 Anemarrhena asphodeloides BUNGE 是按重量計算 0. 5 3 1 的 混合比例范圍進行混合的。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的保健食品，其中所述的提取物包含綠原酸和芒果甙作為標 準組分。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的保健食品，其中所述的提取物包含0.5 )綠原酸和0. 5 )芒果甙作為標準組分。
18.根據(jù)權(quán)利要求11所述的保健食品，其中所述的關(guān)節(jié)炎疾病是退行性關(guān)節(jié)炎、風濕 性關(guān)節(jié)炎或狼瘡性關(guān)節(jié)炎。
19.根據(jù)權(quán)利要求11所述的保健食品，其中所述的保健食品是作為制成粉劑、粒劑、片 劑、膠囊或飲料的形式提供的。
全文摘要
本發(fā)明涉及本發(fā)明的組合物，該組合物包含混合草藥金銀花和知母提取物，并顯示有效的抗炎癥活性，因此，可將其用作治療和預(yù)防關(guān)節(jié)炎疾病的有效及安全的治療制劑或健康食品。
文檔編號A61K36/8964GK101939018SQ200980104672
公開日2011年1月5日 申請日期2009年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月19日
發(fā)明者俞明哲, 崔道永, 樸東錫, 李栽東, 梁馨仁, 白容鉉, 許楨恩, 許鍾鉉, 趙龍白, 鄭仁鎬, 金璟洙 申請人:慶熙大學產(chǎn)學協(xié)力團;丸仁制藥株式會社