逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的基因組合物-h-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的基因組合物-h-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：
多藥耐藥(multidrugresistance，MDR)是指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種抗腫瘤藥物出現(xiàn)耐藥性的同時(shí)，對(duì)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的多種抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥性，從而大大降低了抗腫瘤藥物的療效。MDR形成機(jī)制復(fù)雜，腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)不同途徑導(dǎo)致MDR的產(chǎn)生。腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的產(chǎn)生成為目前腫瘤化療失敗的一個(gè)主要原因，據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)估計(jì)，90％以上腫瘤患者死于不同程度的耐藥。因此，如何成功逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥也已成為目前腫瘤治療領(lǐng)域中亟待解決的重要問(wèn)題[vanVlerkenetal.,2008]。GCS基因(Glucosylceramidesynthase，葡萄糖神經(jīng)酰胺合成酶)近來(lái)被發(fā)現(xiàn)其高表達(dá)與腫瘤MDR密切相關(guān)。GCS是一種葡萄糖轉(zhuǎn)移酶，參與神經(jīng)酰胺的代謝，可催化UDP-glucose上的糖基轉(zhuǎn)運(yùn)到神經(jīng)酰胺生成葡萄糖神經(jīng)酰胺(glucosylceramide，GlcCer)，使細(xì)胞逃避神經(jīng)酰胺介導(dǎo)的凋亡作用而產(chǎn)生MDR。神經(jīng)酰胺是鞘脂類代謝的主要分子，在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中起著重要作用，是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的第二信使，它在多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮廣泛的作用，其糖基化代謝產(chǎn)物GlcCer是細(xì)胞合成其他鞘糖脂的前體物質(zhì)，它與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為密切相關(guān)，不僅維持著細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)功能，還參與了細(xì)胞增殖、分化及腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥。GCS為神經(jīng)酰胺糖基化的限速酶，具有底物特異性，對(duì)MDR的產(chǎn)生有重要作用。抑制GCS延緩神經(jīng)酰胺糖基化，增加細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺的含量已成為逆轉(zhuǎn)MDR的有效策略。隨著腫瘤細(xì)胞MDR分子機(jī)制研究的不斷深入，克服MDR的方法研究也取得了較大進(jìn)展，目前研究較多的是化學(xué)合成抑制劑和基因治療?；瘜W(xué)合成的抑制劑能夠增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，但這些藥物在臨床應(yīng)用中特異性不高、毒副作用嚴(yán)重，難以達(dá)到逆轉(zhuǎn)MDR的有效血漿濃度，并且腫瘤細(xì)胞也可以對(duì)這些藥物產(chǎn)生耐藥性，其臨床應(yīng)用受到限制。目前逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的基因治療方法主要集中在：1)抑制P-gp藥泵功能(Linetal,2003)；2)干擾MDR相關(guān)基因的表達(dá)，如MDR1基因的反義寡聚脫氧核糖核酸(AOD)，MDR1和MRP基因的反義RNA聯(lián)合抑制，切割MDR1mRNA的核酶(Stuartetal2000；Wangetal,2003；Hueskeretal,2002)；3)針對(duì)MDR1基因調(diào)節(jié)的基因治療(Efferthetal,2001)；4)mdr1/siRNA的RNA干擾(Hannonetal,2002；Yagueetal,2004)。與反義寡核苷酸、反義RNA和人工轉(zhuǎn)錄因子相比，siRNA的應(yīng)用前景最好，其它均存在體內(nèi)特異性不強(qiáng)、轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定表達(dá)不足等問(wèn)題。盡管siRNA相比于反義寡核苷酸、反義RNA等具有較好的應(yīng)用前景，但具有核酸和小分子化合物的雙重特性的siRNA，其本身的親水性和陰離子特性使其很難通過(guò)細(xì)胞膜，而且由于易被核酸酶(RNase)降解導(dǎo)致其具有穩(wěn)定性差、半衰期短、轉(zhuǎn)染效率低等特點(diǎn)。因此應(yīng)用siRNA分子的關(guān)鍵是如何使其有效地穿過(guò)細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中的RNAi通路。而且將siRNA分子導(dǎo)入生物體內(nèi)治療疾病更為復(fù)雜，除了細(xì)胞膜障礙外，還要克服靶細(xì)胞的選擇性、體內(nèi)siRNA分子的穩(wěn)定性、動(dòng)態(tài)平衡的機(jī)制以及對(duì)非靶細(xì)胞的毒性等問(wèn)題。因此，siRNA是否能夠有效遞送是其能否應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵，設(shè)計(jì)和合成安全、高效、靶向的siRNA遞送載體已經(jīng)成為目前siRNA藥物研究的重要方向。新型樹枝狀高分子聚酰胺-胺(PAMAM)，以其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和表面性質(zhì)，成為了治療性基因載體研究的熱點(diǎn)。以末端為胺基的PAMAM樹枝狀大分子為例，它在生理pH條件下具有很好的溶解性，其正電性的特征可以實(shí)現(xiàn)更多數(shù)量基因的運(yùn)載，而且體系穩(wěn)定，能夠保護(hù)目的基因不受體內(nèi)血漿或組織細(xì)胞中各種酶的破壞，因而可以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)的有效轉(zhuǎn)染[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:4897-4902]。但PAMAM作為基因遞送載體在體內(nèi)應(yīng)用尚存在以下幾個(gè)問(wèn)題需要解決：1)轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較低；2)在體內(nèi)環(huán)境下，PAMAM可以非特異性的結(jié)合大量的負(fù)電大分子和紅細(xì)胞，影響轉(zhuǎn)染效率并且發(fā)生溶血現(xiàn)象；3)如何實(shí)現(xiàn)PAMAM納米基因遞送系統(tǒng)的靶向性。為了解決上述問(wèn)題，目前研究多直接在PAMAM分子上進(jìn)行修飾，如在PAMAM表面修飾鳥氨酸等殘基[IntJPharm,2010,392:294–303]，增強(qiáng)PAMAM分子表面正電性以增強(qiáng)轉(zhuǎn)染效率，但此方法在增強(qiáng)過(guò)多正電性的同時(shí)，也提高了細(xì)胞毒性；另一方面，對(duì)PAMAM表面修飾PEG[Nanotechnology,2009,20:105-103]，以提高生物相容性，減少非特異性的結(jié)合血漿中的負(fù)電大分子和紅細(xì)胞，另外，在PEG末端修飾特定蛋白如乳鐵蛋白[Biomaterials,2008,29(2):238-246]，以實(shí)現(xiàn)組織靶向性，但PEG的修飾增加了PAMAM分子和DNA分子結(jié)合的空間位阻，降低了轉(zhuǎn)染效率。表皮生長(zhǎng)因子受體(EpidermalGrowthFactorReceptor，EGFR)是一種具有酪氨酸激酶活性的生長(zhǎng)因子受體，在正常細(xì)胞表達(dá)率低，而在多種腫瘤如肺癌、大腸癌、腎癌和頭頸部鱗癌等多種腫瘤細(xì)胞中存在過(guò)度表達(dá)。EGFR信號(hào)通路在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，EGFR的異常表達(dá)常與惡性腫瘤的特征如細(xì)胞增殖、免疫逃避、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、腫瘤血管形成以及化療抗拒、不良預(yù)后等相關(guān)，為以EGFR為靶點(diǎn)的腫瘤治療和針對(duì)EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)干預(yù)治療提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目前以EGFR為靶點(diǎn)的腫瘤治療方式中單克隆抗體為常見(jiàn)治療方法，EGFR單克隆抗體與內(nèi)源性配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合EGFR，通過(guò)抑制酪氨酸激酶的激活、促進(jìn)EGFR內(nèi)化等作用產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)，也可與抗癌藥物或毒素相偶聯(lián)，從而達(dá)到特異性抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。例如，尼妥珠單克隆抗體(Nimotuzumab，h-R3)為抗人EGFR人源化單克隆抗體(mAb)，具有人源性、高選擇性和半衰期長(zhǎng)的特點(diǎn)，能夠競(jìng)爭(zhēng)性抑制內(nèi)源性配體與EGFR的結(jié)合，抑制EGFR的酪氨酸激酶活性，阻斷由EGFR介導(dǎo)的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。體內(nèi)外研究表明，h-R3有抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤血管生成以增加放化療敏感性的作用[ExpertRevAnticancerTher,2003,3(3):367-380；LungCancer,2013,79(3)270-275]。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于抗腫瘤多藥耐藥的組合物。本發(fā)明提供的組合物，由末端帶有氨基的聚酰胺-胺樹枝狀聚合物、尼妥珠單抗h-R3和GCSsiRNA復(fù)合制成。GCSsiRNA，購(gòu)自圣克魯斯生物技術(shù)(上海)有限公司，由siRNA-A、siRNA-B、siRNA-C三種siRNA組成，siRNA-A由如下兩條單鏈組成，正義鏈CAAGAAGGCAACUGACAAAtt(序列1)；反義鏈為UUUGUCAGUUGCCUUCUUGtt(序列2)；siRNA-B由如下兩條單鏈組成，正義鏈GAACUUCACAUCCAAGAUAtt(序列3)；反義鏈為UAUCUUGGAUGUGAAGUUCtt(序列4)；siRNA-C由如下兩條單鏈組成，正義鏈CAGUUUCAAUCCAGAAUGAtt(序列5)；反義鏈為UCAUUCUGGAUUGAAACUGtt(序列6)。上述的組合物中，所述聚酰胺-胺樹枝狀聚合物的數(shù)均分子量為28824.81。上述的組合物中，所述聚酰胺-胺樹枝狀聚合物與所述GCSsiRNA的氮/磷比為1:1-40:1。上述的組合物中，所述聚酰胺-胺樹枝狀聚合物與所述GCSsiRNA的氮/磷比為20:1。上述的組合物中，所述尼妥珠單抗h-R3與所述GCSsiRNA的質(zhì)量比為0.05:1-5:1。上述的組合物中，所述尼妥珠單抗h-R3與所述GCSsiRNA的質(zhì)量比為0.05:1、0.1:1或0.5:1。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備上述的抗腫瘤多藥耐藥組合物的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：將末端為氨基的聚酰胺-胺樹枝狀聚合物的水溶液與GCSsiRNA混合后，孵育條件下自組裝形成聚酰胺-胺樹枝狀聚合物與GCSsiRNA的組合物；再將所述聚酰胺-胺樹枝狀聚合物與GCSsiRNA的組合物中加入到尼妥珠單抗h-R3中，孵育條件下自組裝形成聚酰胺-胺樹枝狀聚合物、尼妥珠單抗h-R3和GCSsiRNA的組合物，即得到所述的抗腫瘤多藥耐藥基因組合物。上述的組合物在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥產(chǎn)品中的應(yīng)用或在制備抗腫瘤細(xì)胞多藥耐藥產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述應(yīng)用中，所述腫瘤細(xì)胞為多藥耐藥腫瘤細(xì)胞，所述多藥耐藥腫瘤細(xì)胞具體為MCF-7/ADR；所述產(chǎn)品為藥物。上述的組合物在靶向運(yùn)輸核酸或制備靶向運(yùn)輸核酸產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍，在本發(fā)明中的核酸為GCSsiRNA。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：1)以EGFR為靶點(diǎn)，通過(guò)自組裝的方法形成尼妥珠單抗h-R3修飾的PAMAM載體作為基因遞送載體，利用h-R3與腫瘤細(xì)胞EGFR介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，提高PAMAM載體對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性，從而將針對(duì)GCS基因的小干擾RNA成功遞送到細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)目的基因GCSsiRNA的沉默，進(jìn)一步增加化療藥物的敏感性；2)通過(guò)單克隆抗體h-R3對(duì)PAMAM的修飾，可降低PAMAM載體過(guò)強(qiáng)的正電荷強(qiáng)度，有利于降低細(xì)胞毒性和溶血現(xiàn)象的發(fā)生；3)采用自組裝方法制備h-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA組合物，與化學(xué)合成相比，分子自組裝方法可更方便、靈活的對(duì)體系進(jìn)行修飾，并且保持配體的生物活性。附圖說(shuō)明圖1為WesternBlot法檢測(cè)敏感細(xì)胞MCF-7與耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR中GCS蛋白的表達(dá)。圖2為PCR檢測(cè)敏感細(xì)胞MCF-7與耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR中GCS蛋白的表達(dá)。圖3為不同氮/磷比(N/P比)的PAMAMG5/GCSsiRNA的凝膠電泳阻滯圖。圖4為不同h-R3修飾量對(duì)h-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物凝膠阻滯結(jié)果的影響。圖5為PCR檢測(cè)MCF-7/ADR細(xì)胞經(jīng)h-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染后GCS基因的表達(dá)圖6為PCR檢測(cè)MCF-7/ADR細(xì)胞經(jīng)h-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染后MDR1基因的表達(dá)圖7為PCR檢測(cè)MCF-7/ADR細(xì)胞經(jīng)h-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡相關(guān)因子bcl-2的表達(dá)圖8為PCR檢測(cè)MCF-7/ADR細(xì)胞經(jīng)h-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡相關(guān)因子caspase-3的表達(dá)圖9為WesternBlot法檢測(cè)MCF-7/ADR細(xì)胞經(jīng)h-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物和EGF/PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染后GCS蛋白的表達(dá)圖10為WesternBlot法檢測(cè)MCF-7/ADR細(xì)胞經(jīng)h-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物和EGF/PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染后P糖蛋白的表達(dá)具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。聚酰胺-胺樹枝狀聚合物(PAMAM)：末端帶有氨基，以乙二胺為核，5.0代，(購(gòu)自Sigma-Aldrich，貨號(hào)：536709，規(guī)格5g，數(shù)均分子量為28824.81)；采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀抽真空，去掉甲醇溶劑，獲得PAMAMG5，再用PBS緩沖液(pH7.4)溶解，制備成10mg/mL儲(chǔ)存液于4℃?zhèn)溆谩Ｄ嵬字閱慰?Nimotuzumab，h-R3)：購(gòu)自百泰生物藥業(yè)有限公司。多藥耐藥基因(GCS)小干擾RNA(GCSsiRNA又稱為UGCGsiRNA)：購(gòu)自圣克魯斯生物技術(shù)(上海)有限公司，sc-45404由siRNA-A、siRNA-B、siRNA-C三種siRNA組成，siRNA-A由如下兩條單鏈組成，正義鏈CAAGAAGGCAACUGACAAAtt；反義鏈為UUUGUCAGUUGCCUUCUUGtt；siRNA-B由如下兩條單鏈組成，正義鏈GAACUUCACAUCCAAGAUAtt；反義鏈為UAUCUUGGAUGUGAAGUUCtt；siRNA-C由如下兩條單鏈組成，正義鏈CAGUUUCAAUCCAGAAUGAtt；反義鏈為UCAUUCUGGAUUGAAACUGtt；耐藥細(xì)胞株(MCF-7/ADR)：購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心首先采用蛋白質(zhì)印跡法(WesternBlot，WB)檢測(cè)耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR中GCS的表達(dá)，并與敏感細(xì)胞MCF-7(購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心)進(jìn)行比較。結(jié)果如圖1所示，1為MCF-7細(xì)胞、2為MCF-7/ADR細(xì)胞；由結(jié)果可知GCS在耐藥細(xì)胞株MCF-7/ADR中的表達(dá)明顯高于在敏感細(xì)胞株MCF-7中的表達(dá)。進(jìn)一步采用PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)錄水平上敏感細(xì)胞和耐藥細(xì)胞中GCS表達(dá)的差異，結(jié)果如圖2所示，1：Marker；2：MCF-7中的MDR1；3：MCF-7/ADR中的MDR1；4：MCF-7中的GCS；5：MCF-7/ADR中的GCS；6：MCF-7中的GAPDH；7：MCF-7/ADR中的GAPDH；表明在MCF-7和MCF-7/Adr細(xì)胞株中，不僅GCS的表達(dá)存在差異，多藥耐藥蛋白MDR1的表達(dá)也存在差異。實(shí)施例1、制備h-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物及其表征一、PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物首先將上述制成的PAMAMG5(數(shù)均分子量為28824.81)10mg/mL儲(chǔ)存液溶解于消毒蒸餾水中，振蕩混勻，配制成1mg/mL的工作溶液，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。轉(zhuǎn)染前取1.0μgGCSsiRNA置于EP管中，分別加入0.7μL、1.4μL、3.5μL、7μL、14μL、21μL、28μL濃度為1mg/mL的PAMAMG5工作溶液，再加入opti-MEM培養(yǎng)基(購(gòu)自invitrogen，產(chǎn)品目錄號(hào)為11058-021)500uL，混勻后置室溫孵育30min形成PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物。形成的PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物中，PAMAM與GCSsiRNA的氮/磷比分別為1:1、2:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1。將上述制備的PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物采用瓊脂糖凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)證明PAMAM與GCSsiRNA的復(fù)合情況以及穩(wěn)定性。所檢測(cè)的PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物中，PAMAM與GCSsiRNA的氮/磷比分別為1:1、2:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1。具體方法如下：稱取適量瓊脂糖，加入1×TAE溶液，加熱溶解，配制1％瓊脂糖凝膠溶液，室溫冷卻至約50℃，加入1μL溴化乙錠溶液(500μg/ml)插入DNA染色，灌膠，加樣，120V電泳30min左右，紫外透射儀觀察并拍照。新鮮配制所需轉(zhuǎn)染復(fù)合物，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定包封效果。結(jié)果如圖3所示，泳道1為裸GCSsiRNA；泳道2-8為氮/磷比分別為1，2，5，10，20，30，40；泳道9為RNAMarker，結(jié)果顯示siRNA在沒(méi)有與PAMAM完全結(jié)合時(shí)(泳道2-5)，能夠出現(xiàn)正常電泳條帶；當(dāng)N/P比為20(泳道6)時(shí)，PAMAM-siRNA能夠完全阻滯其包裹的siRNA的電泳，使其滯留在點(diǎn)樣孔附近，無(wú)法電泳出正常電泳條帶，表明N/P達(dá)到20時(shí)，能夠形成穩(wěn)定的PAMAM-siRNA。二、h-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物將尼妥珠單抗(Nimotuzumab，h-R3)用PBS緩沖液(pH7.4，NaCl8.0g,KCl0.2g,NaH2PO4·H2O1.56g,KH2PO40.20g，蒸餾水定容至1000ml)，配制成濃度為1mg/mL的單抗溶液，向100μL氮/磷比為20的PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物加入不同體積的濃度為1mg/mL的單抗溶液，混勻后置室溫孵育30min形成h-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物。形成h-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物中，h-R3與GCSsiRNA的質(zhì)量比分別為0.05:1、0.1:1、0.5:1、1:1、2:1、5:1，PAMAMG5與GCSsiRNA的氮/磷比為20:1。將上述制備的h-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物采用瓊脂糖凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)證明PAMAM與GCSsiRNA的復(fù)合情況以及穩(wěn)定性，所檢測(cè)的h-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物中，PAMAM與GCSsiRNA的氮/磷比為20:1；h-R3與GCSsiRNA的質(zhì)量比分別為0.05，0.1，0.5，1，2，5。方法同上。h-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA三元復(fù)合物的瓊脂糖凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，泳道1為裸GCSsiRNA；泳道2-7為PAMAMG5與GCSsiRNA氮/磷比為20:1、且h-R3與GCSsiRNA的質(zhì)量比分別為0.05，0.1，0.5，1，2，5的h-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物；泳道8為Marker)，從圖中可見(jiàn)，當(dāng)h-R3與GCSsiRNA的質(zhì)量比為0.05、0.1、0.5時(shí)，無(wú)裸siRNA條帶，此時(shí)形成的h-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物是穩(wěn)定的，可以有效包裹GCSsiRNA。因此，結(jié)合上述結(jié)論，h-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物，PAMAM與DNA的氮/磷比為20:1，且h-R3與GCSsiRNA的質(zhì)量比為0.05、0.1、0.5，為最佳反應(yīng)組合物。實(shí)施例2、h-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物體在抑制腫瘤細(xì)胞多耐藥中的應(yīng)用一、轉(zhuǎn)錄水平上檢測(cè)h-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染后耐藥基因以及相關(guān)凋亡基因的表達(dá)1、h-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物體轉(zhuǎn)染后耐藥基因表達(dá)量檢測(cè)1)GCS基因?qū)-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物(PAMAM與DNA的氮/磷比為20:1，且h-R3與GCSsiRNA的質(zhì)量比為0.5)轉(zhuǎn)染進(jìn)入耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR，利用RT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中GCS基因表達(dá)量的變化。引物序列為：GCSforCCTTTCCTCTCCCCACCTTCCTCTGCSreGGTTTCAGAAGAGAGACACCTGGG以GAPDH作為內(nèi)參基因。結(jié)果如圖5所示，1:Marker；2:未轉(zhuǎn)染MCF-7/ADR中的GCS；3:轉(zhuǎn)染后MCF-7/Adr中的GCS；4:未轉(zhuǎn)染MCF-7/ADR中的GAPDH；5:轉(zhuǎn)染后MCF-7/Adr中的GAPDH，看出，該復(fù)合物轉(zhuǎn)染后耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR中GCS基因的表達(dá)明顯降低。2)多藥耐藥基因MDR1同時(shí)對(duì)多藥耐藥基因MDR1進(jìn)行檢測(cè)，引物序列為：MDR1forATATCAGCAGCCCACATCATMDR1reGAAGCACTGGGATGTCCGGT以GAPDH作為內(nèi)參基因。結(jié)果如圖6所示，1:未轉(zhuǎn)染MCF-7/Adr中的GAPDH；2:轉(zhuǎn)染后MCF-7/Adr中的GAPDH；3：未轉(zhuǎn)染MCF-7/Adr中的MDR1；4:轉(zhuǎn)染后MCF-7/Adr中的MDR1；5:Marker，從條帶3和4的亮度上可以看出，條帶4(轉(zhuǎn)染后MCF-7/Adr中的MDR1)的亮度明顯弱于條帶3(未轉(zhuǎn)染MCF-7/Adr中的MDR1)，說(shuō)明耐藥細(xì)胞經(jīng)h-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染后MDR1的表達(dá)降低。h-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染后，耐藥細(xì)胞中MDR1的表達(dá)也有一定下調(diào)。這些結(jié)果說(shuō)明h-R3/PAMAM能夠介導(dǎo)GCSsiRNA進(jìn)入耐藥細(xì)胞中，對(duì)GCS基因進(jìn)行沉默干擾，同時(shí)對(duì)多藥耐藥基因MDR1的表達(dá)也有一定的抑制作用。2、對(duì)凋亡相關(guān)基因bcl-2和caspase-3的檢測(cè)同時(shí)對(duì)凋亡相關(guān)基因bcl-2和caspase-3的檢測(cè)bcl-2的引物序列為：bcl-2forTGCTGAAGATTGATGGGATCbcl-2reTGCATTCTTGGACGAGGGcaspase-3的引物序列為：caspase-3forTGTGGCATTGAGACAGACcaspase-3reGAGGGAAATACAGTACCAAATA圖7為PCR檢測(cè)MCF-7/ADR細(xì)胞經(jīng)h-R3/PAMAM/GCSsiRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡相關(guān)因子bcl-2的表達(dá)，其中，1:Marker；2:未轉(zhuǎn)染MCF-7/Adr中的bcl-2；3:轉(zhuǎn)染后MCF-7/Adr中的bcl-2；4:未轉(zhuǎn)染MCF-7/Adr中的GAPDH；5:轉(zhuǎn)染后MCF-7/Adr中的GAPDH；圖8為PCR檢測(cè)MCF-7/ADR細(xì)胞經(jīng)h-R3/PAMAM/GCSsiRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡相關(guān)因子caspase-3的表達(dá)，其中1:Marker；2:未轉(zhuǎn)染MCF-7/Adr中的caspase-3；3:轉(zhuǎn)染后MCF-7/Adr中的caspase-3；4:未處理MCF-7/Adr中的GAPDH；5:處理后MCF-7/Adr中的GAPDH；可以看出，h-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染后，耐藥細(xì)胞中bcl-2和caspase-3的表達(dá)也有一定程度的下調(diào)，從而進(jìn)一步驗(yàn)證GCS基因的沉默會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。二、翻譯水平上檢測(cè)h-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染后耐藥相關(guān)蛋白的以及相關(guān)凋亡基因的表達(dá)為了進(jìn)一步驗(yàn)證h-R3修飾的PAMAMG5復(fù)合物能夠有效地將GCSsiRNA遞送到耐藥細(xì)胞并且發(fā)揮功效，在下面的實(shí)施例中增加了對(duì)照實(shí)驗(yàn)，即采用EGF修飾的PAMAMG5復(fù)合物攜載GCSsiRNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1)GCS蛋白將h-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物(PAMAM與DNA的氮/磷比為20:1，且h-R3與GCSsiRNA的質(zhì)量比為0.5)以及對(duì)照復(fù)合物EGF/PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物(制備方法類似，PAMAM與DNA的氮/磷比為20:1，且EGF與GCSsiRNA的質(zhì)量比為2)分別轉(zhuǎn)染進(jìn)入耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR，利用WesternBlot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中GCS蛋白表達(dá)量的變化，同時(shí)設(shè)定內(nèi)參GAPDH。具體方法如下：收集狀態(tài)較好的MCF-7/ADR細(xì)胞(細(xì)胞計(jì)數(shù)，一般107個(gè)左右)，使之保持細(xì)胞數(shù)目相同，進(jìn)行離心(1100rpm離心7min)，得到細(xì)胞沉淀，之后按照蛋白提取試劑盒進(jìn)行蛋白提取。首先用PBS洗滌細(xì)胞沉淀2-3次，根據(jù)細(xì)胞沉淀的多少加入細(xì)胞裂解液，加之前要在細(xì)胞裂解液中加入5％的蛋白酶抑制劑，冰上靜置30min，測(cè)定蛋白濃度，加入LoadingBuffer，沸水浴煮10min，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｖ筮M(jìn)行WesternBlotting檢測(cè)。結(jié)果如圖9所示，A:h-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA組；B:EGF/PAMAMG5/GCSsiRNA組；條帶1:未經(jīng)復(fù)合物處理的MCF-7/ADR細(xì)胞；條帶2:經(jīng)復(fù)合物處理的MCF-7/ADR細(xì)胞。從圖中條帶的亮度可以看出，經(jīng)兩組復(fù)合物轉(zhuǎn)染后MCF-7/ADR細(xì)胞中的GCS蛋白表達(dá)量均有所下降，h-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA組GCS蛋白下調(diào)的更為明顯。這個(gè)結(jié)果表明相比于EGF修飾的PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物，尼妥珠單抗h-R3修飾后復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率更高，進(jìn)入耐藥腫瘤細(xì)胞后沉默效果更好。2)P糖蛋白同時(shí)對(duì)耐藥相關(guān)蛋白P糖蛋白進(jìn)行檢測(cè)，具體方法同1)。結(jié)果如圖10所示，A:h-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA組；B:EGF/PAMAMG5/GCSsiRNA組；條帶1:未經(jīng)復(fù)合物處理的MCF-7/ADR細(xì)胞；條帶2:經(jīng)復(fù)合物處理的MCF-7/ADR細(xì)胞。從圖中條帶的亮度可以看出，經(jīng)兩組復(fù)合物轉(zhuǎn)染后MCF-7/ADR細(xì)胞中的P蛋白表達(dá)量均有所下降，h-R3/PAMAMG5/GCSsiRNA組P蛋白下調(diào)的更為明顯。這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步表明相比于EGF修飾的PAMAMG5/GCSsiRNA復(fù)合物，尼妥珠單抗h-R3修飾后復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率更高，進(jìn)入耐藥腫瘤細(xì)胞后沉默效果更好。