一種制備可降解載藥涂層支架的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備可降解載藥涂層支架的方法，具體方法為：第一步、預(yù)處理；第二步、將第一步中制備的凍干物溶于三羥甲基氨基甲烷緩沖液中；第三步、鋼片的包被；第四步、包被金黃色葡萄球菌A蛋白；第五步、進(jìn)行封閉，本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供的可降解載藥涂層支架制備方法解決了目前應(yīng)用的藥物涂層支架中存在的諸多問題，采用本發(fā)明提供的制備方法所制取的藥物涂層耐沖刷、涂層均勻、穩(wěn)定、體外捕獲內(nèi)皮組細(xì)胞能力強(qiáng)，可以達(dá)到很好的抑制血栓形成及降低再狹窄的目的，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】一種制備可降解載藥涂層支架的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種制備支架的方法，特別涉及一種制備可降解載藥涂層支架的方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前，心血管病已經(jīng)成為威脅人類生命的最主要疾病之一。世界衛(wèi)生組織指出，全 球每年有約1700萬人死于心血管疾病，占全球死亡人數(shù)的三分之一，預(yù)計(jì)到2020年，這個(gè) 數(shù)字將有可能突破2000萬。心血管疾病死亡病例中有80%分布在低中等收入國(guó)家。一項(xiàng) 關(guān)于我國(guó)人口死亡原因的調(diào)查分析資料顯示，近年國(guó)人死亡人員中，心腦血管疾病導(dǎo)致死 亡的占40%，而且這個(gè)比例在呈年輕化、上升的趨勢(shì)。在心血管疾病中對(duì)人類最大的病種就 是心肌梗塞，已成為我國(guó)人口的第一死因，成為危害國(guó)人健康的第一殺手，給社會(huì)和家庭造 成巨大負(fù)擔(dān)。
[0003] 自1985年P(guān)almaz等首次在外周動(dòng)脈血管中使用氣囊支架后，支架置入術(shù)成為治 療心血管病的重要途徑之一。然而支架置入術(shù)后內(nèi)膜的過度增生會(huì)導(dǎo)致再狹窄的發(fā)生，單 純裸支架再狹窄的發(fā)生率可達(dá)10-30%，故支架置入術(shù)后再狹窄一直是心血管病治療研究 中重中之重。
[0004] 為了防止內(nèi)皮過渡增生降低支架內(nèi)再狹窄發(fā)生率，人們發(fā)明了藥物涂層支架 (Drug-Eluting Stent,DES)。涂層材料經(jīng)過選擇，具有良好的生物相容性，并且含有抗增生 的藥物，防止平滑肌細(xì)胞過度增生。國(guó)際上通常采用的抑制血管平滑肌細(xì)胞增生，降低再狹 窄的藥物是雷帕霉素和紫杉醇，但由于這些藥物與支架材料表面鍵合弱，涂層很容易被血 流快速剝離，隨著血液的沖刷，藥物在1-2周內(nèi)就降低到很低的濃度，1月后基本上沒有藥 物作用，難以達(dá)到長(zhǎng)期抑制平滑肌細(xì)胞增生，避免血管內(nèi)膜過渡增厚導(dǎo)致的血管再狹窄。
[0005] 綜合來看，目前應(yīng)用的藥物涂層支架的不足主要包括：
[0006] 1)內(nèi)皮完整是預(yù)防血栓的最重要的屏障。DES的涂層藥物在抑制平滑肌細(xì)胞過度 增生的同時(shí)，也抑制正常內(nèi)皮細(xì)胞再生，導(dǎo)致支架植入后血管內(nèi)皮化過程延遲，增加了遲發(fā) 性血栓形成風(fēng)險(xiǎn)；
[0007] 2)目前支架涂層藥物多使用單一藥物，而再狹窄是由多種發(fā)病機(jī)制參與作用， 支架上所涂藥物不可能在各個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，從而限制其抗支架內(nèi)再狹窄（Instent Restenosis，ISR)的作用；
[0008] 3)由于目前常用DES的載體不能降解，在某種程度上也可能會(huì)增加病變血管局部 慢性炎癥的發(fā)生，另外藥物發(fā)揮作用的時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)組織的滲透作用越長(zhǎng)，也是造成內(nèi)皮化 延遲的可能因素之一
[0009] 4)DES的涂層與支架材料表面鍵合弱，涂層很容易被血流快速剝離，難以達(dá)到長(zhǎng)期 抑制平滑肌細(xì)胞增生，避免血管內(nèi)膜過渡增厚導(dǎo)致的血管再狹窄。
[0010] 綜上所述，臨床上亟待開發(fā)一種新的制備方法用以制備出新型的能降低血栓形 成、防止再狹窄、可降解、耐沖刷涂層支架以解決目前治療面臨的困難。


【發(fā)明內(nèi)容】
toon] 本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有的臨床所用血管支架不能有效地降低血栓形成、不 能有效地防止血管再狹窄的發(fā)生等諸多問題而提供的一種制備可降解載藥涂層支架的方 法。
[0012] 本發(fā)明提供的制備可降解載藥涂層支架的方法，其具體方法如下所述：
[0013] 第一步、預(yù)處理：先用拋光機(jī)將鋼片拋光至鏡面，然后將拋光后的鋼片用去污粉清 洗，之后分別用丙酮、乙醇超聲清洗，最后用去離子水超聲清洗；然后制備多巴胺和肝素縮 合形成的化合物的凍干物；鋼片及凍干物紫外線滅菌；三羥甲基氨基甲烷緩沖液的配置： Tris堿0. 121加80ml Milli-Q水溶解，用1M鹽酸調(diào)節(jié)PH值為8. 5,定容至100ml，驗(yàn)證PH 值，滅菌，肝素鈉溶液配置：3mg/ml肝素鈉的Milli-Q水溶液100ml，用0. 1M NaOH及1%醋 酸調(diào)節(jié)pH值為4. 2,配好的肝素鈉溶液，滅菌；
[0014] 第二步、將第一步中制備的凍干物溶于三羥甲基氨基甲烷緩沖液中，配好的溶液 中保證多巴胺濃度為4mg/ml ;取48孔板，每孔中放置配置好的溶液，用鑷子每孔放1枚鋼 片，結(jié)束鋼片上多巴胺的聚合反應(yīng)：將鋼片自溶液中取出，置于新的48孔板中，Milli-Q水 清洗，清洗后氮?dú)獯蹈桑?br> [0015] 第三步、鋼片的包被：將第二步中制得的鋼片進(jìn)行血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和肝素的包 被，包被層數(shù)為1-10層；具體包被過程為：將血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子溶于pH值為7. 4的PBS緩 沖液中，配置成l〇〇ug/ml溶液，將制得的鋼片浸入血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子溶液中，4°C條件下反 應(yīng)，12小時(shí)后取出鋼片，去離子水沖洗，氮?dú)獯蹈?，制得的鋼片表面生成有血管?nèi)皮生長(zhǎng)因 子層，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的等電點(diǎn)為8. 5,通過調(diào)節(jié)pH值能夠使血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子溶液和 肝素鈉溶液分別帶正電、負(fù)電，然后一層肝素一層血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子再一層肝素這樣層層 靜電吸附直至所需層數(shù)；
[0016] 第四步、包被金黃色葡萄球菌A蛋白：將金黃色葡萄球菌A蛋白中加入PBS，配置 成lmg/ml溶液，再進(jìn)行稀釋，最終配置成0. lmg/ml金黃色葡萄球菌A蛋白溶液，將上步中 獲得的支架置于金黃色葡萄球菌A蛋白溶液中，4°C冰箱中靜置24小時(shí)，將鋼片取出用pH 值為7. 4的PBS溶液清洗3次，氮?dú)獯蹈桑?br> [0017] 第五步、進(jìn)行封閉：將上步中被金黃色葡萄球菌A蛋白包被后的支架浸入10mg/ ml牛血清白蛋白中，4°C下靜置封閉，取出用PBS清洗，氮?dú)獯蹈?，然后配置?4抗體溶液， 將封閉后的支架浸入CD34抗體溶液中，4°C條件下反應(yīng)12小時(shí)，取出用PBS清洗，常溫干 燥；進(jìn)一步，進(jìn)行CD34抗體的突光標(biāo)記和表征：包被抗體CD34的支架中取一枚進(jìn)行突光標(biāo) 記，之前用兔血清封閉，異硫氰酸熒光素標(biāo)記鼠抗兔IgG抗體配置成混合溶液，將包被抗體 ⑶34的支架與標(biāo)記物37°C條件下共浴1小時(shí)，常溫下過夜干燥，固定于載玻片上，送檢免疫 熒光。
[0018] 本發(fā)明的有益效果：
[0019] 本發(fā)明提供的可降解載藥涂層支架制備方法解決了目前應(yīng)用的藥物涂層支架中 存在的諸多問題，采用本發(fā)明提供的制備方法所制取的藥物涂層耐沖刷、涂層均勻、穩(wěn)定、 體外捕獲內(nèi)皮組細(xì)胞能力強(qiáng)，可以達(dá)到很好的抑制血栓形成及降低再狹窄的目的，具有重 要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1為涂層支架上的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和⑶34抗體含量示意圖。
[0021] 圖2為酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)涂層支架材料上的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的含量示意圖。
[0022] 圖3為酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)涂層支架材料上的CD34抗體的含量示意圖。
[0023] 圖4為內(nèi)皮祖細(xì)胞分離培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)示意圖。
[0024] 圖5為流式細(xì)胞儀檢測(cè)的內(nèi)皮祖細(xì)胞空白對(duì)照示意圖。
[0025] 圖6為流式細(xì)胞儀檢測(cè)的內(nèi)皮祖細(xì)胞CD133的陽性率示意圖。
[0026] 圖7為流式細(xì)胞儀檢測(cè)的內(nèi)皮祖細(xì)胞含激酶插入?yún)^(qū)受體的陽性率示意圖。
[0027] 圖8為流式細(xì)胞儀檢測(cè)的內(nèi)皮祖細(xì)胞CD34的陽性率示意圖。
[0028] 圖9為噻唑藍(lán)法檢測(cè)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0029] 本發(fā)明提供的制備可降解載藥涂層支架的方法，其具體方法如下所述：
[0030] 第一步、預(yù)處理：先用拋光機(jī)將鋼片拋光至鏡面，然后將拋光后的鋼片用去污粉清 洗，之后分別用丙酮、乙醇超聲清洗，最后用去離子水超聲清洗；然后制備多巴胺和肝素縮 合形成的化合物的凍干物；鋼片及凍干物紫外線滅菌；三羥甲基氨基甲烷緩沖液的配置： Tris堿0. 121加80ml Milli-Q水溶解，用1M鹽酸調(diào)節(jié)PH值為8. 5,定容至100ml，驗(yàn)證PH 值，滅菌，肝素鈉溶液配置：3mg/ml肝素鈉的Milli-Q水溶液100ml，用0. 1M NaOH及1%醋 酸調(diào)節(jié)pH值為4. 2,配好的肝素鈉溶液，滅菌；
[0031] 第二步、將第一步中制備的凍干物溶于三羥甲基氨基甲烷緩沖液中，配好的溶液 中保證多巴胺濃度為4mg/ml ;取48孔板，每孔中放置配置好的溶液，用鑷子每孔放1枚鋼 片，結(jié)束鋼片上多巴胺的聚合反應(yīng)：將鋼片自溶液中取出，置于新的48孔板中，Milli-Q水 清洗，清洗后氮?dú)獯蹈桑?br> [0032] 第三步、鋼片的包被：將第二步中制得的鋼片進(jìn)行血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和肝素的包 被，包被層數(shù)為1-10層；具體包被過程為：將血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子溶于pH值為7. 4的PBS緩 沖液中，配置成l〇〇ug/ml溶液，將制得的鋼片浸入血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子溶液中，4°C條件下反 應(yīng)，12小時(shí)后取出鋼片，去離子水沖洗，氮?dú)獯蹈桑频玫匿撈砻嫔捎醒軆?nèi)皮生長(zhǎng)因 子層，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的等電點(diǎn)為8. 5,通過調(diào)節(jié)pH值能夠使血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子溶液和 肝素鈉溶液分別帶正電、負(fù)電，然后一層肝素一層血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子再一層肝素這樣層層 靜電吸附直至所需層數(shù)；
[0033] 第四步、包被金黃色葡萄球菌A蛋白：將金黃色葡萄球菌A蛋白中加入PBS，配置 成lmg/ml溶液，再進(jìn)行稀釋，最終配置成0. lmg/ml金黃色葡萄球菌A蛋白溶液，將上步中 獲得的支架置于金黃色葡萄球菌A蛋白溶液中，4°C冰箱中靜置24小時(shí)，將鋼片取出用pH 值為7. 4的PBS溶液清洗3次，氮?dú)獯蹈桑?br> [0034] 第五步、進(jìn)行封閉：將上步中被金黃色葡萄球菌A蛋白包被后的支架浸入10mg/ ml牛血清白蛋白中，4°C下靜置封閉，取出用PBS清洗，氮?dú)獯蹈?，然后配置?4抗體溶液， 將封閉后的支架浸入CD34抗體溶液中，4°C條件下反應(yīng)12小時(shí)，取出用PBS清洗，常溫干 燥；進(jìn)一步，進(jìn)行CD34抗體的突光標(biāo)記和表征：包被抗體CD34的支架中取一枚進(jìn)行突光標(biāo) 記，之前用兔血清封閉，異硫氰酸熒光素標(biāo)記鼠抗兔IgG抗體配置成混合溶液，將包被抗體 ⑶34的支架與標(biāo)記物37°C條件下共浴1小時(shí)，常溫下過夜干燥，固定于載玻片上，送檢免疫 熒光。
[0035] 具體做法如下：
[0036] 材料準(zhǔn)備：鋼板規(guī)格-316L不銹鋼，直徑6mm圓片，厚度1mm，剛好能置于96孔板 中；Tris堿、Milli-Q水、4M鹽酸（即鹽酸濃度為4mol/L)、去污粉、丙酮、乙醇、去離子水、凍 干物、配置好的三羥甲基氨基甲烷緩沖液、已處理好的鋼片（18片）、滅菌的Milli-Q水、肝 素鈉、0.說似0!1、1%醋酸、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、？85緩沖液溶液（?!1值為7.4)、金黃色葡萄 球菌A蛋白、牛血清白蛋白、CD34抗體，制備好的凍干物成分為多巴胺中氨基和肝素中 羧基縮合反應(yīng)后形成的化合物。
[0037] 儀器準(zhǔn)備：電子天平、100ml容量瓶1個(gè)、量筒100ml 1個(gè)、加樣槍及槍頭、PH計(jì)、PH 試紙（堿性）、PH試紙（酸性）、拋光機(jī)、超聲清洗機(jī)、60°C烘箱、紫外滅菌燈、超凈工作臺(tái)、48 孔板、無菌鑷子、真空低溫?zé)o菌保存裝置、燒杯（200ml)、燒杯（50ml)、加樣槍（5ml、200ul)、 EP管。
[0038] 制作方法如下：
[0039] 溶液配制：配置三羥甲基氨基甲烷緩沖液（10mM，pH8. 5) :Tris堿0. 121g加80ml Milli-Q水溶解，用1M鹽酸調(diào)節(jié)PH為8. 5,定容至100ml，驗(yàn)證PH，滅菌。多巴胺中氨基和 肝素中羧基縮合反應(yīng)后形成的化合物，將化合物制備成凍干物備用。
[0040] 鋼片的拋光：用拋光機(jī)拋光至鏡面。
[0041] 拋光后的鋼片處理：將拋光后的鋼片用去污粉清洗，之后分別用丙酮、乙醇超聲清 洗，分別超聲15min。最后去離子水超聲清洗3次，每次15 min。清洗后60°C烘箱中干燥 24h。
[0042] 鋼片及凍干物紫外線滅菌。
[0043] 鋼片上多巴胺聚合：在超凈工作臺(tái)中操作。將凍干物溶于三羥甲基氨基甲烷緩沖 液中，配好的溶液中保證多巴胺濃度為4mg/ml ;取48孔板，將24個(gè)孔每孔中放置0. 25ml配 置好的溶液，用鑷子每孔放1枚鋼片。（1片鋼片約需〇. 25ml溶液，共需聚合3組鋼片，每組 6片，共需4. 5ml溶液。制備的凍干物中共含20mg多巴胺，可配置5ml溶液。）
[0044] 結(jié)束鋼片上多巴胺的聚合反應(yīng)：將24片鋼片自溶液中取出，置于新的48孔板中， Milli-Q水清洗3遍，每遍5min，清洗后氮?dú)獯蹈伞Ｈ∑渲?枚鋼片，記作肝素-多巴胺組， 真空低溫?zé)o菌保存。余16片鋼片繼續(xù)下述自組裝過程。
[0045] 進(jìn)行血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和肝素的層層自組裝：配置3mg/ml肝素鈉的Mi 11 i-Q水溶 液l〇〇ml，用0. 1M NaOH及1%醋酸調(diào)節(jié)pH為4. 2,配好的肝素鈉溶液，滅菌。配置lug/ml 的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的PBS緩沖液溶液（pH為7. 4) 20ml，滅菌。在48孔板的16個(gè)孔中各 置入0. 3ml肝素鈉溶液，將上述吸附有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的鋼板各置入孔中，室溫下靜置 30min。將鋼片取出，置入48孔板新的孔中，之后Milli-Q水沖洗3遍，每次5min，氮?dú)獯?干。在48孔板的16個(gè)孔中各置入0. 2ml血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子溶液，將上述D-Η組鋼片置于 孔中，浸入血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子溶液中，室溫下靜置30min。將鋼片取出，置入48孔板新的孔 中，之后Mi 11 i-Q水沖洗3遍，每次5min，氮?dú)獯蹈伞Ｈ∑渲?枚再次紫外線滅菌后低溫干 燥無菌保存，另8枚鋼片進(jìn)行下一步包被。
[0046] 自組裝金黃色葡萄球菌A蛋白和⑶34抗體：將總量lmg金黃色葡萄球菌A蛋白中 加入lmlPBS，配置成lmg/ml溶液，再取出100ul稀釋于900ulPBS中，最終配置成0· lmg/ml 金黃色葡萄球菌A蛋白溶液，滅菌。8枚鋼片每片需要0.25ml，共需2ml。在48孔板的8個(gè) 孔中各置入0. 25ml金黃色葡萄球菌A蛋白溶液，將最終獲得的鋼片置于孔中，室溫下靜置 30分鐘。將鋼片取出，置入48孔板新的孔中，之后Milli-Q水沖洗3遍，每次5分鐘，氮?dú)?吹干。配置l〇mg/ml牛血清白蛋白，滅菌。將上述鋼片浸入10mg/ml牛血清白蛋白中，4°C 下靜置24h封閉，取出用Milli-Q水沖洗清洗5min，氮?dú)獯蹈伞Ｅ渲?ug/ml⑶34抗體溶液， 每枚鋼片約需〇. 2ml抗體溶液，共8枚，約需1. 6ml抗體溶液，需要3. 2ug抗體。將封閉后 的鋼片浸入抗體溶液中，4°C條件下反應(yīng)12h。取出用PBS清洗5min，常溫下過夜干燥。
[0047] 進(jìn)行⑶34抗體的熒光標(biāo)記和表征：取制好的一枚鋼片進(jìn)行熒光標(biāo)記。之前用兔血 清封閉，異硫氰酸熒光素標(biāo)記鼠抗兔IgG抗體配置成混合溶液，將鋼片與標(biāo)記物37°C條件 下共浴lh，常溫下過夜干燥。固定于載玻片上，送檢免疫熒光。
[0048] 具體檢測(cè)方法如下：
[0049] 一、免疫熒光檢測(cè)涂層支架上的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和⑶34抗體含量檢測(cè)：
[0050] (一）主要設(shè)備和產(chǎn)地：
[0051] 1)激光共聚焦顯微鏡Leica公司SP5激光共聚焦顯微鏡
[0052] 2)微量移液槍德國(guó)Eppendorf公司
[0053] 3)細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別蓋玻片美國(guó)corning公司
[0054] 4)濕盒（塑料飯盒與紗布）、塑料蓋玻片或封口膜上海實(shí)生公司
[0055] (二）試劑：
[0056] 1 X PBS (Sangon 上海生工）
[0057] 牛血清蛋白（美國(guó)BD)
[0058] 洗滌緩沖液（Sangon上海生工）
[0059] 抗體：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（abeam ab46154, 1:100)
[0060] 突光二抗（abeam ab99700, 1:400)
[0061] (三）實(shí)驗(yàn)方法：
[0062] 1、用PBS清洗鋼板。
[0063] 2、用含3%牛血清蛋白的PBS在室溫封閉lh。
[0064] 3、洗滌緩沖液室溫漂洗三次，每次5 min。
[0065] 4、加入一抗（⑶34組不加一抗，直接孵育二抗）濕盒內(nèi)4°C孵育過夜（附：抗體稀 釋比例，P651:100)。
[0066] 5、用PBS在室溫漂洗三次，每次5 min。
[0067] 6、加入熒光二抗1 :400,在室溫下避光孵育lh。
[0068] 7、去除二抗。
[0069] 8、用PBS在室溫漂洗三次，每次10min。
[0070] 9、在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。
[0071] (四）實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0072] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，D_H[316不銹鋼支架-多巴胺聚合物](圖中用I表示）， 其中D-(H-V) 10 [316不銹鋼支架-多巴胺聚合物-(肝素-血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）10]組（圖 中用II表示）和D-(H-V) 10-A[316不銹鋼支架-多巴胺聚合物-(肝素-血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因 子）10_蛋白A]組（圖中用III表示）中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子包被很成功，能明顯檢測(cè)出血管 內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；D-(H-V) 10-A[316不銹鋼支架-多巴胺聚合物-(肝素-血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因 子）10-蛋白A]組中⑶34抗體包被很成功。
[0073] 二、酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)涂層支架材料上的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和CD34抗體的含 量
[0074] ( -）主要設(shè)備和產(chǎn)地
[0075] 1、80°C低溫冰箱美國(guó)Thermo Forma公司；
[0076] 2、臺(tái)式水平離心機(jī)Eppendorf，5810R德國(guó)；
[0077] 3、Nanopure超純水儀日本SANYO公司；
[0078] 4、AA-200 型電子天平美國(guó) Denver Instrumol/Lent 公司；
[0079] 5、90 - 2型磁力攪拌器上海滬西分析儀器廠
[0080] 6、低溫高速離心機(jī)ThermoForma公司
[0081] 7、酶標(biāo)儀：Biotek 公司，型號(hào)：synergy H4 Hybrid Reader
[0082] 8、微量移液槍德國(guó)Eppendorf公司
[0083] 9、燒杯、容量瓶：上海實(shí)生公司
[0084] (二）試劑和材料
[0085] 1、RIPA(完全裂解液）；Tris-HCl (三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽）：50mM，pH7. 4; NP_40(非離子去污劑）：1% ;NaCl: 150mM ;EDTA(乙二胺四乙酸二鈉）ImM ;PMSF(蛋白酶抑 制劑）ImM ;Leupeptin (亮抑肽酶）10ug/ml ;Pepstatin (抑肽素）2ug/ml ;
[0086] 2、PI3_Kinase activity ELISA Kit (磷脂酰肌醇3-激酶活動(dòng)酶聯(lián)免疫試劑盒）： 美國(guó) echelon 公司 K-1000 ;
[0087] 3、ATP (三磷酸腺苷）美國(guó)Sigma公司；
[0088] 4、TBST(洗滌緩沖液）：FW ;Tris-Base(三羥甲基氨基甲烷）20mM121. 14、2.4228g/ L ;NaCl、137 mM、58. 44、8· 0145g/L ;Tween-20(吐溫 20)0. 1% (V/V)、lml/L、PH = 7· 6。
[0089] (三）實(shí)驗(yàn)方法
[0090] 從_80°C取出處理過的細(xì)胞（一個(gè)100mm圓盤視野> 5X106細(xì)胞），酶管中加60 ul RIPA(細(xì)胞裂解液），在 4°C裂解 30min。12000rpm，4°C，離心 10min。
[0091] BCA(牛血清白蛋白）法測(cè)定蛋白濃度（測(cè)定方法詳見"Western Blot (蛋白印跡） BCA(牛血清白蛋白）法測(cè)定蛋白含量"部分），用RIPA(細(xì)胞裂解液）調(diào)整樣本蛋白濃度至 5ug/ul。測(cè)定蛋白樣本濃度與平衡（見表1)。
[0092] 表1.測(cè)定蛋白樣本濃度與平衡表格
[0093]

【權(quán)利要求】
1. 一種制備可降解載藥涂層支架的方法，其特征在于：其具體方法如下所述： 第一步、預(yù)處理：先用拋光機(jī)將鋼片拋光至鏡面，然后將拋光后的鋼片用去污粉清洗， 之后分別用丙酮、乙醇超聲清洗，最后用去離子水超聲清洗；然后制備多巴胺和肝素縮合形 成的化合物的凍干物；鋼片及凍干物紫外線滅菌；三羥甲基氨基甲烷緩沖液的配置：Tris 堿0. 121加80ml Milli-Q水溶解，用1M鹽酸調(diào)節(jié)PH值為8. 5,定容至100ml，驗(yàn)證PH值， 滅菌，肝素鈉溶液配置：3mg/ml肝素鈉的Milli-Q水溶液100ml，用0. 1M NaOH及1%醋酸 調(diào)節(jié)pH值為4. 2,配好的肝素鈉溶液，滅菌； 第二步、將第一步中制備的凍干物溶于三羥甲基氨基甲烷緩沖液中，配好的溶液中保 證多巴胺濃度為4mg/ml ;取48孔板，每孔中放置配置好的溶液，用鑷子每孔放1枚鋼片，結(jié) 束鋼片上多巴胺的聚合反應(yīng)：將鋼片自溶液中取出，置于新的48孔板中，Milli-Q水清洗， 清洗后氮?dú)獯蹈桑? 第三步、鋼片的包被：將第二步中制得的鋼片進(jìn)行血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和肝素的包被，包 被層數(shù)為1-10層；具體包被過程為：將血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子溶于pH值為7. 4的PBS緩沖液 中，配置成l〇〇ug/ml溶液，將制得的鋼片浸入血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子溶液中，4°C條件下反應(yīng)， 12小時(shí)后取出鋼片，去離子水沖洗，氮?dú)獯蹈桑频玫匿撈砻嫔捎醒軆?nèi)皮生長(zhǎng)因子 層，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的等電點(diǎn)為8. 5,通過調(diào)節(jié)pH值能夠使血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子溶液和肝 素鈉溶液分別帶正電、負(fù)電，然后一層肝素一層血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子再一層肝素這樣層層靜 電吸附直至所需層數(shù)； 第四步、包被金黃色葡萄球菌A蛋白：將金黃色葡萄球菌A蛋白中加入PBS，配置成 lmg/ml溶液，再進(jìn)行稀釋，最終配置成0. lmg/ml金黃色葡萄球菌A蛋白溶液，將上步中獲得 的支架置于金黃色葡萄球菌A蛋白溶液中，4°C冰箱中靜置24小時(shí)，將鋼片取出用pH值為 7. 4的PBS溶液清洗3次，氮?dú)獯蹈桑? 第五步、進(jìn)行封閉：將上步中被金黃色葡萄球菌A蛋白包被后的支架浸入10mg/ml牛血 清白蛋白中，4°C下靜置封閉，取出用PBS清洗，氮?dú)獯蹈?，然后配置?4抗體溶液，將封閉 后的支架浸入CD34抗體溶液中，4°C條件下反應(yīng)12小時(shí)，取出用PBS清洗，常溫干燥；進(jìn)一 步，進(jìn)行CD34抗體的熒光標(biāo)記和表征：包被抗體CD34的支架中取一枚進(jìn)行熒光標(biāo)記，之前 用兔血清封閉，異硫氰酸熒光素標(biāo)記鼠抗兔IgG抗體配置成混合溶液，將包被抗體CD34的 支架與標(biāo)記物37°C條件下共浴1小時(shí)，常溫下過夜干燥，固定于載玻片上，送檢免疫熒光。
【文檔編號(hào)】A61L31/10GK104083805SQ201410355973
【公開日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年7月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月24日
【發(fā)明者】宋春莉, 李倩, 劉斌, 刁鴻英, 趙麗艷, 張基昌, 于雲(yún)鵬, 史永峰, 王冠, 王金鵬 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)