一種酶解卵白蛋白的方法及酶解產(chǎn)物的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酶解卵白蛋白的方法，包括如下步驟，(1)將卵白蛋白、木瓜肽酶、L-半胱氨酸、蒸餾水均勻混合，進(jìn)行酶解反應(yīng),木瓜肽酶的氨基酸序列是如SEQ ID NO:1所示的序列；(2)對(duì)(1)步酶解后的混合物加熱，過濾去除未酶解的卵白蛋白殘?jiān)?3)對(duì)步驟(2)處理后的酶解產(chǎn)物進(jìn)行滅菌即可。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，木瓜乳汁中簡(jiǎn)便、低成本、高純度地提取出了木瓜肽酶，并且木瓜肽酶是一種天然生物活性物質(zhì)，采用該肽酶對(duì)卵白蛋白進(jìn)行酶解，能夠得到分子量約為500-1000的小分子寡肽和氨基酸，酶解率高，并且得到的小分子寡肽和氨基酸可以作為制備治療肝病的藥物使用，也能夠進(jìn)一步促進(jìn)機(jī)體和皮膚的吸收。
【專利說明】一種酶解卵白蛋白的方法及酶解產(chǎn)物的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物酶解的【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是一種酶解卵白蛋白的方法及酶解產(chǎn)物的 應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 卵白蛋白是卵白中屬于白蛋白部分的蛋白質(zhì)。通常指的是其主要成分（約占卵白 的65% )的卵清蛋白（Al bumi η)。除此外卵白中還存在著少量（約14% )的稱為伴清蛋 白（Conal bumin)的白蛋白，但是卵白蛋白在應(yīng)用時(shí)不易直接被機(jī)體和皮膚吸收，必須將它 水解成氨基酸和多肽才能被機(jī)體吸收。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中有很多方法將卵白蛋白酶解，例如采用酸或堿的方法來水解卵白蛋 白，但是現(xiàn)有的這種方法往往會(huì)發(fā)生水解后氨基酸被全部或部分破壞，例如：用酸水解卵白 蛋白時(shí)常造成絲氨酸、酪氨酸、蘇氨酸的部分破壞，色氨酸全部破壞，當(dāng)用堿水解時(shí)可引起 精氨酸及胱氨酸的部分及全部破壞，影響氨基酸的利用，無論用酸水解或堿水解都增加了 分離純化工作的難度并造成環(huán)境污染，本公司在93年時(shí)開發(fā)出了一種比較先進(jìn)的酶解方 法，具體見專利申請(qǐng)?zhí)枮?3112571. 5,發(fā)明名稱為"一種酶解保健液-酶解卵白蛋白溶液" 的專利文件，但是，該專利公開的方法雖然解決的酸、堿酶解的缺陷，可是仍達(dá)不到酶解出 最佳的小分子肽，為了更精確的獲得小分子多肽，最大限度地使機(jī)體吸收，擴(kuò)大受用人群， 所以還需要開發(fā)出新的酶解方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中酸、堿方法破壞卵白蛋白中氨基酸的技術(shù)缺陷、以及采用木 瓜蛋白酶仍得不到最佳的小分子多肽的問題，本發(fā)明公開了一種新的酶解卵白蛋白的方法 及酶解產(chǎn)物的應(yīng)用，進(jìn)一步改進(jìn)了酶解方法，得到最佳的小分子多肽，并且發(fā)現(xiàn)了酶解產(chǎn) 物新的用途。
[0005] 實(shí)現(xiàn)上述目的，所采用的技術(shù)方案為，本發(fā)明公開的一種酶解卵白蛋白的方法，包 括如下步驟，（1)將卵白蛋白、木瓜肽酶、L-半胱氨酸、蒸餾水均勻混合，進(jìn)行酶解反應(yīng)，木 瓜肽酶的氨基酸序列是如SEQ ID NO: 1所示的序列；
[0006] (2)對(duì)⑴步酶解后的混合物加熱，去除未酶解的卵白蛋白殘?jiān)?br> [0007] (3)對(duì)步驟（2)處理后的酶解產(chǎn)物進(jìn)行滅菌即可。木瓜乳汁中存在多種酶，主要含 有四種半胱氨酸酶：木瓜蛋白酶、木瓜肽酶、木瓜凝乳蛋白酶A和B。除此之外，還含有溶 菌酶，II型幾丁質(zhì)酶和脂肪酶等，各種酶的氨基酸序列不同，其生化性質(zhì)也有很大差別。本 發(fā)明經(jīng)過試驗(yàn)，最終采用木瓜肽酶將卵白蛋白酶解，將原先分子量約為37000-49000的卵 白蛋白，酶解后最大限度的得到小分子的寡肽和氨基酸，不僅解決了用酸、堿酶解對(duì)氨基酸 的破壞問題，與現(xiàn)有技術(shù)中采用木瓜蛋白酶對(duì)卵白蛋白進(jìn)行酶解后對(duì)比，木瓜蛋白酶酶解 產(chǎn)物中最小的分子量的肽為八肽物質(zhì)，其分子量約為960左右，另外含有的肽分子量約為 6X 104,本發(fā)明酶解產(chǎn)物中含有分子量約為500-1000的小分子寡肽和氨基酸酶解產(chǎn)物，8肽 以下含量大于50 %，其中5肽含量接近20 %，由此可以看出，本發(fā)明酶解方法能夠得到5肽 的物質(zhì)，并且最小分子量為500，所以采用該酶解產(chǎn)物可以進(jìn)一步的促進(jìn)人體皮膚或腸胃的 吸收，并且經(jīng)該方法得到的酶解產(chǎn)物還被驗(yàn)證了有新的用途。
[0008] 進(jìn)一步的，步驟（1)提取木瓜肽酶的方法為：①將木瓜粉溶解于0. IM醋酸-醋酸 鈉緩沖溶液中；
[0009] ②向①步混合液中加入硫酸銨，使混合液的飽和度達(dá)到0. 45,放置12_16h后抽 濾，將上清液體用質(zhì)量濃度〇. IMNaCl溶液透析；
[0010] ③將②步得到的透析液上柱CM S印harose，用質(zhì)量濃度為0. 05 - I. OMNaCl進(jìn)行 梯度洗脫，收集最后流出的液體；
[0011] ④向③步得到的液體加入硫酸銨直至溶液飽和度達(dá)到0.85,放置12-16h后抽 濾，將得到的沉淀用質(zhì)量濃度0.05M NaCl溶液透析。將透析液冷凍干燥即可得到木瓜肽酶 粉末。
[0012] 木瓜肽酶的分離純化不易操作，本發(fā)明選擇該方法將木瓜肽酶提取出來，提取的 純度最高，操作方法最為簡(jiǎn)便。
[0013] 優(yōu)選的，步驟⑵中卵白蛋白、木瓜肽酶、L-半胱氨酸、蒸餾水的質(zhì)量比為 100:5-10:1-2. 5:2000。所選擇的質(zhì)量配比在成本最低的條件下，酶解的最為充分。
[0014] 優(yōu)選的，步驟（2)中酶解溫度為45-65°C，PH為6-7,酶解時(shí)間為12-24h，該參數(shù)條 件正好可以使卵蛋白充分酶解為小分子多肽和氨基酸。
[0015] 進(jìn)一步的，步驟（3)去除未酶解的卵白蛋白殘?jiān)木唧w方法為，酶解后將溫度加 熱至90-KKTC變性5-10分鐘，使蛋白酶失活，將酶解產(chǎn)物過濾，得到上清液。
[0016] 進(jìn)一步的，步驟（4)滅菌的具體方法為，向經(jīng)步驟（3)處理后的酶解產(chǎn)物中加入 質(zhì)量濃度為〇. 02-0. 05%的抗氧化劑，攪拌均勻后，在溫度為121-125°C條件下進(jìn)行濕熱滅 菌，所采用的抗氧化劑為維生素 C與焦亞硫酸鈉按照質(zhì)量配比10:0. 5-1的混合物。
[0017] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，經(jīng)該酶解方法得到的卵白蛋白酶解產(chǎn)物，能夠作為作為制備治療肝 硬化、肝炎、糖尿病藥物的應(yīng)用。采用一種天然活性物質(zhì)，使原來分子量較大的、不易被人體 直接吸收的卵白蛋白，水解成一種含有易被人體吸收的小分子寡肽和氨基酸的酶解產(chǎn)物， 得到的酶解產(chǎn)物無毒副作用，并且經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該酶解產(chǎn)物助于肝合成白蛋白，還因?yàn)榈玫?的分子量約為500-1000的小分子多肽可修復(fù)組織肝細(xì)胞，所以對(duì)肝硬化、肝炎、以及對(duì)化 療后造成的免疫功能減退及白細(xì)胞下降具有修復(fù)及提高的作用；糖尿病患者有糖、脂肪及 蛋白質(zhì)代謝紊亂，特別是蛋白質(zhì)分解代謝增加，多數(shù)有低白蛋白血癥，容易出現(xiàn)感染，本發(fā) 明得到的酶解產(chǎn)物通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的分解代謝，從而將脂肪、蛋白質(zhì)代謝的紊亂調(diào)節(jié)正常 的代謝，以此作為制備治療糖尿病的藥物，對(duì)治療糖尿病有很好的效果。
[0018] 綜上，本發(fā)明的有益效果是，從木瓜乳汁中簡(jiǎn)便、低成本、高純度地提取出了木瓜 肽酶，并且木瓜肽酶是一種天然生物活性物質(zhì)，采用該肽酶對(duì)卵白蛋白進(jìn)行酶解，能夠得到 分子量約為500-1000的小分子寡肽和氨基酸，酶解率高，并且得到的小分子寡肽和氨基酸 可以作為制備治療肝病的藥物使用，也能夠進(jìn)一步促進(jìn)機(jī)體和皮膚的吸收。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本
【發(fā)明內(nèi)容】
作出進(jìn)一步的說明。在沒有特殊說明下，操作 方法都是采用的本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法。
[0020] 實(shí)施例一：⑴將卵白蛋白、木瓜肽酶、L-半胱氨酸、蒸餾水均勻混合，進(jìn)行酶解反 應(yīng)，木瓜肽酶的氨基酸序列是如SEQ ID NO: 1所示的序列；
[0021] (2)對(duì)（1)步酶解后的混合物加熱，過濾去除未酶解的卵白蛋白殘?jiān)?br> [0022] (3)對(duì)步驟（2)處理后的酶解產(chǎn)物進(jìn)行滅菌即可。
[0023] 以下通過幾種酶解的試驗(yàn)對(duì)比，對(duì)本發(fā)明選擇木瓜肽酶作為酶解的溶媒進(jìn)行說 明，對(duì)比效果如下：
[0024]

【權(quán)利要求】
1. 一種酶解卵白蛋白的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟，（1)將卵白蛋白、木 瓜肽酶、L-半胱氨酸、蒸餾水均勻混合，進(jìn)行酶解反應(yīng)，木瓜肽酶的氨基酸序列是如SEQ ID NO: 1所示的序列； (2) 對(duì)（1)步酶解后的混合物加熱，過濾去除未酶解的卵白蛋白殘?jiān)? (3) 對(duì)步驟（2)處理后的酶解產(chǎn)物進(jìn)行滅菌即可。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述酶解卵白蛋白的方法，其特征在于，步驟（1)提取木瓜肽酶的方 法為：①將木瓜粉溶解于〇. 1M醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中； ② 向①步混合液中加入硫酸銨，使混合液的飽和度達(dá)到〇. 45,放置12-16h后抽濾，將 上清液體用質(zhì)量濃度〇. lMNaCl溶液透析； ③ 將②步得到的透析液上柱CM-S印harose，然后用質(zhì)量濃度為0. 05 - 1. 0M NaCl溶液 進(jìn)行梯度洗脫，收集最后流出的液體； ④ 向③步得到的液體加入硫酸銨直至溶液飽和度達(dá)到〇. 85,放置12-16h后抽濾，將得 到的沉淀用質(zhì)量濃度0. 05M NaCl溶液透析；將透析液冷凍干燥即可得到木瓜肽酶粉末。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶解卵白蛋白的方法，其特征在于，步驟（2)中卵白蛋白、木 瓜肽酶、L-半胱氨酸、蒸餾水的質(zhì)量比為100:5-10:1-2. 5:2000。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述酶解卵白蛋白的方法，其特征在于，步驟（2)中酶解溫度為 45-65°C，酶解PH為6-7,酶解時(shí)間為12-24h。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶解卵白蛋白的方法，其特征在于，步驟（3)去除未酶解的 卵白蛋白殘?jiān)木唧w方法為，酶解后將溫度加熱至90-100°C變性5-10分鐘，將酶解產(chǎn)物過 濾，得到上清液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶解卵白蛋白的方法，其特征在于，步驟（4)滅菌的具體方法 為，向經(jīng)步驟（3)處理后的酶解產(chǎn)物中加入質(zhì)量濃度為0.02-0. 05%的抗氧化劑，攪拌均勻 后，在溫度為121_125°C條件下進(jìn)行濕熱滅菌，所采用的抗氧化劑為維生素 C與焦亞硫酸鈉 按照質(zhì)量配比10:0. 5-1的混合物。
7. 權(quán)利要求1所述方法得到的酶解產(chǎn)物的應(yīng)用，其特征在于，將該酶解產(chǎn)物作為制備 治療肝硬化、肝炎、糖尿病藥物的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P1/16GK104480175SQ201410350561
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年7月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月22日
【發(fā)明者】叢峰松, 王定恩, 李朝陽 申請(qǐng)人:上海榮神生物化學(xué)有限公司