基于微陣列檢測(cè)芯片的農(nóng)獸藥多殘留的檢測(cè)方法
【專利摘要】基于微陣列檢測(cè)芯片的農(nóng)獸藥多殘留的檢測(cè)方法。本發(fā)明是以小分子的農(nóng)獸藥半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)制備成免疫抗原，用免疫抗原免疫小鼠制備得到相應(yīng)的農(nóng)獸藥單克隆抗體，捕獲單抗探針用生物芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣到瓊脂糖修飾的玻片固相載體上，制備成多重復(fù)的“捕獲單抗探針”微陣列。將農(nóng)獸藥半抗原與卵清白蛋白偶聯(lián)制備成“半抗原-OVA”偶聯(lián)體，然后用熒光分子Cy3標(biāo)記。將待檢樣品液與“標(biāo)記檢測(cè)抗原”按一定濃度混合后，與芯片孵育，樣品中的待測(cè)抗原和相應(yīng)“標(biāo)記檢測(cè)抗原”與固定在芯片上的相應(yīng)的“捕獲單抗探針”直接競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，在一定的條件下洗脫。用生物芯片掃描儀檢測(cè)結(jié)果。該方法能同時(shí)檢測(cè)農(nóng)副產(chǎn)品樣品中多種農(nóng)獸藥殘留，適用于種植、養(yǎng)殖生產(chǎn)中藥物殘留高通量、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)。
【專利說明】基于微陣列檢測(cè)芯片的農(nóng)獸藥多殘留的檢測(cè)方法
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明是食品安全領(lǐng)域中制備農(nóng)獸藥多殘留檢測(cè)微陣列芯片的方法。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]農(nóng)、獸藥是目前世界各國(guó)防治農(nóng)作物病蟲害和養(yǎng)殖業(yè)病害的有效手段。大量化學(xué)農(nóng)、獸藥，特別是高毒、高殘留農(nóng)獸藥的使用，成為食品安全和危害人們健康的主要“殺手”。
[0005]目前，主要使用的化學(xué)農(nóng)藥按其功能不同，主要分為殺蟲劑(Insecticide)、除草劑(Herbicide)和殺菌劑(Fungicide)三大類。依據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，可分為有機(jī)氯類、有機(jī)磷類、擬除蟲菊脂類、氨基甲酸脂類和無機(jī)農(nóng)藥等多種類型。這些化學(xué)農(nóng)藥的共同特點(diǎn)是:①有毒性，且靶向性差；②殘留性，一般分為高殘留、中殘留和低殘留等；③遷移性和累積性，可通過空氣、土壤或地下水發(fā)生遷移，甚至在生物體內(nèi)累積。有機(jī)磷類殺蟲劑成為目前使用量最大的農(nóng)藥之一，多屬于高效農(nóng)藥。目前，有機(jī)磷農(nóng)藥包括甲拌磷、乙拌磷、內(nèi)吸磷、對(duì)硫磷、甲胺磷、乙酰甲胺磷、殺螟硫磷、特普、敵百蟲、樂果、馬拉硫磷、甲基對(duì)硫磷、二甲硫吸磷、敵敵畏、甲基內(nèi)吸磷、氧化樂果、久效磷等。有機(jī)氯農(nóng)藥有滴滴涕、六六六、林丹、甲氧、高殘毒DDT、硫丹。常用的擬除蟲菊脂類農(nóng)藥有溴氰菊脂、氯氰菊脂、氯菊脂、胺菊脂、甲醚菊脂等。氨基甲酸酯類有西維因、葉蟬散、涕滅威、呋喃丹和異索威等。
[0006]獸藥殘留分為七類:抗生素類，驅(qū)腸蟲藥類，生長(zhǎng)促進(jìn)劑類，抗原蟲藥類，滅錐蟲藥類，鎮(zhèn)靜劑類和β_腎上腺素能受體阻斷劑。我國(guó)雖已制定“動(dòng)物性食品中獸藥殘留最高限量”標(biāo)準(zhǔn)，但尚未得到有效實(shí)施。據(jù)估計(jì)，濫用和超標(biāo)使用獸藥尤其是抗菌藥物的狀況十分嚴(yán)重。
[0007]農(nóng)、獸藥對(duì)人體的危害不僅表現(xiàn)在干擾人體化學(xué)信息的傳遞，破壞身體的酶，而且它阻礙器官發(fā)揮正常的生理功能，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能失調(diào)。癌癥、不孕癥、內(nèi)分泌紊亂等疾病均與農(nóng)獸藥污染有關(guān)。農(nóng)獸藥殘留超標(biāo)，會(huì)直接危及人體的神經(jīng)系統(tǒng)和肝、腎等重要器官。大量進(jìn)食農(nóng)殘超標(biāo)蔬菜，會(huì)危害神經(jīng)中樞，以致痙攣而死。農(nóng)藥慢性中毒時(shí)，引起人體倦乏、頭痛、食欲不振、肝腎損害等，具有遲發(fā)性神經(jīng)毒性。殘留農(nóng)獸藥在人體內(nèi)蓄積，最終產(chǎn)生致癌、致畸、致突變作用。如雌激素、硝基呋喃類、砷制劑等都已被證明具有致癌作用，許多國(guó)家都已禁止這些藥物用于食品動(dòng)物。
[0008]近年來食品安全問題，特別是農(nóng)獸藥殘留超標(biāo)問題已越來越受到社會(huì)的關(guān)注和高度重視，農(nóng)獸藥殘留超標(biāo)造成的危害越來越大，嚴(yán)重影響了人民生活?！安嘶@子”、“肉籃子”和“米袋子”污染問題以農(nóng)獸藥殘留較為突出。在日常市場(chǎng)監(jiān)督檢查中發(fā)現(xiàn)蔬菜、水果、肉食品中農(nóng)獸藥殘留超標(biāo)問題十分廣泛和嚴(yán)重。如農(nóng)業(yè)部對(duì)我國(guó)14個(gè)經(jīng)濟(jì)較發(fā)達(dá)省會(huì)城市2110個(gè)樣品檢測(cè)，蔬菜中農(nóng)藥、重金屬和亞硝酸鹽分別超標(biāo)31.1%,23.5%U2.1%，其中尤其以有機(jī)磷農(nóng)藥殘留最為突出。食用農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全問題，嚴(yán)重影響了我國(guó)居民的生活和消費(fèi)，出現(xiàn)了部分地區(qū)居民“談藥色變”的現(xiàn)象，部分食品的社會(huì)消費(fèi)量顯著下降。
[0009]食品安全檢驗(yàn)檢測(cè)是食品安全監(jiān)管的重要手段之一，它為食品安全監(jiān)管提供重要的技術(shù)支持。隨著農(nóng)獸藥殘留超標(biāo)造成的危害越來越大，相應(yīng)的農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)也得到迅速發(fā)展。目前，用于農(nóng)獸藥殘留的檢測(cè)方法主要有(I)氣相色譜法(Ge):具有高選擇性、高分離效能、高靈敏度等特點(diǎn)，是農(nóng)藥殘留量檢測(cè)最常用的方法之一。但檢測(cè)成本高，儀器操作須專業(yè)人員，前處理要求較高，時(shí)間長(zhǎng)。(2)液相色譜法(HPLC):可用于不易氣化或受熱易分解的農(nóng)藥的檢測(cè)。(3)色質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS，HPLC-MS):可同時(shí)達(dá)到定性、定量的檢測(cè)目的，特別適合于農(nóng)藥代謝物、降解物的檢測(cè)和多殘留檢測(cè)等，不過此法需要貴重儀器且操作繁雜困難，不適合于經(jīng)常性的檢測(cè)。一般可用來做最后的確認(rèn)工作。(4)超臨界流體色譜(SFC):既有氣譜的快速、高效、靈敏的特點(diǎn)，又有能檢測(cè)對(duì)熱不穩(wěn)定和大分子化合物的液譜的特點(diǎn)，但需要昂貴的儀器且操作繁雜困難等。(5)毛細(xì)管電泳法(CE):適合于一些難于用傳統(tǒng)色譜法分離的離子化樣品的分離和分析，比HPLC有高10-1000倍的分析能力，需要貴重儀器且操作繁雜困難，不適合于經(jīng)常性的檢測(cè)。一般可用來做最后的確認(rèn)工作。
[0010]這些技術(shù)的應(yīng)用，雖然大大提高農(nóng)獸藥殘留分析的靈敏度，提高了分析效率。但這些農(nóng)獸藥殘留分析技術(shù)檢測(cè)需要貴重儀器且操作繁雜、成本高、時(shí)間長(zhǎng)等問題，難以滿足高通量、快速及在線檢測(cè)的需要，制約了其在農(nóng)獸藥快速殘毒檢測(cè)的應(yīng)用推廣，難以成為農(nóng)獸藥快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的常規(guī)方法。
[0011]控制農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)獸藥殘留量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一就是對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)獸藥殘留量及時(shí)、快速、準(zhǔn)確的分析檢測(cè)，杜絕農(nóng)獸藥殘留超標(biāo)的產(chǎn)品上市銷售。
[0012]這就給食品安全監(jiān)管部門對(duì)農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)前、產(chǎn)中、產(chǎn)后的監(jiān)督工作帶來了許多不便，因此，大量的快速檢測(cè)技術(shù)孕育而生，常見農(nóng)藥殘留檢測(cè)有化學(xué)速測(cè)法、免疫分析法、酶抑制法和活體檢測(cè)法等。(I)化學(xué)速測(cè)法，主要根據(jù)氧化還原反應(yīng)，水解產(chǎn)物與檢測(cè)液作用變色，用于有機(jī)磷農(nóng)藥的快速檢測(cè)，但是靈敏度低，使用局限性，且易受還原性物質(zhì)干擾。(2)免疫分析法，它具有專一性強(qiáng)、靈敏度高、快速、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，試劑盒可廣泛用于現(xiàn)場(chǎng)樣品和大量樣品的快速檢測(cè)，可準(zhǔn)確定性、定量。但由于抗體依賴國(guó)外進(jìn)口等影響，目前，我國(guó)市場(chǎng)上酶聯(lián)免疫法成品試劑盒依賴從國(guó)外進(jìn)口。(3)酶抑制法，是研究最成熟、應(yīng)用最廣泛的快速農(nóng)殘檢測(cè)技術(shù)，該方法只能檢測(cè)有機(jī)磷和氨基甲酸酯二類農(nóng)藥，對(duì)同類而不同種農(nóng)藥的抑制率差別很大，所以用統(tǒng)一的抑制率確定農(nóng)藥殘留是否超標(biāo)，必然會(huì)產(chǎn)生假陽性或假陰性的漏檢，可說是當(dāng)前“不得已而采用的速測(cè)法”，僅適用于基層初檢，起著警示作用，發(fā)現(xiàn)超標(biāo)現(xiàn)象時(shí)，必須用標(biāo)準(zhǔn)方法復(fù)測(cè)、確證，陰性反應(yīng)也應(yīng)按比例抽樣，用可靠的方法復(fù)測(cè)和確證。而獸藥的快速檢測(cè)主要用免疫分析法。
[0013]到目前為止，國(guó)外己開發(fā)了近百種農(nóng)藥的免疫化學(xué)分析方法。美國(guó)分析化學(xué)協(xié)會(huì)(AOAC)推薦了四十余種農(nóng)藥的商品化試劑盒，試劑盒的方法以酶免疫分析法為主，尤其是酶聯(lián)免疫分析法應(yīng)用的最為廣泛。一些檢測(cè)商品試劑盒也相繼研究開發(fā)出。美國(guó)ImmunoSystems Inc 1991年已生產(chǎn)出10余種以ELISA為基礎(chǔ)的農(nóng)藥酶免疫速測(cè)箱用于測(cè)定水、果汁以及部分食品乙腈提取液中的殺蟲劑、殺菌劑、除草劑，檢測(cè)限在mg/kg級(jí)，與HPLC比較有較好的相關(guān)性。這些試劑盒價(jià)格昂貴，在國(guó)內(nèi)少有使用。
[0014]國(guó)內(nèi)這方面的研究也漸漸起步，己有關(guān)于對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷、甲基對(duì)氧磷、毒死蜱、氟蟲睛、二氯哇琳酸、三哇酮、甲胺磷等農(nóng)藥的人工抗原和高親和力的特異性抗體的制備及用RIA法或ELISA法進(jìn)行樣品中痕量農(nóng)藥分析的報(bào)道。但均沒有商業(yè)化檢測(cè)試劑盒出
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[0015]國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有的研究主要集中于針對(duì)單一農(nóng)獸藥建立其特異性免疫檢測(cè)方法，而實(shí)際上農(nóng)產(chǎn)品中殘留的農(nóng)獸藥往往有多種，單農(nóng)獸藥組分免疫分析方法及相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒己難以滿足實(shí)際檢測(cè)的需要。
[0016]生物芯片是20世紀(jì)90年代在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)高新技術(shù)。生物芯片已在疾病診斷和治療、藥物篩選、農(nóng)作物的優(yōu)育優(yōu)選、司法鑒定、食品衛(wèi)生監(jiān)督、環(huán)境檢測(cè)、國(guó)防、航天等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。
[0017]目前生物芯片的研究和開發(fā)種類逐漸趨于多樣化，其應(yīng)用生物芯片可實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢樣品中目標(biāo)核酸分子、蛋白質(zhì)分子、細(xì)胞、微小組織等物質(zhì)的有無及多少進(jìn)行準(zhǔn)確、快速、大信息量檢測(cè)，具有微型化、高通量和自動(dòng)化的檢測(cè)特征。生物芯片在生物檢測(cè)、醫(yī)學(xué)檢測(cè)及疾病診斷、藥物篩選和基因序列分析上有著極其重要的應(yīng)用價(jià)值意義，因此受到廣泛關(guān)注和投資，使其已經(jīng)成為一個(gè)全球性的新型產(chǎn)業(yè)，即生物芯片產(chǎn)業(yè)。
[0018]鑒于此，農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)需要技術(shù)就需要技術(shù)上的創(chuàng)新。因而，開發(fā)高通量、快速、準(zhǔn)確、能定量定性、用于測(cè)定農(nóng)獸藥多殘留檢測(cè)微陣列芯片具有重要意義。
[0019]
【發(fā)明內(nèi)容】

[0020]本發(fā)明的目的是是提供一種高通量、準(zhǔn)確性高、能定量定性、便于程序化加工制作，用于制備測(cè)定農(nóng)獸藥多殘留微陣列芯片的方法。采用如下的技術(shù)方案:
基于微陣列檢測(cè)芯片的農(nóng)獸藥多殘留的檢測(cè)方法，包括如下步驟:
第I步、將瓊脂糖溶液涂覆于玻片,干燥后,用NaIO4溶液活化,用純水沖洗后,干燥,得到瓊脂糖修飾的玻片；
第2步、將農(nóng)藥或者獸藥的單克隆抗體用含40?60%(w/w)甘油的磷酸鹽緩沖溶液稀釋后，點(diǎn)樣于第I步所得的瓊脂糖修飾的玻片上，得到帶有捕獲單抗探針的微陣列芯片；
第3步、將農(nóng)藥或者獸藥的半抗原與卵清白蛋白偶聯(lián)制備成半抗原-OVA偶聯(lián)體，再用Cy3標(biāo)記，得到檢測(cè)抗原；
第4步、對(duì)第2步所得的帶有捕獲單抗探針的微陣列芯片進(jìn)行溫孵、封閉、洗滌，將檢測(cè)抗原與不同濃度的農(nóng)藥或者獸藥的對(duì)照品混合后，加入到微陣列芯片上的陣列中，孵育、洗脫，再用生物芯片掃描儀檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
第5步、對(duì)第2步所得的帶有捕獲單抗探針的微陣列芯片進(jìn)行溫孵、封閉、洗滌，將待測(cè)樣品與檢測(cè)抗原混合后，加入到微陣列芯片上的陣列中，孵育、洗脫，再用生物芯片掃描儀檢測(cè)，通過第4步所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到待測(cè)樣品中農(nóng)藥或獸藥的濃度。
[0021]上述方法中，所述的農(nóng)藥或者獸藥可以是指:
甲胺磷、二氟沙星、多拉菌素、三聚氰胺、克倫特羅、磺胺甲噁唑、金霉素、磺胺二甲嘧啶、氟甲砜霉素或者氯霉素。
[0022]也可以是指:
羧基、羥基、氨基或者巰基修飾過的甲基對(duì)硫磷、克百威、三唑磷、毒死蜱、對(duì)硫磷、呋喃丹、西維因、樂果、羅丹明B或者蘇丹紅I號(hào)。主要是由于這些農(nóng)藥或者獸藥不能直接作為半抗原，可通過人工設(shè)計(jì)合成其相應(yīng)的具有了活性反應(yīng)基團(tuán)，可和載體蛋白偶聯(lián)。
[0023]上述方法中，農(nóng)藥或者獸藥的單克隆抗體可以通過常規(guī)的制備方法自制得到，也可以通過購(gòu)買相應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞株分泌得到的。例如:如果需要檢測(cè)三聚氰胺時(shí)，可以通過保藏編號(hào)為CGMCC N0.3237的雜交瘤細(xì)胞株3B11分泌產(chǎn)生(參閱CN101705210B)，或者可以通過保藏編號(hào)為CGMCCN0.4303的雜交瘤細(xì)胞株B-4B5-F10-B11分泌產(chǎn)生(參閱CN102168071B)。
[0024]如果需要通過農(nóng)藥或者獸藥作為半抗原制備單克隆抗體時(shí)，可以將農(nóng)藥或者獸藥半抗原與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)制備人工抗原(免疫抗原)，再用合成的農(nóng)獸藥人工抗原免疫小鼠，取小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，得到雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)而制備到其單克隆抗體。
[0025]更進(jìn)一步地說，在使用農(nóng)藥或者獸藥半抗原與BSA或者OVA偶聯(lián)體時(shí)，可以采用碳二亞胺法，將二氟沙星、蘇丹紅I號(hào)、克倫特羅與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)；或者采用NHS法和混合酸酐法將多拉菌素與BSA偶聯(lián)制備人工抗原；或者通過戊二醛法將三聚氰胺、金霉素、羅丹明123 (羅丹明B的同系物)與BSA連接制備人工抗原；或者通過重氮化法將磺胺甲噁唑(SMZ)、磺胺二甲嘧啶(SM2)制備SMZ-HAS (人血清白蛋白)和SM2-BSA人工抗原；或者通過重氮化將氯霉素(氯霉素分子中的芳香硝基需要還原為芳香氨基)與BSA偶聯(lián)制備人工抗原；或者通過羰基二咪唑法將氟甲砜霉素與BSA偶聯(lián)制備人工抗原。制備OVA偶聯(lián)體時(shí)，也可以采用同BSA偶聯(lián)體相同的方法。
[0026]作為優(yōu)選，上述的第I步中，瓊脂糖溶液的濃度為1.2%(w/w)，在將瓊脂糖溶液涂覆于玻片上時(shí)，玻片預(yù)熱至60°C，使用NaIO4溶液活化30min，超純水沖洗后，再用氮?dú)饬鞔蹈伞?br> [0027]作為優(yōu)選，上述的第3步中，半抗原-OVA偶聯(lián)體以10nmol/ml的濃度溶于0.1M的碳酸鹽緩沖液，再用Cy3染料進(jìn)行染色，標(biāo)記反應(yīng)結(jié)束后，以3000 rpm的速度離心去除未結(jié)合的熒光分子及碳酸鹽緩沖液。
[0028]作為優(yōu)選，上述的第4步和第5步中，帶有捕獲單抗探針的微陣列芯片上的陣列上加入的混合液后，室溫下避光孵育I小時(shí)，再分別用0.0lM PBS/0.l%Tween-20 (pH7.4)、0.0lM PBS (pH7.4)和去離子蒸餾水各洗滌一次，再用氮?dú)饬鞔蹈伞?br> [0029]作為優(yōu)選，上述的第4步和第5步中，生物芯片掃描儀的操作參數(shù)是:85%激光強(qiáng)度、80%PMT增益值、5Mm分辨率；標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過線性擬合計(jì)算得到。由于在芯片上的捕獲單抗探針可以與單抗原-OVA偶聯(lián)體或者待檢測(cè)的農(nóng)藥或者獸藥相結(jié)合，因此，如果在待檢物料中沒有農(nóng)獸藥殘留時(shí)，被熒光標(biāo)記的檢測(cè)抗原(單抗原-OVA偶聯(lián)體)與探針結(jié)合之后，可以通過生物掃描儀檢測(cè)到熒光強(qiáng)度值；若待檢物料中含有一部分農(nóng)獸藥殘留時(shí)，這部分殘留物也會(huì)與捕獲探針結(jié)合，使一部分檢測(cè)抗原不能與探針結(jié)合，再進(jìn)行掃描時(shí)，就可以得到另外一個(gè)強(qiáng)度的熒光強(qiáng)度值；熒光強(qiáng)度值一般是與待檢物料中的農(nóng)獸藥殘留量成反比的，通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線即可實(shí)現(xiàn)對(duì)殘留量的定量檢測(cè)。
[0030]技術(shù)效果
本發(fā)明將酶聯(lián)免疫技術(shù)和生物芯片微點(diǎn)樣技術(shù)相結(jié)合，綜合兩個(gè)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，制備出高通量、特異性好、可批量化的食品安全快速檢測(cè)芯片，達(dá)到創(chuàng)新食品安全快速檢測(cè)技術(shù)體系的目的。
[0031]1、本發(fā)明以農(nóng)獸藥作為半抗原合成免疫抗原，制備單克隆抗體，以單克隆抗體作為探針點(diǎn)樣制作微陣列，以抗原、抗體的特異性反應(yīng)為檢測(cè)基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)特異性雜交，確保了檢測(cè)高準(zhǔn)確性和靈敏性。
[0032]2、本發(fā)明以農(nóng)獸藥半抗原與卵清白蛋白(OVA)偶聯(lián)，然后用熒光分子Cy3對(duì)“半抗原-0VA”進(jìn)行標(biāo)記，得到“半抗原_0VA-Cy3”復(fù)合體，S卩“標(biāo)記檢測(cè)抗原”。這樣一個(gè)復(fù)合體合成設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)，不僅體現(xiàn)在”半抗原-0VA”的合成和“半抗原-BSA”合成過程和試劑同質(zhì)性，而且可對(duì)半抗原進(jìn)行方便、有效地標(biāo)記。
[0033]3、本發(fā)明以Cy3進(jìn)行標(biāo)記，可直接用芯片掃描儀進(jìn)行檢測(cè)，不需要其他反應(yīng)底物和顯色反應(yīng)，操作過程更簡(jiǎn)便。
[0034]4、本發(fā)明可在一張芯片上設(shè)置分區(qū)和多個(gè)平行重復(fù)點(diǎn)，可有效控制芯片質(zhì)量，極大地提高了芯片檢測(cè)結(jié)果的可靠性，使其檢測(cè)的可控性和可靠性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ELISA等其他常規(guī)檢測(cè)方法，能滿足國(guó)家對(duì)農(nóng)藥殘留限量檢測(cè)的最高要求。
[0035]5、本發(fā)明所需的單克隆抗體和“標(biāo)記檢測(cè)抗原”可大批量制備，這不僅使該種芯片的制備成本大大降低，而且可以按照一定工藝批量生產(chǎn)，其反應(yīng)過程可望通過高度自動(dòng)化的設(shè)備進(jìn)行監(jiān)控，因而便于建成標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)平臺(tái)，可節(jié)省大量樣品、檢測(cè)時(shí)間和人員設(shè)備。
[0036]6、本發(fā)明的芯片配套材料可以在國(guó)內(nèi)自主生產(chǎn)，可以有效減少對(duì)國(guó)外試劑的依賴，能夠?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)提供必要的技術(shù)保障。
[0037]【專利附圖】

【附圖說明】.
[0038]圖1是農(nóng)獸藥多殘留單抗微陣列檢測(cè)芯片檢測(cè)原理示意圖；
其中，
1:瓊脂糖修飾的玻片基質(zhì)
2:捕獲單抗探針
3:待檢農(nóng)獸藥
4:卵清白蛋白(OVA)
5:Cy3
(a):點(diǎn)樣捕獲單抗探針
(b):待檢測(cè)樣品+標(biāo)記檢測(cè)抗原
(C):待檢測(cè)樣品+標(biāo)記檢測(cè)抗原，與捕獲單抗探針微陣列芯片孵育
(d):芯片掃描
(e):結(jié)果分析
(1):待檢測(cè)樣品無檢測(cè)目標(biāo)農(nóng)獸藥殘留物
(2):待檢測(cè)樣品有檢測(cè)目標(biāo)農(nóng)獸藥殘留物
圖2是“捕獲單抗探針”微陣列點(diǎn)樣布陣示意圖1 --第I列所點(diǎn)樣品為磷酸鹽甘油緩沖液(陰性對(duì)照)
2-n:第2到第η列所點(diǎn)樣品為不同農(nóng)獸藥“捕獲單抗探針”
圖3是Cy3標(biāo)記的芯片系統(tǒng)檢測(cè)3種農(nóng)獸藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線A:培氟沙星(實(shí)施例1)
B:三聚氰胺(實(shí)施例2)
C:甲胺磷(實(shí)施例3)
D:三聚氰胺(實(shí)施例4)
【具體實(shí)施方式】
[0039]實(shí)施例1
第一部分培氟沙星(Pefloxacion, PEF)免疫抗原和檢測(cè)抗原的合成(I)準(zhǔn)確稱取N—羥基琥珀酰亞胺(NHS)45 mg，碳二亞胺(EDC)210 mg，培氟沙星(PEF)36 mg，加入5 mL的N，N —二甲基甲酰胺(DMF)。并在室溫下遮光攪拌孵育24 h，此溶液稱為A。
[0040](2)準(zhǔn)確稱取牛血清白蛋白(BSA)105 mg，加入0.01 mo I/L (pH值7.4)磷酸鹽緩沖液(PBS) 15 mL，此溶液稱為B。
[0041](3)將孵育好的溶液A逐滴加入到B溶液中，邊加邊攪拌，用0.01 mol/L(pH值
7.4)PBS磁力攪拌透析6 d，期間數(shù)次換液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)。12000 r/min離心30 min,收集上清，即得PEF-BSA偶合物，將得到的PEF-BSA偶聯(lián)物保存于一 20 °C冰箱備用。
[0042]將BSA替換為卵清白蛋白(OVA)后，依同法制備得到PEF-OVA偶聯(lián)物。
.[0043]第二部分農(nóng)獸藥單克隆抗體制備 (O小鼠免疫
①取健康6-8周齡的雌性Balb/c小鼠6只。
[0044]②免疫前取未經(jīng)免疫的Balb/c小鼠陰性血清對(duì)照。對(duì)小鼠斷尾取血，采血0.2ml(獲得0.1ml免疫前血清)常溫放置40min后6000rpm離心IOmin,上清液即為血清。
[0045]③將實(shí)施例1第一部分所得到的PEF-BSA偶聯(lián)物用PBS緩沖液配制成IPg/ μ?的溶液，作為免疫抗原PBS溶液。
[0046]④第一次免疫，將免疫抗原PBS溶液與等體積的弗氏完全佐劑充分混合(研磨成油包水的乳糜狀)，抽取混勻的乳液進(jìn)行腹腔多點(diǎn)注射，每只鼠的注射量為200μ?，含免疫抗原 lOOPg。
[0047]⑤第二次免疫:兩周后進(jìn)行注射方法、注射體積及抗原劑量不變，弗氏不完全佐劑。
[0048]⑥第三次免疫:一周后按照第二次免疫方案一周后再進(jìn)行免疫。
[0049]⑦采血和間接ELISA檢測(cè)血清效價(jià)(第三次免疫一周后)。
[0050]⑧第四次免疫:(第三次免疫兩周后，15天)(抗原溶于PBS或鹽水)取同量免疫抗原不加佐劑對(duì)小鼠進(jìn)行尾靜脈注射以強(qiáng)化免疫。
[0051](2)細(xì)胞融合
第四次免疫一周后，進(jìn)行細(xì)胞融合。
[0052]①猝死小鼠。眼球放血處死，留血樣做陽性對(duì)照(血樣RT Ih后與4°C冰箱過夜，再3000rpm離心lOmin，取上清_20°C保存)，自來水沖洗鼠身至干凈。將小鼠泡于75%酒精內(nèi)進(jìn)行消毒5-10min。[0053]②超凈臺(tái)內(nèi)無菌分離脾臟:將取出的脾臟放入預(yù)先放有IOml 1640培養(yǎng)液(不含血清，以下均相同)的培養(yǎng)皿內(nèi)。
[0054]③分散脾臟輕壓、研磨，將細(xì)胞充分洗入培養(yǎng)皿內(nèi)充分混勻，計(jì)數(shù)脾細(xì)胞。
[0055]④吹打骨髓瘤細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中,補(bǔ)充至40ml,充分混勻,計(jì)數(shù)脾細(xì)胞。
[0056]⑤分別將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞懸液離心1200rpm，5min,用1640培養(yǎng)液洗滌離心，重復(fù)兩次，1:10稀釋后計(jì)數(shù)。
[0057]⑥將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按照1:10充分混勻，用1640培養(yǎng)液洗滌一次，拍勻，1200rpm離心5min,吸去上清,輕輕將細(xì)胞團(tuán)彈散開。
[0058]⑦融合步驟水浴37°C，向細(xì)胞團(tuán)加入Iml PEG溶液，逐滴加入，滴一滴攪拌一次或轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，90秒內(nèi)滴完，攪勻，繼續(xù)反應(yīng)90秒，再加入IOml 37°C預(yù)熱后的1640培養(yǎng)液，再加20ml 1640,小心吹打懸浮細(xì)胞,迅速離心1200rpm, 5min,計(jì)數(shù)。
[0059]⑧以計(jì)數(shù)多的細(xì)胞計(jì)算，用37°C預(yù)熱后HAT培養(yǎng)基將融合后的細(xì)胞稀釋為5-8 X IO5個(gè)/ml的濃度，按照200μ1/孔接種于96孔板。
[0060]⑨于融合后第3-4天，半量更換HAT培養(yǎng)基；于融合后第6_7天，半量更換HAT培養(yǎng)基，視集落生長(zhǎng)情況于融合后第8-9天開始檢測(cè)。
[0061](3)雜交瘤細(xì)胞的選擇
①免疫抗原用包被液稀釋至10μ g/ml。
[0062]②以100 μ I/孔量加入酶標(biāo)板孔中，置4°C過夜或37°C吸附2小時(shí)。
[0063]③棄去孔內(nèi)的液體，同時(shí)用洗滌液洗3次，每次3分鐘，拍干。
[0064]④每孔加100 μ I封閉液37 °C封閉I小時(shí)。
[0065]⑤洗滌液洗3次。
[0066]⑥每孔加100 μ I待檢雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，同時(shí)設(shè)立陽性、陰性對(duì)照和空白對(duì)照；37°C孵育I小時(shí)；洗漆，拍干。
[0067]⑦加酶標(biāo)第二抗體，每孔100μ 1，37°C孵育I小時(shí)，洗漆，拍干。
[0068]⑧加底物液，每孔加新鮮配制的底物使用液100 μ 1，37°C 20分鐘。
[0069]⑨以2mol/L H2SO4終止反應(yīng)，在酶聯(lián)免疫閱讀儀上讀取OD值。
[0070]⑩結(jié)果判定:以P/N蘭2.1，或P蘭N+3SD為陽性。
[0071](4)雜交瘤細(xì)胞的克隆化(有限稀釋法)
①制備小鼠脾細(xì)胞為飼養(yǎng)細(xì)胞。
[0072]②制備待克隆的雜交瘤細(xì)胞懸液，用含20%血清的HAT培養(yǎng)基稀釋至每毫升含5、10和20個(gè)細(xì)胞3種不同的稀釋度。
[0073]③按每毫升加入5 X IO4?I X IO5細(xì)胞的比例，在上述雜交瘤細(xì)胞懸液中分別加入
腹腔巨噬細(xì)胞。
[0074]④每種雜交瘤細(xì)胞分裝96孔板一塊，每孔量為100 μ I。
[0075]⑤37°C、5% CO2培養(yǎng)6天，出現(xiàn)肉眼可見的克隆即可檢測(cè)抗體；在倒置顯微鏡下觀察，標(biāo)出只有單個(gè)克隆生長(zhǎng)的孔，取上清作抗體檢測(cè)。
[0076]⑥取抗體檢測(cè)陽性孔的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，并凍存。
[0077](5)單克隆抗體的生產(chǎn)及純化 (A)單抗大量制備
①成年BALB/c小鼠腹腔接種降植烷或液體石蠟，每只小鼠0.3-0.5ml。
[0078]②7-10天后腹腔接種用PBS或無血清培養(yǎng)基稀釋的雜交瘤細(xì)胞，每只小鼠5X105/0.2ml。
[0079]③間隔5天后，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，如腹部明顯膨大，以手觸摸時(shí)，皮膚有緊張感，即可采集腹水。通常每只小鼠可采3ml腹水；
④將腹水離心(2000r/min 5分鐘)，除去細(xì)胞成分和其他的沉淀物，收集上清，測(cè)定抗體效價(jià)，分裝，_70°C凍存?zhèn)溆谩?br> [0080](B)單克隆抗體的純化(辛酸-硫酸銨沉淀法)
①腹水4°C 12000rpm離心15min,去除雜質(zhì)。
[0081]②取I份腹水加2份0.06mol/L PH5.0醋酸緩沖液，按每毫升稀釋腹水加33 μ I辛酸的比例，室溫?cái)嚢柘轮鸬渭尤胄了幔覝鼗旌?0min。
[0082]③4°C靜置2小時(shí)，取出12000g離心30分鐘，棄沉淀。
[0083]④上清經(jīng)尼龍篩過濾，于50倍體積的0.0lM pH7.4 PBS中4°C透析6h。
[0084]⑤在透析后的上清中加入等體積飽和硫酸銨溶液。
[0085]⑥4°C靜置Ih以上，IOOOOg離心30分鐘，棄上清。
[0086]⑦沉淀溶于適量PBS (含 137mmol/L NaCl, 2.6mol/L KCl，0.2mmol/L EDTA)中，于50-100倍體積的PBS中透析過夜。
[0087]⑧取少量透析后樣品適當(dāng)稀釋后，以紫外分光光度計(jì)檢測(cè)蛋白含量，SDS-PAGE，WB檢測(cè)抗體純度。
[0088]
第三部分點(diǎn)樣制備農(nóng)獸藥單克隆抗體微陣列 (O瓊脂糖玻片的修飾
配制1.2%(w/w)瓊脂糖溶液，微波爐煮沸3 min完全溶解。將2 ml瓊脂糖溶液覆蓋在60°C預(yù)熱的清潔玻片上；瓊脂糖凝固后，玻片在37°C下過夜干燥。使用前用NaIO4溶液(濃度0.1 M)活化30min，超純水徹底沖洗3遍，并用氮?dú)饬鞔蹈伞?br> [0089](2)點(diǎn)樣“捕獲單抗探針”微陣列
將本實(shí)施例第二部分所得的培氟沙星單克隆抗體用含50%(w/w)甘油的PBS稀釋至0.1mg/ml，用點(diǎn)樣儀在上述瓊脂糖修飾的玻片表面點(diǎn)樣，每張芯片兩排三列共6個(gè)(2X3)矩陣，每個(gè)亞陣列所點(diǎn)樣品一致，每列為4個(gè)點(diǎn)，第一列所點(diǎn)樣品為磷酸鹽甘油緩沖液作為陰性對(duì)照，第二列是培氟沙星單抗的PBS溶液點(diǎn)樣。如果需要測(cè)定多種農(nóng)藥或獸藥時(shí)，可以在繼續(xù)在后續(xù)的第η列中分別點(diǎn)樣相應(yīng)的單抗，作為“捕獲單抗探針”，為農(nóng)獸藥檢測(cè)點(diǎn)。
[0090](3)合成“標(biāo)記檢測(cè)抗原”
以lOnmol/ml的濃度將“半抗原-0VA”，即PEF-OVA偶聯(lián)物溶于0.1M的碳酸鹽緩沖液(0.1Μ，ρΗ9.0)中。在25nmol的粉末狀FluoroLink? Cy3染料中加入25μ1 0.1M的碳酸鹽緩沖液(0.1Μ，ρΗ9.0)，充分混合后加入1.5μ1 Cy3染料于0.5ml溶解的“半抗原-0VA”中。輕輕的混勻使“半抗原-0VA”與染料分子充分接觸，避光室溫反應(yīng)30分鐘，每分鐘輕輕地晃動(dòng)一次反應(yīng)液。標(biāo)記反應(yīng)結(jié)束后，以3000rpm離心去除未結(jié)合的熒光分子及碳酸鹽緩沖液。用PBS離心清洗2遍。將標(biāo)記好的“半抗原-0VA”溶于100μ1 PBS溶液中。每10μ1分裝于-40°C保存?zhèn)溆谩?br> [0091]5、待檢測(cè)樣品和“標(biāo)記檢測(cè)抗原”混勻，與已點(diǎn)樣“捕獲單抗探針”微陣列芯片雜交 將制備好的“捕獲單抗探針”微陣列芯片在37°C雜交盒中溫孵2h，用封閉液(0.0lmol/
L pH7.4的PBS，含1%牛血清白蛋白和2.5%蔗糖)封閉2h，PBST洗3次，每次15s，離心機(jī)甩干，每個(gè)陣列中加入2.5 μ I待檢測(cè)樣品和2.5 μ I濃度為0.0lnmol/μ I “標(biāo)記檢測(cè)抗原”混合而成的混合液，然后在雜交液上蓋上排斥硅烷處理過的蓋玻片，最后用保鮮膜封住培養(yǎng)皿，置于室溫下避光孵育I小時(shí)。雜交結(jié)束后，分別用0.0lM PBS (pH7.4)/0.l%Tween-20、0.0lM PBS (pH7.4)和去離子蒸餾水各洗滌一次，每次5分鐘。然后用氮?dú)饬鞔蹈伞?br> [0092]6、芯片掃描及結(jié)果判讀
(I)雜交后的芯片的熒光信號(hào)通過芯片掃描儀在Cy3 (Cy5)波長(zhǎng)下進(jìn)行掃描，掃描條件為85%激光強(qiáng)度，80% PMT增益值(PMT gain)，5Mm分辨率。系統(tǒng)自動(dòng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀，給出檢測(cè)結(jié)果。
[0093](2)在農(nóng)獸藥濃度定量分析中，首先要用不同的已知濃度的農(nóng)獸藥溶液進(jìn)行上面的檢測(cè)分析，制作出“農(nóng)獸藥濃度-熒光”標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測(cè)農(nóng)獸藥溶液的熒光信號(hào)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，就可以確定待測(cè)溶液中農(nóng)獸藥的濃度。
[0094]實(shí)施例2
第一部分三聚氰胺(Melamine)免疫抗原和檢測(cè)抗原的合成
以多元酸酐與混合酸酐聯(lián)用法合成免疫抗原三聚氰胺BSA和檢測(cè)抗原三聚氰胺-0VA。
[0095]( I)用多元酸酐法合成三聚氰胺戊二酸酐半醛(其中吡啶作為為溶劑和催化劑)。稱取125 mg三聚氰胺(約I mmol),加入4 mL含114 mg (約I mmol)戍二酸酐的批唳溶液中，在室溫條件下，用磁力攪拌器攪拌反應(yīng)22 h。待反應(yīng)完成后，用氮?dú)獯蹈蛇拎ぁ?br> [0096](2)用上述產(chǎn)物與氯甲酸異丁酯反應(yīng)得到混合酸酐。用40 mL溶劑(DMF和1，4_ 二氧六環(huán)1:1混合)溶解三聚氰胺-戊二酸酐半醛，加入262 μ L (約I mmol)正三丁胺，冰中攪拌10 min,加入氯甲酸異丁酯144 μ L(約I mmol),在室溫條件下,用磁力攪拌器攪拌反應(yīng)I h生成混合酸酐。
[0097](3)混合酸酐與載體蛋白偶聯(lián)。在冰浴環(huán)境中，將載體蛋白溶液(0.4 g BSA溶于pH8.5，I mo I/L硼酸鈉溶液中)逐滴加入混合酸酐中，然后放在室溫條件下反應(yīng)過夜，得到偶聯(lián)物后放置于磷酸中鹽緩沖液(PBS)透析3 d，過S印Hadex G-25層析柱提純，凍干存于4°C備用。
[0098]將BSA替換為卵清白蛋白(OVA)后，依同法制備得到三聚氰胺-OVA偶聯(lián)物。
[0099]第二部分農(nóng)獸藥單克隆抗體制備、第三部分點(diǎn)樣制備農(nóng)獸藥單克隆抗體微陣列 采用與實(shí)施例1相同的方法，區(qū)別在于:小鼠免疫步驟中，PEF-BSA偶聯(lián)體用三聚氰胺
BSA替代；合成“標(biāo)記檢測(cè)抗原”的步驟中，PEV-OVA偶聯(lián)物用三聚氰胺-OVA偶聯(lián)物替代。其余步驟和參數(shù)皆相同。
[0100]最終制得包含三聚氰胺單克隆抗體探針的微陣列芯片，用不同的已知濃度的農(nóng)獸藥溶液進(jìn)行上面的檢測(cè)分析，制作出“農(nóng)獸藥濃度-熒光”標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測(cè)農(nóng)獸藥溶液的熒光信號(hào)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，就可以確定待測(cè)溶液中農(nóng)獸藥的濃度。
[0101]實(shí)施例3
第一部分甲胺磷免疫抗原和檢測(cè)抗原的合成稱取100 mg甲胺磷溶于10 mL 0.1 mo I/L HCl中，冰浴攪拌下加入預(yù)冷的I % NaNO2至淀粉碘化鉀試紙變蘭后繼續(xù)攪拌30 min;另稱取10 mg BSA溶解于2 mL pH 8.7的硼酸鹽緩沖液中，取上述重氮化產(chǎn)物2mL滴加到蛋白溶液中，冰浴下攪拌2h，4°C放置過夜后將反應(yīng)液裝入透析袋。4°C下，用PBS透析3天，透析液冷凍干燥得到白色粉末，貯于-20°C下備用。同法制得包被抗原甲胺磷-0VA。
[0102]第二部分農(nóng)獸藥單克隆抗體制備、第三部分點(diǎn)樣制備農(nóng)獸藥單克隆抗體微陣列 采用與實(shí)施例1相同的方法，區(qū)別在于:小鼠免疫步驟中，PEF-BSA偶聯(lián)體用甲胺
磷-BSA偶聯(lián)物替代；合成“標(biāo)記檢測(cè)抗原”的步驟中，PEV-OVA偶聯(lián)物用甲胺磷-BSA偶聯(lián)物替代。其余步驟和參數(shù)皆相同。
[0103]最終制得包含甲胺磷單克隆抗體探針的微陣列芯片，用不同的已知濃度的農(nóng)獸藥溶液進(jìn)行上面的檢測(cè)分析，制作出“農(nóng)獸藥濃度-熒光”標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測(cè)農(nóng)獸藥溶液的熒光信號(hào)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，就可以確定待測(cè)溶液中農(nóng)獸藥的濃度。
[0104]實(shí)施例4
與實(shí)施例2的區(qū)別在于:第二部分單克隆抗體的制備中，三聚氰胺單抗是通過保藏編號(hào)為CGMCC N0.3237的雜交瘤細(xì)胞株3B11分泌產(chǎn)生，具體的生產(chǎn)步驟是將雜交瘤細(xì)胞接種成年BALB/c小鼠腹腔中，操作步驟同實(shí)施例1的“(5)單克隆抗體的生產(chǎn)及純化”。三聚氰胺-OVA偶聯(lián)體的制備方法仍同實(shí)施例2。
[0105]依實(shí)施例2中同法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行檢測(cè)。
[0106]檢測(cè)方法的驗(yàn)證
(I)精密度驗(yàn)證
分別用滅菌雙蒸水將甲胺磷和培氟沙星、用甲醇將三聚氰胺的標(biāo)準(zhǔn)品配制成0.004nmol/μ I的樣品，使用實(shí)施例1實(shí)施例4所得的生物芯片進(jìn)行檢測(cè)。重復(fù)檢測(cè)6次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，所得結(jié)果如表I所示。
[0107]表I精密度驗(yàn)證結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.基于微陣列檢測(cè)芯片的農(nóng)獸藥多殘留的檢測(cè)方法，包括如下步驟: 第I步、將瓊脂糖溶液涂覆于玻片,干燥后,用NaIO4溶液活化,用純水沖洗后,干燥,得到瓊脂糖修飾的玻片； 第2步、將農(nóng)藥或者獸藥的單克隆抗體用含40?60%(w/w)甘油的磷酸鹽緩沖溶液稀釋后，點(diǎn)樣于第I步所得的瓊脂糖修飾的玻片上，得到帶有捕獲單抗探針的微陣列芯片； 第3步、將農(nóng)藥或者獸藥的半抗原與卵清白蛋白偶聯(lián)制備成半抗原-OVA偶聯(lián)體，再用Cy3標(biāo)記，得到檢測(cè)抗原； 第4步、對(duì)第2步所得的帶有捕獲單抗探針的微陣列芯片進(jìn)行溫孵、封閉、洗滌，將檢測(cè)抗原與不同濃度的農(nóng)藥或者獸藥的對(duì)照品混合后，加入到微陣列芯片上的陣列中，孵育、洗脫，再用生物芯片掃描儀檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； 第5步、對(duì)第2步所得的帶有捕獲單抗探針的微陣列芯片進(jìn)行溫孵、封閉、洗滌，將待測(cè)樣品與檢測(cè)抗原混合后，加入到微陣列芯片上的陣列中，孵育、洗脫，再用生物芯片掃描儀檢測(cè)，通過第4步所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到待測(cè)樣品中農(nóng)藥或獸藥的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于微陣列檢測(cè)芯片的農(nóng)獸藥多殘留的檢測(cè)方法，其特征在于:所述的所述的農(nóng)藥或者獸藥可以是指:甲胺磷、二氟沙星、多拉菌素、三聚氰胺、克倫特羅、磺胺甲噁唑、金霉素、磺胺二甲嘧啶、氟甲砜霉素或者氯霉素；或者是指:羧基、羥基、氨基或者巰基修飾過的甲基對(duì)硫磷、克百威、三唑磷、毒死蜱、對(duì)硫磷、呋喃丹、西維因、樂果、羅丹明B或者蘇丹紅I號(hào)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于微陣列檢測(cè)芯片的農(nóng)獸藥多殘留的檢測(cè)方法，其特征在于:所述的第2步中，所述的獸藥是三聚氰胺，三聚氰胺的單克隆抗體是通過保藏編號(hào)為CGMCC N0.3237的雜交瘤細(xì)胞株.3B11分泌產(chǎn)生，或者是通過保藏編號(hào)為CGMCCN0.4303的雜交瘤細(xì)胞株B-4B5-F10-B11分泌產(chǎn)生。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于微陣列檢測(cè)芯片的農(nóng)獸藥多殘留的檢測(cè)方法，其特征在于:所述的步驟2中，農(nóng)藥或者獸藥的單克隆抗體的制備方法是:將農(nóng)藥或者獸藥半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)制備人工抗原，再用合成的農(nóng)獸藥人工抗原免疫小鼠，取小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，得到雜交瘤細(xì)胞，進(jìn)而制備到單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于微陣列檢測(cè)芯片的農(nóng)獸藥多殘留的檢測(cè)方法，其特征在于:將所述的農(nóng)藥或者獸藥半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)制備人工抗原時(shí)，采用碳二亞胺法，將二氟沙星、蘇丹紅I號(hào)、克倫特羅與牛血清白蛋白偶聯(lián)；或者采用NHS法和混合酸酐法將多拉菌素與BSA偶聯(lián)制備人工抗原；或者通過戊二醛法將三聚氰胺、金霉素、羅丹明123與BSA偶聯(lián)制備人工抗原；或者通過重氮化將氯霉素與BSA偶聯(lián)制備人工抗原，所述的氯霉素分子中的芳香硝基需要還原為芳香氨基；或者通過羰基二咪唑法將氟甲砜霉素與BSA偶聯(lián)制備人工抗原。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于微陣列檢測(cè)芯片的農(nóng)獸藥多殘留的檢測(cè)方法，其特征在于:將所述的農(nóng)藥或者獸藥半抗原與OVA偶聯(lián)時(shí)，采用碳二亞胺法，將二氟沙星、蘇丹紅I號(hào)、克倫特羅與OVA偶聯(lián)；或者采用NHS法和混合酸酐法將多拉菌素與OVA偶聯(lián)；或者通過戊二醛法將三聚氰胺、金霉素、羅丹明123與OVA偶聯(lián)；或者通過重氮化將氯霉素與OVA偶聯(lián)，所述的氯霉素分子中的芳香硝基需要還原為芳香氨基；或者通過羰基二咪唑法將氟甲砜霉素與OVA偶聯(lián)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于微陣列檢測(cè)芯片的農(nóng)獸藥多殘留的檢測(cè)方法，其特征在于:所述第I步中，瓊脂糖溶液的濃度為1.2%(w/w)，在將瓊脂糖溶液涂覆于玻片上時(shí)，玻片預(yù)熱至60°C,使用NaIO4溶液活化30min，超純水沖洗后,再用氮?dú)饬鞔蹈伞?br> 8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于微陣列檢測(cè)芯片的農(nóng)獸藥多殘留的檢測(cè)方法，其特征在于:所述第3步中，半抗原-OVA偶聯(lián)體以10nmol/ml的濃度溶于0.1M的碳酸鹽緩沖液，再用Cy3染料進(jìn)行染色，標(biāo)記反應(yīng)結(jié)束后，以3000 rpm的速度離心去除未結(jié)合的熒光分子及碳酸鹽緩沖液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于微陣列檢測(cè)芯片的農(nóng)獸藥多殘留的檢測(cè)方法，其特征在于:所述第4步和第5步中，帶有捕獲單抗探針的微陣列芯片上的陣列上加入的混合液后，室溫下避光孵育I小時(shí)，再分別用0.0lM PBS/0.l%Tween-20、0.0lM PBS和去離子蒸餾水各洗滌一次，再用氮?dú)饬鞔蹈伞?br> 10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于微陣列檢測(cè)芯片的農(nóng)獸藥多殘留的檢測(cè)方法，其特征在于:所述第4步和第5步中，生物芯片掃描儀的操作參數(shù)是:85%激光強(qiáng)度、80%PMT增益值、5Mm分辨率；標(biāo)準(zhǔn)曲線 是通過線性擬合計(jì)算得到。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103439514SQ201310338039
【公開日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年8月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月5日
【發(fā)明者】李同祥, 孫會(huì)剛, 黃天姿, 候進(jìn)慧 申請(qǐng)人:徐州工程學(xué)院