一種基于微陣列電極的抗生素殘留檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于微陣列電極的抗生素殘留檢測方法，屬于農(nóng)產(chǎn)品安全檢測技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景
[0002]抗生素是一種能抑制或殺死其他微生物細胞的生理活性物質(zhì)，主要由微生物產(chǎn)生。自20世紀(jì)30年代發(fā)現(xiàn)青霉素以來，現(xiàn)如今已被發(fā)現(xiàn)的抗生素有2000多種。常在奶牛中使用的抗生素主要有氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類等。其中，四環(huán)素類抗生素是由放線菌產(chǎn)生的一類廣譜抗生素，包括四環(huán)素、金霉素、土霉素及半合成衍生物甲烯土霉素、強力霉素和二甲胺基四環(huán)素等。如果人類長期食用含抗生素殘留的動物性食品后，藥物不斷在體內(nèi)蓄積，會對人體產(chǎn)生毒性作用，增加細菌的耐藥性，引起人體的過敏和變態(tài)反應(yīng)，甚至?xí)a(chǎn)生致癌、致畸、致突變作用。雖然近年來國際上嚴格限制抗生素的殘留最大量，但由于其對某些作物具有生長刺激作用，所以仍有不少違章使用現(xiàn)象，因此實現(xiàn)對抗生素的檢測是至關(guān)重要的。
[0003]普通電極上生物識別過程引起的阻抗變化非常小，微陣列電極則可以將反應(yīng)過程中發(fā)生的阻抗變化放大，從而降低了檢測時間，減少非目標(biāo)分析物的干擾影響；傳統(tǒng)電極表面的半無限線性擴散層易使反應(yīng)物損耗，而微電極表面的球形擴散場能夠加快反應(yīng)物的供給速率；微電極能夠加快反應(yīng)物的供給速率，普通電極則易造成更大的反應(yīng)物損耗。相比傳統(tǒng)電極，微電極只需要較低濃度的電活性離子形成雙層。所以，微電極能夠在傳統(tǒng)電極的靈敏度不足的低導(dǎo)電性的溶液中進行阻抗測試，同時，微陣列電極可實現(xiàn)傳感器微型化，因此微電極與傳統(tǒng)的檢測系統(tǒng)相結(jié)合成為具有潛力的選擇。傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留檢測方法具有選擇性好、靈敏度高和準(zhǔn)確度高，同時檢測多種元素或化合物的優(yōu)勢，但其需要昂貴的儀器設(shè)備，樣品的前處理過程繁瑣、費時，并且對分析人員的技術(shù)水平要求很高，不適于現(xiàn)場快速檢測。因此本文嘗試制備一種四環(huán)素殘留的適配體傳感器。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種能克服上述方法的缺陷，且靈敏度高、特異性高、集成化、便攜化的四環(huán)素殘留檢測的適配體傳感器檢測方法。采用的技術(shù)方案為:利用微陣列電極的集成化、便攜化，將納米ΑΤ0-殼聚糖溶液滴在微電極工作區(qū)域，由于殼聚糖溶液良好的生物相容性，使四環(huán)素適配體穩(wěn)定的固定在電極表面，從而使抗原抗體反應(yīng)更有效，檢測電極表面的阻抗值，研究該傳感器的電化學(xué)性能。
[0005]所述方法的步驟如下:
1)首先對微陣列電極清洗，測試其阻抗值的變化；
2)將步驟1)所得微陣列電極進行底液pH、適配體濃度、孵育時間等參數(shù)，進行優(yōu)化，篩選出最佳的試驗取值；
3)將步驟2)所得的微陣列電極，在最優(yōu)條件下滴加納米ΑΤ0-殼聚糖溶液，將其固定在電極表面，從而獲得納米ΑΤΟ-殼聚糖修飾界面；
4)在步驟3)所得納米ΑΤΟ-殼聚糖修飾電極上滴加適配體，使其與納米ΑΤΟ-殼聚糖自組裝后獲得適配體修飾界面；
5)利用抗原抗體間的特異性反應(yīng)，滴加不同濃度的四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)液，加入底液PBS后進行阻抗檢測，建立不同四環(huán)素濃度與微陣列電極阻抗變化之間的關(guān)系曲線；
6)將牛奶樣品液滴加在微陣列電極表面，加入底液PBS后進行阻抗檢測，獲得牛奶樣品中是否含有四環(huán)素及是否超標(biāo)的信息。
[0006]所述方法的步驟1)所述清洗并測試微陣列電極，是分別進入一定濃度的NaOH、HC1溶液中15min，再用蘸有無水乙醇的擦鏡紙對電極表面擦拭；最終，經(jīng)超純水沖洗后，進行阻抗譜掃描，與上次裸電極的結(jié)果對比，兩者基本重合，則說明清洗干凈，否則需要重新清洗。
[0007]所述方法的步驟2)所述底液pH、適配體濃度、孵育時間等參數(shù)進行了優(yōu)化:底液pH選取值為7.5 ;適配體濃度選取6 μΜ ;孵育時間30 min ;對不同條件下的阻抗值進行分析測試，確定微陣列電極測試過程中的最佳參數(shù)。
[0008]所述方法的步驟3)所述滴加納米ΑΤ0-殼聚糖溶液，滴加量為3 μ L，固定30 min。
[0009]所述方法的步驟4)所述滴加不同濃度的四環(huán)素適配體溶液，滴加量為3 yL，固定40 min，孵育溫度為室溫。
[0010]所述方法的步驟5)所述滴加不同濃度的四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)液，加入底液PBS后進行阻抗檢測。
[0011]所述方法的步驟6)所述滴加不同濃度的四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)液，孵育30 min，滴加底液PBS后進行阻抗檢測。
[0012]所述方法的具體步驟如下:
1)微陣列電極的清洗:首先在1M NaOH溶液中浸泡15min ;然后在1M HC1溶液中浸泡15 min ;再用蘸有無水乙醇的擦鏡紙對電極表面擦拭；最終，經(jīng)超純水沖洗后，進行阻抗譜掃描，與上次裸電極的結(jié)果對比，兩者基本重合，則說明清洗干凈，否則需要重新清洗。獲得清洗干凈的微陣列電極，便于在其表面進行修飾，保證構(gòu)建傳感器的準(zhǔn)確性；
2)所述底液pH、適配體濃度、孵育時間等參數(shù)進行了優(yōu)化:底液pH很小時，測試阻抗值也很小，pH值增大的同時，阻抗值也在增加；當(dāng)pH值在7.5時，阻抗值達到最大，繼續(xù)增大pH值，其測試的阻抗值呈現(xiàn)出減小趨勢，可能是由于在堿性或者酸性條件下，適配體的活性受到了影響，所以，本試驗中選取7.5作為底液最佳pH值。將不同濃度的適配體分別固定到微陣列電極表面，修飾好的電極在與四環(huán)素結(jié)合反應(yīng)前后進行阻抗分析，并對各濃度適配體的阻抗值變化進行比較:當(dāng)適配體濃度從2μΜ增到6μΜ時，阻抗值不斷增加，當(dāng)適配體濃度進一步增大，其阻抗差也在增大，但幾乎穩(wěn)定不變，說明適配體在6 μ Μ濃度時，適配體在電極表面的固定量達到了飽和狀態(tài)，所以，本實驗最優(yōu)適配體濃度為6 μ Μ。對于適配體和四環(huán)素孵育時間，對測試阻抗值的變化進行研究:隨著時間的增加，阻抗差也不斷增大，說明適配體傳感器和目標(biāo)檢測物在發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，當(dāng)孵育時間達到30min后，阻抗差值基本達到一個穩(wěn)定的值，變化幅度很小，說明適配體與四環(huán)素的結(jié)合反應(yīng)完成。因此，該實驗選擇四環(huán)素與適配體的最佳孵育時間為30min ;
3)取納米ΑΤΟ-殼聚糖溶液，根據(jù)微陣列電極工作區(qū)域的大小，確定出試驗所用最佳量，滴加納米ΑΤΟ-殼聚糖溶液的量為3 μ?，固定30 min，從而獲得ΑΤΟ-殼聚糖修飾的適配體傳感器界面；
4)取四環(huán)素適配體原液，用PBS稀釋不同倍數(shù)，配置2μΜ，4μΜ，5μΜ，6μΜ，8μΜ，10 μ Μ等不同濃度，對其阻抗值進行測定，篩選出試驗所用最佳的濃度值為6 μ Μ，滴加四環(huán)素適配體的濃度為6μΜ，固定40min ;進而完成適配體在修飾界面的固定；
5)滴加不同濃度的四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)液，加入底液PBS后進行阻抗檢測，分析該適配體傳感器對四環(huán)素的測試性能；
6)將牛奶樣品液滴加在微陣列電極表面，加入底液PBS后進行阻抗檢測，獲得牛奶樣品中是否含有四環(huán)素及是否超標(biāo)的信息。
[0013]本方法的有益效果:
本發(fā)明對底液pH值、適配體濃度和孵育時間等參數(shù)進行了優(yōu)化:7.5作為底液pH、6μΜ作為適配體濃度、30 min作為孵育時間。為進一步研究奠定了基礎(chǔ)，且1-1.0X106 ng/mL范圍內(nèi)線性范圍良好；
采用本發(fā)明制備的基于微陣列電極的四環(huán)素殘留檢測方法操作工藝簡單，低電阻電壓降，高分析效率，樣品和試劑消耗量少，靈敏度高，特異性高，可實現(xiàn)樣品檢測的自動化。符合我國抗生素殘留快速檢測技術(shù)發(fā)展和國際化要求。
【附圖說明】
[0014]圖1納米ΑΤ0-殼聚糖復(fù)合物的掃描電鏡圖
(a.低倍率下納米ΑΤΟ-殼聚糖復(fù)合物的掃描電鏡圖；b.高倍率下納米ΑΤΟ-殼聚糖復(fù)合物的掃描電鏡圖)
圖2適配體傳感器在不同濃度的四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)液:0.0到1.0Χ106 ng/mL范圍內(nèi)的Impensence 口向應(yīng)曲線
(a.微陣列電極；b.納米AT0-CS復(fù)合物修飾后的電極；c.固定適配體后的電極；d.孵育四環(huán)素后的電極)
圖3適配體傳感器影響參數(shù)的優(yōu)化
(a.底液pH值的優(yōu)化；b.適配體濃度的優(yōu)化；c.孵育時間的優(yōu)化)
圖4適配體傳感器對四環(huán)素檢測的的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖5適配體傳感器在實際樣品檢測中的加標(biāo)回收率。
【具體實施方式】
[0015]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明不受實施例的限制。
[0016]實施例1 一種基于微陣列電極適配體傳感器的制備步驟:
1)微陣列電極的清洗:首先在1M NaOH溶液中浸泡15min ;然后在1M HC1溶液中浸泡15 min ;再用蘸有無水乙醇的擦鏡紙對電極表面擦拭；最終，經(jīng)超純水沖洗后，進行阻抗譜掃描，與上次裸電極的結(jié)果對比，兩者基本重合，則說明清洗干凈，否則需要重新清洗，如有需要，可以通過顯微鏡觀察微陣列電極的表面狀態(tài)，(清洗過程與乙醇、丙酮等方法進行對比清洗效果，選出了適當(dāng)?shù)那逑捶椒?；
2)納米ΑΤ0-殼聚糖溶液的制備:取0.2 g殼聚糖粉末溶解于100 mL 0.2%乙酸溶液中并不斷攪拌3 h，制備質(zhì)量分數(shù)為0.2 %的殼聚糖溶液；然后用電子天平稱量1.2 g納米ΑΤΟ粉體溶于上述制備好的4mL殼聚糖溶液中，利用超聲清洗儀超聲30min，然后置于程式振蕩器上，震蕩30min，直到溶液達到均勻穩(wěn)定的狀態(tài)。圖1為納米ΑΤΟ-殼聚糖復(fù)