檢測(cè)稻曲菌素a的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)稻曲菌素A的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明所提供的方法及其專用試劑盒所使用的抗稻曲菌素A的單克隆抗體是由小鼠雜交瘤細(xì)胞株2D3G5分泌產(chǎn)生的，該小鼠雜交瘤細(xì)胞株在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC?No.8774。本發(fā)明所提供的抗稻曲菌素A的單克隆抗體是以稻曲菌素A-OVA（稻曲菌素A和卵清白蛋白的偶聯(lián)物）為包被抗原，通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選得到的；利用該單克隆抗體制備得到的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫試劑盒，用于定性或定量檢測(cè)植物樣品中的稻曲菌素A，線性檢測(cè)范圍在2.8-72.0ng/mL，具有快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】檢測(cè)稻曲菌素A的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測(cè)稻曲菌素A的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]稻曲病(Falsesmut of rice)是由稻綠核菌(Villosiclava virens (Nakata)Tanaka&Tanaka)(無(wú)性態(tài)為:Ustilaginoidea virens (Cooke) Takahashi )侵染形成的一種世界性水稻真菌病害，也叫偽黑穗病、綠黑穗病等。自20世紀(jì)80年代以來(lái)，由于水稻品種的變化、耕作制度的改變和化學(xué)肥料的大量使用以及雜交水稻的問(wèn)世等因素，稻曲病的發(fā)生及危害呈加重趨勢(shì)，已成為中國(guó)及世界上多稻區(qū)的主要病害之一。稻曲病會(huì)嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量和品質(zhì)，更為嚴(yán)重的是稻曲病菌能產(chǎn)生毒素，為害人畜，直接影響水稻的食用安全性。迄今，稻曲病菌中已闡明的毒素有兩類，第一類為黑粉菌素(Ustilaginoidins)，屬于二萘并- Y-卩比喃酮類(Bis(naphtho_ Y_pyrone)s),為脂溶性有色物質(zhì)；另一類為稻曲菌素(Ustiloxins)，屬于環(huán)肽類，為水溶性無(wú)色物質(zhì)。稻曲菌素具有廣泛的毒性，對(duì)水稻種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)及愈傷組織生長(zhǎng)都具有毒害作用；可造成畜禽生長(zhǎng)和生殖能力的下降和內(nèi)臟器官病變；對(duì)微管蛋白組裝和細(xì)胞骨架形成具有抑制作用。
[0003]基于稻曲菌素廣泛的毒性，快速、準(zhǔn)確了解稻曲球、稻曲病菌、以及稻草和稻谷及其制品中稻曲菌素的種類和含量就顯得尤為重要。稻曲菌素A (Ustiloxin A)是主要的稻曲菌毒素成分，因此稻曲菌素的檢測(cè)分析主要針對(duì)稻曲菌素A。目前可采用薄層層析(TLC)檢測(cè)法、高效液相色譜(HPLC)法、液-質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)法進(jìn)行分析。由于免疫測(cè)定技術(shù)具有高通量、快速及靈敏度高等特點(diǎn)，在真菌毒素的檢測(cè)方面已經(jīng)獲得了廣泛的應(yīng)用。雖然文獻(xiàn)已有報(bào)道關(guān)于稻曲菌素A的抗血清，但只是定性地定位稻曲菌素A在稻曲病菌中的分布情況，基于稻曲菌素A的單克隆抗體的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒還未見(jiàn)報(bào)道，所以開發(fā)一種基于稻曲菌素A的單克隆抗體的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒具有非常重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)稻曲菌素A的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。
[0005]該方法及其專用試劑盒所使用的抗稻曲菌素A的單克隆抗體是由小鼠雜交瘤細(xì)胞株2D3G5分泌產(chǎn)生的，該小鼠雜交瘤細(xì)胞株在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC N0.8774。
[0006]上述小鼠雜交瘤細(xì)胞株2D3G5CGMCC N0.8774分泌產(chǎn)生的抗稻曲菌素A的單克隆抗體，也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0007]上述抗稻曲菌素A的單克隆抗體可用于檢測(cè)或輔助檢測(cè)稻曲菌素A，尤其適合于檢測(cè)或輔助檢測(cè)植物樣品中的稻曲菌素A。
[0008]本發(fā)明所提供的小鼠雜交瘤細(xì)胞株2D3G5CGMCC N0.8744或抗稻曲菌素A的單克隆抗體可用于制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)稻曲菌素A的試劑或試劑盒，特別是用于制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)植物樣品中的稻曲菌素A的試劑或試劑盒。
[0009]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)稻曲菌素A的試劑盒。
[0010]本發(fā)明所提供的試劑盒中含有獨(dú)立包裝的所述抗稻曲菌素A的單克隆抗體。
[0011 ] 在本發(fā)明所提供的試劑盒中，還可含有獨(dú)立包裝的稻曲菌素A標(biāo)準(zhǔn)品。
[0012]所述抗稻曲菌素A標(biāo)準(zhǔn)品可為稻曲菌素A或由所述稻曲菌素A配制成的一系列不同濃度的稻曲菌素A溶液；所述一系列不同濃度的稻曲菌素A溶液的濃度具體可為:200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL 和 3.125ng/mL,所述稻曲菌素A溶液的溶劑具體可為水，稀釋可用樣品稀釋液；所述樣品稀釋液的溶劑為水，溶質(zhì)為Na2HPO4, KH2PO4和NaCl、吐溫-20和明膠；所述Na2HPO4、所述KH2PO4和所述NaCl在所述樣品稀釋液中的濃度分別為0.02M、0.0015M和0.14M ;所述吐溫-20在所述樣品稀釋液中的體積百分含量為0.1% ;所述明膠在所述樣品稀釋液中的含量為5g/L。
[0013]在本發(fā)明所提供的試劑盒中，還可含有獨(dú)立包裝的標(biāo)記酶；所述標(biāo)記酶可為辣根過(guò)氧化酶或堿性磷酸酶。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述標(biāo)記酶具體為羊抗鼠酶標(biāo)二抗IgG-HRP (購(gòu)自Jackson公司，商品目錄號(hào)為79556)。
[0014]在本發(fā)明所提供的試劑盒中，還可含有獨(dú)立包裝的如下I)-5)試劑中的至少一種:
[0015]I)包被緩沖液:溶劑為水，溶質(zhì)為Na2CO3和NaHCO3 ;所述Na2CO3和所述NaHCO3在所述包被緩沖液中的濃度分別為0.0lM和0.04M ；pH9.6。
[0016]2)樣品稀釋液:溶劑為水，溶質(zhì)為Na2HP04、KH2POjP NaCl、吐溫-20和明膠；所述Na2HPO4、所述KH2PO4和所述NaCl在所述樣品稀釋液中的濃度分別為0.02M、0.0015M和0.14M ;所述吐溫-20在所述樣品稀釋液中的體積百分含量為0.1% ;所述明膠在所述樣品稀釋液中的含量為5g/L ;pH7.5。
[0017]3)洗滌液:溶劑為水，溶質(zhì)為Na2HP04、KH2P04、NaCl和吐溫-20 ;所述Na2HPO4、所述KH2PO4和所述NaCl在所述洗滌液中的濃度分別為0.02M、0.0015M和0.14M ;所述吐溫-20在所述洗滌液中的體積百分含量為0.1% ；pH7.5。
[0018]4)底物緩沖液:溶劑為水，溶質(zhì)為檸檬酸三鈉和Na2HPO4 ;所述檸檬酸三鈉和所述Na2HPO4在所述底物緩沖液中的濃度分別為0.0lM和0.03M ；pH5.5。
[0019]5 )終止液:2M的硫酸水溶液。
[0020]在本發(fā)明所提供的試劑盒中，還可含有獨(dú)立包裝的包被原。
[0021]所述包被原為稻曲菌素A與載體蛋白的偶聯(lián)物。在所述包被原中，所述稻曲菌素A與所述載體蛋白的質(zhì)量配比可為1.15:7.50。
[0022]在本發(fā)明中，所述載體蛋白具體為卵白蛋白(0VA)，將相應(yīng)的包被原命名為稻曲菌素A-OVA包被原。
[0023]具體的，所述稻曲菌素A-OVA包被原是按照如下步驟的方法制備得到的:
[0024](al)將稻曲菌素A溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，得到溶液A ；
[0025]所述稻曲菌素A和所述二甲基甲酰胺(DMF)的比例為2.3mg:l.0mL ；
[0026](a2)將卵白蛋白(OVA)溶解于PBS溶液中，得到溶液B ;
[0027]所述卵白蛋白(OVA)和所述PBS溶液的配比為7.5mg:l.0mL ；
[0028](a3)將所述溶液A和所述溶液B混合，使混合液中所述稻曲菌素A和所述卵白蛋白(OVA)的質(zhì)量配比為1.15:7.50，得到溶液C ;
[0029](a4)向所述溶液C中加入體積分?jǐn)?shù)5%的戊二醛水溶液，4°C過(guò)夜偶聯(lián)，PBS中透析3天，得到所述稻曲菌素A-OVA包被原；
[0030]所述體積分?jǐn)?shù)5%的戊二醛水溶液和所述溶液C的體積比為6.8 μ L: 1.5mL。
[0031]本發(fā)明的還一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)稻曲菌素A的方法。
[0032]本發(fā)明所提供的檢測(cè)或輔助檢測(cè)稻曲菌素A的方法，包括使用所述試劑盒對(duì)待測(cè)樣品(如植物樣品)進(jìn)行檢測(cè)的步驟。
[0033]所述試劑盒在定性或定量檢測(cè)稻曲菌素A中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0034]本發(fā)明還保護(hù)如下:將所述抗稻曲菌素A的單克隆抗體和固相載體相偶聯(lián)得到的免疫親和吸附劑；或以所述免疫親和吸附劑為填料的免疫親和色譜柱；或含有所述免疫親和吸附劑或所述免疫親和色譜柱的試劑盒。
[0035]所述免疫親和吸附劑、所述免疫親和色譜柱或所述試劑盒在分離純化稻曲菌素A中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0036]本發(fā)明所提供的抗稻曲菌素A的單克隆抗體是以稻曲菌素A-OVA(稻曲菌素A和卵清白蛋白的偶聯(lián)物)為包被抗原，通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選得到的；利用該單克隆抗體制備得到的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫試劑盒，用于定性或定量檢測(cè)植物樣品中的稻曲菌素A，線性檢測(cè)范圍在2.8-72.0ng/mL，具有快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。
[0037]保藏說(shuō)明
[0038]參椐的生物材料(株):2D3G5
[0039]科學(xué)描述:小鼠雜交瘤細(xì)胞株
[0040]保藏機(jī)構(gòu):中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心
[0041]保藏機(jī)構(gòu)簡(jiǎn)稱:CGMCC
[0042]地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)
[0043]保藏日期:2014年I月16日
[0044]保藏中心登記入冊(cè)編號(hào):CGMCC N0.8774
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0045]圖1為間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA中稻曲菌素A的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以不同濃度的稻曲菌素A溶液的濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo)，(B表示含有稻曲菌素A時(shí)的OD值，Btl表示不含有稻曲菌素A時(shí)的OD值)為縱坐標(biāo)，運(yùn)用0riginPro8軟件繪制得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0046]圖2為稻曲菌素A的HR-ES1-MS譜圖。
[0047]圖3為稻曲菌素A的1H NMR譜圖(D2O, 400MHz)。
[0048]圖4為稻曲菌素A的13C NMR譜圖(D2O, 400MHz)。
[0049]圖5為稻曲菌素B的HR-ES1-MS譜圖。
[0050]圖6為稻曲菌素B的1H NMR譜圖(D2O, 400MHz)。
[0051]圖7為稻曲菌素B的13C NMR譜圖(D2O, 400MHz)。
【具體實(shí)施方式】
[0052]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。[0053]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0054]弗氏完全佐劑=Sigma公司，產(chǎn)品目錄編號(hào)為F5881。
[0055]弗氏不完全佐劑=Sigma公司，產(chǎn)品目錄編號(hào)為F5506。
[0056]稻曲菌素A和稻曲菌素B (標(biāo)準(zhǔn)品):由發(fā)明人所在實(shí)驗(yàn)室分離并純化得到?？删唧w參考發(fā)明人所發(fā)表的如下論文:
[0057]Shan T, Sun W，Liu H, Gao S，Lu S，Wang M, Chen Z, Wang S，Zhou L.Determinationand analysis of ustiloxins A and B by LC-ES1-MS and HPLC in false smut balls ofrice.1nternational Journal of Molecular Sciences, 2012, 13(9):11275-11287.[0058]Shan T, Sun ff, Wang X, Fu X, Sun ff, Zhou L.Purification of ustiloxins A andB from rice false smut balls by macroporous resins.Molecules, 2013, 18(7):8181-8199.[0059]包被緩沖液:溶劑為水，溶質(zhì)為Na2COdPNaHCO3, pH值為9.6 ;溶質(zhì)Na2COjP NaHCO3在包被緩沖液中的濃度分別為0.0lM和0.04M。
[0060]洗滌液:溶劑為水，溶質(zhì)為Na2HP04、KH2PO4, NaCl和吐溫-20，pH值為7.5 ;溶質(zhì)Na2HPO4, KH2PO4和NaCl在洗滌液中的濃度分別為0.02M、0.0015M和0.14M ;吐溫-20在洗滌液中的體積百分含量為0.1%。
[0061]樣品稀釋液:溶劑為水，溶質(zhì)為Na2HP04、KH2PO4和NaCl、吐溫-20和明膠；溶質(zhì)Na2HPO4, KH2PO4和NaCl在所述樣品稀釋液中的濃度分別為0.02M、0.0015M和0.14M ;所述吐溫-20和明膠在所述樣品稀釋液中的百分含量為0.1%(ν/ν)和0.5%(w/v)。
[0062]底物緩沖液:溶劑為水，溶質(zhì)為檸檬酸三鈉和Na2HPO4, pH值為5.5 ;溶質(zhì)檸檬酸三鈉和Na2HPO4在底物緩沖液中的濃度分別為0.0lM和0.03M。
[0063]終止液:濃度為2M的硫酸水溶液。
[0064]實(shí)施例1、稻曲菌素A抗原的合成
[0065]按照如下方法合成稻曲菌素A-BSA免疫原和稻曲菌素A-OVA包被原:
[0066]取2.3mg稻曲菌素A溶解在ImL 二甲基甲酰胺(DMF)中，稱取Ilmg牛血清白蛋白(BSA)和7.5mg卵白蛋白(OVA)分別用ImL PBS溶解，然后將如上稻曲菌素A溶液分成兩等份(500 μ L/份)分別加入到BSA溶液和OVA溶液中，攪拌均勻，分別加入6.8 μ L體積分?jǐn)?shù)5%的戊二醛水溶液，4°C過(guò)夜偶聯(lián)，PBS中透析3天，得到稻曲菌素A-BSA免疫原和稻曲菌素A-OVA包被原。
[0067]實(shí)施例2、小鼠雜交瘤細(xì)胞株的獲得及抗稻曲菌素A單克隆抗體的制備
[0068]Bal b/C小白鼠:8_10周齡雌性小鼠，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
[0069]SP2/0骨髓瘤細(xì)胞:購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。
[0070]一、動(dòng)物免疫
[0071]1、以8-10周齡的雌性Bal b/C小白鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。
[0072]2、基礎(chǔ)免疫:取ImL實(shí)施例1制備的的稻曲菌素A-BSA免疫原溶液(濃度為Img/mL，溶劑為PBS)加入等體積弗氏完全佐劑，用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞榛?，直到滴入水中不擴(kuò)散。用乳化好的免疫原采用腹腔及背部皮下多點(diǎn)注射Bal b/C小白鼠，注射劑量為每只小鼠注射0.1mg稻曲菌素A-BSA免疫原，其中腹腔注射0.05mg,背部皮下注射兩點(diǎn)，0.025mg/點(diǎn)。[0073]3、加強(qiáng)免疫:基礎(chǔ)免疫2周后，取ImL實(shí)施例1制備的的稻曲菌素A-BSA免疫原溶液(濃度為lmg/mL，溶劑為PBS)，加入ImL弗氏不完全佐劑，用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢枞榛钡降稳胨胁粩U(kuò)散。將乳化好的免疫原采用腹腔及背部皮下多點(diǎn)注射Bal b/C小白鼠，注射劑量為每只小鼠注射0.1mg稻曲菌素A-BSA免疫原，其中腹腔注射0.05mg,背部皮下注射兩點(diǎn)，0.025mg/ 點(diǎn)。
[0074]二、細(xì)胞融合和克隆化
[0075]加強(qiáng)免疫每隔2周一次，從第三次加強(qiáng)免疫開始，每次免疫后第3天，從小鼠眼眶采血，測(cè)定抗體效價(jià)，效價(jià)的定義為OD值為I時(shí)的血清稀釋倍數(shù)。待效價(jià)大于1:8000 (即OD值為1，稀釋倍數(shù)為8000)后，選擇血清效價(jià)最佳的小鼠，取脾細(xì)胞，按9:1 (數(shù)量配比)t匕例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合；采用有限稀釋法篩選分泌單克隆抗體的小鼠雜交瘤細(xì)胞株；采用間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA的方法以實(shí)施例1制備得到的稻曲菌素A-OVA為包被抗原篩選分泌抗體效價(jià)高和特異性好的單克隆細(xì)胞株。
[0076]上述間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的步驟具體如下:
[0077]I)包被:在96孔酶標(biāo)板中加入100 μ L濃度為250ng/mL的稻曲菌素A-0VA溶液(溶劑為包被緩沖液)，37°C包被3小時(shí)，用洗滌液洗滌4次。
[0078]2)加樣品:抑制孔加入預(yù)先配置好的稻曲菌素A標(biāo)準(zhǔn)品(濃度為100ng/mL，溶劑為樣品稀釋液)50 μ L，空白孔加入50 μ L樣品稀釋液。
[0079]3)加抗體:將50 μ L雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液加至酶標(biāo)板中，置濕盒中37°C條件下30min,洗板4次。
[0080]4)加酶標(biāo)二抗:將羊抗鼠酶標(biāo)二抗IgG-HRP (購(gòu)自Jackson公司，商品目錄號(hào)為79556)(濃度為0.lmg/mL)用樣品稀釋液稀釋1000倍，每孔加100 μ L，置濕盒中37°C條件下30min,洗板4次。
[0081]5)顯色:取20mg鄰苯二胺(OPD)溶于IOmL底物緩沖液中，再向其中加4 μ L30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))H2O2，得到底物溶液。將底物溶液加入酶標(biāo)板中，每孔100 μ L。顯色lOmin。
[0082]6)終止:每孔加入50 μ L終止液，用酶標(biāo)儀492nm處測(cè)定各孔的OD值，部分結(jié)果見(jiàn)表1。表1中，2D3、3G9、4F7和4B11分別代表篩選過(guò)程中加入的細(xì)胞培養(yǎng)板不同孔中的雜交瘤細(xì)胞，抑制率(％)=[(空白孔OD值一抑制孔OD值)/空白孔OD值]X 100%。
[0083]表1間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法篩選雜交瘤細(xì)胞的結(jié)果
[0084]
【權(quán)利要求】
1.小鼠雜交瘤細(xì)胞株2D3G5，在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC N0.8774。
2.抗稻曲菌素A的單克隆抗體，其特征在于:所述單克隆抗體是由權(quán)利要求1所述的小鼠雜交瘤細(xì)胞株2D3G5CGMCC N0.8774分泌產(chǎn)生的。
3.權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在檢測(cè)或輔助檢測(cè)稻曲菌素A中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的小鼠雜交瘤細(xì)胞株2D3G5CGMCCN0.8774或權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)稻曲菌素A的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
5.一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)稻曲菌素A的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中含有獨(dú)立包裝的權(quán)利要求2所述的稻曲菌素A的單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中還含有獨(dú)立包裝的稻曲菌素A標(biāo)準(zhǔn)品。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中還含有獨(dú)立包裝的如下I) -5)試劑中的至少一種: 1)包被緩沖液:溶劑為水，溶質(zhì)為Na2CO3和NaHCO3;所述Na2CO3和所述NaHCO3在所述包被緩沖液中的濃度分別為0.0lM和0.04M。 2)樣品稀釋液:溶劑為水，溶質(zhì)為Na2HP04、KH2PO4和NaCl、吐溫-20和明膠；所述Na2HPO4、所述KH2PO4和所述NaCl在所述樣品稀釋液中的濃度分別為0.02M、0.0015M和0.14M ;所述吐溫-20在所述樣品稀釋液中的體積百分含量為0.1% ;所述明膠在所述樣品稀釋液中的含量為5g/L。 3)洗滌液:溶劑為水，溶質(zhì)為Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和吐溫-20 ;所述Na2HPO4、所述KH2PO4和所述NaCl在所述洗滌液中的濃度分別為0.02M、0.0015M和0.14M ;所述吐溫-20在所述洗漆液中的體積百分含量為0.1%。 4)底物緩沖液:溶劑為水，溶質(zhì)為檸檬酸三鈉和Na2HPO4;所述檸檬酸三鈉和所述Na2HPO4在所述底物緩沖液中的濃度分別為0.0lM和0.03M。 5)終止液:2M的硫酸水溶液。
8.—種檢測(cè)或輔助檢測(cè)稻曲菌素A的方法，包括使用權(quán)利要求5-7中任一所述的試劑盒對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)的步驟。
9.權(quán)利要求5-7中任一所述的試劑盒在定性或定量檢測(cè)稻曲菌素A中的應(yīng)用。
10.將權(quán)利要求2所述抗稻曲菌素A的單克隆抗體和固相載體相偶聯(lián)得到的免疫親和吸附劑；或 以所述免疫親和吸附劑為填料的免疫親和色譜柱；或 含有所述免疫親和吸附劑或所述免疫親和色譜柱的試劑盒；或 所述免疫親和吸附劑、所述免疫親和色譜柱或所述試劑盒在分離純化稻曲菌素A中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK103760353SQ201410045470
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年2月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月8日
【發(fā)明者】王保民, 周立剛, 傅小香, 單體江, 王曉晗, 賴道萬(wàn) 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)