抗菌肽awrk6在制備治療敗血癥藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及抗菌肽AWRK6在制備治療敗血癥藥物中的應(yīng)用?？咕腁WRK6，分子量為2130.5，二級結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋，等電點(diǎn)為9.60，不穩(wěn)定系數(shù)為-6.74，該肽在體內(nèi)外以劑量依賴的方式中和內(nèi)毒素，能顯著抑制內(nèi)毒素所誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α的釋放以及小鼠全血中IL-8的釋放。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，AWRK6能有效地保護(hù)肝臟免遭致死量LPS的攻擊，能顯著提高內(nèi)毒素血癥動(dòng)物的生存率，具有很好的治療效果。安全性評價(jià)表明，AWRK6對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞無毒，高劑量的AWRK6對小鼠也無明顯毒副作用。AWRK6具有開發(fā)為新一代治療由內(nèi)毒素引起的敗血性休克的新生代抗感染藥物。
【專利說明】抗菌肽AWRK6在制備治療敗血癥藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于小肽藥物應(yīng)用領(lǐng)域，具體地涉及一種抗菌肽AWRK6在制備治療敗血性 休克藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 抗生素，被廣泛用于治療由細(xì)菌引起的感染，現(xiàn)今已經(jīng)產(chǎn)生了很多副作用，如導(dǎo) 致了多重耐藥菌的出現(xiàn)，更嚴(yán)重的是，抗生素抑殺細(xì)菌使細(xì)菌死亡的同時(shí)釋放出大量內(nèi)毒 素（LPS)，釋放的內(nèi)毒素可引起多種慢性呼吸道疾病，包括慢性阻塞性肺疾病，哮喘，過敏性 肺泡炎，也可產(chǎn)生內(nèi)毒素休克，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致死亡，僅在美國每年就有接近20萬人死于敗血 癥，由革蘭氏陰性菌感染所引發(fā)的敗血癥目前已成為世界醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一大難題。
[0003] 內(nèi)毒素多由細(xì)菌分裂、死亡或是抗生素治療感染時(shí)釋放出來，可作用于多種宿主 細(xì)胞如嗜中性類細(xì)胞、肥大細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，是敗血癥的主要致病因子。具體的作用機(jī)制為 內(nèi)毒素與宿主血清蛋白（LPS結(jié)合蛋白）相互作用后激活單核細(xì)胞表面的LPS受體CD14， LPS-LBP-⑶14復(fù)合物通過與TLR4相互作用后開啟細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號通路，激活一系列轉(zhuǎn)錄 因子，包括ERK-l、C-Jun、NF-κB、CREB，誘導(dǎo)早期促炎因子（如TNF-α、IL-8、IL-lβ和 N0)釋放，進(jìn)而釋放第二波促炎因子，如血小板激活因子、白三烯，這些炎癥因子的過量表達(dá) 會(huì)引起組織損傷、凝血障礙、多器官功能障礙綜合癥（MODS)等，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致敗血癥或急性 呼吸窘迫綜合征，甚至危及病人的生命。因此，尋求新興的能夠阻斷LPS對機(jī)體免疫系統(tǒng)刺 激的治劑已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)界必要而迫切的任務(wù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于治療由內(nèi)毒素引起的敗血性休克的新生代抗感 染治劑。
[0005] AWRK6 (SWVGKHGKKFGLKKHKKH)為東北林蛙抗菌肽，由18個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子量為 2130. 5,利用HNN法預(yù)測其為二級結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)主要為a -螺旋，等電點(diǎn)為9. 60,不穩(wěn)定系數(shù) 為-6. 74,是具有較好生物穩(wěn)定性的陽離子抗菌肽。
[0006] 本發(fā)明提供的抗菌肽AWRK6可按本領(lǐng)域多肽的常規(guī)固相技術(shù)合成，小肽序列 為SWVGKHGKKFGLKKHKKH，并采用高效液相色譜和質(zhì)譜技術(shù)，鑒定小肽序列和純度（大于 98 % )，冷凍干燥得到白色粉末狀抗菌肽AWRK6。）
[0007] 本發(fā)明，通過一系列的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)對AWRK6抗內(nèi)毒素活性進(jìn)行評估，并進(jìn)一步對 其安全性進(jìn)行評價(jià)，為其開發(fā)為新一代治療由內(nèi)毒素引起的敗血性休克的新生代抗感染治 劑提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[0008] AWRK6具備良好的中和LPS的結(jié)構(gòu)特征。結(jié)果表明，AWRK6在體內(nèi)外均表現(xiàn)出了良 好的中和內(nèi)毒素活性，并能以劑量依賴的方式顯著抑制由內(nèi)毒素所誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-a 和IL-8的釋放。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，AWRK6能有效地保護(hù)肝臟免遭致死量LPS的攻擊，能 顯著提高內(nèi)毒素血癥動(dòng)物的生存率，起到很好的治療效果，AWRK6對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞無 毒，高劑量的AWRK6對小鼠也未表現(xiàn)出任何毒副作用。
[0009] 通過本發(fā)明，表明了抗菌肽AWRK6可在制備治療敗血性休克藥物中的應(yīng)用。特別 是用于制備治療由內(nèi)毒素引起的敗血性休克藥物中的應(yīng)用。抗菌肽AWRK6的有效劑量為 2-10mg/kg/ 天。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 圖1 :AWRK6體外中和內(nèi)毒素活性；
[0011] 圖中，**表示與只加 LPS組相比表現(xiàn)出極顯著差異（p〈0. 01)，PMB:多粘菌素 B。
[0012] 圖2 :AWRK6抑制LPS所誘導(dǎo)的全血中IL-8的釋放；
[0013] 圖中，*表示與只加 LPS組相比差異顯著（p〈0. 05)，**表示與只加 LPS組相比差 異極顯著（P〈〇. 01)，PMB :多粘菌素 B。
[0014] 圖3 :AWRK6抑制LPS所誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF- α的釋放；
[0015] 圖中，**表示與只加 LPS組相比差異極顯著（ρ〈0. 01)，ΡΜΒ :多粘菌素 Β。
[0016] 圖4 :AWRK6對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞毒性分析。
[0017] 圖5 :不同濃度AWRK6治療后內(nèi)毒素血癥小鼠生存曲線圖
[0018] 圖中，*表示與內(nèi)毒素血癥組相比生存差異顯著（p〈0. 05)，**表示與內(nèi)毒素血癥 組相比生存差異極顯著（Ρ〈〇· 01)，cum survival (1.0)表示存活率為100%。
[0019] 圖6 :AWRK6和PMB治療組小鼠生存曲線圖；
[0020] 圖中，*表示與內(nèi)毒素血癥組相比生存差異顯著（p〈0. 05)，**表示與內(nèi)毒素血癥 組相比生存差異極顯著（P〈〇. 01)。
[0021] 圖7 :AWRK6治療內(nèi)毒素血癥小鼠時(shí)間依賴性結(jié)果。
[0022] 圖8 :AWRK6中和內(nèi)毒素血癥小鼠血清中內(nèi)毒素的結(jié)果圖；
[0023] 圖中，**表示與內(nèi)毒素血癥小鼠組相比差異極顯著（p〈0. 01)。
[0024] 圖9 :AWRK6抑制內(nèi)毒素血癥小鼠血清中LPS所誘導(dǎo)的IL-8的產(chǎn)生；
[0025] 圖中，**表示與內(nèi)毒素血癥小鼠組相比差異極顯著（p〈0. 01)。
[0026] 圖10 :AWRK6抑制內(nèi)毒素血癥小鼠血清中LPS所誘導(dǎo)的TNF- α的產(chǎn)生；
[0027] 圖中，**表示與內(nèi)毒素血癥小鼠組相比差異極顯著（ρ〈0. 01)。
[0028] 圖11 :AWRK6保護(hù)肝臟免遭致死量LPS的損傷的組織學(xué)結(jié)果；
[0029] 圖中，A.陰性對照；B. LPS攻擊小鼠24小時(shí)肝臟；C. AWRK6治療組小鼠24小時(shí)肝 臟；D. PMB治療組小鼠24小時(shí)肝臟；E. AWRK6治療96小時(shí)肝臟；F. PMB治療組小鼠96小時(shí) 肝臟。
[0030] 圖12 :高劑量的AWRK6(50mg/kg)處理小鼠后的生存曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0031] 一、AWRK6體外中和LPS活性檢測
[0032] 方法：通過EliSa實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測，具體步驟為：10ul濃度梯度AWRK6(終濃度5，10， 20ug/ml)在96孔板中與10ul LPS(終濃度0. 2ng/ml)在37°C孵育30min，多粘菌素 B(PMB) 作為陽性對照，殘余的LPS含量通過Elisa檢測。
[0033] 抗菌肽AWRK6體外中和內(nèi)毒素（LPS)活性檢測結(jié)果如圖1所示。從圖1可見，AWRK6 和陽性對照組PMB在體外都以劑量依賴的方式顯著降低內(nèi)毒素含量，與陰性對照相比差異 極顯著（p〈〇.〇l)。說明抗菌肽AWRK6具有體外中和內(nèi)毒素活性。
[0034] 二、LPS誘導(dǎo)的全血中IL-8水平檢測
[0035] 方法：通過心臟穿刺將血液收集到肝素化采血管中，使25ul LPS (終濃度5ng/ml) 在96孔板中與25ulAWRK6 (終濃度5,10, 20ug/ml)在37°C中預(yù)孵育30min，將200ul血液 加入96孔板中，血液與LPS混合物在37°C中孵育24h，1200rmp8min，取10ul上層血漿通過 Elisa分析炎癥因子IL-8水平。
[0036] 抗菌肽AWRK6抑制LPS所誘導(dǎo)的全血中IL-8的釋放結(jié)果如圖2所示。從圖2可 見，當(dāng)細(xì)胞用AWRK6 (或PMB)和LPS共同孵育，與只用LPS刺激組相比，IL-8分泌量顯著降 低，且IL-8的降低與藥物劑量呈正相關(guān)，與PMB相比，在一定濃度下AWRK6對LPS所誘導(dǎo)的 IL-8釋放表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制活性。
[0037] 三、LPS誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α水平檢測
[0038] 方法：小鼠摘眼球放血，75%酒精浸泡3min，腹腔注入4mll640培養(yǎng)基（含 雙抗），輕柔腹部2min，吸出腹腔液于10ml離心管中，再洗兩次腹腔，收集到的腹腔液 1200rmpl0min，棄上清，用1640培養(yǎng)基（含雙抗）重懸，1200rmpl0min，棄上清，加1640培 養(yǎng)基（含10%胎牛血清+雙抗），懸浮，計(jì)數(shù)，以2X 105細(xì)胞/孔于96孔板培養(yǎng)過夜，棄上 清，PBS洗一次，加入160ul新鮮1640完全培養(yǎng)基，加入濃度梯度AWRK6 (終濃度5,10, 20ug/ ml)和LPS(終濃度5ng/ml)在37°C中作用6h，相應(yīng)濃度的PMB作為陽性對照，取10ul上 清Elisa檢測TNF-a含量。
[0039] 抗菌肽AWRK6抑制LPS所誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF- a的釋放的結(jié)果如圖3 所示，從圖3可見，當(dāng)細(xì)胞用AWRK6(或PMB)和LPS共同孵育，與只用LPS刺激相比，TNF-a 分泌量顯著降低，且TNF-a的降低與藥物劑量呈正相關(guān)，與PMB相比，在相同濃度下AWRK6 對LPS所誘導(dǎo)的TNF- a釋放表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制活性。
[0040] 四、細(xì)胞毒性分析
[0041] 方法：通過細(xì)胞增殖試劑盒_8 (CCK-8)檢測AWRK6對正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞是否 有毒副作用，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞以2X 104個(gè)/孔鋪進(jìn)96孔板，培養(yǎng)3小時(shí)后，加藥物刺激 (終濃度5, 10, 20ug/ml)，有細(xì)胞無藥物組作為對照，無細(xì)胞無藥物組作為空白對照，作用4 小時(shí)后，每孔加10ulCCK-8,再孵育3小時(shí)后，酶標(biāo)儀450nm檢測吸光度。細(xì)胞活率=[(A-A 空白）/ (A 對照-A 空白）]X 100 (η = 4)。
[0042] 抗菌肽AWRK6對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞毒性分析結(jié)果如圖4所示，從圖4可見，在中和 內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)中所使用到的AWRK6和ΡΜΒ濃度，經(jīng)檢測對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞均無毒性，因?yàn)榧?xì) 胞活率均高于90%。更重要的是，AWRK6不僅對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞無毒，而且在一定程度上 促進(jìn)了細(xì)胞的增殖，因?yàn)榧?xì)胞活率均超過100%，且以劑量依賴的方式增加。
[0043] 以上四個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AWRK6在體外以劑量依賴的方式中和內(nèi)毒素，能顯著抑制 內(nèi)毒素所誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-a的釋放以及小鼠全血中IL-8的釋放，且AWRK6 對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞并無毒副作用。
[0044] 五、抗菌肽AWRK6體內(nèi)抗敗血癥活性評估
[0045] (1)齊?量依賴性分析
[0046] 為了檢測AWRK6能否在體內(nèi)清除內(nèi)毒素，構(gòu)建小鼠內(nèi)毒素血癥模型。昆明小鼠，平 均體重20 ± 2g，購自沈陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心并在20 ± 2°C條件下飼養(yǎng)，小鼠自由攝食、飲 水。實(shí)驗(yàn)前先讓小鼠適應(yīng)5天環(huán)境。每組10只小鼠，給小鼠注射0. 5ml的LPS (50mg/Kg)， 在無治療的情況下，小鼠在48小時(shí)內(nèi)死亡率為100%，實(shí)驗(yàn)組同時(shí)注射0.5ml的濃度抗菌 肽AWRK6 (10mg/Kg，5mg/Kg，2. 5mg/Kg)，每8小時(shí)記錄下小鼠的存活狀況，共持續(xù)168小時(shí)。
[0047] 結(jié)果如圖5所示，從圖5可見，LPS攻擊小鼠在無治療情況下48小時(shí)內(nèi)全部死亡， 相比之下，AWRK6治療后存活率顯著增加，經(jīng)2. 5,5,10mg/kg AWRK6治療七天后內(nèi)毒素血癥 小鼠存活率分別為20 %，50 %，90 %。這些數(shù)據(jù)表明AWRK6在體內(nèi)可以有效保護(hù)小鼠免遭致 死量LPS攻擊。
[0048] 從劑量依賴性結(jié)果可知，10mg/Kg AWRK6治療效果最佳，治愈率達(dá)90%，且小鼠的 基本生存活動(dòng)完全恢復(fù)，進(jìn)食及運(yùn)動(dòng)均恢復(fù)正常，故選用該濃度進(jìn)行之后的實(shí)驗(yàn)。
[0049] (2) AWRK6治療內(nèi)毒素血癥活性與PMB相比較
[0050] 給小鼠注射0· 5ml致死量的的LPS(50mg/Kg)，同時(shí)注射0· 5ml的PMB(2. 6mg/Kg)， 每8小時(shí)記錄下小鼠的存活狀況，共持續(xù)168小時(shí)，并對該試驗(yàn)結(jié)果與AWRK6進(jìn)行比較。
[0051] 結(jié)果如圖6所示，從圖6可見，內(nèi)毒素血癥小鼠接受相應(yīng)濃度AWRK6和PMB治療七 天后，存活率分別為90%和60%，與LPS組相比均表現(xiàn)出顯著性差異。
[0052] (3)時(shí)間依賴性分析
[0053] 每組10只小鼠，分別在注射致死量LPS(50mg/Kg) 1小時(shí)前、同時(shí)及1小時(shí)后注射 抗菌肽AWRK6 (10mg/Kg)，每8小時(shí)觀察各組小鼠的存活狀態(tài)，共持續(xù)168小時(shí)。
[0054] 結(jié)果如圖7所示，從圖7可見，不同注射時(shí)間的各組間小鼠存活率并無顯著差異， 即治療效果與給藥時(shí)間并無顯著差異。
[0055] ⑷AWRK6對內(nèi)毒素血癥動(dòng)物血液中內(nèi)毒素清除作用分析
[0056] 每組10只小鼠，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射0. 5ml LPS(50mg/kg)，治療組分別同時(shí)注射 AWRK (10mg/kg)和PMB (2. 6mg/kg)，只注射生理鹽水組作為空白對照。注射LPS60min后小鼠 摘眼球取血，3000 X g4°C lOmin收集血清，收集的血清樣本于-20°C中保存直至通過Elisa 檢測血液中LPS含量。
[0057] 結(jié)果如圖8所示，從圖8可見，AWRK6和PMB均能顯著降低內(nèi)毒素血癥小鼠血清中 內(nèi)毒素含量，且在相同濃度下，AWRK6表現(xiàn)出更強(qiáng)的中和內(nèi)毒素活性。
[0058] (5) AWRK6對LPS所誘導(dǎo)的小鼠血液中TNF- α和IL-8釋放量的影響
[0059] 每組10只小鼠，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射0· 5ml LPS(20mg/kg)，治療組分別同時(shí)注射 AWRK(10mg/kg)和PMB(2.6mg/kg)，只注射生理鹽水組作為空白對照。由于注射LPS大 約一小時(shí)后血液中TNF-α和IL-8含量達(dá)到峰值，因而收集注射LPS90min的小鼠血， 3000 X g4°C lOmin收集血清，收集的血清樣本于-20°C中保存直至通過Elisa檢測血液中 TNF-α 和 IL-8。
[0060] 結(jié)果如圖9和圖10所示，從圖9和圖10可見，AWRK6可以有效抑制IL-8和TNF-a 釋放，與對空白照組差異極顯著，且與陽性對照PMB相比，在相同濃度下AWRK6在降低IL-8 和TNF-a含量上表現(xiàn)出更強(qiáng)的活性。
[0061] (6)組織學(xué)分析
[0062] 每組3只小鼠，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射0. 5ml LPS (50mg/kg)，治療組分別同時(shí)注射 AWRK(10mg/kg)和PMB(2.6mg/kg)，只注射生理鹽水組作為空白對照。存活的小鼠分別在 24,96小時(shí)眼球放血，取肝臟，pH7. 4的PBS清洗后放到10%中性福爾馬林中室溫下固定24 小時(shí)以上。組織樣本用濃度梯度的酒精脫水（75% ,85% ,95%，100% andlOO% )，二甲苯 透明，然后包埋入固體石蠟中，5um切片，42°C水浴展片，切片用蘇木精、伊紅染色后觀察并 拍照。
[0063] 結(jié)果如圖11所示，從圖11可見，只注射生理鹽水的小鼠肝臟并未發(fā)生任何病變 (圖11A)，然而，致死量LPS攻擊小鼠24小時(shí)肝臟表現(xiàn)出了急性損傷，如，中性類細(xì)胞浸潤， 細(xì)胞密度降低，細(xì)胞間隙增大（圖11B)。與只接受LPS攻擊組小鼠相比，AWRK6治療組小鼠 在治療24小時(shí)之后，肝臟損傷明顯降低（圖11C)，表現(xiàn)為中性類細(xì)胞浸染數(shù)量相對較少，細(xì) 胞密度相對較高，細(xì)胞間隙相對較小，PMB治療效果與之相似（圖11D)。AWRK6治療96小 時(shí)后，損傷更小，幾乎恢復(fù)正常（圖11E)，PMB治療96小時(shí)后治療效果略差于AWRK6,但也 基本恢復(fù)正常（圖11F)。這些結(jié)果表明，AWRK6可以有效保護(hù)肝臟免遭LPS攻擊。
[0064] (7)動(dòng)物毒性分析
[0065] 為了檢測高劑量AWRK6是否對小鼠有毒害作用，我們使用了 50mg/kg AWRK6,這是 本文試驗(yàn)中所使用的最高劑量的五倍劑量。小鼠腹腔注射該劑量AWRK6,每8小時(shí)記錄小鼠 存活率，試驗(yàn)共進(jìn)行七天。
[0066] 結(jié)果如圖12所示，從圖12可見，所有的小鼠在腹腔注射50mg/kg的AWRK6,7天后 10只小鼠全部存活，且存活狀態(tài)與未經(jīng)處理小組并無差異，這表明高劑量AWRK6對哺乳類 動(dòng)物無明顯毒性。
[0067] 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分表明，AWRK6能顯著降低內(nèi)毒素血癥小鼠血清中內(nèi)毒素、IL-8 和TNF-α含量，這一結(jié)果與前期的體外試驗(yàn)結(jié)果相一致。更重要的是，AWRK6能有效地保 護(hù)肝臟免遭致死量LPS的攻擊，能有效的保護(hù)小鼠免于LPS所誘發(fā)的急性死亡。這些結(jié)果 均表明AWRK6在治療敗血癥方面展現(xiàn)出很好的潛能，且與陽性對照PMB相比，AWRK6無論在 中和內(nèi)毒素，降低炎癥因子釋放還是保護(hù)內(nèi)毒素血癥小鼠免遭死亡方面，在一定濃度下，都 表現(xiàn)出更強(qiáng)的活性。此外，AWRK6對哺乳類腹腔巨噬細(xì)胞無毒副作用，且高劑量的AWRK6對 哺乳動(dòng)物也無毒害作用，這對AWRK6治療由于內(nèi)毒素引起的敗血癥方面展現(xiàn)出了很好的應(yīng) 用潛能。
【權(quán)利要求】
1. 抗菌肽AWRK6在制備治療敗血癥藥物中的應(yīng)用。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：抗菌肽AWRK6在制備治療內(nèi)毒素引起的敗 血性休克藥物中的應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：抗菌肽AWRK6中和內(nèi)毒素。
4. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：抗菌肽AWRK6抑制由內(nèi)毒素所誘導(dǎo)的炎癥 因子的釋放。
5. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的炎癥因子是TNF-α和IL-8。
6. 如權(quán)利要求1-5任一所述的應(yīng)用，其特征在于：抗菌肽AWRK6的有效劑量為2-10mg/ kg/ 天。
7. 如權(quán)利要求1-5任一所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的抗菌肽AWRK6的序列是 SffVGKHGKKFGLKKHKKH〇
【文檔編號】A61P31/04GK104147589SQ201410345566
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月18日
【發(fā)明者】王秋雨, 王歡, 金莉莉, 王錚 申請人:遼寧大學(xué)