重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白rLZ-8在治療肺癌，喉癌和腦膠質(zhì)瘤中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白rLZ-8在治療肺癌，喉癌和腦膠質(zhì)瘤中的應(yīng)用。本發(fā)明分別通過尾靜脈注射方法建立了肺癌小鼠模型、皮下移植瘤方法建立了喉癌及腦膠質(zhì)瘤的裸鼠動物模型研究rLZ-8的體內(nèi)抗腫瘤作用，治療結(jié)果表明rLZ-8對肺癌、喉癌及腦膠質(zhì)瘤有明顯的抗腫瘤作用。
【專利說明】重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白rLZ-8在治療肺癌，喉癌和腦膠質(zhì) 瘤中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白（rLZ-8)在制備治療抗腫 瘤藥物中的應(yīng)用，重點(diǎn)涉及重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白（rLZ-8)在抗肺癌、喉癌以及腦膠質(zhì)瘤的 生長的治療作用，提高改善荷瘤小鼠生活狀態(tài)及提高荷瘤小鼠存活率。。

【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌是來源于支氣管或細(xì)支氣管表皮細(xì)胞的惡性腫瘤，占肺實(shí)質(zhì)惡性腫瘤的 90-95%。肺癌是肺部最常見的原發(fā)性惡性腫瘤。世界衛(wèi)生組織調(diào)查報告，許多國家和地區(qū)， 肺癌的發(fā)病率占惡性腫瘤的首位。本病多在40多歲以上發(fā)病，發(fā)病年齡高峰在60-79歲 之間。男女患病率為2. 3:1。肺癌起源于支氣管粘膜上皮，局限于基底膜內(nèi)者成為原位癌， 可向支氣管腔內(nèi)或/和臨近的肺組織生長，并可通過淋巴血行或經(jīng)支氣管轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。肺癌 主要有兩大基本類型，即小細(xì)胞肺癌（SCLC)和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC)。其中非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC)發(fā)生更多，約80%的肺癌患者屬于這種類型。目前小細(xì)胞肺癌患者主要用化學(xué)療法 治療，外科治療對這種類型肺癌患者并不起主要作用。外科治療主要適用于非小細(xì)胞肺癌 患者。
[0003] 肺癌的主要原因是由于外界環(huán)境危險因素暴露的逐漸增加，如吸煙和被動吸煙人 群的大范圍存在、呼吸系統(tǒng)疾病(肺結(jié)核、慢性阻塞性肺疾患、哮喘等）的增加、城市大氣污 染的增加、廚房油煙的不完全處理、新鮮蔬菜和水果攝入量減少等。目前肺癌治療方面尚未 做到早期發(fā)現(xiàn)，早期診斷及早期治療，多數(shù)病人在第一次外科診斷時病變已屬晚期。所以， 盡快開發(fā)和研究出肺癌的有效治療藥物是目前科學(xué)研究的一個重大而又艱巨的任務(wù)。
[0004] 喉癌（Laryngocarcinoma)為消化系統(tǒng)癌癥的一種。大多數(shù)的喉癌都是鱗狀細(xì)胞癌 (laryngealsquamouscellcarcinoma,LSCC)，所占比例約95%左右，可見喉癌主要是于喉 上皮的鱗狀上皮細(xì)胞上形成。喉癌可以在喉的任何一個位置形成，而喉癌的康復(fù)率很受癌 細(xì)胞位置的影響。喉癌主要可分為三個基本類型：聲門型(聲帶)，聲門上型(聲襞)和聲門下 型。喉癌以聲門型最為普遍，其次是聲門上型，而最少出現(xiàn)的就是聲門下型。據(jù)統(tǒng)計資料， 喉癌占全身惡性腫瘤的1. 2-1. 6%，占頭頸惡性腫瘤的3. 3-8. 1%。喉癌具有高發(fā)病率、高復(fù) 發(fā)率的特點(diǎn)，男性發(fā)病居多，每年新發(fā)病人為3. 5-5. 5/10萬，女性為0. 6/10萬，發(fā)達(dá)國家發(fā) 病率較高，死亡率約為2. 4/10萬，女性為0. 3/10萬。呼吸道腫瘤中，喉癌發(fā)病率居第2位。 [0005]目前喉癌的治療主要是通過手術(shù)、放療、化療、生物治療手段的合理應(yīng)用，以達(dá)到 最大程度消滅腫瘤、保留喉功能、提高患者生存率。其中手術(shù)治療是喉癌的首選治療方法， 但是手術(shù)治療不可避免地造成喉部損害，同時也會影響病人的生活質(zhì)量。喉癌的放療適用 于病變>lcm、表淺、無轉(zhuǎn)移的聲門上型喉癌，且全身情況差，不宜手術(shù)者。但是喉癌細(xì)胞對 輻射的靈敏度不同，有些抗輻射的細(xì)胞即使在高強(qiáng)度的照射下也會存活。喉癌的誘導(dǎo)化療 對器官保留有重要作用，目前臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，化療可以提高保喉率，減少遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，對 患者總的生存率并無提高。
[0006] 腦膠質(zhì)瘤（Glioma)是膠質(zhì)瘤的一種，膠質(zhì)瘤是一種始于腦部或者脊柱的腫瘤，它 被稱為膠質(zhì)瘤的原因是其由膠質(zhì)細(xì)胞癌變產(chǎn)生，其中腦部的膠質(zhì)瘤是最常見的。腦部腫瘤 與中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性的異質(zhì)群體有關(guān)，是一種危及生命，存活率較低的疾病。原 發(fā)性惡性腦瘤的年發(fā)病率大約是24000例。惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤是發(fā)生于神經(jīng)膠質(zhì)部位的腫 瘤，發(fā)生率占腦瘤的70%。
[0007]目前腦膠質(zhì)瘤的治療方法主要包括手術(shù)治療、放療和化療。腦膠質(zhì)瘤的特點(diǎn)是呈 彌漫性、侵襲性向周圍腦組織浸潤生長，與周圍組織無明顯界限，故手術(shù)不能完全切除腫 瘤，還可能激活處于休眠期的瘤細(xì)胞，使之迅速浸入增殖期，導(dǎo)致切除后易復(fù)發(fā)，多于瘤床 2cm范圍內(nèi)復(fù)發(fā)，治療效果較差。放療在治療腦膠質(zhì)瘤方面，作用十分有限，當(dāng)放射劑量達(dá) 到73-80Gy時，才能對膠質(zhì)瘤細(xì)胞形成有效殺傷，而正常腦組織所能耐受劑量僅有60Gy，而 且部分惡性腦瘤需進(jìn)行大范圍腦部放射線治療或全顱及脊椎放射治療，故放療對病人學(xué)習(xí) 和記憶能力均會造成一定的損傷。目前由于腦膠質(zhì)瘤對化療藥物產(chǎn)生一定的耐藥性并且大 部分治療腦膠質(zhì)瘤的化療藥物具有較強(qiáng)的毒副作用，故腦膠質(zhì)瘤的化療藥物的療效較低。
[0008] 靈芝（Ganodermalucidum)是一種藥用真菌，作為中藥材已有數(shù)千年的藥用歷 史，據(jù)報道，靈芝有免疫調(diào)節(jié)以及抗腫瘤作用。靈芝中的活性成分之一靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋 白（LZ-8)是從赤靈芝中提取的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白，本論文提供的重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白 (RecombinantGanodermalucidumimmunoregulatoryprotein,rLZ_8)是重新設(shè)計編石馬并 全合成LZ-8基因，并通過畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)并純化獲得的蛋白樣品，以往研究表 明，rLZ-8也具有一定的抗腫瘤活性，例如，rLZ-8可有效殺傷人肺腺癌腫瘤細(xì)胞(A549)，人 胃腺癌細(xì)胞（SGC7901)等腫瘤細(xì)胞株，但關(guān)于rLZ-8對肺癌、喉癌及腦膠質(zhì)瘤的治療作用尚 未見報道。本發(fā)明提出rLZ-8對肺癌、喉癌及腦膠質(zhì)瘤均有顯著的治療效果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明涉及rLZ-8在制備治療肺癌、喉癌及腦膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用，通過一系列 的實(shí)驗(yàn)手段及結(jié)果表明rLZ-8對肺癌、喉癌及腦膠質(zhì)瘤均具有顯著的抑制作用，具體發(fā)明 內(nèi)容如下： ⑴采用健康靈活C57BL/6小鼠建立了肺癌轉(zhuǎn)移瘤模型。設(shè)計了rLZ-8體內(nèi)抗肺癌實(shí)驗(yàn) 分組，其中包括正常對照組、模型組、rLZ-8低劑量組、rLZ-8中劑量組、rLZ-8高劑量組在內(nèi) 的5個實(shí)驗(yàn)組，各組給藥劑量與給藥方式以及治療時間詳見實(shí)施例3,以荷瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移瘤 結(jié)節(jié)數(shù)與生存時間作為考察對象，分別給藥30天與給藥60天后，統(tǒng)計各組小鼠肺結(jié)節(jié)數(shù)與 生存情況，計算出rLZ-8對荷瘤小鼠腫瘤抑制率以及荷瘤小鼠存活率。
[0010] ⑵采用健康靈活的BALB/c-nude裸鼠建立了喉癌裸鼠皮下移植瘤模型。設(shè)計了包 括模型對照組(生理鹽水)、rLZ-8低劑量組、rLZ-8中劑量組、rLZ-8高劑量組在內(nèi)的4個實(shí) 驗(yàn)組，其中rLZ-8低、中、高劑量組的劑量分別為125μ8/1^、250yg/kgjOOyg/kg，給藥 時間為60天與90天。治療效果指標(biāo)主要記錄體重、瘤重、瘤體積并以瘤重為依據(jù)計算腫瘤 抑制率等。分別將數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計學(xué)分析得出rLZ-8在治療喉癌的效果顯著。
[0011] ⑶采用健康靈活的BALB/c-nude裸鼠建立了腦膠質(zhì)瘤裸鼠皮下移植瘤模型。設(shè)計 了包括模型對照組(生理鹽水)、rLZ-8低劑量組、rLZ-8中劑量組、rLZ-8高劑量組在內(nèi)的4 個實(shí)驗(yàn)組，其中，rLZ-8低、中、高劑量組的劑量分別為125μg/kg、250μg/kg、500μg/kg。 給藥天數(shù)為60天與90天。治療效果指標(biāo)主要記錄體重、瘤重、瘤體積并以瘤重為依據(jù)計算 腫瘤抑制率等。分別將數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計學(xué)分析得出rLZ-8具有體內(nèi)抗腦膠質(zhì)瘤的治療效果 顯著。
[0012] 經(jīng)過一系列rLZ-8對肺癌、喉癌及腦膠質(zhì)瘤皮下移植瘤小鼠實(shí)驗(yàn)動物模型的藥效 學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rLZ-8能夠改善荷瘤小鼠的生存狀態(tài)，抗腫瘤效果顯著。
[0013] 本發(fā)明有益效果：本發(fā)明采用體內(nèi)試驗(yàn)方式驗(yàn)證rLZ-8在治療肺癌、喉癌及腦膠 質(zhì)瘤的應(yīng)用，通過一系列的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，rLZ-8治療肺癌、喉癌及腦膠質(zhì)瘤效果顯 著，其中，rLZ-8在肺癌的治療過程中不僅挺高了腫瘤抑制率延長荷瘤小鼠的存活時間，而 且出現(xiàn)了一定比例的肺癌結(jié)節(jié)數(shù)消失的荷瘤小鼠模型，這是發(fā)明人意想不到的；同時在治 療喉癌及腦膠質(zhì)瘤的應(yīng)用同樣出現(xiàn)了皮下實(shí)體瘤消失的治療效果。

【具體實(shí)施方式】
[0014] 實(shí)施例1rLZ-8對肺轉(zhuǎn)移小鼠（LLC)腫瘤抑制率及其荷瘤存活率的影響 1藥物配制 將rLZ-8蛋白原液的濃度為lmg/ml分別配置成rLZ-8低劑量（250μg/kg) 31. 25μg/ml溶液，rLZ-8 中劑量（500μg/kg) 62. 5μg/ml溶液，為rLZ-8 高劑量（1000μg/kg) 125μg/ml溶液。
[0015] 肺癌小鼠模型的建立 收集對數(shù)生長期的LLC細(xì)胞，1000r/min離心5min，除去上清液，將細(xì)胞懸浮于生理鹽 水溶液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為8. 5X106/ml。取細(xì)胞懸液尾靜脈接種于小鼠體內(nèi)，接種細(xì)胞數(shù) 為1. 7X106個/只，接種體積為0. 2ml/只。
[0016] 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法 健康靈活C57BL/6小鼠126只隨機(jī)分為7組，每組18只，每組選出9只作為30天給藥 組，剩余9只作為60天給藥組。第1天小鼠造模結(jié)束后開始給藥，分別給藥治療30天與給 藥60天，考察給藥周期對治療效果的影響。具體分組及給藥方式見表1。
[0017]表1實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法(包括給藥30天與給藥60天）

【權(quán)利要求】
1. 重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白rLZ-8在治療肺癌，喉癌和腦膠質(zhì)瘤中的應(yīng)用。
2. 如權(quán)利要求1所述肺癌，其特征在于肺癌包括小細(xì)胞肺癌（SCLC)和非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC)。
3. 如權(quán)利要求1所述喉癌，其特征在于喉癌包括聲門型(聲帶)，聲門上型(聲襞）和聲 門下型。
4. 如權(quán)利要求1所述腦膠質(zhì)瘤，其特征在于腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生部位包括腦部或者脊柱。
5. 如權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于該藥物制劑核心成分是由權(quán)利要求1所述的重 組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白（rLZ-8)和任選的藥學(xué)可接受的輔劑組成。
6. 如權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于給藥途徑為口服和非腸道給藥，其中，口服包括 口服液，片劑，丸劑和膠囊；非腸道給藥包括外用藥和注射劑。
【文檔編號】A61K38/16GK104043105SQ201410270401
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年6月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月18日
【發(fā)明者】孫非, 梁重陽, 張喜田 申請人:張喜田, 孫非