專利名稱：：編碼草菇真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的基因序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種分子生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的基因序列，具體是一種編碼草菇真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的基因序列。
背景技術(shù)：
：真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白(FungalImmunomodulatoryproteins,FIPs)是從一些高等擔(dān)子菌(蘑燕類)子實(shí)體中提取的與植物凝集素和免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)和免疫功能相似的一類小分子蛋白質(zhì)。自1989年日本學(xué)者Kino等從赤靈芝(Ganodermalucidium)子實(shí)體中分離提取出第一個(gè)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白(LZ-8)以來，目前己分別從松杉靈芝(G.tsugae)、金針菇(Flammulinavelutipes)、松茸(Tricholomamatsutake)、蒙古口蘑(T.mongolicum)、大蟬草(Cordycepscicadae)禾口草菇(Volvariellavolvacea)等的子實(shí)體中提取出多種真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白，這些免疫調(diào)節(jié)蛋白的氨基酸序列分別具有60%-70%的同源性，形成了一個(gè)新的蛋白家族。該家族的蛋白具有相似的生理功能，如對(duì)機(jī)體具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能，在體內(nèi)促進(jìn)人外周血淋巴細(xì)胞和小鼠脾臟細(xì)胞的有絲分裂；減少抗原誘導(dǎo)型抗體的形成以及抑制非胖糖尿病小鼠的自身免疫，顯示了對(duì)機(jī)體免疫能力的抑制作用。不同的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白家族成員不僅在氨基酸序列上存在差異，在體內(nèi)與體外具有不同程度的免疫調(diào)節(jié)功能。Kino，K等在《JournalofBiologicalChemistry》(生物化學(xué)雜志)1989年第l期472-478頁發(fā)表了題為《Isolationandcharacterizationofanewi咖unomodulatoryprotein,lingzhi_8(LZ-8)，fromGanodermalucidium》(分離及描述在赤靈芝中的一種新的免疫調(diào)節(jié)蛋白，lingzhi-8(LZ-8))—文，文中評(píng)述，赤靈芝的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白(FIP-Glu)在體外具有凝集山羊(she印綿羊)紅細(xì)胞的作用，但對(duì)人紅細(xì)胞不起作用，在體內(nèi)能阻止大鼠過敏反應(yīng)，減少抗體的產(chǎn)生；Ko,J.L等在《EuropeanJournalofBiochemistry》(歐洲生化雜志)1995年第2期244-249頁發(fā)表了題為《ANewFungalImmunomodulatory3Protein,FIP-fveIsolatedfromtheEdibleMushroom,Fla鵬ulinavelutipesanditsCompleteAminoAcidSequence》(從食用真菌金針燕中分離得到了一種新的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白，F(xiàn)IP-fve，及其完整的氨基酸序列)一文，文中評(píng)述，金針菇的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白(FIP-Fve)在體外具有凝集人紅細(xì)胞的作用，能提高IL-2與干擾素Y的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，可激活人外周血淋巴細(xì)胞，在體內(nèi)也能阻止過敏反應(yīng)；Hsu，H.C等在《BiochemicalJournal》(生物化學(xué)雜志)1997年增刊第2期557-565頁發(fā)表了題為《Fip-vvo，anewfungalimmunomodulatoryproteinisolatedfromVolvariellavolvacea》(從草燕中分離到了一種新的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白，F(xiàn)ip-vvo)—文，文中評(píng)述，草菇的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白(FIP-Vvo)在體外具有凝集兔紅細(xì)胞的作用，可激活人外周血淋巴細(xì)胞，也可提高IL-2，IL-4與干擾素Y的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，在體內(nèi)能減小小鼠阿爾圖斯反應(yīng)，但不能阻止過敏反應(yīng)。不僅如此，不同的FIP家族成員在促發(fā)免疫響應(yīng)過程中存在劑量效應(yīng)。比如在對(duì)小鼠血凝集實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)IP-Glu的最低有效濃度為O.10ug/mL、FIP-Vvo的最低有效濃度為O.05ug/mL。不同的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白家族成員在激活人外周血淋巴細(xì)胞(hPBL)增殖時(shí)有效劑量不同，如FIP-Fve的有效濃度為100ug/mL，而FIP-vvo的有效濃度僅為5ng/mL;由于真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白在真菌的子實(shí)體中含量較低，Hsu,H.C等在《BiochemicalJournal》(生化雜志)1997年增刊第2期557-565頁發(fā)表了題為《Fip-vvo,anewfungalimmunomodulatoryproteinisolatedfromVolvariellavolvacea》(從草菇中分離到了一種新的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白，F(xiàn)ip-vvo)—文，文中評(píng)述，從3kg草燕子實(shí)體中提純Fip-vvo，經(jīng)不同純化步驟最終所獲得的蛋白質(zhì)僅115mg，并且直接從這些真菌中提取天然的免疫調(diào)節(jié)蛋白成本較高且費(fèi)時(shí)，因此利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)有活性的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白，其前景受到關(guān)注。經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，張介馳，孔祥輝，張丕奇等在《吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)》2007年第29巻第5期第304308頁發(fā)表了"金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白基因克隆及其表達(dá)"，文中提及，目前人們僅從赤靈芝(G.lucidium)(GenBank登陸號(hào)AY449802、AY449803、AY449804、E02372、M58032)、紫芝(G.sinense)(AY449805)和紫芝(G.japonicum)(AY987805)和金針燕中克隆到FIP基因，缺少從草菇中克隆編碼真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因的報(bào)道；Lin，W.H等在《JournalofBiologicalandChemistry》(生物化學(xué)雜志)1997年第32期20044-20048頁發(fā)表了題為《DimerizationoftheN-terminalamphipathicalpha-helixdomainofthefungalimmunomodulatoryproteinfromGanodermatsugae(Fip-gts)definedbyayeasttwo-hybridsystemandsite-directedmutagenesis》(利用酵母雙雜交及定點(diǎn)突變確定松衫靈芝中真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白分子氮末端的兩性a螺旋結(jié)構(gòu)域)一文，文中評(píng)述，使用已克隆的基因在原核生物中的表達(dá)，產(chǎn)量較低還不能達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求，僅為20mg/L?，F(xiàn)有技術(shù)中天然真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的產(chǎn)量低，已經(jīng)克隆的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因在原核生物中的表達(dá)達(dá)不到工業(yè)化的要求，這些缺點(diǎn)和不足是本發(fā)明能夠針對(duì)性解決的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種編碼草菇真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的基因序歹U。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了該基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)，進(jìn)而提高FIP-Vvo(真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白)的產(chǎn)量。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明涉及一種編碼草菇真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的基因序列，具有SEQIDNO.1中第1-339位所示的核苷酸序列或在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDNO.1中第1-339位所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。所述中度嚴(yán)謹(jǐn)條件指用2XSSC、0.1%SDS洗膜。所述基因序列與SEQIDNO.1中第1-339位所示的核苷酸序列有至少85%的同源性。所述基因序列編碼的多肽具有SEQIDN0.2所示的氨基酸序列。本發(fā)明按照大腸桿菌偏愛密碼子結(jié)構(gòu)，人工合成FIP-Vvo基因，該基因編碼在氨基酸水平上與野生型FIP-Vvo具有相同功能的氨基酸序列。本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明按照大腸桿菌偏愛密碼子的優(yōu)化結(jié)構(gòu)，人工合成了草菇真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因，使之在大腸桿菌中高度表達(dá)，提高了草菇真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)量，降低了工業(yè)發(fā)酵的成本，在工業(yè)上具有廣闊的產(chǎn)業(yè)化前景，本發(fā)明為真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白大規(guī)模生產(chǎn)和作為藥物或健康產(chǎn)品應(yīng)用提供了依據(jù)。本發(fā)明中所涉及的菌株大腸桿菌DH5a、大腸桿菌BL21(DE3)已在《汪玲玲，楊輯，黃誠之，王海洪；大腸桿菌ho10-ACP的過表達(dá)、分離純化及長鏈脂酰ACP5的合成，微生物學(xué)報(bào)，2008，48(7):963-969》中公開；本發(fā)明涉及的菌株可通過公開市售的商業(yè)渠道取得，如上海天根生物公司，公司地址上海市漕溪路258弄27號(hào)航星商務(wù)樓1號(hào)樓606室。本發(fā)明中所涉及的大腸桿菌M15已在《和生琦，丁國富，李斌，李軍，羅平，董燕，張蓉，顏偉，周紅；青霉素結(jié)合蛋白2aC-末端在大腸桿菌M15中的表達(dá)、純化及鑒定，創(chuàng)傷外科雜志，2007，9(1):28-31》中公開；本發(fā)明涉及的M15大腸桿菌菌株可通過公開市售的商業(yè)渠道取得，如北京博邁德科技發(fā)展有限公司，公司地址北京市海淀區(qū)西四環(huán)中路甲59號(hào)。圖1為人工合成FIP-Vvo基因電泳圖2為FIP-Vvo基因誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物電泳檢測(cè)圖3為FIP-Vvo基因時(shí)間梯度誘導(dǎo)表達(dá)電泳檢測(cè)圖4為FIP-Vvo基因在大腸桿菌中的可溶性分析電泳檢測(cè)圖5為Western檢測(cè)圖6為紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)室具體的試驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例步驟一，按照細(xì)菌偏愛密碼子化學(xué)合成草菇真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因1、根據(jù)草菇真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白氨基酸序列，按照大腸桿菌偏愛密碼子對(duì)照表(見表l)設(shè)計(jì)合成能夠包含全部FIP-Vvo基因序列的8條寡聚核苷酸(見表2)，每條寡聚核苷酸約60bp，這8條寡聚核苷酸中相鄰的兩條寡聚核苷酸有18bP的重疊區(qū)域。6表l<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2、將表2中Vvo-2Vvo-7所示的六條寡聚核苷酸各取1WL，混合后取0.5yL作為模板，將Vvo-l和Vvo-8所示的兩條寡聚核苷酸各取1PL作為引物，利用KODplus聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序如下94'C變性2min后，按照94。C，15sec;58°C，15sec;72°C，20sec進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；之后再加入rTaq聚合酶lnL，在72。C下延伸20min。PCR電泳圖如圖1所示，圖中，泳道M:DL2，000TMDNAMarker(TaKaRa);泳道1-4:人工合成FIP-Vvo基因。3、將PCR產(chǎn)物連入pMD18-T克隆載體中測(cè)序測(cè)序結(jié)果顯示草薛真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因共有339個(gè)核苷酸序列，除了3'端的3個(gè)核苷酸為終止密碼子外，由336個(gè)核苷酸序列推導(dǎo)出的氨基酸序列共有112個(gè)，分子量為12.8KDa，等電點(diǎn)為8.09，序列詳見SEQIDNO.2。按大腸桿菌偏愛密碼子設(shè)計(jì)人工合成的FIP-Vvo基因序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸禾口蛋白質(zhì)同源檢索，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)與人工合成的FIP-Vvo核苷酸序列或是以人工合成的FIP-Vvo核苷酸序列推導(dǎo)出的蛋白質(zhì)氨基酸序列相似的野生型FIP-Vvo的任何序列。利用BLAST程序比對(duì)人工合成的FIP-Vvo氨基酸序列和野生型FIP-Vvo氨基酸序列(BiochemicalJournal.1997,323:557-565)，結(jié)果顯示他們的氨基酸殘基的同源性達(dá)到100%，見氨基酸序列同源比較(FASTA)，見表3。由此可見，設(shè)計(jì)合成的FIP-Vvo與野生型FIP-Vvo在蛋白質(zhì)水平上一致同源，可以認(rèn)為兩者在功能上也相同。表3Score=232bits(591),Expect=8e-60Identities=112/112(100%),Positives=112/112(100%),Gaps=0/112(0%)Query1STDLTQLLFFIAYNLQKVNFDYTPQWQRGNPSSYIDAVVFPRVLTNKAYQYRVVTGDKDL60STDLTQLLFFIAYNLQKVNFDYTPQWQRGNPSSYIDAVVFPRVLTNKAYQYRVVTGDKDLSbjct1STDLTQLLFFIAYNLQKVNFDYTPQWQRGNPSSYIDAVVFPRVLTNKAYQYRVVTGDKDL60Query61GIKPSYSVQADGSQ,LLEYNGGYGVADTTTIKIYWDPSNGNQYLIAQWK112GIKPSYSVQADGSQKVNLLEYNGGYGVADTTTIKIYVVDPSNGNQYLIAQWKSbjct61GIKPSYSVQADGSQKVNLLEYNGGYGVADTTTIKIYVVDPSNGNQYLIAQWK112Query:草恭真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白(FIP-Vvo)的氨基酸序列(BiochemicalJournal.1997,323:557-565)Sbjct:按大腸桿菌偏愛密碼子設(shè)計(jì)人工合成的FIP-Vvo氨基酸序列步驟二，草薛真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因在細(xì)菌中的表達(dá)1、大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建在保證閱讀框正確的前提下，將含有合成基因FIP-Vvo的pQE-30質(zhì)粒載體的大腸桿菌DH5a接種到含有Kanamycin和Carbenicillin抗生素的LB培養(yǎng)基中，在37C的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)過夜，過夜的細(xì)菌按照分子克隆所提供的方法，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。抽提8質(zhì)粒，采用熱激法將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌M15。2、FIP-Vvo基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)(1)將含有FIP-Vvo基因的重組大腸桿菌細(xì)胞用無菌牙簽挑取單克隆，接種于10mL的LB培養(yǎng)基中37'C培養(yǎng)過夜；(2)取過夜培養(yǎng)的菌液2.5mL接種于50mLLB培養(yǎng)基中，37°C，250rpm振蕩培養(yǎng)至光密度0D6。。=0.5-0.7;(3)向菌液中加入IPTG，使IPTG的終濃度達(dá)到lmM，繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時(shí)。3、FIP-Vvo基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)(1)將M15大腸桿菌，轉(zhuǎn)入pQE-30的M15大腸桿菌及轉(zhuǎn)入pQE30-FIP-Vvo的M15大腸桿菌37。C振蕩培養(yǎng)至0D6。。=0.5-0.7時(shí)，分別做未用IPTG誘導(dǎo)和使用IPTG誘導(dǎo)處理；(2)分別取菌液樣品lmL，4，000轉(zhuǎn)離心20min，去上清；(3)用100uL2XSDS-PAGESampleBuffer重懸沉淀；(4)95°C水浴5min;(5)取20nL用15%SDS-PAGE檢測(cè)，考馬斯亮藍(lán)染色。檢測(cè)結(jié)果見圖2，圖中，泳道M:中分子量蛋白質(zhì)Marker(Sangon);泳道l:未使用IPTG誘導(dǎo)的E.coliM15;泳道2:使用IPTG誘導(dǎo)的E.coliM15;泳道3:未使用IPTG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)入pQE-30的E.coliM15;泳道4:使用IPTG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)入pQE-30的E.coliM15;泳道5:未使用IPTG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)入pQE-FIP-Vvo的E.coliM15;泳道6:使用IPTG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)入pQE-FIP-Vvo的E.coliM15。4、FIP-Vvo基因時(shí)間梯度誘導(dǎo)表達(dá)檢測(cè)將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌37。C振蕩培養(yǎng)至OD6。。=0.5-0.7時(shí)，取出lml菌液樣品，-2(TC保存?zhèn)溆茫蚴Ｓ嗑褐屑尤隝PTG至終濃度為lmM，按照誘導(dǎo)0.5、1、2、3、4、5、6小時(shí)各取lml菌液-2(TC保存?zhèn)溆茫?5。C融化菌液，4，000轉(zhuǎn)離心20min，去上清；用100uL2XSDS-PAGESampleBuffer重懸沉淀；95°C水浴5min;取20nL用15%SDS-PAGE檢測(cè)，考馬斯亮藍(lán)染色。結(jié)果見圖3，圖中，泳道M:中分子量蛋白質(zhì)Marker(Sangon);泳道1:未使用IPTG誘導(dǎo)；泳道2-8:使用IPTG分別誘導(dǎo)0.5，1，2，3，4，5，6小時(shí)。95、FIP-Vvo基因在大腸桿菌中的可溶性分析(1)將50ml轉(zhuǎn)化的大腸桿菌37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。=0.5-0.7;(2)4,000轉(zhuǎn)離心20min，去上清；(3)將收集到的菌體用5mLLysisBuffer懸浮菌液，用液氮冰凍樣品，再在冷水(2°C—4°C)中解凍；(4)冰上超聲破碎菌體，250W，6次，每次10秒，中間間隔10秒；(5)將超聲破碎后的混合液13,000rpm離心20分鐘，取出上清保存在冰上；(6)將沉淀在5mLLysisBuffer中重懸；(7)各取50uL可溶性蛋白和非可溶性蛋白與50uL2XSDS-PAGESampleBuffer混合均勻，95°C水浴5min;(8)取20yL用15。/。SDS-PAGE檢測(cè)，考馬斯亮藍(lán)染色。檢測(cè)結(jié)果見圖4，圖中泳道M:中分子量蛋白質(zhì)Marker(Sangon);泳道1:未使用IPTG誘導(dǎo)；泳道2:使用IPTC誘導(dǎo)；泳道3:可溶性蛋白；泳道4:非可溶性蛋白；泳道5:純化表達(dá)產(chǎn)物。6、Western檢測(cè)將樣品通過15%SDS-PAGE檢測(cè)的凝膠電轉(zhuǎn)到0.2um的PVDF膜。利用His-Tag抗體雜交檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果見圖5，圖中，泳道l:未使用IPTG誘導(dǎo)；泳道2-8:使用IPTG分別誘導(dǎo)0.5，1，2，3，4，5，6小時(shí)。步驟三，重組草菇真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的純化及功能驗(yàn)證1、重組草菇真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的純化(1)將步驟二中獲得的誘導(dǎo)的50ml菌液4,OOOg離心20分鐘；(2)用5mLLysisBuffer懸浮菌液，用液氮冰凍樣品，再在冷水(2°C—4。C)中解凍；(3)冰上超聲破碎菌體，250W，6次，每次10秒，中間間隔10秒；(4)將超聲破碎后的混合液13,000rpm離心20分鐘；(5)將上清通過鎳離子鰲合柱純化蛋白，收集目的蛋白。利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白含量，經(jīng)過5小時(shí)的誘導(dǎo)表達(dá)，可溶性草菇真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白占到大腸桿菌總可溶性蛋白的15.38%，而Hsu,H.C從天然的草菇子實(shí)體中純化出的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的含量是非常低的，從3kg草菇子實(shí)體中10經(jīng)不同純化步驟最終所獲得的蛋白質(zhì)僅115mg(Hsu，H.C.Fip-vvo，anewfungalimmunomodulatoryproteinisolatedfromVolvariellavolvacea.BiochemicalJournal(生化雜志)，1997年增刊第2期557-565)。2、重組草菇真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的凝血功能取小鼠全血，用PBS洗滌5次后，以1.5%(v/v)懸浮于PBS，將純化的FIP-Vvo用PBS稀釋成不同的濃度(30ng/mL至50ug/mU，各取100uL處理好的血液及純化的FIP-Vvo混合后加入U(xiǎn)型底的96孔板，37。C培養(yǎng)4小時(shí)，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果見圖6，當(dāng)FIP-Vvo的濃度大于O.05Ug/mL時(shí)對(duì)小鼠血紅細(xì)胞具有凝集作用。3、重組草菇真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的促有絲分裂活性取人外周血淋巴細(xì)胞，懸浮于RPMI1640培養(yǎng)基(可通過公開市售的商業(yè)渠道取得，如上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，公司地址上海市松江區(qū)車墩工業(yè)區(qū)香閔路698號(hào))，并將細(xì)胞調(diào)至5Xl()6個(gè)/mL。將100u1細(xì)胞懸液加入96孔板中，同時(shí)加入用100yL用PBS稀釋成不同濃度的FIP-Vvo(30ng/mL至50yg/mL)，將96孔板放置在5%(V/V)C02，37'C條件下培養(yǎng)42小時(shí)后，加入20yLWST-8(已在《朱慧利，沈薇，陳忠勇；柳氮磺胺吡啶誘導(dǎo)HSC-T6肝星狀細(xì)胞凋亡及其機(jī)制，第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008,30(1):70-74》文獻(xiàn)中公開，可在碧云天生物技術(shù)研究所購得，公司地址江蘇省海門市解放東路602號(hào))繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)，在450nm測(cè)定吸光值，結(jié)果表明，F(xiàn)IP-Vvo的有效濃度為5yg/mL。序列表<110>上海交通大學(xué)<120>編碼草恭真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的基因序列<160>2<170>PatentInversion3.1〈210〉1<211>339〈212〉DNA,<213〉人工合成<400>1agcaccgatctgacccagctgctgttttttattgcgtataacctgcagaaagtgaacttt60gattataccccgcagtggcagcgtggcaacccgagcagctatattgatgcggtggtgttt120ccgcgtgtgctgaccaacaaagcgtatcagtatcgtgtggtgaccggcgataaagatctg180ggcattaaaccgagctatagcgtgcaggcggatggcagccagaaagtgaacctgctggaa240tataacggcggctatggcgtggcggataccaccaccattaaaatttatgtggtggacccg300agcaacggcaaccagtatctgattgcgcagtggaaataa33912<210>2〈211〉112<212>PRT<213〉草恭(Volvariellavolvacea)<400〉2AspLeuThrGinLeuLeu5AspSerThr1LysValSerTyrTyrGin50SerTyr65TyrAsnAsnlie35TyrPhe20AspTyrThrProAlaValValArgValValSerValGinGlyGlyValValAspPro100Tyr85SerAla70GlyThr55AspPhe40GlyGlyValAlaAsnGlyAsnPhePhelieAlaTyrAsnLeuGin1015GinTrpGinArgGlyAsnProSer2530ProArgValLeuThrAsnLysAla45AspLysAspLeuGlylieLysPro60SerGinLysValAsnLeuLeuGlu7580AspThrThrThrlieLyslieTyr9095GinTyrLeulieAlaGinTrpLys1051101權(quán)利要求1、一種編碼草菇真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的基因序列，其特征在于，具有SEQIDNO.1中第1-339位所示的核苷酸序列或在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDNO.1中第1-339位所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的編碼草菇真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的基因序列，其特征是，所述中度嚴(yán)謹(jǐn)條件指用2XSSC、0.P/。SDS洗膜。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的編碼草菇真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的基因序列，其特征是，所述基因序列與SEQIDNO.1中第1-339位所示的核苷酸序列有至少85%的同源性。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的編碼草菇真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的基因序列編碼的多肽，其特征是，具有SEQIDN0.2所示的氨基酸序列。全文摘要一種分子生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的編碼草菇真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白的基因序列，該基因具有SEQIDNO.1中第1-339位所示的核苷酸序列或在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQIDNO.1中第1-339位所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，該基因序列編碼的多肽具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了該基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)，進(jìn)而提高FIP-Vvo(真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白)的產(chǎn)量。文檔編號(hào)C07K14/37GK101509001SQ20091004778公開日2009年8月19日申請(qǐng)日期2009年3月19日優(yōu)先權(quán)日2009年3月19日發(fā)明者周選圍,李奇璋,娟林申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)