專利名稱：蛋白在基因修飾真菌中的表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過真菌的基因修飾來提高目的蛋白的產(chǎn)量。此外，本發(fā)明還涉及新型的基因重組物，含有這些構(gòu)建物的真菌，其蛋白產(chǎn)量明顯地增加。
背景技術(shù)：
真菌表達(dá)體系在生產(chǎn)目的蛋白中的應(yīng)用在本領(lǐng)域是眾所周知的。例如，真菌表達(dá)體系中生產(chǎn)的外源蛋白已應(yīng)用于生物量的轉(zhuǎn)化、洗滌劑、纖維素酶底物的去皮，以及其他工業(yè)酶。其他目的外源蛋白，例如食品添加劑或補(bǔ)充劑、藥物化合物、抗體、蛋白試劑等，以及工業(yè)用蛋白都可用真菌表達(dá)體系生產(chǎn)。
很多微生物產(chǎn)生水解纖維素的酶，包括腐木菌木霉屬(Trichoderma)，復(fù)合細(xì)菌嗜熱單孢屬(Thermomonospora)，桿菌屬(Bacillus)，和纖維單孢屬(Cellulomonas)；鏈霉菌屬(Streptomyces)，以及真菌腐質(zhì)霉屬(Humicola)、曲霉屬(Aspergillus)和鐮刀霉屬(Fusarium)。這些微生物所產(chǎn)生的酶是蛋白混合物，并以三種作用方式參與纖維素向葡萄糖的轉(zhuǎn)化，例如葡聚糖內(nèi)切酶(EG)、纖維二糖水解酶(CBH)，和β-葡萄糖苷酶。EG和CBH酶總稱為“纖維素酶”。EG酶在隨機(jī)位置切斷纖維素聚合物，直至可被CBH酶作用。舉例來說，木霉株產(chǎn)生至少四種不同的EG酶，已知為EGI、EGII、EGIII和EGV。CBH酶連續(xù)將纖維二糖分子從纖維素聚合物的末端釋放出來。纖維二糖是水溶性的β-1，4-連接的葡萄糖二聚體。木霉中有兩種主要的CBH酶，CBHI和CBHII。β-葡萄糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖。木霉產(chǎn)生一種葡萄糖苷酶。
上述β-葡萄糖苷酶催化的纖維素水解的最后一步是重要的一步，因?yàn)槠咸烟侨菀淄ㄟ^各種酵母發(fā)酵為乙醇，而纖維二糖不能發(fā)酵為乙醇。水解結(jié)束后殘留的纖維二糖表示損失的乙醇產(chǎn)量。更重要的是，纖維二糖是CBH和EG酶的很強(qiáng)的抑制劑。纖維二糖濃度僅為3.3g/L時(shí)，即可使木霉CBH和EG酶的水解速度降低50％。由于水解速度的降低，必須加入更多的纖維素酶，這樣反過來又影響了整個(gè)工藝的經(jīng)濟(jì)性。因此，生產(chǎn)乙醇時(shí)，水解過程中的纖維二糖的蓄積是很不希望出現(xiàn)的。
因?yàn)槟久购推渌a(chǎn)生纖維素酶的微生物只產(chǎn)生很少的β-葡萄糖苷酶，所以在酶催化的水解過程中纖維二糖的積蓄成為主要問題。β-葡萄糖苷酶占木霉產(chǎn)生的總蛋白的1％以下。低水平的β-葡萄糖苷酶量導(dǎo)致缺乏將纖維二糖水解為葡萄糖的能力，并且在水解過程中，纖維二糖的積蓄量可達(dá)到10～20g/L。這種高水平的纖維二糖使纖維素酶的需要量比含有適當(dāng)量的β-葡萄糖苷酶時(shí)增加了10倍。
現(xiàn)已提出了幾種方法來克服纖維素酶中β-葡萄糖苷酶的不足。
一種途徑是用產(chǎn)生少量纖維素的微生物來生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，并將這種外源的β-葡萄糖苷酶加入纖維素酶中，提高其水解能力。產(chǎn)生這種β-葡萄糖苷酶的微生物中最成功的是黑曲霉(Aspergillusniger)和海棗曲霉(Aspergillus phoenicis)。來源于這些微生物的β-葡萄糖苷酶市售品如Novo Nordisk生產(chǎn)的Novozym188，但是，作為乙醇生產(chǎn)過程的商業(yè)化生物質(zhì)，所需量的成本太高。
克服β-葡萄糖苷酶不足的第二種途徑是纖維素的水解與葡萄糖的酵母發(fā)酵同時(shí)進(jìn)行，即所謂的同時(shí)糖化和發(fā)酵(SSF)方法。在SSF系統(tǒng)中，葡萄糖的發(fā)酵可將其本身從溶液中除去。葡萄糖是強(qiáng)的β-葡萄糖苷酶的抑制劑，因此，SSF的目的是增加β-葡萄糖苷酶的效率。然而，SSF系統(tǒng)尚未實(shí)現(xiàn)商業(yè)化，因?yàn)槔w維素酶要求的溫度條件為50℃，對(duì)此來說，酵母的作用溫度28℃太低了；采用折衷溫度37℃則效率很低，且容易造成微生物污染。
克服β-葡萄糖苷酶不足的第三種途徑是采用基因工程的方法使該酶過表達(dá)，并增加木霉的β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)量。這種方法已被Barnett、Berka和Fowler采用，例如“Trichoderma reesi胞外β-葡萄糖苷酶基因的克隆和擴(kuò)增纖維質(zhì)底物糖化方法的檢驗(yàn)或改良評(píng)估”Bio/Technology，Vol.9，1991.6，p.562-567，在此稱為“Barrett等”；以及Fowler、Barnett和Shoemaker的WO92/10581“Trichoderma reeseiβ-葡萄糖苷酶基因的克隆和擴(kuò)增，以及纖維素的改良糖化方法”，在此稱為“Fowler等”。
Barnett等和Fowler等都描述了將多拷貝的β-葡萄糖苷酶基因?qū)隩richoderma reesei(以下，也可略作T.reesei)株P(guān)40中。兩個(gè)研究小組均構(gòu)建了質(zhì)粒pSASβ-glu，該質(zhì)粒為含有T.reesei基因組β-葡萄糖苷酶基因和amd S標(biāo)記篩選的轉(zhuǎn)化載體。amd S基因來源于構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)，并編碼乙酰胺酶，它可使轉(zhuǎn)化細(xì)胞在以乙酰胺為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長。T.reesei不具有與amd S基因等同的功能，因此不能利用乙酰胺作為氮源。該轉(zhuǎn)化細(xì)胞含有10-15個(gè)β-葡萄糖苷酶基因的拷貝，其產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶比未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞高出5.5倍。
Barnett等和Fowler等所獲得的β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量的提高并不能緩解其在纖維素水解中的不足。天然木霉株的β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量，舉例來說，必須增加至少10倍才能滿足纖維素水解的需要。
在木霉中過表達(dá)蛋白時(shí)，一種策略是將目的基因直接與cbh1啟動(dòng)子或cbh1分泌信號(hào)連接。因?yàn)镃BH1是木霉在纖維素酶的誘導(dǎo)條件下產(chǎn)量最豐富的蛋白，所以認(rèn)為cbh1啟動(dòng)子和分泌信號(hào)在指導(dǎo)蛋白的轉(zhuǎn)錄和分泌中是非常有效的，該蛋白由基因重組物中位于上述啟動(dòng)子和分泌信號(hào)之后的基因編碼。這種策略已成功地應(yīng)用于過表達(dá)木霉和其他微生物蛋白(“在Trichoderma reesei中表達(dá)Trichoderma harzianum內(nèi)切殼聚糖酶以及該內(nèi)切殼聚糖酶的改良生產(chǎn)方法”Margolles-Clark，Hayes，Harman and Penttila，Appl.Environ.Microbiol.62(6)2145-2151，1996；“Trichoderma reesei和Hormoconis resinae葡糖淀粉酶P(gamP)基因的轉(zhuǎn)化異源葡糖淀粉酶在Trichoderma reesei中的生產(chǎn)”Joutsjouki，Torkkeli and Nevalainen，1993，Curr.Genet.24223-228；“Trichoderma reesei中高頻一步基因置換1.葡聚糖內(nèi)切酶I的過剩生產(chǎn)”Karhunen，Mantyla，Nevalainen and Suominen，1993，Mol.Gen.Genet.241515-522)。
另一個(gè)用真菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的工業(yè)酶的例子是木聚糖酶。某些商業(yè)上最重要的木聚糖酶屬于木聚糖酶家族11。如果某種木聚糖酶具有家族11共有的氨基酸，包括兩個(gè)作為必要的催化殘基的谷基酸殘基，則可將這種木聚糖酶屬于家族11。按Trichoderma reesei的木聚糖酶II編號(hào)，這些殘基為86位和177位氨基酸。木聚糖酶家族11共有的氨基酸記載于Wakarchuck，et al，Protein Science 3467-475(1994)。
藥學(xué)上重要的外源蛋白的表達(dá)，例如對(duì)胰島素(Goeddel D.V.etal.，1979，Proc.Nat.Acad.Sci.76 106-110)和凝血因子Xa(Smith D.B.1988，Gene 6731-40)用細(xì)菌表達(dá)體系的表達(dá)已有報(bào)道。與此類似，U.S.4,751,180公開了在酵母中表達(dá)外源蛋白，其中包括胰島素和IgF-2。
已有報(bào)道用絲狀真菌Trichoderma reesei生產(chǎn)外源的牛凝乳酶原(Harkki A.et al.，1989，Bio/Technol.7596-603)，其基因重組物包括cbh1(纖維二糖水解酶I基因)調(diào)控區(qū)和終止子、cbh1或凝乳酶信號(hào)序列，以及也可包括cbh1的間插區(qū)。Margolles-Clark E等(1996，App Environ Microbiol.，622152-2155)公開了用Trichoderma reesei的cbl1啟動(dòng)子來表達(dá)T.haraianum的內(nèi)切殼多糖酶。同樣，目的蛋白例如凝乳酶也已用絲狀真菌構(gòu)巢曲霉和泡盛曲霉(A.awamori)生產(chǎn)，其所用的基因重組物包括glaA(葡糖糖化酶)基因的調(diào)控區(qū)和分泌信號(hào)、glaA或凝乳酶的信號(hào)序列，以及葡糖糖化酶(EP 215,594)的間插區(qū)。在后面的兩鐘情況中，蛋白產(chǎn)物在宿主中的轉(zhuǎn)錄不是外源蛋白生產(chǎn)的限制因素。但是，分泌到宿主體外的蛋白產(chǎn)物量低，從而造成胞外蛋白的收率很低。
在試圖增加絲狀真菌表達(dá)體系生產(chǎn)的外源蛋白在胞外的蓄蓄積量方面，Lawlis(1997，US 5,679,543)公開了采用多組分的融合多肽來增加目的蛋白的分泌和在胞外的蓄積。該基因重組物是編碼包括4個(gè)部分的融合蛋白的復(fù)合物，4個(gè)部分包括信號(hào)肽、分泌多肽或其部分(載體蛋白)、可斷裂的接頭多肽以及所需表達(dá)的目的多肽。蛋白分泌水平的提高歸結(jié)于將glaA信號(hào)序列與全長糖化酶(載體蛋白)的融合，或是與其他在宿主內(nèi)分泌的蛋白融合，融合產(chǎn)物然后進(jìn)一步與可斷裂的接頭以及目的蛋白(凝乳酶)融合。已發(fā)現(xiàn)在真菌構(gòu)巢曲霉中進(jìn)行表達(dá)時(shí)，這種基因重組物增加了融合多肽的分泌。
雖然在US 5,679,543中提到采用該4組分的融合蛋白可增加分泌水平，但這種表達(dá)載體的生產(chǎn)是復(fù)雜的。這種表達(dá)體系要求采用6部分的基因重組物，由此基因重組物來表達(dá)含有4-部分蛋白產(chǎn)物、表達(dá)蛋白和各種載體蛋白的復(fù)合物。此外，因?yàn)楸磉_(dá)蛋白中包含了載體蛋白，所以目的表達(dá)產(chǎn)物中約有50％不能回收，同時(shí)，目的蛋白的表達(dá)后處理和純化還導(dǎo)致了成本增加。為了回收最終的目的蛋白產(chǎn)物，還需要進(jìn)行重要的分泌后加工，其中包括接頭的去除和培養(yǎng)基的酸化。
在本領(lǐng)域需要有一種簡(jiǎn)單的系統(tǒng)，該系統(tǒng)能使目的蛋白在宿主細(xì)胞中高水平地表達(dá)和分泌。該系統(tǒng)中所用的基因重組物中優(yōu)選包含較少的組成部分，以便于制備嵌合結(jié)構(gòu)。而且，采用這種基因重組物時(shí)表達(dá)和分泌水平必須要高，同時(shí)還優(yōu)選在回收目的蛋白時(shí)不需要或少需要下游操作。
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)。
結(jié)合本發(fā)明的主要權(quán)利要求、從屬權(quán)利要求的特征，以及由這些特征引申出的本發(fā)明的實(shí)施方案，則可達(dá)到上述目的。
發(fā)明的概述本發(fā)明涉及通過真菌的基因修飾來提高目的蛋白的產(chǎn)量。此外，本發(fā)明還涉及新型的基因重組物，含有這些結(jié)構(gòu)的真菌，其蛋白產(chǎn)量和分泌量都明顯地增加。本發(fā)明的基因重組物可在真菌表達(dá)體系中增強(qiáng)目的蛋白的生產(chǎn)。
能達(dá)到上述目的的基因重組物中包含以下DNA序列。該DNA序列包括一個(gè)以上的調(diào)控元件，以及與該調(diào)控元件相連并受該調(diào)控元件調(diào)控的編碼木聚糖酶分泌信號(hào)以及目的蛋白的核苷酸序列，此外還可含有編碼間插區(qū)的核苷酸序列。
本發(fā)明涉及的核苷酸序列包括調(diào)控區(qū)，以及與該調(diào)控區(qū)相連并受該調(diào)控區(qū)調(diào)控的木聚糖酶分泌序列和目的基因，其中，該調(diào)控區(qū)或目的基因中至少有一方與木聚糖酶蛋白的生產(chǎn)是非正常關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是針對(duì)于上述定義的核苷酸序列，其中的調(diào)控區(qū)選自cbh1、cbh2、eg1、eg2、eg3、eg5、xln1和xln2。
本發(fā)明也涉及上所定義的核苷酸序列，其中的目的基因選自編碼某種蛋白的基因，這種蛋白可用于醫(yī)藥、營養(yǎng)品、工業(yè)產(chǎn)品、動(dòng)物飼料、食品添加劑或酶。優(yōu)選該目的基因編碼某種酶，這種酶選自β-葡萄糖苷酶、纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素降解酶、蛋白酶、果膠酶和過氧化物酶。
以上所定義的本發(fā)明的核苷酸序列，還可進(jìn)一步包含間插序列。
本發(fā)明也涉及包含以上定義的核苷酸序列的載體，以及含有該載體的轉(zhuǎn)化絲狀真菌。本發(fā)明還涉及含有上述定義的核苷酸序列的絲狀真菌。優(yōu)選的轉(zhuǎn)化絲狀真菌選自木霉屬(Trichoderma)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、鐮刀霉屬(Fusarium)、曲霉屬(Aspergillus)、葡萄孢屬(Botrytis)、疣孢霉屬(Mycogone)、輪枝孢屬(Verticillium)、鏈霉屬(Streptomyces)、毛盤孢屬(Colletotrichum)、鏈孢霉屬(Neurospora)、灰側(cè)耳菌屬(Pleurotus)、青霉屬(Penicilium)、頭孢屬(Cephalosporium)、漆斑菌屬(Myrothecium)、絲葚霉屬(Papulospora)、綿霉屬(Achlya)、柄孢殼屬(Podospora)、內(nèi)座殼屬(Endothia)、毛霉屬(Mucor)、旋孢腔菌屬(Cochilobbolus)、Tolypocladium、梨孢霉屬(Pyricularia)、青霉屬(Penicillum)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、耙菌屬(Irpex)、葡萄穗霉屬(Stachybotrys)、帚霉屬(Scorpulariopsis)、毛殼霉屬(Chaetomium)、粘帚霉屬(Gilocladium)、頭孢霉屬(Cephalosporin)、支頂孢屬(Acremonium)。
本發(fā)明包含在絲狀真菌中生產(chǎn)目的蛋白的方法。該方法包括用一種核酸序列轉(zhuǎn)化絲狀真菌，該核酸序列包括調(diào)控區(qū)，與該調(diào)控區(qū)相連并受該調(diào)控區(qū)調(diào)控的木聚糖酶分泌序列以及目的基因，其中，該調(diào)控區(qū)或目的基因中至少有一方與木聚糖酶蛋白的生產(chǎn)是非正常關(guān)聯(lián)，以及其中的木聚糖酶分泌序列與該絲狀真菌是異源或同源；培養(yǎng)該絲狀真菌，并促使該絲狀真菌生產(chǎn)目的蛋白。此外，本方法還涉及目的蛋白的純化。
本發(fā)明的目的在于，提供在絲狀真菌中生產(chǎn)目的蛋白的方法。該方法包括，用一種核酸序列轉(zhuǎn)化絲狀真菌，該核酸序列包括調(diào)控區(qū)，與該調(diào)控區(qū)相連并受該調(diào)控區(qū)調(diào)控的木聚糖酶分泌信號(hào)、間插序列和目的基因，其中，該調(diào)控區(qū)或目的基因中至少有一方與木聚糖酶的生產(chǎn)是非正常關(guān)聯(lián)，以及其中的木聚糖酶分泌序列與該絲狀真菌是異源或同源；培養(yǎng)該絲狀真菌，并促使該真菌生產(chǎn)目的蛋白。本方法還涉及目的蛋白的純化。此外，可以除去目的蛋白中由間插序列編碼的氨基酸序列。
本發(fā)明還涉及由上述方法生產(chǎn)的蛋白。
按照本發(fā)明的方法，采用木聚糖酶分泌信號(hào)使一些目的蛋白的表達(dá)和分泌水平高于采用現(xiàn)有技術(shù)中所用的分泌信號(hào)，例如cbh1分泌信號(hào)。因?yàn)槟揪厶敲冈谀久顾a(chǎn)的總蛋白中所占的比例比CBH1小得多(分別為5％和60％)，人們可能預(yù)計(jì)cbh1的分泌信號(hào)會(huì)更有效，然而，情況不是如此。而且，木聚糖酶分泌信號(hào)在數(shù)種宿主的表達(dá)體系中提高了蛋白的產(chǎn)量。
本發(fā)明的概述不必描述本發(fā)明所有的必需特征，但將所述特征的再組合后也可體現(xiàn)本發(fā)明的一些特點(diǎn)。
由以下詳述的優(yōu)選實(shí)施方案及附圖會(huì)對(duì)本發(fā)明的其他方面更為了解，其優(yōu)點(diǎn)也會(huì)更為明顯。
附圖的簡(jiǎn)單說明


圖1載體pCBG1-TV的限制性酶圖譜，以及CBH1分泌信號(hào)/成熟β-葡萄糖苷酶接合點(diǎn)的氨基酸序列(參見實(shí)施例5)。
圖2載體pXBG1-TV的限制性酶圖譜，以及木聚糖酶II分泌信號(hào)/成熟β-葡萄糖苷酶接合點(diǎn)的氨基酸序列(參見實(shí)施例6)。
圖3載體pC/XBG(Xbal)-TV限制性酶圖譜，以及木聚糖酶II分泌信號(hào)/成熟β-葡萄糖苷酶接合點(diǎn)的氨基酸序列(參見實(shí)施例7)。
圖4由T.reesei株RutC30和M2C38分離的基因組DNA的Southern印跡結(jié)果，所用探針為含有M2C38木聚糖酶啟動(dòng)子和分泌信號(hào)的、標(biāo)記的DNA片段。
圖5由T.reesei株RutC30和M2C38分離的基因組DNA的Southern印跡結(jié)果，所用探針為含有M2C38的成熟β-葡萄糖苷酶編碼區(qū)的、標(biāo)記的DNA片段。
圖6eg2表達(dá)載體pEG2-TV(圖6a)和pC/XREG2-TV(圖6b)的示意圖，如實(shí)施例23所述，該載體包含xln2分泌信號(hào)。
圖7實(shí)施例27所述的man1表達(dá)載體pCMAN-TV(圖7a)的示意圖，圖7b表示pXMAN-TV的示意圖；圖7c表示pC/XMAN-TV(圖7c)的示意圖，兩者均含有xln2分泌信號(hào)。后兩種載體描述于實(shí)施例28中。
圖8含有eg2的表達(dá)載體的示意圖，該eg2由Humicol ainsolens獲得。圖8a表示pChHE2-TV；圖8b表示pC/XhHE2-TV，含有xln2分泌信號(hào)，兩者均在實(shí)施例30中有所描述。
圖9漆酶I(lcc1)表達(dá)載體的示意圖。圖9a表示pCL1-TV；圖9b表示pC/XL1-TV，含有xln2分泌信號(hào)，兩者均在實(shí)施例32中有所描述。
圖10實(shí)施例34所述的含有木聚糖酶的表達(dá)載體(pC/XHTX4-TV)的示意圖。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)說明本發(fā)明涉及通過真菌的基因修飾來提高目的蛋白的產(chǎn)量。此外，本發(fā)明涉及新型的基因重組物，含有該結(jié)構(gòu)的真菌，其蛋白產(chǎn)量顯著增加。
以下僅以舉例的方式描述優(yōu)選的實(shí)施方案，而不限制本發(fā)明所必需的特征的組合。
本發(fā)明中所描述的真菌基因修飾是用新型基因重組物表達(dá)目的基因。該目的基因編碼在宿主內(nèi)高水平表達(dá)的目的蛋白，并進(jìn)而將其從該宿主中釋放出來。優(yōu)選的表達(dá)宿主為絲狀真菌。絲狀真菌的特征是營養(yǎng)菌絲體，營養(yǎng)菌絲體的細(xì)胞壁含有復(fù)雜的多糖，包括殼多糖和纖維素。營養(yǎng)體生長通常通過菌絲的伸長而進(jìn)行?？捎糜诒景l(fā)明的絲狀真菌包括木霉屬(Trichoderma)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、鐮刀霉屬(Fusarium)、曲霉屬(Aspergillus)、葡萄孢屬(Botrytis)、疣孢霉屬(Mycogone)、輪枝孢屬(Verticillium)、鏈霉屬(Streptomyces)、毛盤孢屬(Colletotrichum)、鏈孢霉屬(Neurospora)、灰側(cè)耳菌屬(Pleurotus)、青霉屬(Penicillum)、頭孢屬(Cephalosporium)、漆斑菌屬(Myrothecium)、絲葚霉屬(Papulospora)、綿霉屬(Achlya)、柄孢殼屬(Podospora)、內(nèi)座殼屬(Endothia)、毛霉屬(Mucor)、旋孢腔菌屬(Cochilobbolus)、Tolypocladium、梨孢霉屬(Pyricularia)、青霉屬(Penicillum)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、耙菌屬(Irpex)、葡萄穗霉屬(Stachybotrys)、帚霉屬(Scorpulariopsis)、毛殼霉屬(Chaetomium)、粘帚霉屬(Gilocladium)、頭孢霉屬(Cephalosporin)、支頂孢屬(Acremonium)，但不限于這些。
絲狀真菌的轉(zhuǎn)化方法在本領(lǐng)域是已知的(例如EP 870,835；U.S.5,863,783；Camels T.et al.Curr.Genet.，1991，20309-314；Lorito etal.，1993，Curr.Genet.24349-356；Goldman et al.，1990，Curr.Genet.17169-174；Penttila et al.，1987，Gene 6155-164；Yelton et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 811470-1474；Bajar et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888202-8212；“鏈霉菌的基因操作實(shí)驗(yàn)手冊(cè)”Hopwood et al.，1985，The John Innes Foundation，Norwich，UK；所有上述文獻(xiàn)在此均作為參考引入)。
本發(fā)明的基因重組物通常包含調(diào)控區(qū)，與該調(diào)控區(qū)相連并受該調(diào)控區(qū)調(diào)控的分泌信號(hào)和目的基因，以及包含其他需要加入的元件，例如終止子序列，篩選標(biāo)記等。如果需要，在分泌信號(hào)和目的基因之間可插入間插序列。調(diào)控區(qū)
“調(diào)控區(qū)”或“調(diào)控元件”通常是指基因上游的一部分核酸，這部分核酸通常由DNA組成，但也并非總是如此。調(diào)控元件包括啟動(dòng)子元件、基本(核心)啟動(dòng)子元件、可被外部刺激物誘導(dǎo)的元件、啟動(dòng)子活性介導(dǎo)元件，例如負(fù)調(diào)控元件或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子。此處所用的調(diào)控元件也包括轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控元件，例如調(diào)整基因表達(dá)的調(diào)控元件，這其中包括翻譯和轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子、翻譯和轉(zhuǎn)錄阻遏子、上游激活序列和mRNA不穩(wěn)定效應(yīng)物。后面的幾種元件可位于靠近編碼區(qū)的位置。本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“調(diào)控元件”或“調(diào)控區(qū)”通常是指結(jié)構(gòu)基因的編碼序列上游(5′)的DNA序列，該序列通過提供被RNA聚合酶和/或其他轉(zhuǎn)錄起始所需的因子識(shí)別的某一特定位置，對(duì)編碼區(qū)的表達(dá)進(jìn)行調(diào)整，但并非總是如此。但是，其他核酸序列，例如位于3′端的序列，但不僅限于此，也可能對(duì)目的編碼區(qū)的表達(dá)起調(diào)控作用。為RNA聚合酶或其他轉(zhuǎn)錄因子提供識(shí)別部位并保證轉(zhuǎn)錄在某一特定位置起始的調(diào)控元件的例子是啟動(dòng)子元件。啟動(dòng)子元件包括負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄起始的基本啟動(dòng)子元件，以及修飾基因表達(dá)的其他調(diào)控元件(如以上所列出的)。
本發(fā)明所用的調(diào)控元件包括發(fā)育調(diào)控的、可誘導(dǎo)的和組成型調(diào)控元件。發(fā)育調(diào)控或?qū)κ芷湔{(diào)控的基因的差異表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的調(diào)控元件，在宿主的發(fā)育期間的特定時(shí)間內(nèi)是活化的?？烧T導(dǎo)的調(diào)控元件受誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)時(shí)，能直接或間接地激活一種以上DNA序列或基因的轉(zhuǎn)錄。誘導(dǎo)劑不存在時(shí)，DNA序列或基因不能轉(zhuǎn)錄。通常，與可誘導(dǎo)的調(diào)控元件特異結(jié)合以激活轉(zhuǎn)錄的蛋白因子是以失活的形式而存在，然后直接或間接被誘導(dǎo)劑轉(zhuǎn)換為激活的狀態(tài)。誘導(dǎo)劑可以是化學(xué)試劑，例如蛋白、代謝物或其他化學(xué)試劑。組成型的調(diào)控元件在宿主體內(nèi)以連續(xù)的方式指導(dǎo)基因的表達(dá)。
現(xiàn)已克隆了很多合適的調(diào)控元件，并對(duì)其特性作了鑒定，如本文所述，這些元件可用來驅(qū)動(dòng)目的基因在真菌宿主中的表達(dá)。例如，不受任何形式的限制，現(xiàn)已克隆了幾種基因及其關(guān)聯(lián)的調(diào)控區(qū)。T.reesei的EGIII(Saloheimo M et a.，1988，Gene 6311-21)，木聚糖酶xln2(Saarelainen et al.，Mol.Gen.Genet.241497-503，1993)。其他用于目的外源基因表達(dá)的調(diào)控區(qū)在本領(lǐng)域也是已知的。例如，不受任何方式的限制，組成型啟動(dòng)子pgk(磷酸甘油酸激酶；Vanhanen et al.，Gene 106129-133，1991)；T.reesei的組成型啟動(dòng)子pki(Carmen LM et al.，1999，phytopathol.892554-261)；米黑毛霉(Mucor miehei)的羧基蛋白酶的調(diào)控區(qū)(U.S.5,679,543)；曲酶的gla A(淀粉葡萄糖苷酶)(Cullen D.et al.，1987，Bio/Technol.5713-719)、gpd(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)(Deane et al.，1999，Enzyme and Microbial Tech.Vol.24，pp.419-424；Pentilla et al.，1987，Gene Vol.61，pp.155-164)；構(gòu)巢曲霉的tpiA(McKinight，G.L.et al.，1986，Cell 46143-147)；曲霉的alcA(Lockington，P.A.，et al.，1986，Gene 33137-149)、米曲霉的amy(α-淀粉酶)(Christensen T.et al.，1988，Bio/Technol.61419-1422)；T.reesei的Trl(Camels et al.，1991，Gurr Gent.Vol.20，pp.309-314)、T.reesei的cbh1(Harkki，A.et al.，1989，Bio/Technol.7596-603)；黑曲霉(Aspergillus niger)糖化酶的調(diào)控區(qū)(Nunberg J.H.et al.，1984，Mol.Cell.Bio.42306-2315；Boel E.et al.，1984，EMBO J.，31581-1585)；構(gòu)巢曲霉的trpC(Yelton M.et al.，1984，Proc.Nat.Acad.Sci.811470-1474)、構(gòu)巢曲霉的xln1或xln2(Torronen et al.，1992，Bio/Technol.101461-1465)或amdS(Hynes M.J.，et al.，1983 Mol.Cell.Genet.19937-45)。外源調(diào)控元件的應(yīng)用在U.S.5,863,783中已有描述，包括xlnA、肌醇六磷酸酶、ATP合成酶亞基9(oliC)、tpi(磷酸丙糖異構(gòu)酶)、adh(乙醇脫氫酶)、amy、glaA、乳糖酶和gpd。
對(duì)基因重組物中調(diào)控元件的選擇并不限制本發(fā)明的實(shí)際應(yīng)用。但是，優(yōu)選的調(diào)控元件為cbh1、cbh2、eg1、eg2、eg3、eg5、xln1和xln2。T.reesei cbh1的DNA序列已存儲(chǔ)在基因庫中，登記號(hào)為D86235。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員懂得，可通過置換、取代、附加或缺失一個(gè)或一個(gè)以上核苷酸對(duì)天然的調(diào)控元件進(jìn)行修飾，而不改變其功能。本發(fā)明的實(shí)踐包含這種對(duì)啟動(dòng)子的改變，但不會(huì)受其約束。分泌信號(hào)“分泌信號(hào)”亦可稱為“分泌序列”，用于促使宿主產(chǎn)生的目的蛋白定位在胞外。如本文所述，優(yōu)選的分泌信號(hào)是來源于木聚糖酶的木聚糖酶分泌信號(hào)。木聚糖酶分泌信號(hào)是編碼木聚糖酶分泌信號(hào)肽的DNA序列。木聚糖酶分泌信號(hào)肽(或分泌肽)是存在于編碼的木聚糖酶氨基末端的肽序列，該序列隨后在將成熟的木聚糖酶運(yùn)出宿主細(xì)胞期間被除去。該分泌信號(hào)可包含肽原、前肽或兩者。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，木聚糖酶分泌信號(hào)包含11家族木聚糖酶基因的木聚糖酶分泌信號(hào)。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，11家族木聚糖酶基因是木霉的木聚糖酶基因。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，木聚糖酶分泌信號(hào)包含木霉木聚糖酶I(xln1)基因或木聚糖酶II(xln2)基因的木聚糖酶分泌信號(hào)。木霉xln1和xln2分泌信號(hào)的DNA序列分別見“T.reesei的兩種主要木聚糖酶酶和基因特性的鑒定”的圖3和2中(Torronen，Mach，Messner，Gonzalez，Kalkkinen，Harkki，and Kubicek，Bio/Technology 101461-1465，1992)(發(fā)表的圖例中，基因鑒定結(jié)果是顛倒的)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員懂得，通過置換、取代、附加或缺失天然分泌信號(hào)中的一個(gè)或更多個(gè)核酸，可對(duì)其進(jìn)行修飾而不改變其功能。本發(fā)明的實(shí)踐包括這種對(duì)木聚糖酶分泌信號(hào)的改變，而又不受這種改變的約束。間插區(qū)在信號(hào)序列和目的基因之間的間插區(qū)，可以插入其他的核苷酸序列。插入這些序列的目的有很多，例如為了增加前導(dǎo)肽的長度，使目的基因易于插入基因重組物中，提高目的蛋白的表達(dá)水平，增加目的蛋白從宿主輸出的量(例如U.S.5,679,543)，或有助于目的蛋白的純化，例如用親合色譜或其他本領(lǐng)域中為大家所熟知的方法。前導(dǎo)序列的長度可以不同，由幾個(gè)氨基酸至該宿主分泌蛋白的氨基酸序列。此外，該前導(dǎo)序列也可編碼一些氨基酸，這些氨基酸有助于通過可斷裂的接頭分離目的蛋白。如果間插區(qū)含有影響目的蛋白活性的前導(dǎo)肽，含有用于蛋白純化的親合標(biāo)記，或者如果該前導(dǎo)肽過長，則需要采用可斷裂的接頭。這種可斷裂的接頭在本領(lǐng)域是為大家所熟知的，例如可被溴化氰切斷的氨基酸，但不限于蛋氨酸；或者是已知可被蛋白酶切斷的氨基酸，例如可被胰蛋白酶、膠原酶、梭菌蛋白酶、酵母的KEX2蛋白酶、Xa因子、枯草蛋白酶(例如Martson F.A.O.1986，Biol.Chem J.2401-12)切斷的氨基酸，但不僅限于這些蛋白酶。但是，本發(fā)明的基因重組物也可不含有這種間插序列。
如
圖1-3和6-9所示，實(shí)施例5-7、23、27、28、30和32中所述的基因重組物中含有附加9個(gè)的堿基對(duì)的DNA序列；前3個(gè)編碼T.reesei木聚糖酶II基因分泌信號(hào)之后的谷氨酰胺殘基，其余6個(gè)堿基對(duì)為插入和/或修飾的單一限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，用于連接木聚糖酶分泌信號(hào)和編碼目的蛋白的核苷酸序列。這些DNA序列使木聚糖酶分泌信號(hào)肽和目的蛋白之間產(chǎn)生附加的氨基酸。相應(yīng)于該基因重組物編碼的木聚糖酶分泌信號(hào)或用于連接木聚糖酶分泌信號(hào)序列與目的基因的限制性酶切位點(diǎn)，這些DNA序列可以是天然的或合成的，并編碼成熟木聚糖酶中一個(gè)或更多個(gè)氨基酸。如上所述，間插序列也可包含編碼被蛋白酶識(shí)別的氨基酸序列或前導(dǎo)序列。本發(fā)明的實(shí)踐包括在木聚糖分泌信號(hào)與成熟β-葡萄糖苷酶編碼區(qū)之間存在附加的DNA序列，但并不僅限于此。目的基因“目的基因”是指在轉(zhuǎn)化宿主中表達(dá)的任何基因。目的基因包含編碼目的蛋白的核酸序列。目的蛋白可以包括有藥學(xué)活性的蛋白，例如生長因子、生長調(diào)控劑、抗體、抗原、可用于免疫或疫苗接種等的抗原衍生物、白細(xì)胞介素、胰島素，G-CSF、GM-CSF、hPG-CSF、M-CSF或它們的組合物，干擾素α、干擾素β、干擾素τ等干擾素，凝血因子如因子VIII、因子IX、tPA或它們的組合物，但不限于此。目的基因也可編碼工業(yè)酶，例如用于紙漿和紙、紡織品改良，或乙醇生產(chǎn)的酶。目的基因也可編碼蛋白添加劑、營養(yǎng)品，或用于動(dòng)物飼料、食物，或飼料和食品兩者的加值產(chǎn)品。這類蛋白的例子包括酶、蛋白酶、氧化酶、肌醇六磷酸酶、殼多糖酶、甘露聚糖酶、漆酶、轉(zhuǎn)化酶、脂肪酶、纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素降解酶、果膠酶、木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、過氧化物酶等，但不限于此。目的蛋白的類似物也可用本發(fā)明的嵌合基因重組物表達(dá)。這些類似物的特征通常是其氨基酸序列有改變，例如插入、缺失、或其他變異如等位變異等。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是含有目的DNA的嵌合基因重組物，該目的DNA與本發(fā)明的調(diào)控元件和分泌序列連接并受調(diào)控元件的調(diào)控。按照本發(fā)明，任何目的基因都可采用并進(jìn)行操作，以使該目的蛋白得到表達(dá)。其他元件本發(fā)明的基因重組物中，在緊接著編碼目的蛋白的核苷酸序列下游可含有轉(zhuǎn)錄終止子。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，任何合適的轉(zhuǎn)錄終止子都可采用。本發(fā)明的實(shí)踐對(duì)所用轉(zhuǎn)錄終止子沒有限制。轉(zhuǎn)錄終止子的例子不受任何限制，可以是任何目的基因下游的終止子。本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易獲得合適的終止子，至少可從上述鑒定的基因獲得(參見“調(diào)控區(qū)”)。
對(duì)實(shí)施例5-7、23、27、28、30、32和34中所述的終止子并沒有任何限制，這些終止子由位于木霉cbh2基因終止密碼子3′端的1.9kb的DNA構(gòu)成。T.reesei cbh2轉(zhuǎn)錄終止子的前553個(gè)堿基對(duì)的DNA序列已公開，該序列緊接TAA終止密碼子的下游(或3′端)(參見“T.reesei纖維二糖水解酶II的核苷酸序列及推測(cè)的一級(jí)結(jié)構(gòu)”的圖2，Chen，Gritzali and Stafford，Bio/Technology 5274-278，1987)。此外，也可使用其他終止子序列，例如實(shí)施例23、27和28(圖6a和7a-c)所述的cbh1、xln2的終止子序列，但也不限于此。
本發(fā)明的基因重組物中含有篩選標(biāo)記，該標(biāo)記可位于同一質(zhì)粒載體中基因重組物的上游或下游(例如，在該結(jié)構(gòu)的5′端或3′端)，或位于與該基因重組物不同的質(zhì)粒載體中并共轉(zhuǎn)化。篩選標(biāo)記的選擇對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是熟知的，篩選標(biāo)記包括能給予轉(zhuǎn)化細(xì)胞利用不是此微生物正常代謝產(chǎn)生的代謝物的能力(例如，編碼乙酰胺酶的構(gòu)巢曲酶amd S基因，它能使轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有在乙酰胺為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長的能力)的基因(合成或天然的)，或者是使轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有抗生素抗性的基因(例如，編碼潮霉素β-磷酸轉(zhuǎn)移酶的大腸桿菌hph基因，它能使轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有潮霉素抗性)。如果宿主菌缺少與篩選標(biāo)記相應(yīng)的功能基因，那么該基因就可用作標(biāo)記。這類標(biāo)記的例子包括trp、pyr4、pyrG、argB、leu等，相應(yīng)的宿主菌應(yīng)沒有與此篩選標(biāo)記相應(yīng)的功能基因，即，trp、pyr、arg、leu等。實(shí)施例5-7、27和28中所述的用于基因重組物中的篩選標(biāo)記是木霉磷酸甘油酸激酶(pgk)啟動(dòng)子表達(dá)的大腸桿菌hph基因。在實(shí)施例23、30和32中(圖6b、8a、8b、9a和9b)記載了pyr4的應(yīng)用。
大腸桿菌hph基因的DNA序列可參見文獻(xiàn)“質(zhì)粒編碼的潮霉素B抗性潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的序列及其在大腸桿菌和啤酒酵母中的表達(dá)”的圖4(Gritz and Davies，Gene 25179-188，1983)T.reesei的pgk啟動(dòng)子的DNA序列可參見文獻(xiàn)“Trichoderma reesei的3-磷酸甘油酸激酶的編碼基因(pgk1)的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)和表達(dá)”的圖2(Vanhanen，Saloheimo，Ilmen，Knowles and Penttila，Gene 106129-133 1991)。
因此，本發(fā)明的基因重組物包含調(diào)控區(qū)，以及與該調(diào)控區(qū)相連并受該調(diào)控區(qū)調(diào)控的木聚糖酶分泌序列和目的基因。其中，該調(diào)控區(qū)或目的基因中至少有一方與木聚糖酶蛋白的生產(chǎn)是非正常關(guān)聯(lián)。
迄今為止所描述的本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中包括β-葡萄糖苷酶基因重組物。本發(fā)明的實(shí)踐不受制備該重組物的方法所約束，該方法包括標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)，例如用堿裂解法從大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶消化質(zhì)粒DNA，用瓊脂糖凝膠電泳分離和回收DNA片段，用T4 DNA連接酶連接DNA片段，通過聚合酶鏈反應(yīng)或加入寡核苷酸接頭在DNA片段末端插入單一的限制性酶切位點(diǎn)，以及用T4 DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段補(bǔ)平DNA片段末端，但不限于此。
實(shí)施例1-7描述了制備上述基因重組物的步驟。
本發(fā)明還公開了以下基因重組物(表達(dá)載體)的制備方法。例如T.reesei和H.insolens的葡聚糖內(nèi)切酶II、eg2(實(shí)施例4和30)、甘露聚糖酶、man1(實(shí)施例27和28)、漆酶、lcc1(實(shí)施例34)和木聚糖酶(實(shí)施例38)。實(shí)施例25，29，31和33中描述了這些目的蛋白中的幾種在T.reesei中的表達(dá)。在實(shí)施例38中描述了目的蛋白在Humicola insolens中的表達(dá)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，在真菌宿主中導(dǎo)入編碼β-葡萄糖苷酶、葡聚糖內(nèi)切酶II、甘露聚糖酶、漆酶或木聚糖酶的基因重組物并進(jìn)行表達(dá)，進(jìn)而制成基因修飾的微生物。相對(duì)于未轉(zhuǎn)化的微生物宿主，或者與含有表達(dá)基因固有內(nèi)源分泌信號(hào)的轉(zhuǎn)化宿主比較，上述基因修飾的微生物提高了目的蛋白的生產(chǎn)水平。對(duì)所有檢測(cè)的目的蛋白和所有檢測(cè)的宿主來說，含有木聚糖酶分泌信號(hào)的嵌合基因重組物都能增加從宿主分離出來的目的蛋白量。例如，不受限制條件來考慮，相對(duì)于未轉(zhuǎn)化的微生物宿主來說，可看到β-葡萄糖苷酶提高的水平優(yōu)選為至少約10倍，更優(yōu)選為至少約40倍，最優(yōu)選為至少約120倍。用其他目的蛋白也可觀察到表達(dá)水平的提高(分別參見實(shí)施例25、29、33和38的葡聚糖內(nèi)切酶II、甘露聚糖酶、漆酶和木聚糖酶)。
本發(fā)明中包括將含有目的基因的基因重組物導(dǎo)入本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的微生物宿主的任何方法，這些方法包括用氯化鈣處理細(xì)菌細(xì)胞或真菌原生質(zhì)體，使其細(xì)胞膜變得脆弱；加入聚乙二醇使細(xì)胞膜融合；用電穿孔法使細(xì)胞膜去極化；土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化；用粒子槍等通過微粒轟擊，使DNA穿過細(xì)胞壁和膜等；但不限于此。絲狀真菌的轉(zhuǎn)化方法已有文獻(xiàn)報(bào)道(如EP 870,835；U.S.5,863,783；Camels T.et al.，Curr Genet.，1991，20309-314；這些文獻(xiàn)都在此作為參考引入)。
實(shí)施例9、20和35描述了用粒子槍將β-葡萄糖苷酶基因重組物導(dǎo)入木霉或Humicola insolens孢子中的方法。
與未轉(zhuǎn)化的微生物宿主相比，β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)量增加了10倍以上，這比天然變異的菌株高出很多并表明產(chǎn)量得到了顯著增加，并且在商業(yè)上具有重要的意義。采用這種方法，β-葡萄糖苷酶增加的程度可高達(dá)136倍，并能達(dá)到1000倍以上。如實(shí)施例11所述，測(cè)量β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量增加程度的方法時(shí)使培養(yǎng)物生長，并測(cè)定β-葡萄糖苷酶的活性。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，酶混合物的β-葡萄糖苷酶比活性(IU/mg蛋白)可通過降低酶混合物中的纖維素酶和其他蛋白的量來提高。通過物理和機(jī)械方法將酶混合物分離，或通過基因重組方法使纖維素酶或其他基因缺失，則可達(dá)到上述目的。用微生物實(shí)際生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的過程中，這種方法效果很小或是無效。但是根據(jù)需要，本發(fā)明的實(shí)踐中可包括這些步驟。
實(shí)施例25、29和33描述了采用本發(fā)明的嵌合基因重組物過表達(dá)葡聚糖內(nèi)切酶II、甘露聚糖酶和漆酶。在所有情況下都觀察到目的蛋白生產(chǎn)水平的提高，該提高的范圍為3-10倍或更多，并且活性超過未轉(zhuǎn)化的宿主。實(shí)施例30和31描述了H.insolens葡聚糖內(nèi)切酶II在T.reesei中的生產(chǎn)，同樣也獲得葡聚糖內(nèi)切酶II生產(chǎn)水平提高的結(jié)果。
實(shí)施例34-38描述了T.reesei木聚糖酶的生產(chǎn)，以及其在H.insolens中的表達(dá)。這些實(shí)施例表明，非天然的啟動(dòng)子和分泌信號(hào)在異源絲狀真菌中是有活性的，同時(shí)也表明這些元件促進(jìn)了在異源宿主內(nèi)有活性的目的基因的表達(dá)。在這些實(shí)施例中，目的基因可從木霉獲得，并能編碼木聚糖酶，該目的基因與同樣來源于木霉的木聚糖酶分泌信號(hào)融合。此融合核酸序列受同樣也是來源于木霉的cbh1啟動(dòng)子的調(diào)控。最終的重組物用來轉(zhuǎn)化腐質(zhì)霉屬H.insolens。對(duì)目的基因在轉(zhuǎn)化的和未轉(zhuǎn)化H.insolens中的活性進(jìn)行了測(cè)定(參見實(shí)施例38)，結(jié)果表明來源于木霉的cbh1啟動(dòng)子和木聚糖酶分泌信號(hào)在H.insolens中具有活性。此外，與未轉(zhuǎn)化宿主表達(dá)的內(nèi)源活性相比，轉(zhuǎn)化宿主產(chǎn)生的活性增加了2-2.5倍。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，來源于一種絲狀真菌的非天然啟動(dòng)子和分泌信號(hào)在另一種絲狀真菌中是有活性的。
因此，本發(fā)明的目的是用任一絲狀真菌表達(dá)目的基因，并生產(chǎn)目的蛋白。例如，不受任何方式的限制來考慮，宿主可選自木霉屬(Trichoderma)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、鐮刀霉屬(Fusarium)、曲霉屬(Aspergillus)、鏈霉屬(Streptomyces)、毛盤孢屬(Colletotrichum)、鏈孢霉屬(Neurospora)、灰側(cè)耳菌屬(Pleurotus)、青霉屬(Penicillum)、頭孢屬(Cephalosporium)、綿霉屬(Achlya)、柄孢殼屬(Podospora)、內(nèi)座殼屬(Endothia)、毛霉屬(Mucor)、旋孢腔菌屬(Cochilobbolus)、Tolypocladium、梨孢霉屬(Pyricularia)。適合宿主的選擇取決于所要生產(chǎn)的目的蛋白。將DNA重組物導(dǎo)入木霉中的方法有文獻(xiàn)報(bào)道(“Biolistic Transformation of Trichoderma harzianum and Gliocladiumvirens using plasmid and genomic DNA”Lorito，Hayes，Dipietro andHarman，Curr.Genet.24349-356 1993；“用高壓電脈沖法轉(zhuǎn)化Trichoderma harsianum”Goldman，VanMontagu and Herrera-Estrella，Curr.Genet.17169-174 1990；“纖維素分解真菌Trichoderma reesei的通用轉(zhuǎn)化系統(tǒng)”Penttila，Nevalainen，Ratto，Salminen and Knowles，Gene6155-164 1987)，以及對(duì)DNA重組物導(dǎo)入曲霉(“用trpC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化構(gòu)巢曲霉”Yelton，Hamer and Timberlake，Proc.Natl.Acad.Sci.USA811470-1474 1984)、鐮刀霉(“可被磷酸化轉(zhuǎn)換因子介導(dǎo)的植物信號(hào)誘導(dǎo)的真菌角質(zhì)酶及其鑒定”Bajar，Podila and Kolattukudy，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888202-8212 1991)、Tolypocladium(Camels T.et al.，Curr.Genet.，1991，20309-314)的方法也均有報(bào)道。此外，EP 870,835公開了用土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)化各種絲狀真菌的方法，這些絲狀真菌包括曲霉、毛盤孢、鐮刀霉、鏈孢霉、灰側(cè)耳菌和木霉。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，微生物宿主為木霉。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，微生物宿主為木霉屬的Trichoderma reesei。
上述這些發(fā)表的轉(zhuǎn)化方法中所用的基因重組物，與實(shí)施例5-7、23、27、28、30、32和34中所描述的基因重組物類似，其類似點(diǎn)在于它們都含有調(diào)控區(qū)，與調(diào)控區(qū)相連并受其調(diào)控的蛋白編碼區(qū)(該編碼區(qū)可編碼可篩選標(biāo)記)，以及轉(zhuǎn)錄終止子。在大多數(shù)情況下，該基因重組物與可篩選標(biāo)記基因相連。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，木聚糖酶的分泌信號(hào)是微生物宿主天然的木聚糖酶分泌信號(hào)，而基因修飾的微生物是由此微生物宿主產(chǎn)生的(即，木聚糖酶分泌信號(hào)來源的微生物宿主，與產(chǎn)生所說的基因修飾的微生物的微生物宿主是同一類型)。但是，如本文所述，任何木聚糖酶分泌信號(hào)都可使用。
用本發(fā)明的方法和基因重組物產(chǎn)生的目的蛋白可以使用由宿主得到的粗提取物，或可用本領(lǐng)域熟知的方法將此目的蛋白部分或完全純化，所用的方法包括離心、鹽和pH沉淀、尺寸排阻、離子交換、親合層析等。采用含有親合標(biāo)記的前導(dǎo)肽，然后用合適的親合基質(zhì)分離標(biāo)記的目的蛋白，可以提高目的蛋白的純化水平。這種親合標(biāo)記及其相應(yīng)的親合基質(zhì)，在本領(lǐng)域也是為大家所熟知的。而且，間插序列編碼的前導(dǎo)肽可以在目的蛋白的加工之前、加工期間或加工之后，與該目的蛋白分開。
以上的描述不會(huì)以任何方式來限制本發(fā)明的范圍，此外，所討論的特征組合對(duì)闡明本發(fā)明可能不是絕對(duì)必需的。
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。這些實(shí)施例僅是用于說明本發(fā)明，而不以任何方式來限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1描述了從木霉屬Trichoderma reesei株RutC30、M2C38、BTR48中分離基因組DNA，以及這些菌株的基因修飾衍生物。實(shí)施例2-7描述了基因組DNA文庫的構(gòu)建，各種基因的克隆，以及來源于Trichoderma reesei株M2C38的幾種基因重組物。實(shí)施例9和11-15描述了β-葡萄糖苷酶基因重組物在Trichoderma reesei株M2C38、BTR48和RutC30中的轉(zhuǎn)化和表達(dá)。
Trichoderma reesei株M2C38和BTR48是Iogen公司有產(chǎn)權(quán)的菌株，并由Trichoderma reesei RutC30(ATCC 56765，“纖維素酶高產(chǎn)的T.reesei突變株的篩選分離”Montenecourt and Eveleigh，Adv.Chem.Ser.1979，181289-301)衍生而來，該菌株本身又來源于Trichoderma reeseiQm6A(ATCC 13631，“碳源和金屬對(duì)綠色木霉的纖維素酶的影響效應(yīng)”Mandels and Reese，1957，J.Bacterial.73269-278)。
在實(shí)施例1及隨后的實(shí)施例中，限制性內(nèi)切酶、T4 DNA聚合酶、T4 DNA連接酶和大腸桿菌DNA聚合酶1的Klenow片段購自Gibco/BRL、New England Biolabs、Boehringer Mannheim或Pharmacia，并按生產(chǎn)商推薦的方法使用。具有校對(duì)活性的Pwo聚合酶(BoehringerMannheim)按照生產(chǎn)商所提供的方案，用于所有的聚合酶鏈反應(yīng)中(PCR)。潮霉素B購自CalBiochem。
噬菌體文庫在載體λ-DASH(Stratagene，Inc)中構(gòu)建，其構(gòu)建方法如下?；蚪MDNA(3μg)用2、1、0.5和0.2單位/μg的BamHI在37℃下消化1小時(shí)，以產(chǎn)生9-23kb大小的片段。每份消化反應(yīng)所得的DNA用1倍體積Tris飽和的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提，隨后用10μl 3M醋酸鈉(pH5.2)和250μl 95％的乙醇(-20℃)沉淀。通過微量離心沉淀消化的DNA，用0.5ml冷的70％乙醇淋洗，空氣干燥后重新懸浮于滅菌去離子水中。通過瓊脂糖凝膠電泳(0.8％瓊脂糖，電泳液為含1mM EDTA的0.04M Tris-醋酸鹽)進(jìn)行9-23kb大小DNA片段的富集。將消化的DNA(0.4μg)與1μg用BamHI(Stratagene)預(yù)先消化的λ-DASH臂連接，連接反應(yīng)物中含有2單位T4 DNA連接酶和1mM ATP，總體積為5μl，在4℃下反應(yīng)過夜。用GigapackII Goldpackaging extracts(Stratagene)并按照生產(chǎn)商的方案，將連接混合物包裝入噬菌體顆粒中。用大腸桿菌宿主菌株XL1-Blue MRA(P2)評(píng)估該文庫的規(guī)模，測(cè)得共含有3×105個(gè)獨(dú)立的克隆。
32P標(biāo)記的探針制備方法如下。從富含Hind III、BamH1或EcoRI片段的庫中，用PCR法分別擴(kuò)增bgl1、cbh1和cbh2編碼區(qū)的短片段(0.7-1.5kb)，標(biāo)記反應(yīng)物中含有10-50ng靶DNA、0.2mM的d(GCT)TP、0.5μM dATP，20-40μCiα-32P-dATP、10pmol寡核苷酸引物以及0.5單位Tag聚合酶，反應(yīng)總體積為20μl。該擴(kuò)增反應(yīng)共進(jìn)行6個(gè)循環(huán)(95℃2分鐘；56℃1.5分鐘；70℃5分鐘)。加入0.5ml 10％(w/v)的三氯乙酸和0.5mg酵母tRNA使擴(kuò)增的32P-標(biāo)記的DNA沉淀。然后通過微量離心收集DNA沉淀，用1ml 70％乙醇洗兩次，經(jīng)空氣干燥后重新懸浮于含1mM EDTA、pH7.5的1M Tris中。
將固定了重組pUC119質(zhì)粒的尼龍膜放入加熱密封的袋中60-65℃下預(yù)雜交1小時(shí)，預(yù)雜交液含1M NaCl、1％SDS、50mM Tris(pH7.5)、1mM EDTA，并含有100μg/ml變性并切斷的鮭魚精子DNA。雜交反應(yīng)在加熱密封的袋中用同樣的緩沖液進(jìn)行，緩沖液中含有50μg/ml變性并切斷的鮭魚精子DNA和5×106-5×107cpm變性的bgl1、cbh1或cbh2探針，反應(yīng)在60-65℃進(jìn)行16-20小時(shí)。膜用1M NaCl、0.5％SDS在60℃洗15分鐘，共洗一次；用0.3M NaCl、0.5％SDS在60℃洗15分鐘，共洗兩次；然后再用0.03M NaCl、0.5％SDS在55℃洗15分鐘，共洗一次。將膜再放入熱密封的袋內(nèi)，并暴露于Kodak RP X光片，在-70℃下放置16-48小時(shí)。按生產(chǎn)商的方案使該X光片顯影。挑取給出強(qiáng)或弱信號(hào)的菌落，并在添加70μg/ml氨芐青霉素的2×YT培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用堿裂解法(Sambrook等，pp.1.25-1.28)從這些培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒DNA，再用限制性內(nèi)切酶消化、Southern雜交(Sambrook等，pp.9.38-9.44)和PCR分析(Sambrook等，pp.14.18-14.19)進(jìn)行分析。
用1.0kb bgl1探針與pUC119-Hind III文庫(實(shí)施例2)進(jìn)行菌落轉(zhuǎn)移雜交，以鑒定攜帶bgl1基因的克隆，bgl1探針采用寡核苷酸引物制備，該引物設(shè)計(jì)成可擴(kuò)增已知bgl1序列中堿基對(duì)462-1403的片段(Barrett等)。分離出的bgl1克隆pJEN200中含有的6.0kb的Hind III片段，該片段相當(dāng)于啟動(dòng)子、結(jié)構(gòu)基因和終止子序列。用0.7kb的cbh1探針與pUC119-BamH1文庫進(jìn)行菌落轉(zhuǎn)移雜交，以鑒定攜帶cbh1基因的克隆，cbh1探針用寡核苷酸引物制備，該引物設(shè)計(jì)成可擴(kuò)增已知發(fā)表的cbh1序列中堿基對(duì)597-1361的片段(“Trichoderma reesei菌株L27的外切纖維二糖水解酶1的分子克隆”Shoemaker，Schweikart，Ladner，Gelfand，Kwok，Myambo and Innis，Bio/Technology 1691-696，1983；以下稱為Shoemaker等)。分離出的cbh1克隆pCOR132中含有5.7kb的BamHI片段，該片段相當(dāng)于啟動(dòng)子(4.7kb)和1kb的cbh1結(jié)構(gòu)基因。在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上，將包含Cbh1啟動(dòng)子(2.1kb)和cbh1編碼區(qū)的5′端(0.4kb)的2.5kb EcoRI片段亞克隆到pUC119中，構(gòu)建pCB152。用1.5kb的cbh2探針與pUC119-EcoRI文庫進(jìn)行菌落轉(zhuǎn)移雜交，以鑒定攜帶cbh2基因的克隆，cbh2探針用寡核苷酸引物制備，該引物設(shè)計(jì)成可擴(kuò)增已知cbh2序列中堿基對(duì)580-2114片段(“Trichoderma reesei纖維二糖水解酶的核苷酸序列以及推測(cè)的一級(jí)結(jié)構(gòu)”Chen，Gritzali and Stafford，Bio/Technology 5274-278，1987；以下稱為Chen等)。分離出的cbh2克隆pZUK 600含有4.8kb的EcoRI片段，該片段相當(dāng)于啟動(dòng)子(600bp)、結(jié)構(gòu)基因(2.3kb)和終止子(1.9kb)。實(shí)例例4T.reesei M2C38 cbh1終止子，木聚糖酶II(xln2)基因，磷酸甘油酸激酶(pgk p)的克隆地高辛-11-dUTP標(biāo)記的探針制備過程為，PCR擴(kuò)增cbh1、xln2和pgk基因的編碼區(qū)，引物是用DIG標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒(BoehringerMannheim)并按照生產(chǎn)商的方案標(biāo)記的隨機(jī)引物。含有cbh1、xln2和pgk基因的基因組克隆通過λ-DASH文庫的噬菌斑轉(zhuǎn)移雜交來鑒定。對(duì)于每個(gè)目的基因，將1×104個(gè)克隆轉(zhuǎn)移至Nytran(Schleicher andSchull)尼龍膜上。膜上有噬菌斑的一面在用0.5M NaOH、1M NaCl飽和的印跡紙(VWR238)覆蓋，放置5分鐘，使噬菌體顆粒裂解并使噬菌體DNA變性；然后將此膜上有噬菌斑的一面在用1.5MTris(pH7.5)、1M NaCl飽和的印跡紙(VWR238)覆蓋，放置5分鐘，使膜中和。將該膜在空氣中干燥30分鐘后，在80℃烘烤2小時(shí)，使DNA固定在膜上。將膜放入加熱密封的袋中，65℃預(yù)雜交2小時(shí)，預(yù)雜交液為6×SSPE、5×Denhardt′s、1％SDS，再加入100μg/ml變性并切斷的鮭魚精子DNA。然后再將此膜放入加熱密封的袋中雜交，雜交液與預(yù)雜交液的相同，但含有50μg/ml的變性并切斷的鮭魚精子DNA和0.5μg地高辛-dUTP標(biāo)記的探針，在65℃反應(yīng)過夜。雜交后的膜用2×SSPE、0.1％SDS，室溫下洗兩次，每次15分鐘；用0.2×SSPE、0.1％SDS，65℃洗兩次，每次15分鐘；以及用2×SSPE洗一次，洗15分鐘。陽性的雜交克隆按照生產(chǎn)商的方案，通過與抗-地高辛/堿性磷酸酶抗體偶聯(lián)物的反應(yīng)來鑒定，顯色底物為5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯和4-氮藍(lán)四唑氯(Boehringer Mannbeim)。用地高辛dUTP標(biāo)記的探針進(jìn)行第二輪的篩選，進(jìn)一步將陽性的雜交克隆純化。單個(gè)克隆的分離以及噬菌體DNA的純化按Sambrook等(1989)pp.2.118-2.121中所述的方法進(jìn)行，但其中的CsCl梯度離心步驟用1倍體積的酚∶氯仿∶異戍醇(25∶24∶1)和1倍體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提步驟所替代。用0.1倍體積的3M醋酸鈉(pH5.2)和2.5倍體積冷的95％乙醇沉淀DNA，用0.5ml冷的70％乙醇洗滌沉淀的噬菌體DNA，空氣干燥后重懸于50μl含1mM EDTA、pH8.0的10mM Tris中。用限制性內(nèi)切酶消化該純化的噬菌體DNA，以及用Southern印跡雜交(Sambrook等，pp.9.38-9.44)鑒定含有目的基因的限制性片段。該Southern印跡雜交過程中，采用與篩選λ-DASH文庫相同的地高辛-dUTP標(biāo)記的探針。采用與轉(zhuǎn)移噬菌斑時(shí)同樣的方法，將膜雜交并使陽性雜交片段顯影。一旦由每個(gè)λ-DASH克隆鑒定出所需的限制性片段，則重復(fù)上述限制性內(nèi)切酶消化步驟。酶切的片段在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳分離，電泳液為TAE，并將所需的條帶切下。用Sephaglas BandPrep試劑盒(Pharmacia)并按照生產(chǎn)商的方案，將DNA從凝膠切片上洗脫下來。
用cbh1探針與λ-DASH文庫(實(shí)施例2)進(jìn)行菌落轉(zhuǎn)移雜交，以鑒定攜帶cbh1基因的克隆，該cbh1探針含有已知的cbh1序列(Shoemaker等)中堿基對(duì)45-2220的片段。用限制性內(nèi)切酶消化由λ-DASH cbh1克隆純化的噬菌體DNA，分離出含有cbh1編碼區(qū)的3′端(0.5kb)和cbh1終止子(1.3kb)的1.8kb的BamHI片段。將此片段亞克隆到大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC 119的BamHI位點(diǎn)，制備質(zhì)粒pCB1Ta。用xln2探針與λ-DASH文庫(實(shí)施例2)進(jìn)行菌落轉(zhuǎn)移雜交，以鑒定攜帶xln2基因的克隆，該xln2探針含有已知的xln2序列(“Trichoderma reesei木聚糖內(nèi)切酶II(pI9)基因xln2的克隆、序列分析和表達(dá)增強(qiáng)”Saarelainen，Paloheimo，F(xiàn)agerstrom，Suominen andNevalainen，Mol.Gen.Genet.241497-503，1993；以下稱為Saarelainen等)中堿基對(duì)100-783的片段。用限制性內(nèi)切酶消化由λ-DASH xln2克隆純化的噬菌體DNA，分離出含有xln2基因的啟動(dòng)子(2.3kb)、編碼區(qū)(0.8kb)和終止子(2.6kb)的5.7kb KpnI片段。將此片段亞克隆到pUC119的KpnI位點(diǎn)，制備質(zhì)粒pXYN2K-2。用pgk1探針與λ-DASH文庫(實(shí)施例2)進(jìn)行菌落轉(zhuǎn)移雜交，以鑒定攜帶pgk基因的克隆，該pgk1探針含有已知的pgk序列(“絲狀真菌Trichoderma reesei3-磷酸甘油酸激酶基因(pgk)的分離和鑒定”Vanhanen，Penttila，Lehtovaara and Knowles，Curr.Genet.15181-186，1989)中堿基對(duì)4-1586的片段。用限制性內(nèi)切酶消化由λ-DASH pgk克隆純化的噬菌體DNA，分離出含有pgk基因的啟動(dòng)子(2.9kb)、編碼區(qū)(1.6kb)和終止子(0.5kb)的5.0kb EcoRI片段。將此片段亞克隆到pUC119的EcoRI位點(diǎn)，制備質(zhì)粒pGK5.0。
用Pwo聚合酶，以pJEN200為模板，PCR擴(kuò)增含有bgl1編碼區(qū)并減去β-葡萄糖苷酶分泌信號(hào)(堿基對(duì)474-2679)的DNA片段。擴(kuò)增所用的引物與發(fā)表的bgl1序列同源，并可在編碼的β-葡萄糖苷酶32位纈氨酸5′端導(dǎo)入SphI位點(diǎn)或在bgl1終止密碼子的3′端導(dǎo)入KpnI位點(diǎn)。用SphI和KpnI消化此擴(kuò)增的片段，并插入用SphI和KpnI消化的pCB219N中，制備pBgstrf。為了制備pCB219N，以pZUK600為模板，擴(kuò)增出cbh2終止子片段。所用的一個(gè)引物與發(fā)表的cbh2基因3′端非翻譯區(qū)的堿基對(duì)2226-2242(Chen等，1987)同源，并在5′端導(dǎo)入Kph1位點(diǎn)；所用的另一引物為PUC正向引物(Cat，NO.1224，NewEngland Biolabs)，該引物與pZUK600中cbh2 3′端的EcoRI位點(diǎn)的下游配對(duì)。將此擴(kuò)增的片段在構(gòu)建的KpnI和EcoRI位點(diǎn)進(jìn)行消化，然后插入pUC119的相應(yīng)位點(diǎn)，制備pCB219。再將EcoRI-Not1接頭(Cat.NO.35310-010，Gibco/BRL)插入pCB219的單一EcoRI位點(diǎn)，制備pCB219N。由pCB152，用cbh1特異引物(發(fā)表的cbh1序列中的堿基對(duì)249-286，Shoemaker等，1983)和PUC正向引物(Cat.No.1224，New England Biolabs)擴(kuò)增含有cbh1啟動(dòng)子和分泌信號(hào)的片段。cbh1特異引物可在編碼的CBH1第19位絲氨酸3′端導(dǎo)入SphI位點(diǎn)，pUC正向引物與pCB152中cbh1 5′端EcoRI位點(diǎn)的上游配對(duì)。然后用SphI和EcoRI消化上述包括cbh1啟動(dòng)子和分泌信號(hào)PCR產(chǎn)物，并將其插入pBR322L(pBR322的衍生物，其中SphI和Sal1位點(diǎn)間的區(qū)域被SphI-NotI-SalI接頭所替代)的相應(yīng)位點(diǎn)中，制備pBR322LCS。為了構(gòu)建表達(dá)序列盒，從pBgstrf中分離出包含bgl1編碼區(qū)和cbh2終止子的4.1kb的SphI/NotI片段，并插入用SphI和NotI消化的pBR322LCS中。在接合cbh1分泌信號(hào)與成熟β-葡萄糖苷酶時(shí)，為了保持其閱讀框的正確性，將所得質(zhì)粒pCBGstrf在單一SphI位點(diǎn)線性化，并用T4DNA聚合酶將SphI位點(diǎn)補(bǔ)平。然后將所得質(zhì)粒pCBG1進(jìn)一步修飾，即加入XhoI接頭(Cat.No.1073，New England Biolabs)使cbh2終止子3′端的唯一NotI位點(diǎn)轉(zhuǎn)換為唯一XhoI位點(diǎn)。最終的質(zhì)粒pCBG1-Xho即為表達(dá)序列盒質(zhì)粒。
由質(zhì)粒pVU1005，用Pwo聚合酶擴(kuò)增用作T.reesei篩選標(biāo)記的大腸桿菌潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hph)(“用作植物細(xì)胞篩選標(biāo)記的嵌合潮霉素抗性基因”Van den Wizen，Townsend，Lee and Bedbrook，Plant Mol.Biol，5299-302，1989)。所用的引物設(shè)計(jì)成在hph的編碼區(qū)(發(fā)表的hph序列中堿基對(duì)211-1236；“質(zhì)粒編碼的潮霉素B抗性潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的序列及其在大腸桿菌和啤酒酵母中的表達(dá)”Gritz and Davies，Gene 25179-188，1983)的5′端和3′端分別引入SphI和KpnI位點(diǎn)。用SphI和KpnI消化所得的PCR產(chǎn)物，并將消化產(chǎn)物插入pUC119多接頭區(qū)的相應(yīng)位點(diǎn)。所產(chǎn)生的質(zhì)粒pHPT100用作起始質(zhì)粒以構(gòu)建篩選序列盒。將兩個(gè)新的接頭區(qū)引入此質(zhì)粒，以便于克隆啟動(dòng)子和終止子片段。其中，HindIII-XbaI-XhoI-SphI接頭插入HindIII和SphI位點(diǎn)之間，以及KpnI-NotI-SacI接頭插入仍保留在pHPT100中的pUC119多接頭的KpnI和SacI位點(diǎn)之間。所產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)指定為pHPT102。用于擴(kuò)增pgk啟動(dòng)子(“T.reesei 3-磷酸甘油酸激酶基因(pgk1)的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)和表達(dá)”Vanhanen，Saloheimo，Ilmen，Knowles and Penttila，Gene 106129-133，1991)的引物設(shè)計(jì)成在啟動(dòng)子的-970位和+1位分別引入XhoI位點(diǎn)和SphI位點(diǎn)。這些位點(diǎn)隨后用來將pgk啟動(dòng)子插入pHPT102的XhoI和SphI位點(diǎn)，以制備pHPT115。由pCB1Ta，用Pwo聚合酶擴(kuò)增1.3kb的cbh1終止子片段，所用的一個(gè)引物與cbh1的3′端非翻譯區(qū)(發(fā)表的cbh1序列中堿基對(duì)1864-1899)配對(duì)，該非翻譯區(qū)在堿基對(duì)1877-1882含有KpnI位點(diǎn)，所用的另一引物為PUC反向引物(Cat.No.18432-013，Gibco/BRL)，該引物與pCB1Ta中cbh1終止子3′端EcoRI位點(diǎn)的下游配對(duì)。用KpnI消化cbh1終止子的PCR產(chǎn)物，并將此消化產(chǎn)物插入pHPT115的唯一KpnI位點(diǎn)，制備篩選序列盒質(zhì)粒pHPT136。
為了獲得轉(zhuǎn)化載體，由pCBG1-Xho分離出5.6kb XbaI/XhoI片段的表達(dá)序列盒，并將其插入pHPT136的篩選序列盒上游的唯一XbaI/XhoI位點(diǎn)。最終的轉(zhuǎn)化載體pCBG1-TV如
圖1所示，以環(huán)狀質(zhì)粒的形式，如以下實(shí)施例9所述，通過微粒轟擊導(dǎo)入T.reesei M2C38中。
由基因組bgl1克隆pJEN200，用Pwo聚合酶和引物擴(kuò)增出β-葡萄糖苷酶編碼區(qū)(堿基對(duì)474-2680)，以便在發(fā)表的bgl1序列(Barrett，等)中堿基對(duì)474的正上游插入XbaI位點(diǎn)，以及在堿基對(duì)2680的正下游插入KpnI位點(diǎn)。將平端的pCR產(chǎn)物插入PUC118的SmaI位點(diǎn)，制備的質(zhì)粒指定為pBGm.s。由于XbaI位點(diǎn)是構(gòu)建在成熟β-葡萄糖苷酶的起始32位纈氨酸的正上游，所以克隆的片段不包括β-葡萄糖苷酶的分泌信號(hào)。用XbaI和KpnI消化質(zhì)粒pBGm.s，分離出含有bgl1編碼區(qū)并減去分泌信號(hào)的2.2kb片段，將此片段插入質(zhì)粒pCB219N(在以上實(shí)施例5中描述)中cbh2終止子上游的XbaI和KphI位點(diǎn)，制備質(zhì)粒pBG2X。由基因組xln2亞克隆pXYN2K-2，用Pwo聚合酶，并采用xln2特異的引物和pUC反向引物(Cat.No.18432-013，Gibco/BRL)擴(kuò)增2.3kb含有xln2基因(堿基對(duì)-2150至+99，其中+1表示ATG起始密碼子)的啟動(dòng)子和分泌信號(hào)的片段。xln2特異的引物含有已知的xln2序列(Saarelainen等)中堿基對(duì)103正下游的NheI位點(diǎn)，pUC反向引物與xln2基因5′端KpnI位點(diǎn)的上游配對(duì)。用EcoRI(作為pUC119多接頭的一部分由pXYN2K-2i擴(kuò)增而來)和NheI消化xln2 PCR產(chǎn)物，并將其產(chǎn)物插入質(zhì)粒pBR322L(在以上實(shí)施例5中描述)中，制備pBR322LXN。然后用Klenow將pBR322LXN的EcoRI位點(diǎn)補(bǔ)平，再加入SpeI接頭(Cat.No.1086，New Englanol Biolabs)，制備pBR322SpXN。用XabI和NotI酶切pBG2X質(zhì)粒，分離出含有bgl1編碼區(qū)以及隨后的cbh2終止子的4.2kb片段。將此片段插入用NheI和NotI酶切的質(zhì)粒pBR322SpXN中(NheI和XbaI有相匹配的凸末端)。該克隆中木聚糖酶分泌信號(hào)直接與成熟β-葡萄糖苷酶融合，制成完整的表達(dá)序列盒pXBG-2。
將以上實(shí)施例5中所述的篩選序列盒質(zhì)粒pHPT136中的cbh1終止子，用含有xln2轉(zhuǎn)錄終止子的2.6kb KpnI片段取代。用Pwo聚合酶和引物由基因組亞克隆pXYN2K-2擴(kuò)增xln2終止子，所用的一個(gè)引物可引入發(fā)表的xln2序列(Saarelainen等)中堿基對(duì)780正下游的KpnI位點(diǎn)，另一引物為PUC正向引物(Cat.No.18431-015，Gibco/BRL)，該引物與pXYN2K-2中xln2基因3′端的下游配對(duì)。用KpnI消化xln2終止子的PCR產(chǎn)物，并與含有pUC119中pgk啟動(dòng)的hph基因的pHPT136的5.1kb KpnI片段連接，制成篩選序列盒質(zhì)粒pHPT136X。
轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建包括在篩選序列盒的pgk啟動(dòng)子正上游插入表達(dá)序列盒。用NotI消化表達(dá)序列盒質(zhì)粒pXBG2，用Klenow將末端補(bǔ)平，然后用SpeI消化。篩選序列盒pHPT136X用同樣的方式制備，先用XhoI消化，隨后通過充填反應(yīng)產(chǎn)生平末端，然后用XbaI消化。將pXBG2的6.5kb SpeI/平端NotI片段與pHPT136X的XbaI/平端XhoI片段(Spel和Xbal有相匹配的凸出末端)連接，進(jìn)行上述兩片段進(jìn)行平端一粘端連接。最終的轉(zhuǎn)化載體pXBG-TV如圖2所描述，在其唯一的NotI位點(diǎn)線性化，然后如以下實(shí)施例9所述，通過微粒轟擊轉(zhuǎn)化T.reeseiM2C38。
實(shí)施本實(shí)施例的目的是檢測(cè)cbh1啟動(dòng)子和xln2分泌信號(hào)對(duì)bgl表達(dá)的聯(lián)合影響。用含有cbh1啟動(dòng)子的質(zhì)粒pBR322LCS(實(shí)施例5)作為模板，PCR擴(kuò)增含有cbh1啟動(dòng)子中堿基對(duì)-1399至-204的1.2kb HindIII片段，以便在堿基對(duì)-1393至-1388插入唯一的XbaI位點(diǎn)。此修飾的cbh1啟動(dòng)子片段用Hind III消化后，用來取代pXBG1(實(shí)施例6)中xln2啟動(dòng)子堿基對(duì)-1400至-121的片段，制成新的表達(dá)序列盒質(zhì)粒pC/XBG1。用NotI消化pC/XBG1，隨后用Klenow片段將NotI位點(diǎn)補(bǔ)平，再用SpeI消化，分離出6.4kb的表達(dá)序列盒。然后通過平端/粘端連接，將此片段插入已用XhoI消化的pHPT136X中hph篩選序列盒的上游，并用Klenow將此XhoI補(bǔ)平后，再用XbaI消化。如圖3所示，最終的轉(zhuǎn)化載體pC/XBG(XbaI)-TV(保藏編號(hào)209613，保藏日期1998年2月3日，保藏單位是美國標(biāo)準(zhǔn)生物材料保藏所(American TypeCulture Collection)，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852 USA)，將此轉(zhuǎn)化載體中在cbh1啟動(dòng)子5′端和xln2終止子3′端的單一XbaI和NotI位點(diǎn)線性化，然后如以下實(shí)施例9所述，通過微粒轟擊轉(zhuǎn)化T.reeseiM2C38。
孢子出現(xiàn)后，進(jìn)行第二次篩選，以分離單個(gè)轉(zhuǎn)化子。用接種環(huán)收集孢子并重懸于無菌水中。然后將此懸浮物通過塞有玻璃微纖維的無菌注射器過濾，使孢子濾過，而留下不需要的菌絲體。測(cè)定懸浮物中孢子的濃度，然后進(jìn)行稀釋，將稀釋物在添加0.75％Oxgall(Difco)和潮霉素B(40單位/ml)的PDA平板上涂板，每個(gè)平板得到20-50個(gè)孢子。Oxgall起到菌落限制劑的作用，從而在這些第二次篩選平板上分離出單個(gè)菌落。2-3天后可觀察到分離出來的菌落。
表1親本和重組T.reesei株中的bgl1拷貝數(shù)

實(shí)施例11在液體培養(yǎng)物中生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶本實(shí)施例描述木霉株生產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶酶量的測(cè)定方法將單個(gè)木霉菌落轉(zhuǎn)移到PDA平板上，用于繁殖各自的培養(yǎng)物。為了使搖瓶的接種均勻，要求菌落形成孢子，搖瓶接種后用于測(cè)定其培養(yǎng)物產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶和纖維素酶的能力。培養(yǎng)基的組成如下所示。組分 g/L(NH4)2SO46.35KH2PO44.00MgSO4·7H2O 2.02CaCl2·2H2O 0.53CSL(玉米漿) 6.25CaCO310.00碳源**5-10微量元素*1ml/L*微量元素溶液含有5g/l FeSO4·7H2O；1.6g/l MnSO4·H2O；1.4g/l ZnSO4·7H2O。**5g/l葡萄糖加10g/l Solka floc(采用cbh1或其他纖維素酶啟動(dòng)子時(shí))、10g/l木聚糖(采用xln2啟動(dòng)子時(shí))或其他與指導(dǎo)β-葡萄糖苷酶表達(dá)的啟動(dòng)子相匹配的碳源。碳源可配制成pH2-7的水溶液，分裝后滅菌，然后加入到主培養(yǎng)基中。
液體的體積為每個(gè)1升的瓶中加入150ml，起始pH為5.5，每個(gè)瓶子都在121℃高壓滅菌30分鐘，然后接種。
對(duì)未轉(zhuǎn)化的(天然的)和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，按實(shí)施例9所述，從PDA平板分離孢子，每個(gè)搖瓶接種1-2×106個(gè)孢子。該搖瓶在28℃、以200rpm的速度振搖6天。通過GF/A玻璃微纖維過濾器(Whatman)過濾收集含分泌蛋白的濾液。用Bio-Rad Protein Assay(Cat.No.500-0001)，以木霉纖維素酶為標(biāo)準(zhǔn)，確定蛋白的濃度。β-葡萄糖苷酶活性按實(shí)施例16所述進(jìn)行測(cè)定。
篩選產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力(IU/mg)比未轉(zhuǎn)化的宿主菌至少高10倍以上的轉(zhuǎn)化子，該產(chǎn)酶能力的測(cè)定方法是將培養(yǎng)物濾液的β-葡萄糖苷酶活性IU/ml除以該培養(yǎng)物濾液的蛋白濃度(mg/ml)。實(shí)施例12由T.reesei株RutC30、RC-300、和RC-302用Solka floc碳源生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶基于前面所述的用cbh1啟動(dòng)子和分泌信號(hào)在木霉中使蛋白過表達(dá)的成功結(jié)果，將成熟β-葡萄糖苷酶編碼區(qū)置于基因重組物中cbh1啟動(dòng)子和分泌信號(hào)的下游，該基因重組物如
圖1所示，并在實(shí)施例5中描述(pCBG1-TV)。通過微粒轟擊，將載體引入T.reesei RutC30中(實(shí)施例9)，所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子RC-300能產(chǎn)生高出親本株7倍多的β-葡萄糖苷酶活性(表2)。此7倍增加量是由于轉(zhuǎn)化載體的一個(gè)拷貝摻入了宿主的染色體中(實(shí)施例10，表1)。β-葡萄糖苷酶活性較大的提高是由于某一基因結(jié)構(gòu)的1個(gè)拷貝，在此基因結(jié)構(gòu)中β-葡萄糖苷酶是用cbh1啟動(dòng)子和分泌信號(hào)進(jìn)行表達(dá)，這種策略優(yōu)于Barnett等和Fowler等所采用的策略。在Barnett等和Fowler等所采用的方法中，基因結(jié)構(gòu)的10-15個(gè)拷貝僅使β-葡萄糖苷酶的活性增加了5倍，在該基因結(jié)構(gòu)中β-葡萄糖苷酶用其本身的啟動(dòng)子和分泌信號(hào)進(jìn)行表達(dá)。但是，β-葡萄糖苷酶活性增加7倍，仍不足以緩解纖維素水解過程中β-葡萄糖苷酶的不足。
通過微粒轟擊，將基因重組物導(dǎo)入未轉(zhuǎn)化的T.reesei株RutC30(實(shí)施例9)，該基因重組物來自編碼與T.reesei木聚糖酶II分泌信號(hào)相連的成熟β-葡萄糖苷酶的pC/XBG(XbaI)。
未轉(zhuǎn)化的T.reesei株RutC30及由此宿主產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化株RC-302按實(shí)施例11的步驟，以10g/L Solka floc和5g/L葡萄糖為碳源進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果如表2所示。
未轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生的每mg蛋白中β-葡萄糖苷酶活性為0.14IU。
含有CBH1啟動(dòng)子和木聚糖酶II分泌信號(hào)的轉(zhuǎn)化子RC-302產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶活性約為19IU/mg。這比未轉(zhuǎn)化株提高了約136倍，這對(duì)于纖維素-乙醇生產(chǎn)來說是很重要的。
含有CBH1啟動(dòng)子和木聚糖酶II分泌信號(hào)的轉(zhuǎn)化子RC-302產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶活性比含有CBH1啟動(dòng)子和CBH1分泌信號(hào)的最佳RC300轉(zhuǎn)化子高出19倍。
表2150ml搖瓶培養(yǎng)物中T.reesei株RutC30、RC-300和RC-302的β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量

實(shí)施例13由M2C38和RM4-302株用Solka floc碳源生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶將載體pCBG1-TV通過微粒轟擊導(dǎo)入T.reesei M2C38中(實(shí)施例9)，上述載體中β-葡萄糖苷酶依靠CBH1啟動(dòng)子和分泌信號(hào)來表達(dá)(
圖1和實(shí)施例5)。所得轉(zhuǎn)化子RM4-300產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶活性約為親本株的7-12倍(表3)。
通過微粒轟擊，將基因重組物導(dǎo)入未轉(zhuǎn)化的T.reesei株M2C38(實(shí)施例9)，該基因重組物來源于編碼與T.reesei木聚糖酶II分泌信號(hào)相連的成熟T.reesei β-葡萄糖苷酶的載體pC/XBG(XbaI)-TV。
未轉(zhuǎn)化的M2C38株和由此宿主轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化株RM4-302，以10g/LSolka floc和5g/L葡萄糖為碳源，按實(shí)施例11的步驟進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果如表3所示。
未轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生的每mg蛋白中β-葡萄糖苷酶活性為0.35IU。
含有CBH1啟動(dòng)子和木聚糖酶II分泌信號(hào)的轉(zhuǎn)化子RM4-302產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶活性約為14.1IU/mg。這比未轉(zhuǎn)化株提高了約40倍，這對(duì)纖維素-乙醇生產(chǎn)來說有很重要的意義。
含有CBH1啟動(dòng)子和木聚糖酶II分泌信號(hào)的轉(zhuǎn)化子RM4-302所產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶活性約為含有CBH1啟動(dòng)子和CBH1分泌信號(hào)的轉(zhuǎn)化子的3倍。該差別是很重要的，說明采用CBH1啟動(dòng)子和分泌信號(hào)時(shí)不能產(chǎn)生足夠的β-葡萄糖苷酶，以完全抑制水解過程中纖維二糖的產(chǎn)生。
表3150ml搖瓶培養(yǎng)物中T.reesei株M2C28、RM4-300和RM4-302的β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量

實(shí)施例14用T.reesei株M2C38和RM4-301由木聚糖碳源生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶通過微粒轟擊，將基因重組物轉(zhuǎn)導(dǎo)入未轉(zhuǎn)化的T.reesei株M2C38(實(shí)施例9)，該基因重組物來源于編碼與木聚糖酶啟動(dòng)子和分泌信號(hào)相連的成熟T.reesei β-葡萄糖苷酶的載體pXBG1-TV。
未轉(zhuǎn)化的M2C38株和由此宿主轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化株RM4-301，以5g/L葡萄糖和10g/L木聚糖為碳源，按實(shí)施例11的步驟培養(yǎng)。結(jié)果如表4所示。
未轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生的每mg蛋白中β-葡萄糖苷酶活性為0.16IU。含有木聚糖酶II啟動(dòng)子和木聚糖酶II分泌信號(hào)的轉(zhuǎn)化子RM4-301產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶活性約為20.4IU/mg。此結(jié)果比未轉(zhuǎn)化的菌株提高了約127倍，這對(duì)纖維素-乙醇生產(chǎn)來說是非常有意義的。
表4用木聚糖為碳源，150ml搖瓶培養(yǎng)基物中T.reesei株M2C38和RM4-301的β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量

實(shí)施例15用Solka floc碳源，由BTR-48和RB48-301株生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶通過微粒轟擊，將基因重組物導(dǎo)入未轉(zhuǎn)化的T.reesei株BTR48，該基因重組來源于編碼與木聚糖酶啟動(dòng)子和分泌信號(hào)相連的成熟T.reeseiβ-葡萄糖苷酶的載體pXBG1-TV。
未轉(zhuǎn)化的BTR-48株和由該宿主轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化株RB48-301，以5g/L葡萄糖和10g/L Solka floc為碳源，按實(shí)施例11的步驟進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果如表5所示。
未轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生的每mg蛋白中β-葡萄糖苷活性為0.16IU酶。含有木聚糖酶II啟動(dòng)子和木聚糖酶II分泌信號(hào)的轉(zhuǎn)化子RB48-301產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶活性約為21.9IU/mg。此結(jié)果比未轉(zhuǎn)化株提高了約136倍，這對(duì)纖維素-乙醇生產(chǎn)來說是非常有意義的。
表5用Solka floc為碳源，150ml搖瓶培養(yǎng)基中T.reesei株BTR48和RB48-301的β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量

實(shí)施例16酶混合物中的β-葡萄糖苷酶活性的測(cè)定按照Ghose的方法(“纖維素酶活性的測(cè)定”Pure and Appl.Chem.，59257-268，1987)，測(cè)定β-葡萄糖苷酶活性?；钚詼y(cè)定步驟為用50mM檸檬酸鈉緩沖液(pH4.8)將酶樣品稀釋成若干個(gè)濃度，系列系稀釋樣品的體積均為0.5ml。合適的稀釋倍數(shù)范圍是將樣品的估計(jì)活性稀釋3～24倍。例如，10U/ml的樣品的稀釋比為1∶30-1∶240。無論所用的稀釋倍數(shù)是多少，每支酶標(biāo)管內(nèi)均裝入0.5ml的檸檬酸緩沖液樣品。底物為15mM(5.13g/L)的纖維二糖。將稀釋的酶貯存液和底物分別在50℃預(yù)熱5分鐘，然后在裝有酶的每支管中加入一份0.5ml的底物。試管在50℃溫育30分鐘。然后將各試管浸入沸水浴中5分鐘，以終止反應(yīng)。將試管旋轉(zhuǎn)混合，在YSI葡萄糖分析儀上測(cè)定每份酶樣品管中的糖量，此時(shí)需要考慮到由酶產(chǎn)生的少量背景。
1個(gè)單位β-葡萄糖苷酶活性的定義為每分鐘產(chǎn)生的葡萄糖微摩爾數(shù)。由每種稀釋度所得的平均值按公式1計(jì)算活性，該稀釋度條件下產(chǎn)生0.15-1.5mg/ml的葡萄糖。
A＝C×G×D (1)其中，A＝β-葡萄糖苷酶活性(U/ml)(或微摩爾葡萄糖/ml/分鐘)C＝16.7微摩爾/mg/分鐘G＝產(chǎn)生的葡萄糖(mg/ml)D＝酶的稀釋度(無單位)實(shí)施例17纖維素水解本實(shí)施例的目的是確認(rèn)轉(zhuǎn)化木霉產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶對(duì)纖維素水解的促進(jìn)效果用于此研究的酶為Iogen Cellulase，此酶為Iogen公司生產(chǎn)的纖維素酶市售品；以及按實(shí)施例11的方法，30L發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)RM4-302的產(chǎn)物，所用的培養(yǎng)基濃度為實(shí)施例11中所列出的兩倍。通過Amicon10,000MWCO膜超濾濃縮，使酶濃度提高，并校正至與Iogen Cellulase相同的纖維素酶活性。這兩種酶的活性如表6所示。
表6用于纖維素水解研究的酶的活性

用于本研究中的纖維素是預(yù)處理的燕麥殼，按照Foody等的(“用于纖維素轉(zhuǎn)化為燃料乙醇的改進(jìn)預(yù)處理工藝”U.S.5,916,780)實(shí)施例6的步驟制備。
將0.5g預(yù)處理的燕麥殼纖維素樣品加入到裝有49.5g的0.05mol檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.8)的25ml燒瓶中。
將酶加入到搖瓶中，每g纖維素的相應(yīng)加入量為10FPU。最終的β-葡萄糖苷酶劑量列于表6中。
加入兩種酶的搖瓶都以250rpm振蕩，并保持在50℃共24小時(shí)。此時(shí)，取樣并過濾除去不溶的纖維素，然后用標(biāo)準(zhǔn)Dionex脈沖-電流HPLC糖類分析法分析葡萄糖和纖維二糖的濃度。結(jié)果列于表7中。
Iogen Cellulase是常用的木霉纖維素酶，但該酶僅將45％的纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖。在乙醇生產(chǎn)中如此低的程度是不可接受的。纖維二糖的蓄積也很嚴(yán)重，占纖維素的13％。
β-葡萄糖苷酶含量提高的纖維素酶對(duì)纖維素水解得較好，可將近84％的纖維素轉(zhuǎn)換為葡萄糖。其優(yōu)良表現(xiàn)的原因是由于β-葡萄糖苷酶的含量豐富，導(dǎo)致纖維二糖的蓄積幾乎可忽略。
表7高含量的β-葡萄糖苷酶增加了纖維素的水解

實(shí)施例18RutC30和M2C38株中T.reesei xln2和bgl1基因的比較用六種不同的限制性內(nèi)切酶消化M2C38和RutC30的DNA，這些內(nèi)切酶酶切成熟β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶分泌信號(hào)(實(shí)施例8)編碼區(qū)的內(nèi)部和外部，然后對(duì)此消化的DNA進(jìn)行Southern印跡分析，以確定該兩種菌株間是否存在多態(tài)性。如圖4和圖5所示，用編碼成熟β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶II啟動(dòng)子以及分泌信號(hào)的M2C38片段制備的標(biāo)記探針雜交時(shí)，可發(fā)現(xiàn)相同的條帶，表明了該兩種菌株間的這些區(qū)域不存在多態(tài)性，而有高度的DNA序列同源性。
對(duì)于制備實(shí)施例5-7中所述的基因重組物時(shí)所必需的M2C38DNA序列來說，鑒定和克隆這些序列所用的探針和引物都是基于已發(fā)表的幾種不同T.reesei株的各種基因DNA序列制備的，這些菌株包括QM9414(pgk，Vanhanen等，1989；以及cbh2，Chen等)、QM9419衍生株VTT-D79125(xln2，Saarelaihen等)和L27(cbh1，Shoemaker等)，以及RL-P37株的衍生株P(guān)40(bgl1，Barnett等)。所有這些菌株，類似于M2C38，都來源于QM6a株(“T.reesei染色體和基因的電泳核型分析纖維素酶和木聚糖酶基因的圖譜”Carter，Allison，Reyand Dunn-Coleman，Molecular Microbiology 62167-2174，1992)。
RutC30由QM6a衍生而來，并且是M2C38的先祖。發(fā)明者確信實(shí)施例2-4所述的方法，即用于制備實(shí)施例5-7所述β-葡萄糖苷酶表達(dá)載體的基因序列的分離方法，同樣能用于分離M2C38和RutC30的相同基因序列。根據(jù)上述的菌株譜系和Southern印跡信息，發(fā)明者還高度地確信由RutC30 DNA制備的基因重組物與由M2C38 DNA制備的基因重組物將含有相同的DNA片段，該DNA片段為編碼成熟β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶II分泌信號(hào)的序列。由于由M2C38 DNA制備的基因結(jié)構(gòu)(實(shí)施例5-7)提高了β-葡萄糖苷酶在M2C38和RutC30中的表達(dá)(實(shí)施例12-14)，本發(fā)明者也確信由RutC30 DNA制備的基因重組物將會(huì)在RutC30和M2C38中使β-葡萄糖苷酶活性有同樣水平的提高。
實(shí)施例19描述了T.reesei株M2C38和BTR213營養(yǎng)缺陷型pyr4的分離。實(shí)施例20和21描述了目的酶(內(nèi)源和外源的)通過基因重組物在T.reesei株M2C38和BTR213中的轉(zhuǎn)化和表達(dá)。實(shí)施例22、26和32分別描述了T.reesei eg2和man1基因的克隆。
實(shí)施例23、27、28、30和32描述了用于在T.reesei中表達(dá)目的酶的基因重組物的構(gòu)建。實(shí)施例25、29、31和33描述了基因重組物在T.reesei株M2C38和BTR 213中的轉(zhuǎn)化和表達(dá)。
為了篩選這些突變體，將T.reesei的孢子在含有1.2g/ml FOA、2mg/ml尿苷的固體最小培養(yǎng)基上涂平板。最小培養(yǎng)基的組成如下10g/L的葡萄糖、10g/L KH2PO4、6g/L(NH4)2SO4、1g/L MgSO4·7H2O、3g/L檸檬酸三鈉·2H2O、5mg/L FeSO4·7H2O、1.6mg/L MnSO4·H2O、1.4mg/LZnSO4·7H2O、2mg/ml CaCl2·2H2O、pH5.5。在3-4天內(nèi)出現(xiàn)自發(fā)的FOA抗性菌落。進(jìn)一步篩選，鑒定其生長需要尿苷的突變體。鑒定明確含有缺失pyr4基因的突變體的方法是用質(zhì)粒pNCP4hph轉(zhuǎn)化，該質(zhì)粒含有潮霉素抗性基因和粗糙鏈孢霉pyr4基因。此載體的構(gòu)建方法如下，從pFB6中分離出3.2kb的BglII片段(“通過在大腸桿菌中的表達(dá)，粗糙鏈孢霉乳清酸核苷-5′-一磷酸羧化酶結(jié)構(gòu)基因的克隆”Buxton，F(xiàn).P.and Radford，A.，Mol.Gen.Genet.190403-405，1983)，然后將其克隆到pHPT136(上述實(shí)施例5)的唯一BamHI位點(diǎn)，制備載體pNCP4hph。通過微粒轟擊法，用pNCP4hph轉(zhuǎn)化孢子，并在含潮霉素的Potato Dextrose瓊脂培養(yǎng)基上篩選。隨后用缺乏尿苷的培養(yǎng)基培養(yǎng)抗潮霉素的轉(zhuǎn)化子，鑒定出其缺失的pyr4基因被粗糙鏈孢霉的pyr4基因互補(bǔ)的轉(zhuǎn)化子。
用含有大腸桿菌潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hph)基因作為篩選標(biāo)記的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，在Potato Dextrose瓊脂培養(yǎng)基(PDA)平板上涂布1×106個(gè)孢子。轟擊后的平板在28℃溫育。轟擊后4小時(shí)，將添加80U/ml潮霉素B的篩選PDA培養(yǎng)基覆蓋在平板上，對(duì)孢子進(jìn)行初選。轟擊平板在28℃溫育，生長3-6天后，用無菌牙簽挑取單個(gè)轉(zhuǎn)化子，分別放在含40U/ml潮霉素B的各PDA平板上，并在28℃溫育3-6天。
用含有粗糙鏈孢霉pyr4基因作為篩選標(biāo)記的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，用1×106個(gè)孢子在最小培養(yǎng)基上制備平板(實(shí)施例19)。轟擊的平板在28℃溫育。生長3-6天后，用無菌牙簽挑取單個(gè)的轉(zhuǎn)化子，分別放在各最小培養(yǎng)基平板上，并在28℃溫育3-6天。
每個(gè)1升的搖瓶中加入150ml體積的液體，超始pH為5.5，每個(gè)搖瓶在接種前均在121℃高壓滅菌30分鐘。
用接種環(huán)從平板上收集天然的和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的孢子，并重新懸浮于無菌水中。然后將此懸浮液通過塞入玻璃微纖維的無菌注射器過濾。這樣可使孢子通過，而留下不需要的菌絲體。測(cè)定該懸浮液中孢子的濃度后，每個(gè)搖瓶接種1-2×106個(gè)孢子。將此搖瓶在28℃的溫度、200rpm振蕩培養(yǎng)6天。通過GF/A玻璃微纖維過濾器(Whatman)過濾，收集含有分泌蛋白的濾液。以木霉纖維素酶為標(biāo)準(zhǔn)，用Bio-Rad ProteinAssay(Cat.No.500-0001)測(cè)定蛋白的濃度。
用eg2亞克隆pEG2gen為模板，用Pwo聚合酶(Boehringer)和引物擴(kuò)增編碼葡聚糖內(nèi)切酶II蛋白連同其本身分泌信號(hào)(堿基對(duì)bp262-1692)的DNA序列，該引物設(shè)計(jì)成可在堿基對(duì)260-265引入SphI位點(diǎn)，以及在堿基對(duì)1692的終止密碼子正下游引入KpnI位點(diǎn)。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物以平端片段插入pUC119的SmaI位點(diǎn)，制備質(zhì)粒pEG2-6，并測(cè)定其序列。對(duì)于可使該eg2基因通過cbh1啟動(dòng)子而表達(dá)的表達(dá)序列盒來說，在其構(gòu)建之前，先用Pwo聚合酶和引物，由cbh1基因組亞克隆pCB152(上述實(shí)施例3)擴(kuò)增含有cbh1啟動(dòng)子的2.2kb片段，其中一個(gè)引物與pUC119多接頭的EcoRI位點(diǎn)的上游配對(duì)，另一反向引物設(shè)計(jì)成可在cbh1的起始密碼子引入SphI位點(diǎn)(發(fā)表的cbh1序列的堿基對(duì)209-214；“T.reesei L27株外切纖維二糖水解酶1的分子克隆”Shoemaker，Schweikart，Ladner，Gelfand，Kwok，Myambo andInnis，Bio/Technology 1691-696，1983；以下稱為Shoemakar等)。用EcoRI和SphI消化此擴(kuò)增的片段，并插入pBR322L(上述實(shí)施例5)中，制備質(zhì)粒pBRC1pro，pBR322L是在pBR322原有的位點(diǎn)SphI和SalI間插入合成的SphI-NotI-SalI接頭而衍生出來的質(zhì)粒。由pEG2-6分離出含eg2基因的1.4kb SphI/KpnI片段，并插入質(zhì)粒pCB219N(上述實(shí)施例5)中cbh2轉(zhuǎn)錄終止子上游唯一的SphI和KpnI位點(diǎn)之間。然后用SphI/NotI消化，分離出含eg2基因和cbh2轉(zhuǎn)錄終止子的3.3kb片段，并將其插入pBRC1pro中cbh1啟動(dòng)子正下游的SphI和NotI位點(diǎn)之間。所得表達(dá)序列盒質(zhì)粒pCEG2含有與cbh1啟動(dòng)子和cbh2終止子序列連接的eg2基因(編碼成熟的分泌葡聚糖內(nèi)切酶II及其本身的分泌信號(hào))。對(duì)此質(zhì)粒作進(jìn)一步的修飾，在唯一的NotI位點(diǎn)進(jìn)行消化，用Klenow補(bǔ)平并加入XhoI接頭(Cat.No.1073，New England Biolabs)，從而在cbh2終止子的3′端插入了單一XhoI位點(diǎn)，由此制成新的表達(dá)序列盒質(zhì)粒pEG2-Xho。為了構(gòu)建最終的轉(zhuǎn)化載體pEG2-TV(圖6a)，pCEG2-Xho在cbh2終止子的3′端單一XhoI位點(diǎn)進(jìn)行酶切，然后在cbh1啟動(dòng)子中堿基對(duì)-1392的單一XbaI位點(diǎn)進(jìn)行酶切，以分離出包含在cbh1啟動(dòng)子調(diào)控下的eg2基因的5.6kb表達(dá)序列盒。然后將此片段插入pHPT136(上述實(shí)施例5)中hph篩選序列盒的上游，該pHPT136已在單一XhoI和XbaI位點(diǎn)預(yù)先酶切過。在轉(zhuǎn)化T.reesei M2C38株之前，用XbaI和NotI消化轉(zhuǎn)化載體pEG2-TV，用瓊脂糖凝膠電泳分離片段，純化含有eg2基因結(jié)構(gòu)的大條帶。
為了構(gòu)建與xln2分泌信號(hào)連接并受cbh1啟動(dòng)子調(diào)控的成熟葡聚糖內(nèi)切酶II表達(dá)序列盒，用Pwo聚合酶和引物，以及用基因組亞克隆pEG2gen為模板擴(kuò)增發(fā)表的eg2序列(Saloheimo等)中堿基對(duì)331-1692片段，所用的引物設(shè)計(jì)成可在堿基對(duì)331的正上游引入唯一的NheI位點(diǎn)，以及可在堿基對(duì)1692的正下游引入唯一的KpnI位點(diǎn)。將產(chǎn)生的平末端片段插入pUC119的SmaI位點(diǎn)，制備質(zhì)粒pE1，并測(cè)定eg2基因的序列。用NheI/KpnI消化pE1，分離出1.3kb編碼成熟葡聚糖內(nèi)切酶II的片段(不含分泌信號(hào))，將此片段插入質(zhì)粒pCB219N-HB中cbh2終止子的上游，制備pCB219N-E1。pCB219N-HB是由pCB219N(上述實(shí)施例5)衍生的質(zhì)粒，在pCB219N中原有的pCB219 cbh2終止子片段上游的HindIII和BamI位點(diǎn)間插入合成的HindIII-SphI-NheI-BamHI接頭，即產(chǎn)生pCB219N-HB。用NheI/NotI消化pCB219N-E1，分離出含有eg2編碼區(qū)和cbh2終止子序列的3.2kb片段，將此片段插入質(zhì)粒pBR322LXN(上述實(shí)施例6)中xln2啟動(dòng)子和分泌信號(hào)正下游的NheI和NotI位點(diǎn)之間，制成pXE2。將pXE2中包含xln2啟動(dòng)子中堿基對(duì)-1400至-121的1.3kb HindIII片段用修飾的1.2kb HindIII片段替換，后者含有cbh1啟動(dòng)子中堿基對(duì)-1399至-204的片段，但在-1393至-1388有一個(gè)新的XbaI位點(diǎn)，該片段是用含有cbh1啟動(dòng)子的質(zhì)粒pBR322LCS為模板，通過PCR擴(kuò)增而制備的。由所得質(zhì)粒pC/XRE2-Xba，分離出包含修飾的cbh1啟動(dòng)子、xln2分泌信號(hào)、eg2編碼區(qū)和cbh2終止子的接近4.9kb的XbaI/NotI片段，并用來取代PCE2中包含cbh1啟動(dòng)子和分泌信號(hào)、eg2編碼區(qū)和cbh2終止子的XbaI/NotI片段，從而制備表達(dá)序列盒質(zhì)粒pC/XRE2。注意到pCE2的cbh1啟動(dòng)子中XbaI位點(diǎn)是位于堿基對(duì)-1497至-1492的內(nèi)源位點(diǎn)。因此，在表達(dá)序列盒質(zhì)粒pC/XRE2中，由于pCE2中天然cbh1啟動(dòng)子的內(nèi)源XbaI位點(diǎn)與pC/XE2-Xba中修飾的cbh1啟動(dòng)子的構(gòu)建XbaI位點(diǎn)的融合，丟失了cbh1啟動(dòng)子的堿基對(duì)-1496至-1393的片段。為了構(gòu)建最終的轉(zhuǎn)化載體pC/XRE2-TV(圖6b)，由pCE2和pC/XRE2，通過EcoRI消化(該酶在cbh1啟動(dòng)子的5′端和cbh2終止子的3′端酶切)分離出eg2表達(dá)序列盒。然后將這些片段插入粗糙鏈孢霉pyr4篩選序列盒質(zhì)粒pNCBg1的唯一EcoRI位點(diǎn)。pNCBg1的構(gòu)建方法是，將取自pFB6的、含有粗糙鏈孢霉pyr4基因的啟動(dòng)子、編碼區(qū)和終止子的3.2kb BglII片段插入pUC19多接頭的BamHI位點(diǎn)。選擇插入的方向，使包含eg2表達(dá)序列盒和粗糙鏈孢霉pyr4篩選序列盒的完整基因重組物通過XbaI消化能夠由pUC序列分離出。在轉(zhuǎn)化T.reesei株BTR213之前，用XbaI消化轉(zhuǎn)化載體pC/XRE2-TV，用瓊脂糖凝膠電泳分離消化的片段，并純化含有eg2基因結(jié)構(gòu)的大條帶。
表8親本株和重組木霉屬T.reesei株中eg2的拷貝數(shù)

實(shí)施例25由天然和轉(zhuǎn)化T.reesei株生產(chǎn)葡聚糖內(nèi)切酶II通過微粒轟擊，將基因重組物導(dǎo)入T.reesei株BTR213或其pyr4營養(yǎng)缺陷型(實(shí)施例20)，該基因重組物來源于載體pE2-TV和pC/XRE2-TV，并編碼與eg2或xln2分泌信號(hào)連接并受cbh1啟動(dòng)子調(diào)控的葡聚糖內(nèi)切酶II。用10g/L Solka floc和5g/l葡萄糖作為碳源，按照實(shí)施例21的步驟培養(yǎng)天然的BTR213株和所得轉(zhuǎn)化株。測(cè)定酶樣品的葡聚糖內(nèi)切酶活性葡聚糖內(nèi)切酶活性通過測(cè)量羧甲基纖維素(CMC)底物釋放的還原糖來確定。用50mM檸檬酸鈉緩沖液(pH4.8)將酶樣品稀釋成若干個(gè)濃度，系列稀釋樣品的體積均為0.5ml。合適的稀釋度范圍是將樣品的估計(jì)活性稀釋2-20倍。例如，1000U/ml的樣品的稀釋比為1∶2000～1∶20,000。無論所用的稀釋度是多少，每支酶標(biāo)管中檸檬酸緩沖液樣品的體積均為0.5ml。底物是用50mM檸檬酸鹽緩沖液(pH4.8)制備的1％CMC溶液。稀釋的酶貯存液和底物分別在50℃預(yù)熱5分鐘，然后將0.5ml等份的底物加入到裝有酶的各管中。將試管在50℃溫育30分鐘。加入3ml DNS試劑(1％二硝基水楊酸、1％氫氧化鈉、0.2％酚、0.05％偏亞硫酸氫鈉的水溶液)，并將試管浸入沸水中10分鐘，以終止反應(yīng)。煮沸結(jié)束后，每支管內(nèi)中加入1ml 40％的酒石酸鉀鈉水溶液。然后將管子旋轉(zhuǎn)振蕩。冷卻、并測(cè)定由底物釋放并與DNS試劑反應(yīng)的可溶性還原糖量。測(cè)定的方法是測(cè)量其在550nm的吸光度，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，該標(biāo)準(zhǔn)曲線由含有0.18-0.5mg/ml葡萄糖(還原糖)的50mM檸檬酸鹽緩沖液(pH4.8)制作。培養(yǎng)物的活性用以下方法進(jìn)行計(jì)算。即，在同樣條件下，比較產(chǎn)生0.5mg/ml還原糖所需的培養(yǎng)物濾液ml數(shù)與釋放0.5mg/ml還原糖所需的已知活性的對(duì)照葡聚糖內(nèi)切酶溶液ml數(shù)。
按實(shí)施例21所述，收集培養(yǎng)物濾液，并分析其葡聚糖內(nèi)切酶活性。結(jié)果如表9所示。
表9150ml搖瓶培養(yǎng)物中T.reesei株BTR213、201-2A、843-2和845-2的葡聚糖內(nèi)切酶產(chǎn)量

未轉(zhuǎn)化株每mg蛋白葡的聚糖內(nèi)切酶活性為9.9IU。含2個(gè)拷貝cbh1啟動(dòng)子和eg2分泌信號(hào)的轉(zhuǎn)化子210-2A產(chǎn)生2倍以上的葡聚糖內(nèi)切酶或活性接近22IU/mg，而含有cbh1啟動(dòng)子和xln2分泌信號(hào)的轉(zhuǎn)化子843-2和845-2的葡聚糖內(nèi)切酶活性為29-35IU/mg，這是天然菌株的3.3倍以上，或是含eg2分泌信號(hào)的轉(zhuǎn)化子的1.3-1.6倍。
用man1λDASH克隆為模板，用Pwo聚合酶(Boehringer)和引物擴(kuò)增編碼分泌甘露聚糖酶蛋白(堿基對(duì)88-1443)的DNA序列。所用的引物設(shè)計(jì)成可在堿基對(duì)88-93引入NheI位點(diǎn)，以及在堿基對(duì)1443的終止密碼子正下游引入KpnI位點(diǎn)。所得PCR產(chǎn)物以平末端片段的形式插入到pUC118的SmaI位點(diǎn)，以制成質(zhì)粒pManGNK，對(duì)該序列進(jìn)行測(cè)序。用NheI和KpnI消化pManGNK，分離出man1片段，然后將此片段插入已用NheI和KpnI消化過的表達(dá)序列盒質(zhì)粒pBR322LEC中，制成表達(dá)序列盒質(zhì)粒pLECMAN。pBR322LCS含有2.3kb片段的包含啟動(dòng)子和分泌信號(hào)的T.reesei cbh1基因(上述實(shí)施例5)，由pBR322LCS構(gòu)建pBR322LEC的方法如下用SphI消化pBR322LCS，使其線性化，并用T4 DNA聚合酶(Gibco/BRL)使其末端成為平末端，然后連接NheI接頭；用NheI消化后，用T4 DNA連接酶使該質(zhì)粒重新環(huán)化，從而產(chǎn)生質(zhì)粒pBR322LCN。用NheI/NotI消化pCB219N-HB(上述實(shí)施例22)，分離出含有T.reesei cbh2基因轉(zhuǎn)錄終止子，以及終止子的5′和3′端的唯一KpnI和NotI位點(diǎn)的1.9kb NheI/NotI片段，然后將此片段插入pBR322LCN中唯一NheI和NotI位點(diǎn)間，以獲得pBR322LEC。為了獲得最終的轉(zhuǎn)化載體pCMAN-TV(圖7a)，用NotI消化pLECMAN中cbh2終止子3′端的唯一NotI位點(diǎn)，用Klenow補(bǔ)平，然后在堿基對(duì)-1392的cbh1啟動(dòng)子唯一XbaI位點(diǎn)消化，以分離出含有在cbh1啟動(dòng)子和分泌信號(hào)調(diào)控下的man1基因的5.6kb表達(dá)序列盒。然后將此片段插入pHPT136(上述實(shí)施例5)中hph篩選序列盒的上游，pHPT136的唯一XhoI位點(diǎn)已預(yù)先消化過并已用Klenow補(bǔ)齊，隨后已將鄰近的唯一XbaI位點(diǎn)消化。在轉(zhuǎn)化T.reesei株M2C38之前，先用XbaI和NotI消化pCMAN-TV，用瓊脂糖凝膠電泳分離消化片段，然后純化含有man1基因結(jié)構(gòu)的大條帶。
用NheI/NotI消化pBR322LEC(上述實(shí)施例27)，分離出包含man1編碼區(qū)和cbh2轉(zhuǎn)錄終止子的3.3kb NheI/NotI片段，然后將此片段插入質(zhì)粒pBR322SpXN(上述實(shí)施例6)中T.reesei xln2啟動(dòng)子和分泌信號(hào)序列的下游，產(chǎn)生表達(dá)序列盒質(zhì)粒pXMAN。用Hind III消化pBR322LCS(上述實(shí)施例5)，分離出包含T.reesei cbh1啟動(dòng)子的堿基對(duì)-1399至-204的1.2kb Hind III片段，用此片段替換pXMAN中包含xln2啟動(dòng)子的堿基對(duì)-1400至-121的1.3kb HindIII片段，得到表達(dá)序列盒質(zhì)粒pC/XMAN。為了獲得最終的轉(zhuǎn)化載體pXMAN-TV(圖7b)和pC/XMAN-TV(圖7c)，分別消化pXMAN和pC/XMAN中cbh2終止子3′末端的唯一NotI位點(diǎn)，用Klenow補(bǔ)平，然后在cbh1啟動(dòng)子的堿基對(duì)-1392的唯一XbaI位點(diǎn)消化，以分離出含有受xln2啟動(dòng)子和分泌信號(hào)或cbh1啟動(dòng)子和xln2分泌信號(hào)調(diào)控的man1基因的5.6kb表達(dá)序列盒。然后將這些片段分別插入pHPT136X(上述實(shí)施例6)中hph篩選序列盒的上游，該pHPT 136X的唯一XhoI位點(diǎn)已預(yù)先消化過并已用Klenow補(bǔ)平后，隨后已將鄰近的XbaI位點(diǎn)消化。在轉(zhuǎn)化T.reesei株M2C38之前，用NotI消化轉(zhuǎn)化載體pXMAN-TV和pC/XMAN-TV，使其線性化。
按實(shí)施例21所述收集培養(yǎng)物濾液，并按上述方法分析甘露聚糖酶的活性。結(jié)果如表10所示。
表10150ml搖瓶培養(yǎng)物中T.reesei株M2C38、5D和82D的甘露聚糖酶產(chǎn)量

未轉(zhuǎn)化株的每mg蛋白甘露聚糖酶活性為3.58IU。含有cbh1啟動(dòng)子和分泌信號(hào)的轉(zhuǎn)化子5D產(chǎn)生1.9倍以上甘露聚糖酶或酶活性為6.72IU/mg，而含有cbh1啟動(dòng)子和xln2分泌信號(hào)的轉(zhuǎn)化子82D甘露聚糖酶活性為16.22IU/mg，這是天然株的4.5倍以上，或是含cbh1分泌信號(hào)的轉(zhuǎn)化子的2.4倍以上。
通過微粒轟擊，將載體pXMAX-TV的基因重組物導(dǎo)入T.reesei株M2C38(實(shí)施例20)，該基因重組物編碼與xln2分泌信號(hào)連接并受xln2啟動(dòng)子調(diào)控的成熟甘露聚糖酶。以10g/l木聚糖和5g/l葡萄糖為碳源，按實(shí)施例21的步驟培養(yǎng)天然株M2C38和由其產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化株。
按實(shí)施例21所述收集培養(yǎng)物濾液，并按上述方法分析其甘露聚糖酶活性。結(jié)果如表11所示。
表11150ml搖瓶培養(yǎng)物中T.reesei株M2C38和17D的甘露聚糖酶產(chǎn)量

以木聚糖為碳源時(shí)，未轉(zhuǎn)化株每mg蛋白的甘露聚糖酶活性為0.3IU。含有xln2啟動(dòng)子和分泌信號(hào)的轉(zhuǎn)化子17D產(chǎn)生9.4倍以上的甘露聚糖酶，或酶活性為2.81IU/mg。
為了克隆成熟葡聚糖內(nèi)切酶II基因(cmc3)的編碼區(qū)，用前面所述的方法(實(shí)施例8)，從H.insolens株ATCC 22080生物質(zhì)中分離出H.insolens的基因組DNA，該生物質(zhì)是在含24g/l玉米漿、24g/l葡萄糖和0.5g/l CaCO3、pH5.5的培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48小時(shí)后所得的(如在“清潔劑纖維素酶”中所述，Barbegaard，Jensen and Holm，U.S.Pat.No.4,435,307，1984)。然后用Pwo聚合酶和引物，用此H.insolens基因組DNA作為模板擴(kuò)增成熟葡聚糖內(nèi)切酶II的編碼區(qū)。所用的引物設(shè)計(jì)成可在H.insolens cmc3序列(Gene Bank登記號(hào)X76046)中堿基對(duì)64的正上游以及堿基對(duì)1182的正下游分別引入唯一的NheI和KpnI位點(diǎn)。擴(kuò)增的片段用NheI和KpnI消化，并用來替換表達(dá)序列盒質(zhì)粒pCMAN(實(shí)施例26)中的man1基因，該質(zhì)粒pCMAN已預(yù)先用NheI和KpnI消化。在所得cmc3表達(dá)序列盒質(zhì)粒pChHE2中，cmc3序列的表達(dá)將由cbh1啟動(dòng)子和分泌信號(hào)驅(qū)動(dòng)。為了構(gòu)建cmc3基因與xln2分泌信號(hào)連接的表達(dá)序列盒pC/XhHE2，用經(jīng)NheI和KpnI消化的cmc3PCR產(chǎn)物替換表達(dá)序列盒質(zhì)粒pCE2(上述實(shí)施例22)中的eg2基因，質(zhì)粒pCE2預(yù)先用NheI和KpnI消化。
為了得到轉(zhuǎn)化載體pChHE2-TV(圖8a)和pC/XhHE2-TV(圖8b)，通過EcoRI消化pChHE2和pC/XHE2(該酶在cbh1啟動(dòng)子的5′端和cbh2終止子的3′端酶切)，分離出cmc3表達(dá)序列盒。然后將這些片段分別插入粗糙鏈孢霉pyr4篩選序列盒質(zhì)粒pNCBgl(上述實(shí)施例23)中唯一的EcoRI位點(diǎn)。選擇插入的方向，使包含cmc3表達(dá)序列盒和粗糙鏈孢霉pyr4篩選序列盒的完整基因重組物通過XbaI的消化從pUC序列中分離出。在轉(zhuǎn)化T.reesei株M2C38之前，用XbaI消化轉(zhuǎn)化載體pChHE2-TV和pC/XhHE2-TV，用瓊脂糖凝膠電泳分離消化的片段，并純化含有cmc3基因結(jié)構(gòu)的大條帶。
按實(shí)施例21所述收集培養(yǎng)物的濾液，并按上述方法分析高pH葡聚糖內(nèi)切酶的活性。結(jié)果如表12所示。
表1214升發(fā)酵物中T.reesei株M2C38、984A和998A的高pH葡聚糖內(nèi)切酶產(chǎn)量

未轉(zhuǎn)化株每mg蛋白的高pH葡聚糖內(nèi)切酶活性為0IU。含有cbh1啟動(dòng)子和分泌信號(hào)的轉(zhuǎn)化子984A的高pH葡聚糖內(nèi)切酶活性為0.097IU/mg，而含有cbh1啟動(dòng)子和xln2分泌信號(hào)的轉(zhuǎn)化子998A的高pH葡聚糖內(nèi)切酶活性為0.195IU/mg，該活性為含有cbh1分泌信號(hào)的轉(zhuǎn)化子的2倍以上。
T.versicolor漆酶I基因(lcc1)的cDNA克隆由Edgar Ong等人在噬菌粒載體pBK-CMV中獲得(“水解木質(zhì)素的擔(dān)子菌Trametesversicolor的兩種漆酶互補(bǔ)DNA的克隆和序列分析”O(jiān)ng，Pollock andSmith，Gene 196113-119，1997；以下稱為Ong等)。用Pwo聚合酶和引物擴(kuò)增去除了天然分泌信號(hào)的成熟漆酶編碼區(qū)，該引物設(shè)計(jì)成可在發(fā)表的lcc1序列(Ong等)的堿基對(duì)250的正上游和堿基對(duì)1750的終止密碼子正下游分別引入唯一XbaI位點(diǎn)和唯一XhoI位點(diǎn)。該擴(kuò)增序列以平端片段的形式插入pBR322的唯一EcoRI位點(diǎn)，制成質(zhì)粒pBRLcc1，并對(duì)該lcc1片段的序列進(jìn)行測(cè)定。為了獲得lcc1表達(dá)序列盒質(zhì)粒pCL1和pC/XL1，用KpnI消化cmc3表達(dá)序列盒質(zhì)粒pChHE2和pC/XhHE2，并用T4 DNA聚合酶使其切口變成平末端，隨后連接XhoI接頭(Cat.No.1073，New England Biolabs)，即可在兩個(gè)質(zhì)粒的cbh2轉(zhuǎn)錄終止子的5′端插入唯一的XhoI位點(diǎn)，從而制成修飾的cmc3表達(dá)序列盒質(zhì)粒pChHE2-Xho和pC/XhHE2-Xho。用XbaI/XhoI消化pBRLcc1，即可分離出1.5kb片段的lcc1基因，該片段用來替換表達(dá)序列盒質(zhì)粒pChHE2-Xho和pC/XhHE2-Xho中的cmc3基因，pChHE2-Xho質(zhì)粒和pC/XhHE2-Xho質(zhì)粒已預(yù)先用NheI/XhoI消化(NheI和XbaI有相匹配的凸出末端)。所得lcc1表達(dá)序列盒質(zhì)粒含有與cbh1(在pCL1中)或xln2(pC/XL1)分泌信號(hào)連接并受cbh1啟動(dòng)子調(diào)控的lcc1基因。為了獲得最終的轉(zhuǎn)化載體pCL1-TV(圖9a)和pC/XL1-TV(圖9b)，用EcoRI消化pCL1和pC/XL1，分離出lcc1表達(dá)序列盒，并將其插入pyr4篩選序列盒質(zhì)粒pNCBg1(上述實(shí)施例23)的唯一EcoRI位點(diǎn)。選擇插入的方向，使包含lcc1表達(dá)序列盒和粗糙鏈孢霉pyr4篩選序列盒的完整基因重組物在用XbaI消化時(shí)能從pVC序列分離。在轉(zhuǎn)化T.reesei株BTR213aux28之前，用XbaI消化轉(zhuǎn)化載體pCL1-TV和pC/XL1-TV，用瓊脂糖凝膠電泳分離消化的片段，并純化包含lcc1基因結(jié)構(gòu)的大條帶。
以10g/l Solka floc和5g/l葡萄糖為碳源，按實(shí)施例21的步驟培養(yǎng)天然株BTR213及由其產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化株。酶樣品的漆酶活性測(cè)定通過ABTS在30℃的氧化來測(cè)定漆酶的活性。試驗(yàn)混合物中含有0.5mM ABTS、0.1M醋酸鈉(pH5.0)以及適量的酶。通過測(cè)定其在420nm(ε420＝3.6×104M-1Cm-1)吸光度的增加來檢測(cè)ABTS的氧化。1單位的漆酶活性定義為每分鐘氧化1微摩爾ABTS所需的酶量。
按實(shí)施例21所述收集培養(yǎng)物濾液，并按上述方法分析漆酶的活性。結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)化的宿主(BTR213)相比或與用包含cbh1調(diào)控區(qū)和分泌信號(hào)的載體轉(zhuǎn)化的T.reesei相比，含有木聚糖酶分泌信號(hào)(pC/XL1-TV)的轉(zhuǎn)化子，其漆酶的產(chǎn)量有提高。實(shí)施例34-38描述了修飾的嗜熱木霉木聚糖酶用T.reesei cbh1啟動(dòng)子和xln2分泌信號(hào)在Humicola insolens中的表達(dá)。
組分 g/L(NH4)2SO46.35KH2PO44.00MgSO4·7H2O 2.02CaCl2·2H2O 0.53CSL6.25CaCO310.00碳源**5-200微量元素*1ml/L*微量元素溶液中含有5g/l FeSO4·7H2O；1.6g/l MnSO4·H2O；1.4g/l ZnSO4·7H2O。**葡萄糖、Solka floc碳源可配制成pH2-7的水溶液，分裝后滅菌，然后在培養(yǎng)開始前加入到主培養(yǎng)基中，或在發(fā)酵過程中加入。
每個(gè)1升搖瓶中加入的液體體積為150ml，起始pH為5.5，每個(gè)搖瓶在接種前在121℃高壓滅菌30分鐘。
按前面所述(實(shí)施例9)，從YPSS瓊脂平板分別分離出天然的和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的孢子，每個(gè)搖瓶接種1-2×106個(gè)孢子。然后將搖瓶置于37℃，以200rpm的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)3天。通過GF/A玻璃微纖維過濾器(Whatman)過濾，收集含分泌蛋白的濾液。用Bio-Rad protein Assay(Cat.No.500-0001)測(cè)定蛋白的濃度。
表14150ml搖瓶培養(yǎng)物中H.insolens 22082和22082-5A株的修飾嗜熱T.reesei木聚糖酶產(chǎn)量

未轉(zhuǎn)化株每mg蛋白在50℃時(shí)的木聚糖酶活性為15.9IU，以及每mg蛋白在65℃時(shí)的木聚糖酶活性為10.55IU。轉(zhuǎn)化子22082-5A在50℃時(shí)的木聚糖酶活性為29.8IU/mg，以及在65℃時(shí)的木聚糖酶活性為24.99IU/mg。由此結(jié)果可以看出，65℃時(shí)轉(zhuǎn)化株的木聚糖酶活性為未轉(zhuǎn)化株的2.4倍。
這些結(jié)果表明T.reesei cbh1啟動(dòng)子和xln2分泌信號(hào)對(duì)目的基因在外源宿主中的表達(dá)，以及目的蛋白在外源宿主中的分泌是有效的。
所有引用的文獻(xiàn)都在此作為參考引入。
盡管本發(fā)明描述了有關(guān)目前認(rèn)為是優(yōu)選的實(shí)施方案，但本發(fā)明不受限于所公開的實(shí)施方案。相反，本發(fā)明力求覆蓋包括在附屬的權(quán)利要求的精神和范圍之內(nèi)的各種修改和等同的方案。以下的權(quán)利要求的范圍給出了最寬范圍的說明，以致于可包含所有此類的修改和等同的配方以及用途。
權(quán)利要求
1.一種核苷酸序列，它包括調(diào)控區(qū)、與調(diào)控區(qū)相連并受調(diào)控區(qū)調(diào)控的木聚糖酶分泌序列和目的基因，其中，該調(diào)控區(qū)或目的基因中至少有一方與木聚糖酶蛋白的生產(chǎn)是非正常關(guān)聯(lián)。
2.權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，其中，調(diào)控區(qū)選自cbh1、cbh2、eg1、eg2、eg3、eg5、xln1以及xln2。
3.權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，其中，目的基因編碼的蛋白可用于醫(yī)藥、營養(yǎng)品、工業(yè)品、動(dòng)物飼料、食品添加劑以及酶。
4.權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，它進(jìn)一步包含終止子序列。
5.權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，它進(jìn)一步包含標(biāo)記基因。
6.權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，它進(jìn)一步包含間插序列。
7.一種載體，它包含權(quán)利要求1所述的分離核苷酸序列。
8.一種轉(zhuǎn)化絲狀真菌，它包含權(quán)利要求7所述的載體。
9.一種轉(zhuǎn)化絲狀真菌，它包含權(quán)利要求1所述的核苷酸序列。
10.權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)化絲狀真菌，其中，絲狀真菌選自木霉屬(Trichoderma)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、鐮刀霉屬(Fusarium)、曲霉屬(Aspergillus)、疣孢霉屬(Mycogone)、輪枝孢屬(Verticillium)、鏈霉屬(Streptomyces)、毛盤孢屬(Colletotrichum)、鏈孢霉屬(Neurospora)、葡萄孢屬(Botrytis)、灰側(cè)耳菌屬(Pleurotus)、青霉屬(Penicillum)、頭孢屬(Cephalosporium)、漆斑菌屬(Myrothecium)、絲葚霉屬(Papulospora)、綿霉屬(Achlya)、柄孢殼屬(Podospora)、內(nèi)座殼屬(Endothia)、毛霉屬(Mucor)、旋孢腔菌屬(Cochilobbolus)、Tolypocladium、梨孢霉屬(Pyricularia)、青霉屬(Penicillum)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、耙菌屬(Irpex)、葡萄穗霉屬(Stachybotrys)、帚霉屬(Scorpulariopsis)、毛殼霉屬(Chaetomium)、粘帚霉屬(Gilocladium)、頭孢霉屬(Cephalosporin)、支頂孢屬(Acremonium)。
11.權(quán)利要求10所述的轉(zhuǎn)化絲狀真菌，其中，絲狀真菌為木霉。
12.權(quán)利要求10所述的轉(zhuǎn)化的絲狀真菌，其中，絲狀真菌是腐質(zhì)霉。
13.一種在絲狀真菌中生產(chǎn)目的蛋白的方法，該方法包括以下步驟(i)用核酸序列轉(zhuǎn)化絲狀真菌，該核酸序列包括調(diào)控區(qū)、與調(diào)控區(qū)相連并受調(diào)控區(qū)調(diào)控的木聚糖酶分泌序列和目的基因，其中，該調(diào)控區(qū)或目的基因中至少有一方與木聚糖酶蛋白的生產(chǎn)是非正常關(guān)聯(lián)；(ii)培養(yǎng)該絲狀真菌；以及(iii)促使該真菌生產(chǎn)目的蛋白。
14.一種在絲狀真菌中生產(chǎn)目的蛋白的方法，該方法包括以下步驟(i)用權(quán)利要求6所述的核酸序列轉(zhuǎn)化絲狀真菌；(ii)培養(yǎng)該絲狀真菌；以及(iii)促使該真菌生產(chǎn)目的蛋白。
15.權(quán)利要求13所述的方法，其中，轉(zhuǎn)化步驟中的木聚糖酶分泌序列相對(duì)于該絲狀真菌而言是異源的。
16.權(quán)利要求13所述的方法，其中，轉(zhuǎn)化步驟中的木聚糖酶分泌序列相對(duì)于該絲狀真菌而言是同源的。
17.權(quán)利要求14所述的方法，其中，轉(zhuǎn)化步驟中的木聚糖酶分泌序列相對(duì)于該絲狀真菌而言是異源的。
18.權(quán)利要求14所述的方法，其中，轉(zhuǎn)化步驟中的木聚糖酶分泌序列相對(duì)于該絲狀真菌而言是同源的。
19.權(quán)利要求13所述的方法，其中，促使該真菌生產(chǎn)的步驟進(jìn)一步包括目的蛋白的純化過程。
20.權(quán)利要求14所述的方法，其中，促使該真菌生產(chǎn)的步驟進(jìn)一步包括目的蛋白的純化過程。
21.權(quán)利要求14所述的方法，其中，促使該真菌生產(chǎn)目的蛋白的步驟進(jìn)一步包括由目的蛋白中除去間插序列編碼的氨基酸序列的過程。
22.一種蛋白，它由權(quán)利要求14所述的方法生產(chǎn)。
23.一種蛋白，它由權(quán)利要求20所述的方法生產(chǎn)。
24.權(quán)利要求3所述的核苷酸序列，其中，蛋白選自β-葡萄糖苷酶、纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素降解酶、果膠酶、蛋白酶以及過氧化物酶。
25.一種載體，它包含權(quán)利要求24所述的分離核苷酸序列。
26.一種轉(zhuǎn)化絲狀真菌，它包含權(quán)利要求25所述的載體。
27.一種轉(zhuǎn)化絲狀真菌，它包含權(quán)利要求24所述的核苷酸序列。
28.一種在絲狀真菌中生產(chǎn)目的蛋白的方法，其中，目的蛋白選自β-葡萄糖苷酶、纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素降解酶、果膠酶、蛋白酶和過氧化物酶，目的蛋白的生產(chǎn)方法則包括以下步驟(i)用權(quán)利要求25所述的載體轉(zhuǎn)化絲狀真菌；(ii)培養(yǎng)該絲狀真菌；以及(iii)促使該真菌生產(chǎn)目的蛋白。
29.一種在絲狀真菌中生產(chǎn)目的蛋白的方法，其中，目的蛋白選自β-葡萄糖苷酶、纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素降解酶、果膠酶、蛋白酶和過氧化物酶，目的蛋白的生產(chǎn)方法則包括以下步驟(i)用權(quán)利要求24所述的核酸序列轉(zhuǎn)化絲狀真菌；(ii)培養(yǎng)該絲狀真菌；以及(iii)促使該真菌生產(chǎn)目的蛋白。
30.一種生產(chǎn)目的蛋白的表達(dá)體系，該體系包括含有某種核苷酸序列的絲狀真菌，該核酸序列包含調(diào)控區(qū)、與調(diào)控區(qū)相連并受調(diào)控區(qū)調(diào)控的木聚糖酶分泌序列和編碼目的蛋白的目的基因，其中，該調(diào)控區(qū)或目的基因中至少有一方與木聚糖酶蛋白的生產(chǎn)是非正常關(guān)聯(lián)。
全文摘要
本發(fā)明涉及提高真菌宿主的目的蛋白的產(chǎn)量。本發(fā)明公開了包含調(diào)控區(qū)、與調(diào)控區(qū)相連并受調(diào)控區(qū)調(diào)控的木聚糖酶分泌序列和目的基因的核苷酸序列。該目的基因編碼的蛋白可用于醫(yī)藥、營養(yǎng)品、工業(yè)品、動(dòng)物飼料、食品添加劑以及酶。優(yōu)選該目的基因編碼纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素降解酶、果膠酶、蛋白酶或過氧化物酶。本發(fā)明還涉及含有這些核酸序列的載體和宿主,也涉及生產(chǎn)目的蛋白的方法。
文檔編號(hào)C12N15/80GK1390260SQ00815509
公開日2003年1月8日 申請(qǐng)日期2000年9月1日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月9日
發(fā)明者T·C·懷特, S·麥胡格, C·D·辛德勒 申請(qǐng)人:伊奧根生物產(chǎn)品公司