重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白在制備治療雄激素性脫發(fā)藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(rLZ-8)在雄激素性脫發(fā)中的應(yīng)用。通過體內(nèi)動物模型實驗表明，重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白能夠改善雄激素性脫發(fā)動物模型的脫毛現(xiàn)象，可用于預(yù)防和治療雄激素性脫發(fā)。本發(fā)明所述重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白是通過重組技術(shù)及酵母細(xì)胞真核表達(dá)系統(tǒng)制備的高純度蛋白質(zhì)類物質(zhì)。
【專利說明】重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白在制備治療雄激素性脫發(fā)藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及使用巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)的重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白在治療雄激素性脫發(fā)中的一種新用途，尤其涉及重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白在預(yù)防、緩解和/或治療雄激素性脫發(fā)方面的用途，屬于生物醫(yī)藥工程領(lǐng)域(生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域)。
【背景技術(shù)】
[0002]雄激素性脫發(fā)(Androgenetic Alopecia, AGA),又名脂溢性脫發(fā)(SeborrheicAlopecia, SA),男性型脫發(fā)(Male Pattern Alopecia, MPA),是皮膚科臨床的常見病、多發(fā)病，也是難治疾病之一，該病病程漫長且頑固難愈。臨床癥狀常表現(xiàn)為頭發(fā)油膩、多屑、有明顯瘙癢感、額顳區(qū)及頂部的漸進(jìn)性脫發(fā)，繼而形成“高額”，病情嚴(yán)重時頂部大部分頭發(fā)脫落或全部脫落，僅枕部及兩顳毛發(fā)基本正常。男性型脫發(fā)是世界性皮膚科問題，從發(fā)病率來看，白種人 > 黃種人 > 黑種人，在美國目前有500萬患者，在臺灣大約有120萬左右的男性型脫發(fā)患者而在韓國，50歲以上的男性一半左右會受到男性型脫發(fā)疾病的困擾。據(jù)推斷，中國的男性型脫發(fā)的發(fā)病率也不會低于同處東亞的韓國和臺灣地區(qū)，而且有一個重要而且不容忽視的趨勢——發(fā)病呈年輕化。這意味著脫發(fā)將成為更多年輕人的心頭之痛。
[0003]目前認(rèn)為遺傳因素和雄激素共同作用是主要發(fā)病原因之一，近年來，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，AGA的發(fā)病機(jī)理，特別是AGA與雄激素的關(guān)系更趨明了，因此，性激素失衡是導(dǎo)致AGA發(fā)生的主要因素，該病的發(fā)病特點為:好發(fā)于20-30歲的男性，女性少有，且腦力勞動者多于體力勞動者，脫發(fā)時輕時重，不能自行逆轉(zhuǎn)?；诂F(xiàn)在生活節(jié)奏的加快與工作壓力的加大，其發(fā)病率逐漸上升，發(fā)病年齡也趨于低齡化，由于該病有礙容貌，影響美觀，常給患者帶來很大的心理負(fù)擔(dān)和精神壓力，因此對該病的深入研究，特別是臨床的藥物治療應(yīng)受到廣泛的重視。
[0004]隨著研究手段的不斷發(fā)展，對于雄激素性脫發(fā)的研究水平也在逐漸提高?，F(xiàn)有的關(guān)于AGA的各種治療方法都有其局限性，再加之AGA本身是一個頑固且復(fù)發(fā)性較高的疾病，因此到目前為止還沒有找到能從根本上治療AGA的藥物。近年來，關(guān)于免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子分泌和激素調(diào)控方面的研究已成為AGA治療的研究焦點，一些激素調(diào)節(jié)類藥物和免疫調(diào)節(jié)劑已在動物模型和臨床中取得了令人矚目的成果，這為AGA的治療進(jìn)展奠定了堅實的基礎(chǔ)。
[0005]LZ-8 屬于真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白(fungal immunoregulatory protein, FIP)家族，是1989年由日本人Kino K等首次從赤靈芝菌絲體提取物中分離出的一種免疫調(diào)節(jié)蛋白。等電點為4.4，分子量為12.4 kD，由110個氨基酸殘基組成，基因編碼區(qū)有330-350個堿基對。本發(fā)明中所使用的重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(recombinant Ganoderma Iucidumimmunoregulatory protein, rLZ-8),是應(yīng)用基因工程方法得到的具有高純度和穩(wěn)定生物活性的rLZ-8樣品。靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白的主要功能在于它可以促進(jìn)末梢淋巴細(xì)胞和脾臟細(xì)胞的生物活性，誘導(dǎo)動物和人體的巨噬細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子進(jìn)而防御及消除病原體的侵害，維護(hù)機(jī)體的健康。
[0006]性激素代謝紊亂之后，會直接導(dǎo)致AGA的發(fā)生，不僅脫發(fā)加重，而且機(jī)體內(nèi)血脂異常升高，且與脫發(fā)相關(guān)的各種細(xì)胞因子分泌異常。很多研究證明，使用免疫調(diào)節(jié)類藥物可能對雄激素性脫發(fā)具有改善作用。本發(fā)明的積極效果在于首次公開了重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(rLZ-8)對雄激素性脫發(fā)的作用，其不僅能在小鼠模型體內(nèi)具有改善脫發(fā)作用，并且無明顯毒副作用，對應(yīng)用重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白研制雄激素性脫發(fā)的藥物有一定的積極作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明目的之一是提供重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白的一種新用途，即在預(yù)防、緩解和/或治療雄激素性脫發(fā)中的用途。
[0008]本發(fā)明所述的重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白是使用巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)的重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白，不論是從何種途徑提取或得到的靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白，其主要成分相同，基本結(jié)構(gòu)相同，都具有相同的藥理功效，即，都可以用于預(yù)防、緩解和/或治療雄激素性脫發(fā)。
[0009]本發(fā)明人通過大量雄激素性脫發(fā)動物模型實驗，發(fā)現(xiàn)rLZ-8對AGA動物模型的脫毛現(xiàn)象具有改善作用，故用ELIAGA法檢測小鼠血清中睪酮(T)和雌二醇(E2)含量，結(jié)果顯示模型組小鼠血清T含量顯著升高{Ρ<0.01),含量顯著下降{Ρ<0.01)，Τ/Ε2比值嚴(yán)重失調(diào)，而rLZ-8可改善由T引起的小鼠性激素分泌紊亂現(xiàn)象，該結(jié)果提示rLZ-8可通過調(diào)節(jié)性激素代謝來起到對AGA的治療作用。
[0010]本發(fā)明目的之二是提供一種能夠預(yù)防和治療雄激素性脫發(fā)的藥物組合物，該藥物組合物包含治療上有效量的rLZ-8和至少一種藥學(xué)上可接受的輔料或載體，所述輔料或載體可以是:淀粉、氯化鈉、微晶纖維素、山梨酸和/或甘露醇等。該組合物的給藥方式可以是但不限于經(jīng)腹腔注射、靜脈注射、口服、肌肉、皮下、皮膚表面、局部注射等方式給藥，其劑型可以但不限于是注射液、凍干粉針劑、注射微球、脂質(zhì)體、片劑、膠囊劑、丸劑、水劑、散劑、糊劑、噴霧劑、顆粒劑、口服液、軟膠囊、滴丸劑、貼片、膏劑等，其中優(yōu)選注射液、凍干粉針劑、片劑和膠囊劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)以及制劑領(lǐng)域的公知常識可以方便地制備出所需劑型。
[0011]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
1.安全性高，可長期使用。在目前階段，雄激素性脫發(fā)通常是不可逆的皮膚科臨床常見病和多發(fā)病，病因復(fù)雜。為了使患者病情不繼續(xù)惡化，病人用藥周期較長。靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白作為來源于靈芝的一種蛋白質(zhì)，其高安全性可以保證病人長期用藥的需要。
[0012]2.治療效果好。rLZ-8可以有效調(diào)節(jié)機(jī)體性激素分泌平衡，改善由激素分泌紊亂引起的雄激素性脫發(fā)癥狀。
[0013]說明書【專利附圖】

【附圖說明】
圖1各組雌性小鼠毛發(fā)收集測定結(jié)果。
[0014]注:*與正常對照組相比ρ<0.05、**與正常對照組相比p<0.01 ^與AGA模型組相比 ρ〈0.05。
[0015]圖2各組雄 性小鼠毛發(fā)收集測定結(jié)果。
[0016]注:各組雄性小鼠毛發(fā)收集測定結(jié)果。*與正常對照組相比/7很05、**與正常對照組相比ρ〈0.01 ^與AGA模型組相比ρ〈0.05，與AGA模型組相比ρ〈0.01。
【具體實施方式】
[0017]下述結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。(以下將結(jié)合附圖就藥理作用的實驗結(jié)果分述如下:)
實施例1 rLZ-8能改善丙酸睪酮所致的小鼠脫毛現(xiàn)象。
[0018]I實驗材料
rLZ-8 (由吉林大學(xué)鉆智基因工程藥物研究所提供)，丙酸睪酮注射液(上海通用藥業(yè)股份有限公司)。
[0019]2儀器設(shè)備
篦子，鑷子，自封袋，佳能照相機(jī)。
[0020]3實驗動物 健康靈活的ICR小鼠，雌雄各半，體重20±2g，SPF級。購自吉林大學(xué)基礎(chǔ)動物中心，動物許可證編號:SCXK京2009-0004。在吉林大學(xué)SPF級條件下飼養(yǎng)。實驗期間控制室溫在200C ±2°C，12小時交替照明，小鼠自由飲水、取食。
[0021]動物于給藥前進(jìn)行毛發(fā)檢查，選取合格的小鼠60只隨機(jī)分為6組，每組10只，雌雄各半。
[0022]4實驗方法
4.1實驗分組及給藥
小鼠60只隨機(jī)分為6組，每組10只，雌雄各半。正常對照組:每天腹腔注射生理鹽水2次，連續(xù)63天，其中第4-63天，每天還需皮下注射等體積的生理鹽水I次。溶媒對照組:每天腹腔注射生理鹽水2次，連續(xù)63天，其中第4-63天，每天還需皮下注射等體積的玉米油I次。AGA模型組:每天腹腔注射生理鹽水2次，連續(xù)63天，其中第4-63天，每天還需皮下注射丙酸睪酮注射液(1.0mg/kg)，每天給藥I次；rLZ-8低、中、高劑量組:分別腹腔注射60.0 μ g/kg、100.0 μ g/kg、160.0 μ g/kg 體重的 rLZ-8,每天 2 次，連續(xù) 63 天，其中第 4-63天，每天還需皮下注射丙酸睪酮注射液(1.0mg/kg)，每天給藥I次。
[0023]4.2毛發(fā)收集
從造模第五周開始至實驗結(jié)束，每天收集脫落毛發(fā)。將每只小鼠在相相同條件下，用相同的篦子梳理小鼠背部毛發(fā)。具體操作方法:將受試小鼠置于黑色粗糙表面上，左手拉緊小鼠尾部，右手持工具與小鼠背部表面呈45°角方向，力度均勻一致梳理染色區(qū)毛發(fā)。正常梳理與逆行梳理毛發(fā)每天各30下。用眼科鑷收集脫落毛發(fā)并用自封袋將其制成標(biāo)本。每只小鼠測試后用醫(yī)用酒精擦拭動物背部，用干布擦凈后進(jìn)行下一只。
[0024]5實驗結(jié)果
5.1各組雌性小鼠毛發(fā)收集測定結(jié)果
在雌性小鼠中，與正常對照組相比，其它各實驗組小鼠均發(fā)生不同程度的脫毛現(xiàn)象，除AGA模型組存在極顯著性差異(/7〈0.01)外，其余各組都存在顯著性差異(/7〈0.05);與AGA模型組相比，溶媒對照組、rLZ-8各劑量組脫毛明顯減少，除rLZ-8高劑量組之外，都存在顯著性差異(/7〈0.05) ；rLZ-8各劑量組之間無顯著性差異。結(jié)果見圖1。
[0025]5.2各組雄性小鼠毛發(fā)收集測定結(jié)果在雄性小鼠中，與正常對照組相比，其它各實驗組小鼠均發(fā)生不同程度的脫毛現(xiàn)象，其中AGA模型組存在極顯著性差異(/7〈0.01)，溶媒對照組和rLZ-8低、高劑量組都存在顯著性差異(/K0.05)，與AGA模型組相比，溶媒對照組和rLZ-8低、高都存在顯著性差異(/7<0.05)，rLZ-8各劑量組之間無顯著性差異。結(jié)果見圖2。
[0026]實施例2 rLZ-8能改善小鼠體內(nèi)性激素分泌平衡及對主要臟器指數(shù)的影響 I實驗材料
rLZ-8 (由吉林大學(xué)鉆智基因工程藥物研究所提供)，丙酸睪酮注射液(上海通用藥業(yè)股份有限公司)。
[0027]2儀器設(shè)備
低溫離心機(jī)(eppendorf centrifuge 5810R)、數(shù)顯恒溫循環(huán)水箱(國華HH-42型)、752型紫外光柵分光光度計(山東高密分析儀器廠)。
[0028]3實驗動物
健康靈活的ICR小鼠，雌雄各半，體重20±2g，SPF級。購自吉林大學(xué)基礎(chǔ)動物中心，動物許可證編號:SCXK京2009-0004。在吉林大學(xué)SPF級條件下飼養(yǎng)。實驗期間控制室溫在200C ±2°C，12小時交替照明，小鼠自由飲水、取食。
[0029]動物于給藥前進(jìn)行毛發(fā)檢查，選取合格的小鼠60只隨機(jī)分為6組，每組10只，雌雄各半。
[0030]4實驗方法
4.1實驗分組及給藥
小鼠60只隨機(jī)分為6組，每組10只，雌雄各半。正常對照組:每天腹腔注射生理鹽水2次，連續(xù)63天，其中第4-63天，每天還需皮下注射等體積的生理鹽水I次。溶媒對照組:每天腹腔注射生理鹽水2次，連續(xù)63天，其中第4-63天，每天還需皮下注射等體積的玉米油I次。AGA模型組:每天腹腔注射生理鹽水2次，連續(xù)63天，其中第4-63天，每天還需皮下注射丙酸睪酮注射液(1.0mg/kg)，每天給藥I次；rLZ-8低、中、高劑量組:分別腹腔注射60.0 μ g/kg、100.0 μ g/kg、160.0 μ g/kg 體重的 rLZ-8,每天 2 次，連續(xù) 63 天，其中第 4-63天，每天還需皮下注射丙酸睪酮注射液(1.0mg/kg)，每天給藥I次。
[0031]4.2小鼠血清中睪酮(T)含量
4.2.1取血清:實驗第64天，將各組小鼠經(jīng)摘眼球取血后，3000rpm4°C離心10分鐘，分別取上清液后進(jìn)行分裝，置于-80°C冰箱待測；
4.2.2檢測方法:
(I)取步驟4.2.1中制備的血清樣本測定T含量。
[0032](2)將試劑盒在室溫下平衡20min，取出所需板條，剩余板條封好后置4°C保存。
[0033](3)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔和空白孔。標(biāo)準(zhǔn)品孔加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品；樣本孔先加入40 μ I樣本稀釋液，再加入10 μ I樣本；空白孔只加樣本稀釋液。每個樣本均做雙復(fù)孔。
[0034](4)用封板膜將反應(yīng)孔封住,37°C恒溫孵育箱中反應(yīng)30min。
[0035](5)棄去孔內(nèi)液體，用洗板液洗孔5次。
[0036](6)向各孔內(nèi)加入酶標(biāo)試劑50μ I (空白孔除外)，37°C孵育30min。
[0037](7)棄去孔內(nèi)液體，用洗板液洗孔5次。[0038](8)向各孔加入顯色劑Α50μ 1，再加入顯色劑Β50μ 1，輕輕混勻后37°C下避光顯色 15min。
[0039](9)每孔加入中止液50 μ 1，空白孔調(diào)零，使用酶標(biāo)儀在15min內(nèi)測定450nm處各孔的吸光度值。
[0040](10)以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，根據(jù)樣本的吸光度計算出樣本濃度。
[0041]4.2.3小鼠血清睪酮雌二醇(E2)含量檢測
取步驟4.2.1中制備的血清樣本，按ELISA試劑盒說明書上的方法檢測E2含量，具體操作同4.2.2。
[0042]4.3小鼠各臟器指數(shù)測定
取小鼠心、肝、脾、肺、腎及胸腺，稱重，按公式計算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)(mg/10g)=臟器重量/體重X 100。
[0043]5實驗結(jié)果
5.1小鼠血清中睪酮(T)含量與雌二醇(E2)含量測定結(jié)果
在睪酮(T)含量方面:與正常對照組相比，其余各組血清睪酮(T)含量均呈現(xiàn)不同程度的升高，且有顯著性差異05)，其中模型組與正常對照組相比，有極顯著性差異iP<0.0O ;與模型組相比，各組T含量均有不同程度降低，且都有顯著性差異(八％ 05)；rLZ-8高劑量組與rLZ-8中劑量組相比，有顯著性差異05\
[0044]在血清雌二醇(E2)含量方面:與正常對照組相比，各組血清雌二醇(E2)含量均呈現(xiàn)不同程度的降低，且均有顯著性差異05);與模型組相比，各組E2含量均高于模型組，僅有rLZ-8中劑量有顯著性差異(/Ytt 05) ;rLZ-8各劑量組之間無顯著性差異，且無劑量依賴性。
[0045]在血清T/E2比值方面:與正常對照組相比，其余各組血清T/E2比值均呈現(xiàn)不同程度的升高，且都有顯著性差異(/Y0.05)，其中以模型組升高最為顯著且存在極顯著性差異(/Y0.01);與模型組相比，各組血清T/E2比值均有不同程度降低，且都有顯著性差異(/Y0.05) ；rLZ-8高劑量組與rLZ_8中劑量組相比，有顯著性差異(/Y0.05)。詳見表1。
[0046]表1小鼠血清T及E2含量測定結(jié)果(n=10)
【權(quán)利要求】
1.重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白在制備治療雄激素性脫發(fā)藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物是由重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白rLZ-8和任選的藥學(xué)可接受的輔劑組成，其特征在于:將其制備成注射液、凍干粉針劑、片劑、膠囊劑、丸劑、水劑、口服液、散劑、糊劑、顆粒劑、貼片或膏劑。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物可以通過口服和非腸道給藥，口服藥包括口服液 、片劑、丸劑和膠囊；非腸道包括外用藥和注射劑。
【文檔編號】A61P17/08GK104001154SQ201410254129
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月10日
【發(fā)明者】孫非, 梁重陽, 張喜田 申請人:張喜田, 孫非