針對(duì)jc病毒的vp1蛋白的人單克隆抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及抗JC病毒的VP1蛋白的人中和單克隆抗體，該病毒是進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦病(PML)的原因，也涉及該單克隆抗體在JCV感染或與JCV感染相關(guān)聯(lián)的疾病的治療性或預(yù)防性處置中的應(yīng)用，疾病如進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦病(PML)，并且涉及該單克隆抗體在JCV感染或與JCV感染相關(guān)聯(lián)的疾病的診斷中的應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】針對(duì)JC病毒的VP1蛋白的人單克隆抗體

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明在免疫學(xué)領(lǐng)域范圍內(nèi)，特別是抗（針對(duì)，directagainst)病毒病原體的抗 原的中和抗體領(lǐng)域。
[0002] 更具體地，本發(fā)明涉及抗JC病毒（JCV)的VP1蛋白的單克隆抗體。

【背景技術(shù)】
[0003] JC病毒（JCV)是多瘤病毒科（Polyomaviridae)家族的人多瘤病毒，并且該病毒 是引起極其嚴(yán)重的、通常致死的脫髓鞘疾病的原因，該疾病被指定為進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦 ?。╬rogressive multifocal leukoencephalopathy，PML)。JC 病毒具有無(wú)包膜的二十面 體衣殼，該衣殼包封環(huán)狀雙鏈DNA基因組。衣殼主要成分是病毒蛋白VP1。在病毒粒子上 完成的結(jié)構(gòu)研宄顯示多瘤病毒衣殼由72個(gè)由VP1單體經(jīng)C末端相連所形成的五聚體組成。 VP1結(jié)合至靶細(xì)胞上的受體從而開(kāi)始感染。
[0004] JC病毒感染超過(guò)85%的成年人。初次感染之后，JC病毒在腎和淋巴器官中保持 靜止。在健康的個(gè)體中，該病毒能夠在腎小管細(xì)胞中復(fù)制并在尿中被排瀉出，不引起任何疾 病。然而，在嚴(yán)重免疫低下的情況下、在接受過(guò)器官移植的受試者中、在腫瘤患者中、在用基 于新的單克隆抗體的免疫調(diào)節(jié)治療的患者中或在患有AIDS的人群中，JC病毒可以蔓延到 中樞神經(jīng)系統(tǒng)并引起進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦病（PML)。在前cART(抗逆轉(zhuǎn)錄病毒聯(lián)合療法） 時(shí)代，PML在HIV患者中的發(fā)病率范圍為0. 3%到8%，但是抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的廣泛使用 決定該病發(fā)病率的明顯下降。HIV感染是免疫缺陷的原因，仍然非常頻繁的與PML相關(guān)聯(lián)， 占病例的約80%，隨后是血液性腫瘤（約8% )、實(shí)體瘤（約3% )、器官移植以及用免疫調(diào) 節(jié)治療的自身免疫疾病。
[0005] 然而，在過(guò)去十年中，報(bào)道了越來(lái)越多的非HIV/AIDS相關(guān)聯(lián)的PML病例。這些新 病例中的許多都發(fā)生在經(jīng)歷過(guò)用最近可獲得的藥物的免疫療法的個(gè)體當(dāng)中。到2012年2 月29日，記錄了 212個(gè)與那他珠單抗治療有關(guān)的PML的病例，至于全世界，99571患有多發(fā) 性硬化的患者用了該藥品治療。PML也與其他免疫調(diào)節(jié)療法相關(guān)，包括依法利珠單抗、霉考 酷醋和利安昔單抗。
[0006] 對(duì)于PML的治療，嘗試了數(shù)個(gè)治療策略，這些治療策略是導(dǎo)向針對(duì)不同的病毒復(fù) 制周期階段，如，例如，進(jìn)入靶細(xì)胞以及基因組的復(fù)制。然而，它們中沒(méi)有一個(gè)給出了顯著的 有益效果?；赑ML與嚴(yán)重免疫低下病況之間的聯(lián)系，也嘗試了免疫學(xué)方法。例如，患有PML 并具有更有利預(yù)后的患者顯示出特征在于更強(qiáng)的JCV特異性細(xì)胞介導(dǎo)應(yīng)答和體液應(yīng)答。通 過(guò)用JCV VP1蛋白免疫的動(dòng)物（兔）血清的強(qiáng)的中和活性確認(rèn)特異性抗JCV應(yīng)答（特別 是針對(duì) VP1)的潛在重要性（Goldmann C et al. Journal of Virology，May 1999，pages 4465-4469)〇
[0007] 基于抗JCV抗體的替代療法因此可以應(yīng)用于患PML的患者的治療。特別地，考慮 到VP1蛋白在JCV感染的早期中的關(guān)鍵作用，最佳候選可以是針對(duì)JCV VP1蛋白的抗體。
[0008] 現(xiàn)在，由本發(fā)明人滿足了這樣的需求，本發(fā)明人首次成功獲得導(dǎo)向針對(duì)JCV VP1蛋 白的完整人單克隆抗體，并且成功具有針對(duì)所述病毒的中和活性，這使得它們適合于在PML 的治療性處置（處理，治療，treatment)中使用。
[0009] 根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)認(rèn)為這些結(jié)果是新的和令人驚奇的，因?yàn)槟壳斑€沒(méi)有描述過(guò)人 抗JCV VP1單克隆抗體，更不用說(shuō)（least of all)人抗JCV VP1中和單克隆抗體。
[0010] 在先（supra)的Goldmann C et al?描述了超免疫血清，該超免疫血清具有由病 毒樣顆粒誘發(fā)的（evoke)、具有針對(duì)JCV的中和特性的兔抗VP1抗體。
[0011] 日本專利申請(qǐng)JP9067397A提及用于獲得中和抗JCV抗體的方法，該方法包括：用 對(duì)應(yīng)于VP1蛋白的一部分的合成肽免疫大鼠、從大鼠中收集免疫血清以及分離一部分Y球 蛋白。在這個(gè)專利中，未提及單克隆抗體的選擇，更不用說(shuō)衍生自人的單克隆抗體。
[0012] 指定為ab34756、由艾碧康（AbcamK)英國(guó)銷售的抗JCV VP1單克隆抗體是用 于通過(guò)ELISA和免疫印跡法（Western Blot)檢測(cè)病毒的鼠科動(dòng)物抗體，很明顯不適合于治 療性應(yīng)用，更不用說(shuō)在人類中。
[0013]因此，現(xiàn)有技術(shù)的抗JCV抗體中沒(méi)有一種潛在地適合于在人類患者中在JCV感染 或與其相關(guān)的疾病的治療性或預(yù)防性應(yīng)用中使用。
[0014] 同樣應(yīng)當(dāng)指出的是，在本發(fā)明人完成測(cè)試前，本領(lǐng)域的技術(shù)人員不能預(yù)期獲得能 夠中和JC病毒的完整人抗JCV單克隆抗體，因?yàn)闆](méi)有可利用的科學(xué)出版物，其中在人體液 應(yīng)答中精確評(píng)估了中和抗JCV抗體的存在。舉例來(lái)說(shuō)，提及G. Bloomgren et al. N Engl J Med 2012 ;366:1870-80的論文，其中，作者提出在患有多發(fā)性硬化癥患者中對(duì)PML的風(fēng)險(xiǎn) 分層法。對(duì)于該風(fēng)險(xiǎn)分層法，作者提出三個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因素，即：抗JCV抗體的存在或不存在、免 疫抑制劑的在先使用以及用那他珠單抗治療的時(shí)長(zhǎng)，但是他們沒(méi)有以任何方式提出或提及 中和抗體在人體液應(yīng)答中的存在的評(píng)估。另一方面，現(xiàn)有技術(shù)指出與在人類中檢測(cè)體液抗 JCV應(yīng)答有關(guān)的技術(shù)問(wèn)題，例如，在 Raphael P.Viscidi and Barbara Clayman、Advances in experimental medicine and biology 2006 ;577 ():73-84 和在 Wendy A. Knowles、 Advances in experimental medicine and biology 2006 ;577 ():19-45 中。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 因此，本發(fā)明的第一目的是針對(duì)JC病毒的VP1蛋白的單克隆抗體，該單克隆抗體 的特征在于它是人抗體并且能夠中和JC病毒的事實(shí)。
[0016] 在本說(shuō)明書(shū)的范圍內(nèi)，術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"旨在表示任何能夠結(jié)合抗原的肽結(jié)構(gòu)， 在本案中，抗原是JCV VP1蛋白。因此該術(shù)語(yǔ)同時(shí)包括全長(zhǎng)免疫球蛋白和功能性免疫球蛋白 片段，其通常包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，但是可能也包含單可變區(qū)。具體的，但非限制 的，功能性免疫球蛋白片段的實(shí)例是？ &13、？&13'、？(&13'）2、？ ￥片段、單鏈抗體（8(^0以及單 域抗體。單鏈抗體例如是根據(jù)Ladner et al.的專利US 4, 946, 778中描述的方法而構(gòu)建。 單鏈抗體包含通過(guò)柔性結(jié)合部分（接頭（linker))所連接的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)。指 定為單域抗體的抗體片段甚至比單鏈抗體還小，因?yàn)樗瑔为?dú)的單VH域。用于獲得具有 與全長(zhǎng)抗體至少部分相同的結(jié)合能力的單域抗體的技術(shù)，現(xiàn)有技術(shù)中已有描述并且在本領(lǐng) 域普通技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)。Ward et al?在〃Binding Activities of a Repertoire of Single Immunoglobulin Variable Domains Secreted from Escherichia coli、Nature 341:544-6中描述了一種用于獲得對(duì)靶標(biāo)表位具有足夠強(qiáng)的親和力從而以分離的形式結(jié)合 于其上的抗體的重鏈可變區(qū)（VH單域抗體）的篩選方法。
[0017] 如在本文描述中使用的，術(shù)語(yǔ)"免疫球蛋白"，包括以單體和聚合體形式的IgG(包 括 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA、IgM、IgD 和 IgE。
[0018] 術(shù)語(yǔ)"中和JC病毒"或"能夠中和JC病毒"表示本發(fā)明的目的單克隆抗體可以在 復(fù)制周期的一個(gè)階段中阻斷JC病毒的復(fù)制周期，從而影響它的生物學(xué)活性以及與之相關(guān) 聯(lián)的至少一種疾病。
[0019] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗JCV單克隆抗體能夠結(jié)合到JCVVP1蛋白的構(gòu)象 表位，該構(gòu)象表位包含JCV VP1蛋白的一級(jí)序列（primary sequence)的至少一個(gè)氨基酸殘 基，該殘基選自由以下組成的組：I62、S65、A127、D130、N131、A133和A175或它們的任何組 合。在更具體的實(shí)施方式中，該構(gòu)象表位包含JCV VP1蛋白的一級(jí)序列的氨基酸殘基162、 S65、A127、D130、N131、A133 和 A175。
[0020] 氨基酸殘基的編號(hào)基于來(lái)自Madl株（SEQ ID NO:7)的VP1蛋白的氨基酸序列的 編號(hào)。SEQ ID NO:7 可獲自 UniProtKB/Swiss-Prot 數(shù)據(jù)文庫(kù)（Swiss ID:P03089 特征標(biāo)識(shí) 符：PR0_0000115021)。
[0021] 術(shù)語(yǔ)"構(gòu)象表位"旨在表示所有的氨基酸殘基，即使在蛋白的一級(jí)序列中不連續(xù)， 但其直接涉及與抗體的結(jié)合；或，即使突變免于改變蛋白的總體構(gòu)象，但仍然影響抗體本身 的結(jié)合親和力。
[0022] 進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的單克隆抗體包含至少重鏈可變區(qū)和輕鏈可變 區(qū)，其中重鏈可變區(qū)具有序列SEQ ID N0:1(或由序列SEQ ID N0:3編碼）并且輕鏈可變 區(qū)有序列SEQ ID NO: 2 (或由序列SEQ ID NO: 4編碼）。這樣的特定的單克隆抗體也稱為 GREl〇
[0023] 本發(fā)明的另一個(gè)方面是，如先前所定義的抗JC病毒的VP1蛋白的人單克隆抗體， 用于在JCV感染或與JCV感染相關(guān)聯(lián)的疾病、優(yōu)選進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦?。≒ML)的治療性 或預(yù)防性處置中使用。
[0024] 確定（identify)有效劑量并將本發(fā)明的單克隆抗體配制為適合于在本發(fā)明的范 圍內(nèi)的使用的藥物組合物在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的技能范圍之內(nèi)，無(wú)需過(guò)度的創(chuàng)造性努 力。
[0025] 因?yàn)槠涮卣髟谟诟呙舾行院透咛禺愋?，本發(fā)明的單克隆抗體也適合于在診斷學(xué)領(lǐng) 域中使用。該單克隆抗體表現(xiàn)出對(duì)來(lái)自Madl株的重組VP1的高親和力（約InM)，并且以與 商業(yè)鼠科動(dòng)物抗體（AbeamK)相同濃度時(shí)，通過(guò)ELISA顯示出高度提高的信號(hào)。甚至當(dāng) 通過(guò)在JCV感染的（Mad4株）C0S-7細(xì)胞上的進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)評(píng)估時(shí)，該抗體顯示出比商 業(yè)Abcamt抗體更高的敏感性和特異性。此外，重點(diǎn)指出的是，通過(guò)ELISA，本發(fā)明的單克 隆抗體顯示出對(duì)重組BKV VP1 (如JCV -樣屬于多瘤病毒科家族的病毒JCV和BKV VP1顯 示出約75%的核苷酸序列同源性）無(wú)反應(yīng)性，從而表明它對(duì)JCV VP1高度唯一地特異性。
[0026] 因此，JCV感染的體外診斷方法以及用于診斷的相關(guān)試劑盒在本發(fā)明的范圍之內(nèi)， 其中本發(fā)明的單克隆抗體用作JCV特異的診斷測(cè)試劑。
[0027] 體外免疫診斷方法包括在本發(fā)明的單克隆抗體與JCV VP1抗原（如果在樣品中存 在）結(jié)合的適宜條件下用本發(fā)明的單克隆抗體接觸來(lái)自疑似感染有JCV的患者的生物學(xué)樣 品的步驟，以及定性或定量檢測(cè)本發(fā)明的單克隆抗體與JCV VP1抗原的結(jié)合的步驟。
[0028] 例如，作為ELISA免疫酶試驗(yàn)或作為免疫熒光試驗(yàn)進(jìn)行本發(fā)明的免疫診斷方法。 進(jìn)行試驗(yàn)的樣品例如是血液、血衆(zhòng)、血清、尿液、腦脊液（cephalo-rachidic liquid)、活體 組織切片或認(rèn)為合適的任何其他生物學(xué)樣品。
[0029] 用于進(jìn)行該方法的免疫診斷試劑盒包括：本發(fā)明的單克隆抗體作為特異性試劑、 和進(jìn)行該試驗(yàn)的說(shuō)明以及最終將取決于試驗(yàn)類型而變化的其他成分，并且這些成分本身是 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。能夠可選地包含在該試劑盒中的另外的成分的實(shí)例是用于定性的 和/或定量的檢測(cè)抗體與抗原之間的成功結(jié)合的方式、一種或多種固體支撐物（例如微量 滴定板）、空白溶液、一種或多種包含已知量的感興趣抗原的標(biāo)準(zhǔn)溶液、對(duì)照溶液，待測(cè)樣品 的稀釋溶液、結(jié)合有可檢測(cè)標(biāo)志物（例如熒光分子）的檢測(cè)抗體或結(jié)合有能夠與底物反應(yīng) 形成可檢測(cè)的產(chǎn)物的酶的檢測(cè)抗體、緩沖洗滌液、包含該酶底物的溶液、停止溶液等。
[0030] 本發(fā)明的方法和試劑盒可以有效地用于在具有不同傾向（predisposing)情況的 患者中發(fā)展PML的風(fēng)險(xiǎn)分層（stratifying)。

【具體實(shí)施方式】
[0031] 隨后的實(shí)施例例證說(shuō)明在本發(fā)明范圍內(nèi)的人中和單克隆抗體的識(shí)別和表征，以及 由所述抗體識(shí)別的表位的表征。提供這些實(shí)施例僅以例證的方式說(shuō)明隨附權(quán)利要求中限定 的本發(fā)明的范圍，而沒(méi)有限制目的。
[0032] 實(shí)施例1
[0033] 通過(guò)與先前描述的那些相似的方法（Plaisant, P.，et al.，Human monoclonal recombinant Fabs specific for HCV antigens obtained by repertoire cloning in phage display combinatorial vectors. Res Virol，1997. 148(2) :p. 165-9)在pPD粒載 體中構(gòu)建IgGl/k同種型的并且具有2xl07個(gè)要素的預(yù)估規(guī)模的人抗體片段（單價(jià)Fab)的 組合噬菌體展示文庫(kù)。文庫(kù)產(chǎn)生自一名68歲的男性老人的骨髓，該老人的血清通過(guò)ELISA 檢測(cè)出對(duì)于抗VP1/JCV抗體的存在呈陽(yáng)性。通過(guò)在磷酸緩沖鹽水（PBS)中用100ng/孔的重 組JCV VP1蛋白（Madl，Abeam? )涂覆96孔板進(jìn)行ELISA。數(shù)個(gè)血清稀釋液一式兩份的 添加至VP1涂覆的板。將該板在37°C孵育1小時(shí)然后用0. 1%的PBS/TWEEN 20洗滌。用 結(jié)合（conjugate)有過(guò)氧化物酶（HRP)的抗人IgGl抗體（Sigma-Aldrichk)來(lái)檢測(cè)結(jié)合 的抗體。
[0034] 如先前所描述的進(jìn)行（Williamson、R. A.、et al.、Human monoclonal antibodies against a plethora of viral pathogens from single combinatorial libraries. Proc Natl Acad Sci U S A，1993.90(9):p. 4141-5)用于選擇抗VP1抗體的噬菌體表達(dá)組合的 抗體文庫(kù)的生物淘選。簡(jiǎn)單地，在生物淘選周期的每一個(gè)中使用每毫升1〇 12個(gè)噬菌體的濃 度的菌體配制品（制劑，preparation)用于在涂覆有來(lái)自Madl株的VP1的高結(jié)合ELISA 板（C〇starx )上選擇抗體。進(jìn)行總共5個(gè)生物淘選周期并將從最后三個(gè)周期獲得的噬菌 體轉(zhuǎn)入表達(dá)可溶Fab的噬粒系統(tǒng)。
[0035] 將來(lái)自XL-1-blue株（Agilent Techn〇l〇giesK )的、轉(zhuǎn)化有Fab表達(dá)載體的大腸 桿菌（Escherichia coli)細(xì)胞用于生產(chǎn)選擇的Fab分子用于進(jìn)一步表征。簡(jiǎn)單地，通過(guò)由 培養(yǎng)物的凍融程序獲得Fab配制品。用轉(zhuǎn)化的細(xì)菌接種5毫升的包含氨芐青霉素（50 yg/ ml ; Sigma-Aldricl/)的SB(超級(jí)肉湯）并在旋轉(zhuǎn)攪拌器中37°C生長(zhǎng)7小時(shí)。將異丙 基-0 -D-硫代半乳糖苷（IPTG、lmm〇l/l ; Sigma-Aldrichv')加入至生長(zhǎng)的細(xì)菌，其進(jìn)一步 在30°C.孵育過(guò)夜。然后，將細(xì)胞離心、重懸于1毫升PBS/1%牛血清白蛋白（BSA)中，然 后經(jīng)歷凍融程序（3輪）。通過(guò)在室溫、在微型離心機(jī)（microfuge)中以13000g離心，細(xì)胞 碎片被縮減（reduce)為沉淀，并且上層清液用于ELISA無(wú)需進(jìn)一步處理。如先前所描述的 進(jìn)行ELISA。
[0036] 通過(guò)ELISA針對(duì)JCV VP1產(chǎn)生0D45(I>0.8的克隆被認(rèn)為是陽(yáng)性的，并進(jìn)一步表征。
[0037] 分析了 105個(gè)克隆，11個(gè)克隆檢測(cè)呈陽(yáng)性（10. 5% )。證明了針對(duì)BSA的無(wú)反應(yīng) 性。
[0038] 為了確認(rèn)ELISA陽(yáng)性克隆的特異性，通過(guò)在感染有Mad4JCV株的C0S-7細(xì)胞（轉(zhuǎn) 化的非洲綠猴腎成纖維細(xì)胞）上的免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)這些克隆。將結(jié)合有異硫氰酸熒光素 醋（fluoresceinisothiocyanate) (Sigma-Aldrich?)的山羊抗人Fab抗血清用作二級(jí) 抗體。確認(rèn)所有ELISA檢測(cè)的陽(yáng)性克隆能夠結(jié)合感染的細(xì)胞，而用未感染細(xì)胞檢測(cè)到無(wú)反 應(yīng)性。ELISA檢測(cè)的陰性克隆不能與感染的細(xì)胞結(jié)合。
[0039] 用旋轉(zhuǎn)小量制備試劑盒（Spin Minipr印kit) (Qiagen K )獲得來(lái)自ELISA檢測(cè) 的陽(yáng)性克隆的核酸并在373A測(cè)序儀（PerkinElmer? )上測(cè)序。為了測(cè)序重鏈，使用引物 5￡062(5'-6!^61764〇^660460〇^6-3'）（5￡0 10勵(lì):5)，其結(jié)合至（+)鏈。對(duì)于輕鏈，使用 和頂GT工具進(jìn)行序列分析，并顯示，所有的克隆，對(duì)于重鏈，均獲自VH基因的相同亞家族 (subfamily)，對(duì)于輕鏈，均獲自Vk基因的相同亞家族，且共有相同的序列。此外，抗體的 DNA序列是新的。應(yīng)當(dāng)重點(diǎn)指出的是文獻(xiàn)中目前沒(méi)有人類抗體被描述是導(dǎo)向針對(duì)JCV VP1 蛋白。因此，這是首個(gè)描述的人抗JCVVP1單克隆抗體。由名稱GRE1來(lái)識(shí)別該抗體。
[0040] 為了測(cè)試該人抗VP1GRE1抗體的中和活性，將5xl04/孔的C0S-7細(xì)胞接種在24孔 板（Corning^ )中的完全DMEM培養(yǎng)基中。C0S-7是允許JCV感染的細(xì)胞。
[0041] 第二天，將約100個(gè)病灶形成單位的JCV(Mad4株）加入100 y 1的GRE1的漸進(jìn) (progressive)稀釋液（二倍（two-fold)稀釋，從約 20 y g/ml 到約 0? 3 y g/ml)。將混合 物在37°C孵育1小時(shí)并加入至C0S-7細(xì)胞。然后，將它們?cè)?7°C孵育2小時(shí)。用PBS洗滌 一次后，將500 y 1新鮮的培養(yǎng)基加入每一個(gè)孔中并將這些細(xì)胞在37°C孵育6天。
[0042] 中和活件的評(píng)估
[0043] 通過(guò)免疫熒光法評(píng)估抗體的中和活性。簡(jiǎn)單地，感染后6天進(jìn)行免疫熒光法。通 過(guò)在室溫下用甲醇/丙酮混合物（1:1比例）固定細(xì)胞15分鐘并遵循廠商提供的指南通過(guò) 使用商業(yè)Abeam?鼠科動(dòng)物抗VP1抗體（1 y g/ml)作為一級(jí)抗體和FITC結(jié)合的鼠科動(dòng)物 抗Fab ( Sigma-Aldrich I)作為二級(jí)抗體準(zhǔn)備載玻片。
[0044] 通過(guò)比較其中將病毒加入至GRE1的孔中的陽(yáng)性細(xì)胞與在無(wú)抗體的情況下感染的 細(xì)胞（100%感染）的數(shù)量完成評(píng)估。
[0045]也通過(guò)自動(dòng)化焚光讀取系統(tǒng)（IN Cell Analizer Sistem 1000, GE Healthcare) 確認(rèn)了熒光顯微鏡下觀察到的數(shù)據(jù)，該自動(dòng)化熒光讀取系統(tǒng)能夠自動(dòng)地將陽(yáng)性細(xì)胞與背景 區(qū)分開(kāi)，其表明作為Fab片段的抗體能夠以lng/ y 1的濃度抑制多于50%的JCV感染。
[0046] 類似的實(shí)驗(yàn)同樣在實(shí)驗(yàn)地證明了不是所有來(lái)自針對(duì)JCV VP1有反應(yīng)的患者的血清 都能夠中和該病毒。
[0047] 為了這個(gè)目的，用以1:400稀釋（在PBS/1 % BSA中稀釋）的ELISA檢測(cè)了 100份 血清來(lái)驗(yàn)證抗JCV抗體的存在。簡(jiǎn)言之，用25 y L/孔的含有100ng的重組VP1 ( AbcamK' )的溶液涂覆ELISA板（CostarK )并在4 °C孵育過(guò)夜。第二天，用水洗滌該板并用 PBS-l%BSA(w/v)在37°C封閉一小時(shí)。然后，加入40yL的單一稀釋（1:400在PBS/1% BSA中）的待檢測(cè)的血清并且然后將板在37°C孵育一小時(shí)。完成用PBS-0. l%Tween 20( Sigma-Akirich? )5次洗滌之后，通過(guò)用于ELISA微孔板的自動(dòng)洗滌器（ETI-System Kasher，DiaSorin)，遵從廠商的指南，加入40 y L/孔的商業(yè)辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的抗人 igG抗體（Sigma-Aldrich? )。然后將該板在37°c孵育45分鐘。完成幾次洗滌后，如先 前所描述的，將40 y L的底物（H202和3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺的1:1溶液，TMB底物試劑 盒，Thermo Scientific)加入每個(gè)孔，用于發(fā)生酶促反應(yīng)。15分鐘后，通過(guò)加入40yL/孔 的1N的H2S0 4(Carlo Erba)來(lái)封閉酶的活性并以450nm的波長(zhǎng)用分光光度計(jì)（680型酶標(biāo) 儀，Bio-Rad)測(cè)量比色反應(yīng)。
[0048] 將BSA抗原或其他合適的抗原引入每個(gè)實(shí)驗(yàn)作為陰性對(duì)照，其0.D.45(|將用于檢測(cè) 可能的非特異反應(yīng)性。
[0049] 用中和試驗(yàn)分析了顯示出針對(duì)JCV VP1反應(yīng)性>10. D. 450的一些血清。簡(jiǎn)單的，感 染的前一天，將5xl04/孔C0S-7細(xì)胞（允許JCV感染）接種在24孔板（Corning K )中的 完全DMEM培養(yǎng)基中。第二天，將200 yL的包含JCV(Madl)的培養(yǎng)基加入200 yL的1:200 稀釋的待測(cè)血清中（血清的最終稀釋則為1:400,與用于ELISA試驗(yàn)的相同）。在37°C孵育 該混合物1小時(shí)，隨后添加至C0S7細(xì)胞。隨后，它們?cè)?7°C孵育2小時(shí)。一次PBS洗滌之 后，將500 y 1的新鮮培養(yǎng)基加入每個(gè)孔并將這些細(xì)胞在37°C孵育6天。
[0050] 通過(guò)間接免疫熒光法評(píng)估檢測(cè)的樣品的中和活性。通過(guò)在室溫下用甲醇/丙酮混 合物（1:1比例）固定細(xì)胞15分鐘并遵循廠商提供的指南通過(guò)使用商業(yè)AbeamK鼠科動(dòng) 物抗VP1抗體（1 y g/ml)作為一級(jí)抗體和FITC結(jié)合的鼠科動(dòng)物抗Fab ( Sigma-Aldrich? )作為二級(jí)抗體準(zhǔn)備載玻片。
[0051] 通過(guò)比較其中將病毒加入到檢測(cè)的樣品的孔中陽(yáng)性細(xì)胞與在無(wú)樣品的情況下感 染的細(xì)胞（100%感染）的數(shù)量完成評(píng)估。
[0052] 這個(gè)分析證明，盡管通過(guò)ELISA對(duì)VP1有反應(yīng)性，不可忽略數(shù)量的血清顯示出沒(méi)有 中和抗JCV活性。在圖1的圖表中圖示說(shuō)明該獲得的結(jié)果。在圖1的圖表中，報(bào)道了一部 分已檢測(cè)的血清的中和活性的百分比。所有報(bào)道的血清均由ELISA證明針對(duì)VP1的反應(yīng)性 >10. D. 450〇
[0053] 活體組織切片樣品h的免痔熒光法和免痔組織化學(xué)法
[0054] 通過(guò)在免疫熒光和免疫組織化學(xué)試驗(yàn)中使用本發(fā)明的抗JCVVP1GRE1抗體，可以 在活體組織切片樣品中確定JCV的存在。這個(gè)抗體事實(shí)上顯示出對(duì)JCVVP1蛋白的高敏感 性和特異性，而相反表現(xiàn)出對(duì)BKVVP1無(wú)反應(yīng)性。
[0055] 活體組織切片樣品可以是新鮮的或固定的或賭化（paraffinized)樣品。在 固定的和蠟化樣品的情況下，如果必要，按照標(biāo)準(zhǔn)流程將該樣品去蠟化并恢復(fù)抗原性 (antigenicity)。然后將該樣品用GRE1 (在PBS中10 y g/ml)在37°C孵育30分鐘。孵育 期后，在PBS中洗滌該樣品5次，然后遵照廠商的指南，用FITC結(jié)合的或辣根過(guò)氧化物酶結(jié) 合的抗人Fab( Sigma-AldrichK )在37°C孵育30分鐘。在使用結(jié)合有辣根過(guò)氧化物酶的 抗體的情況下，有必要加入底物（二氨基聯(lián)苯胺、DAB底物試劑盒、Thermo Scientific)，在 過(guò)氧化物酶存在時(shí)其產(chǎn)生棕色沉淀，該棕色沉淀使得能夠可視化可能的抗體結(jié)合。
[0056] 通過(guò)以下進(jìn)行試驗(yàn)的評(píng)價(jià)：如果使用了FITC結(jié)合的抗體，則在熒光顯微鏡下或用 自動(dòng)熒光探測(cè)系統(tǒng)觀察樣品；或，如果使用辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的抗體，則通過(guò)光學(xué)顯微鏡 或用自動(dòng)成像系統(tǒng)觀察樣品。
[0057] 用于檢測(cè)牛物學(xué)樣品中的TCV的捕獲ELISA
[0058] 對(duì)于用人抗JCVVP1GRE1抗體進(jìn)行ELISA，用25 yL/孔的包含40ng的PBS中的綿 羊抗人Fd抗體的溶液（1. 6 yg/ml的最終濃度）涂覆ELISA板（Costal )并在4°C孵育 過(guò)夜。第二天，用水洗滌該板并用PBS-l%BSA(w/v)在37°C封閉1小時(shí)。然后，將40yL的 GRE1 (PBS/1 % BSA中最終濃度約為4ng/ y 1)加入每個(gè)孔然后將該板在37°C孵育1小時(shí)。完 成用PBS-0. 1 % Tween 20 ( Sigma-Aldricli? ) 5次洗滌之后，通過(guò)用于ELISA微孔板的自 動(dòng)洗絳器出1'1-578七61111^81161'，0135〇1'；[11)，將401^的待測(cè)生物學(xué)樣品的數(shù)個(gè)稀釋液（連 續(xù)10倍稀釋，從未稀釋開(kāi)始最高達(dá)1:1000稀釋）加入每個(gè)孔中。然后將該板在37°c孵育 1小時(shí)。完成幾次洗滌后，如先前所描述的，將40 y L的1:1000稀釋的商業(yè)鼠科動(dòng)物抗VP1 抗體（在PBS/BSA中稀釋的Abcamx )加入每個(gè)孔。將該板在37°C留置1小時(shí)。進(jìn)一步 洗滌后，加入40 yL/孔的山羊抗體的多克隆配制品，其結(jié)合鼠科動(dòng)物IgG的Fc部分并且 結(jié)合有辣根過(guò)氧化物酶（在山羊中生產(chǎn)的抗小鼠IgG(Fc特異的）-辣根過(guò)氧化物酶抗體， Sigma-Aldrichx )。將該板在37°C孵育45分鐘。如先前所描述的，進(jìn)行用PBS-Tween20 的5次洗滌之后，將40 y L的底物（H202和3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺的1:1溶液，TMB底物 試劑盒，Thermo Scientific)加入每個(gè)孔，用于使酶促反應(yīng)發(fā)生。約15分鐘后，通過(guò)加入 40 y L/孔的1N的H2S04(Carlo Erba)來(lái)封閉酶的活性并且以450nm的波長(zhǎng)用分光光度計(jì) (680型酶標(biāo)儀，Bio-Rad)測(cè)量比色反應(yīng)。
[0059] 將BSA抗原或其他適當(dāng)?shù)目乖朊總€(gè)實(shí)驗(yàn)作為陰性對(duì)照，其0.D.45(|用于檢測(cè)可 能的非特異反應(yīng)性。
[0060] 實(shí)施例2
[0061] 宙義由GRE1單克降抗體識(shí)別的表位的（線件的或構(gòu)象的）件質(zhì)
[0062] 為了定義由GRE1單克隆抗體識(shí)別的表位的（線性的或構(gòu)象的）性質(zhì)，用變性蛋白 和野生型蛋白二者進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)（Western Blot)和斑點(diǎn)印跡試驗(yàn)（Dot Blot)。
[0063] 圖2示出了在變性情況下免疫印跡的結(jié)果。用0 -硫基乙醇-mer)或用十二 烷基硫酸鈉（SDS)使蛋白變性。商業(yè)鼠科動(dòng)物抗體被指定為Abeam，而GRE1抗JCV VP1單 克隆抗體被指定為GRE。
[0064] 圖3示出用變性的VP1和野生型構(gòu)象的VP1二者進(jìn)行的斑點(diǎn)印跡試驗(yàn)的結(jié)果。商 業(yè)鼠科動(dòng)物抗體被指定為Abeam，而GRE1抗JCV VP1單克隆抗體被指定為IgG GRE。
[0065] 結(jié)果顯示GRE1不能結(jié)合至變性形式的蛋白，而其僅能夠識(shí)別未變性的蛋白。為證 實(shí)這個(gè)事實(shí)，抗VP1線性表位的商業(yè)鼠科動(dòng)物抗體（Abeam"，ab34756)反而能夠識(shí)別兩 種蛋白形式。因此，這些結(jié)果產(chǎn)生如下結(jié)論：由GRE1單克隆抗體識(shí)別的表位是構(gòu)象的表位。
[0066] 宙義GRE1單克降抗體的特異件
[0067] 在文獻(xiàn)當(dāng)中已廣泛描述了 BK病毒基因組（BKV)與JCV基因組（它們是能夠感染 人的主要的多瘤病毒）之間的高度核苷酸序列同源性（約70% )。
[0068]為了確定GRE1是否能夠排他地識(shí)別JCV，通過(guò)針對(duì)重組JCV VP1蛋白（AbcamK， ab74569)以及針對(duì)重組BKV VP1蛋白的ELISA試驗(yàn)檢測(cè)了其反應(yīng)性。證明GRE1僅能夠結(jié) 合至JCV VP1蛋白，指示其絕對(duì)特異性。
[0069] 由丙氨酸拍描宙點(diǎn)誘奪表征由GRE1單克降抗體識(shí)別的表位
[0070] 由ClustalX程序?qū)RJCVVP1和BKVVP1蛋白的氨基酸序列，從而識(shí)別帶有這樣 的殘基的部分：該殘基顯不出兩個(gè)蛋白之間的株的（完全的，profound)差異（如電荷和極 性），以及，該殘基可能是本發(fā)明的抗體具有對(duì)兩個(gè)蛋白的結(jié)合差異的原因。通過(guò)這個(gè)分析 識(shí)別了JCV和BKVVP1之間33個(gè)完全不同的（如電荷和極性）氨基酸殘基。
[0071] 為了定義涉及與GRE1單克隆抗體結(jié)合的決定性的VP1殘基，將先前識(shí)別出的殘基 單獨(dú)地突變成丙氨酸（或在原始?xì)埢鶠楸彼岬那闆r下突變成甘氨酸）。簡(jiǎn)單的，在peDNA? 3. 1表達(dá)載體/V5-HisTOPO?TA表達(dá)試劑盒（Life Technologies?)上進(jìn)行定點(diǎn)誘變， 其中，已經(jīng)預(yù)先克隆了編碼來(lái)自Madl株JCV的VP1蛋白的核苷酸序列。將用于誘變的引物 設(shè)計(jì)成長(zhǎng)度約30個(gè)核苷酸，并在5'端顯示出15至20個(gè)核苷酸重疊區(qū)，通過(guò)這樣的方法來(lái) 獲得有效的誘變產(chǎn)物。擴(kuò)增反應(yīng)后，用酶Dpnl在37°C消化PCR產(chǎn)物4小時(shí)，以清除用作模 板的甲基化的DNA。消化后，將1 yL的擴(kuò)增子用于轉(zhuǎn)化電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞。將一些轉(zhuǎn)化的菌 落分離并通過(guò)測(cè)序檢查，以分析是否插入了期望的突變。然后將突變的VP1克隆到另一個(gè) 表達(dá)載體（pCAGEN，Addgene#11160)中。
[0072] 用pCAG-VPlmut載體轉(zhuǎn)染HEK 293T (人類腎上皮）細(xì)胞，并通過(guò)FACS (熒光激活細(xì) 胞分選儀）評(píng)估抗VP1抗體與這些突變的VP1的結(jié)合。簡(jiǎn)言之，用其中已經(jīng)克隆了突變的 VP1的4yg的載體轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞。離心并用4%的多聚甲醛固定后，在室溫下用GRE1 或針對(duì)羧基端線性序列的AbeamK商業(yè)抗體孵育轉(zhuǎn)染的細(xì)胞30分鐘，抗體稀釋在1 y g/ml 濃度的滲透溶液中。隨后洗滌細(xì)胞，并遵循指南的指示（Sigma-Aldrich? )在室溫下用 抗人或抗鼠FITC結(jié)合的單克隆抗體孵育30分鐘，其后由FACS分析。用未突變的VP1蛋白 觀察的反應(yīng)性認(rèn)為是100 %結(jié)合，相反，將未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用作陰性對(duì)照。
[0073] 軟件GraphPadPrism用于分析由FACS獲得的數(shù)據(jù)并用于編輯圖像。
[0074] 通過(guò)FACS分析，可以觀察到如果以下殘基突變將會(huì)破壞結(jié)合：I62A、S65A、A127G、 013(^、附3認(rèn)、41336、八1756(氨基酸殘基編號(hào)基于1&1(11株￥?1的殘基，其中，編號(hào)起始于位 置1處的甲硫氨酸）（圖4)。相反，這個(gè)分析中沒(méi)有考慮在體外能夠改變蛋白構(gòu)象或嚴(yán)重減 少蛋白表達(dá)的突變的殘基。
[0075] 先前已在文獻(xiàn)中描述的以及提交在免費(fèi)進(jìn)入的RCSB-PDB數(shù)據(jù)文庫(kù)(www. rcsb. org)中的、具有登錄碼 3NXG 晶體圖像模型（crystallographic model) (www. rcsb. org/ pdb/explore/explore. do ? structure Id = 3NXG)被用于結(jié)構(gòu)表征由 GRE1 識(shí)另 lj 的表位。 這個(gè)模型的使用使得能夠注意到，在單個(gè)單體上相遠(yuǎn)離、相反在五聚體形式中的兩個(gè)鄰近 的單體上非常接近的、并且和涉及與唾液酸結(jié)合的蛋白質(zhì)的部分絕對(duì)（完全，absolutely) 鄰近的殘基。這些結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)解釋了 GRE1的可觀的中和活性。
[0076] 獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示GRE1識(shí)別構(gòu)象的、而不是線性的表位，表位包括至少以下殘 基：162、S65、A127、D130、N131、A133、A175 (氨基酸殘基編號(hào)基于Madl株VP1的殘基，其 中，編號(hào)起始于位置1處的甲硫氨酸）。
[0077] 特別地，發(fā)現(xiàn)了如果突變就會(huì)破壞GRE1結(jié)合的這些殘基非常接近于對(duì)于VP1蛋白 和它的受體之間的結(jié)合重要的區(qū)域，并且這解釋了GRE1的中和活性。
[0078]用于體外測(cè)宙中和抗體在牛物學(xué)樣品中的存在的ELISA試駘
[0079] 為了確定中和抗體在生物學(xué)樣品（特別地，但不排他地，在腦脊液、血清或血漿 中）中的存在，在ELISA試驗(yàn)中使用了由GRE1 (中和抗體）識(shí)別的表位。用兩個(gè)策略完成 快速有效的檢測(cè)系統(tǒng)的建立：在其中的一個(gè)中，用樣品和GRE1進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性ELISA試驗(yàn)；在 另一個(gè)中，將仍能夠被中和抗體識(shí)別的VP1的最少的部分（包含原始蛋白的位置50到140 之間的殘基）來(lái)用作抗原。同樣建立了后者試驗(yàn)的變體，其中，使待測(cè)的生物學(xué)樣品在液相 中與只突變了由GRE1識(shí)別的殘基的VP1競(jìng)爭(zhēng)，以更加有效的從反應(yīng)中減去能夠識(shí)別VP1部 分，其與由GRE1識(shí)別的那些不同。
[0080] 通討與GRE1單克降抗體競(jìng)爭(zhēng)VP1蛋白來(lái)體外測(cè)宙中和抗體存在的ELISA試駘
[0081] 為了將GRE1于待測(cè)生物學(xué)樣品中的其他人類抗體區(qū)別開(kāi)，通過(guò)與氨基 酸序列DYKDDDDK的基因表達(dá)融合的方法標(biāo)記GRE1，以由結(jié)合有辣根過(guò)氧化物酶 (Sigma-A丨drich? )的商業(yè)單克隆抗體FLAG?汜排他地識(shí)別。
[0082] 用25yL/孔的含有300ng的重組的VP1 ( Abeam?, ab74569)的溶液涂覆ELISA 板（Costar? )并在4°C孵育過(guò)夜。第二天，用水洗滌該板并用PBS-1% BSA(w/v)在37°C 封閉1小時(shí)。然后，加入40 y L的待測(cè)樣品的數(shù)個(gè)稀釋（連續(xù)10倍稀釋，從未稀釋開(kāi)始最高 達(dá)1:1000的稀釋）并隨后將該板在37°C孵育1小時(shí)。其后，將40yL的GRE1抗JCV VP1 抗體（在PBS/1 % BSA中最終濃度約為lng/y L)連同各樣品稀釋物加入每個(gè)孔，并將該板 在37°C孵育1小時(shí)。完成用PBS-0. 1% Tween 20( Sigma-A丨drich? )5次洗滌之后，通 過(guò)用于ELISA微孔板的自動(dòng)洗絳器（ETI-System Kasher，DiaSorin)，加入40yL/孔的商 業(yè)辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的FLAG? M2抗體（Sigma-AMrich? )。然后將該板在37°C孵 育45分鐘。完成幾次洗滌后，如先前表明的，將40 y L的底物（H202和3, 3'，5, 5' -四甲基 聯(lián)苯胺的1:1溶液、TMB底物試劑盒、Thermo Scientific)加入每個(gè)孔，用于使酶促反應(yīng)發(fā) 生。15分鐘后，通過(guò)加入40 y L/孔的IN的H2S04(CarloErba)來(lái)封閉酶的活性并以450nm 的波長(zhǎng)用分光光度計(jì)（680型酶標(biāo)儀，Bio-Rad)來(lái)測(cè)量比色反應(yīng)。
[0083] 將BSA抗原或其他適當(dāng)?shù)目乖朊總€(gè)實(shí)驗(yàn)作為陰性對(duì)照，其0. D.45(|用于檢測(cè)可 能的非特異反應(yīng)性。
[0084] 觀察其中加入單克隆抗體連同待測(cè)生物學(xué)樣品的不同稀釋物的孔以及其中僅加 入單克隆抗體的孔中檢測(cè)的吸光度的差別來(lái)估計(jì)GRE1結(jié)合的抑制。
[0085] 特別地，如果其中加入單克隆抗體連同待測(cè)生物學(xué)樣品的不同稀釋物的孔中的吸 光度低于用單獨(dú)的單克隆抗體觀察到的吸光度，則GRE1與樣品中抗體之間存在對(duì)VP1上的 表位結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)，從而表明樣品中JCV-GRE1樣抗體的存在，以及因此中和以及保護(hù)性抗體 的存在。
[0086]用于體外測(cè)宙牛物學(xué)樣品中能夠識(shí)別由GRE1單克降抗體結(jié)合的相同表位的抗體 的存在的ELISA試駘
[0087] 為了確定包含由GTE1單克隆抗體識(shí)別的表位的VP1的最小部分，并且該部分仍保 留構(gòu)象的特征，用DNA酶消化編碼來(lái)自Madl株JCV的VP1的核苷酸序列以獲得隨機(jī)切割的 VP1序列。將各種VP1部分克隆在噬粒中以通過(guò)針對(duì)GRE1的生物淘選來(lái)選擇仍然能夠由該 單克隆抗體識(shí)別的VP1部分。一旦確定仍由GRE1識(shí)別的部分，則由特定的軟件經(jīng)由電腦模 擬（in silico)分析該片段以確定構(gòu)象和可能地將其與全長(zhǎng)VP1蛋白的構(gòu)象相比較。
[0088] 考慮到該預(yù)測(cè)的結(jié)果，在細(xì)菌表達(dá)載體pET15b中，與6xHis_標(biāo)簽以及凝血酶切割 位點(diǎn)（pETminiVPl)在框內(nèi)（in frame)克隆所選擇的編碼由GRE1識(shí)別的最小部分的、并且 包含原始蛋白的位置50到140之間殘基的核苷酸序列。將限制性位點(diǎn)Xhol和BamHI (存 在于載體的克隆區(qū)域中，但不存在于VP1中）用于克隆。為了這個(gè)目的，通過(guò)在5'端和3' 端分別插入Xhol和BamHI限制性位點(diǎn)，通過(guò)PCR擴(kuò)增感興趣的VP1區(qū)域。在氨芐青霉素抗 性的基礎(chǔ)上并且通過(guò)序列分析完成包含pETminiVPl的菌落的選擇。
[0089] 對(duì)于該片段的純化，將一個(gè)含有pETminiVPl的菌落接種在10ml的具有50yg/mL 氨芐青霉素的LB中，并在37°C生長(zhǎng)過(guò)夜。第二天，將5ml的培養(yǎng)物進(jìn)一步接種在500ml的 具有50yg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中。用分光光度計(jì)以規(guī)律間隔分析該培養(yǎng)物來(lái)檢測(cè) 細(xì)菌生長(zhǎng)。當(dāng)該培養(yǎng)物到達(dá)0. 6-1的0D600時(shí)，將0. 4mM異丙基--D-1-硫代半乳糖苷 (IPTG)加入該培養(yǎng)基然后將其留在室溫下攪拌過(guò)夜。
[0090] 第二天，將細(xì)菌培養(yǎng)物以3900rcf離心15分鐘，然后將細(xì)菌沉淀重懸在20ml的緩 沖液A(50mM Tris (三異丙基乙磺酰）pH 7. 5、5%丙三醇、250mM NaCl、3mM咪唑）中。然后 通過(guò)使用超聲波儀裂解細(xì)胞。將該懸浮液以12, OOOrcf?離心45分鐘并用0. 4 y m的過(guò)濾器 過(guò)濾來(lái)清除細(xì)菌碎片。
[0091] 然后通過(guò)在鎳柱上親和色譜純化片段。在將樣品應(yīng)用于柱之前，用3體積的緩沖 液八、3體積的緩沖液8(20禮1'1^8?117.5、5%丙三醇、25〇1111恥(：1、50〇1111咪唑）洗滌樹(shù) 月旨，并用8體積的緩沖液A再平衡。這時(shí)，將樣品在柱上運(yùn)行。用50ml的緩沖液A洗滌該 柱去除未結(jié)合的樣品，并用0% -100%梯度的緩沖液B洗脫樣品。洗脫后，使用緩沖液A再 平衡該柱。一旦濃縮，用凝血酶消化片段以便清除可以影響該待測(cè)生物學(xué)樣品的組氨酸尾 巴。為了清除可以影響純化的片段的可能應(yīng)用的洗脫緩沖液的痕跡，將緩沖液對(duì)PBS透析。 由12%的SDS凝膠分析該片段的質(zhì)量和濃度，該片段從現(xiàn)在起將稱為miniVPl。
[0092] 對(duì)于ELISA，用25yL/孔的含有300ng的miniVPl片段（如先前描述產(chǎn)生的）的溶 液涂覆96孔板（Costar? )，并在4°C孵育過(guò)夜。第二天，用水洗該板并用PBS-1 % BSA (w/ v)在37°C封閉1小時(shí)。
[0093] 當(dāng)完成板的孵育時(shí)，加入40 UL的待測(cè)樣品的數(shù)個(gè)稀釋（連續(xù)10倍稀釋，從未稀 釋開(kāi)始最高達(dá)1:1〇〇〇的稀釋），并將該板在37°c孵育1小時(shí)。完成用PBS-0. 1% Tween 20( Sigma-Aldrich? )5次洗滌之后，通過(guò)用于ELISA微孔板的自動(dòng)洗滌器（ETI-System Kasher，DiaSorin)，加入40 y L/孔的結(jié)合人IgG的Fc部分的辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的山羊 抗體的多克隆配制品。將該板在37°C孵育45分鐘。如先前所描述的，進(jìn)行用PBS-0. 1% Tween 20的5次洗滌之后，將40 y L底物（H202和3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺的1:1溶液， TMB底物試劑盒，Thermo Scientific)加入每個(gè)孔，用于使酶促反應(yīng)發(fā)生。15分鐘后，通過(guò) 加入40 y L/孔的1N的H2S04 (Carlo Erba)封閉酶的活性，并以450nm的波長(zhǎng)用分光光度計(jì) (680型酶標(biāo)儀，Bio-Rad)來(lái)測(cè)量比色反應(yīng)。
[0094] 將BSA抗原或其他適當(dāng)?shù)目乖朊總€(gè)實(shí)驗(yàn)作為陰性對(duì)照，其0.D.45(|用于檢測(cè)可 能的非特異的反應(yīng)性。將lng/ y L的最終濃度的GRE1單克隆抗體用作陽(yáng)性對(duì)照。
[0095] 與BSA相比，對(duì)miniVPl顯示出更高反應(yīng)性的樣品被認(rèn)為是陽(yáng)性的，并因此包含具 有中和活性進(jìn)而保護(hù)性活性的JCV-GRE1樣抗體。
[0096]用于體外測(cè)宙牛物學(xué)樣品中能夠識(shí)別由GRE1單克降抗體結(jié)合的相同表位的抗體 (具有由突奪的VP1競(jìng)爭(zhēng)的奪體）的存在的ELISA試駘
[0097] 為了增強(qiáng)先前試驗(yàn)的嚴(yán)謹(jǐn)性，通過(guò)增加用在對(duì)于GRE1與蛋白的結(jié)合重要的殘基 上突變了的VP1預(yù)孵育待測(cè)樣品的步驟建立了另一個(gè)版本的實(shí)驗(yàn)。
[0098] 為了獲得在GRE1結(jié)合位點(diǎn)上修飾了的VP1蛋白，并且其之后將在生物學(xué)樣品中通 過(guò)去選擇抗體而起作用，通過(guò)進(jìn)行以下一些改變來(lái)使用定點(diǎn)誘變策略：既然有些殘基非常 接近于誘變處理，一些殘基被同時(shí)突變。首先，通過(guò)使用以下引物突變殘基162和S65 :Fw: 5? -gttttagtaagcaGCae2lZAtctataGcaa5sZAgatac-3' (SEQ ID NO:8)以及作為反向的 5'-tgac ttactaaaacccctaagatgctcatctgg_3'（SEQ ID N0:9)。其中已預(yù)先克隆有來(lái)自 Madl 株 JCV 的 VP1 的載體 pcDNA? 3. 1/V5-His T0P0K :表達(dá)試劑盒（Life Technologies)用作模板。 通過(guò)PCR獲得同樣包含突變的蛋白的擴(kuò)增產(chǎn)物。為了除去用于反應(yīng)的DNA模板（該模板 當(dāng)然不會(huì)包含期望的突變），在37°C用Dpnl消化該反應(yīng)產(chǎn)物4小時(shí)。其后，用2 yL的預(yù) 先處理過(guò)的擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞。在氨芐青霉素耐受性的基礎(chǔ)上選擇包含該質(zhì) 粒的細(xì)胞，然后通過(guò)序列分析核對(duì)。將在第一次擴(kuò)增反應(yīng)中顯示出突變插入的載體用作第 二次擴(kuò)增反應(yīng)的模板，其中位置127A、130D、131N和133A被突變。為了插入這些突變，將 5 ?-cactctaatgggcaagGa127A/GactcatgCc130D/AGCt 131N/AggtgGa133A/Gggg-3? (SEQ ID NO: 10)用作 Fw 引物，以及 5'_cttgcccattagagtgcacattcatcaaac_3'（SEQ ID N0:11)作為反向引物。 用Dpnl在37°C消化PCR產(chǎn)物4小時(shí)。其后，用2 y L的預(yù)先處理過(guò)的擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化電轉(zhuǎn)感 受態(tài)細(xì)胞。在氨芐青霉素耐受性的基礎(chǔ)上選擇包含該質(zhì)粒的細(xì)胞，然后通過(guò)序列分析核對(duì)。 在細(xì)菌表達(dá)載體pET15b中，將通過(guò)序列分析示出所有插入突變的VP1與6xHis-標(biāo)簽以及 凝血酶切割位點(diǎn)在框內(nèi)克?。╬ET-VPlmut)。然后用與用于純化miniVPl相同的方案來(lái)純化 突變的 VP1 (VPlmut)。
[0099] 對(duì)于ELISA，用25 y L/孔的含有300ng的miniVPl (如先前所描述的產(chǎn)生的）的溶 液涂覆96孔板（Costar? )，并在4°C孵育過(guò)夜。第二天，用水洗該板并用PBS-l%BSA(w/ v)在37°C封閉1小時(shí)。同時(shí)，用待測(cè)生物學(xué)樣品的數(shù)個(gè)稀釋（連續(xù)10倍稀釋，從未稀釋開(kāi) 始最高達(dá)1:1000稀釋）預(yù)孵育50 y g/mL的突變的VP1，然后在37°C孵育30分鐘。當(dāng)完成 板的孵育時(shí)，加入40 y L的各種血清稀釋物（或其他生物學(xué)樣品）與突變的VP1的混合物， 并將該板在37°C孵育1小時(shí)。完成用PBS-0. 1% Tween20( Sigma-Aldrich? )5次洗滌之 后，通過(guò)用于ELISA微孔板的自動(dòng)洗絳器（ETI-System Kasher，DiaSorin)，加入40 y L/孔 的結(jié)合人IgG的Fc部分（Sigma-Aldrich"')的辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的山羊抗體的多克 隆配制品。將該板在37°C孵育45分鐘。如先前所描述的，進(jìn)行用PBS-0. 1% Tween 20的 5次洗滌之后，將40 y L的底物（H202和3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺的1:1溶液，TMB底物試 劑盒，Thermo Scientific)加入每個(gè)孔，用于使酶促反應(yīng)發(fā)生。15分鐘后，通過(guò)加入40 yL/ 孔的IN的H2S04 (Carlo Erba)來(lái)封閉酶的活性，并以450nm的波長(zhǎng)用分光光度計(jì)（680型酶 標(biāo)儀，Bio-Rad)來(lái)測(cè)量比色反應(yīng)。
[0100] 將BSA抗原或其他適當(dāng)?shù)目乖朊總€(gè)實(shí)驗(yàn)作為陰性對(duì)照，其0. D. 45(|用于檢測(cè)可 能的非特異的反應(yīng)性。將lng/ y L的最終濃度的GRE1單克隆抗體用作陽(yáng)性對(duì)照。
[0101] 與BSA相比，認(rèn)為對(duì)miniVPl顯示出更高反應(yīng)性的樣品是陽(yáng)性的，進(jìn)而包含具有中 和活性、進(jìn)而保護(hù)性活性的JCV-GRE1樣抗體。
【權(quán)利要求】
1. 一種抗JC病毒的VPl蛋白的單克隆抗體，其特征在于以下事實(shí)，所述單克隆抗體是 人抗體并且能夠中和所述JC病毒。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，所述單克隆抗體能夠結(jié)合至JCV VPl蛋白的構(gòu) 象表位，所述構(gòu)象表位包含選自由以下組成的組的至少一個(gè)JCV VPl蛋白的一級(jí)序列的氨 基酸殘基：162、S65、A127、D130、N131、A133、A175和它們的任何組合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的單克隆抗體，其中，所述JCV VPl蛋白的所述構(gòu)象表位包含所 述JCV VPl蛋白的所述一級(jí)序列的氨基酸殘基I62、S65、A127、D130、N131、A133*A175。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體，所述單克隆抗體是選自由以下 組成的組的全長(zhǎng)免疫球蛋白或功能性免疫球蛋白片段：Fab、Fab'、F(ab'） 2、Fv、單鏈抗體 (svFv)和單域抗體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體，所述單克隆抗體包含至少重鏈可 變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中，所述重鏈可變區(qū)具有序列SEQ ID N0:1并且所述輕鏈可變區(qū)具有 序列SEQ ID NO:2;或所述重鏈可變區(qū)由序列SEQ ID NO:3編碼并且所述輕鏈可變區(qū)由序 列 SEQ ID NO:4 編碼。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體，用于在JCV感染或與JCV感染相 關(guān)聯(lián)的疾病的治療性或預(yù)防性處置中使用。
7. 用于根據(jù)權(quán)利要求6使用的單克隆抗體，其中，與JCV感染相關(guān)聯(lián)的所述疾病是進(jìn)行 性多灶性白質(zhì)腦病（PML)。
8. -種藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物組合物，用于在JCV感染或與JCV感染相關(guān)聯(lián)的疾病的 治療性或預(yù)防性處置中使用。
10. 用于根據(jù)權(quán)利要求9使用的藥物組合物，其中，與JCV感染相關(guān)聯(lián)的所述疾病是進(jìn) 行性多灶性白質(zhì)腦病（PML)。
11. 一種診斷JCV感染或與JCV感染相關(guān)聯(lián)的疾病的體外方法，所述方法包括在單克隆 抗體與如果存在于樣品中的JCV VPl抗原結(jié)合的適宜條件下用根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一 項(xiàng)所述的單克隆抗體接觸來(lái)自疑似感染有JCV的患者的生物學(xué)樣品的步驟，以及定性或定 量檢測(cè)所述單克隆抗體與所述JCV VPl抗原的結(jié)合的步驟，這樣的結(jié)合表明JCV感染或與 JCV感染相關(guān)聯(lián)的疾病。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中與JCV感染相關(guān)聯(lián)的所述疾病是進(jìn)行性多灶性 白質(zhì)腦?。≒ML)。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的方法，所述方法是免疫ELISA試驗(yàn)或免疫熒光試驗(yàn)或 免疫組織化學(xué)試驗(yàn)。
14. 一種用于診斷JCV感染或與JCV感染相關(guān)聯(lián)的疾病的免疫診斷試劑盒，所述試劑盒 包括：根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體以及用于進(jìn)行體外免疫診斷方法的 說(shuō)明。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的免疫診斷試劑盒，其中，所述體外免疫診斷方法是根據(jù)權(quán) 利要求11至13中任一項(xiàng)所述的方法。
16. 根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的試劑盒，其中，所述與JCV感染相關(guān)聯(lián)的疾病是進(jìn)行 性多灶性白質(zhì)腦病（PML)。
17. -種對(duì)于患有JCV感染的人類患者中的JCV病毒的中和方法，所述方法包括給予所 述人類患者有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體。
【文檔編號(hào)】A61P31/20GK104520318SQ201380034401
【公開(kāi)日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2013年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月27日
【發(fā)明者】羅伯托·布廖尼, 馬西莫·克萊門(mén)蒂 申請(qǐng)人:潑莫納搜索有限公司