專利名稱：抗o型和a型口蹄疫病毒雙價(jià)多肽疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以O(shè)型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的VP1蛋白的主要抗原決定簇構(gòu)成的能抗O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的二價(jià)多肽疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
國際獸醫(yī)局將口蹄疫列為A類傳染病之首。家畜口蹄疫是當(dāng)今世界上最為嚴(yán)重的家畜傳染病，主要危害豬、牛、羊等偶蹄類動(dòng)物。多年來，口蹄疫在世界范圍內(nèi)大規(guī)模爆發(fā)和流行，給畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。預(yù)防接種是控制該病毒的主要手段。根據(jù)免疫原性，有A、O、C、SATI、SATII、SATIII及Asia I共7個(gè)血清型及65個(gè)以上的亞型?？谔阋卟《?FMDV)各型之間無交叉免疫反應(yīng)，一種類型的疫苗不能保護(hù)家畜免受另一種類型病毒的感染，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在許多地區(qū)會(huì)有一個(gè)以上病毒流行，如果用一個(gè)型的疫苗免疫家畜，有很大的盲目性，為了克服這種免疫的局限性，因此研制抗O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒二價(jià)多肽疫苗有重要的實(shí)踐意義。
在各種預(yù)防口蹄疫的疫苗中，基因工程疫苗由于安全性好，易于保存，效果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)具有廣闊的應(yīng)用前景，與口蹄疫病毒免疫原性密切相關(guān)的是其外殼蛋白VP1基因，該蛋白中含有口蹄疫病毒主要抗原表位，本發(fā)明以O(shè)型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的VP1蛋白的主要抗原決定簇構(gòu)成多肽疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種能同時(shí)抗O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的二價(jià)多肽疫苗及其制備方法。
本發(fā)明提出的抗O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒二價(jià)多肽疫苗，是以編碼O型口蹄疫病毒的VP1蛋白21～40、141～160位氨基酸的DNA序列，以及A型口蹄疫病毒的VP1蛋白21～40、138～160位氨基酸的DNA序列構(gòu)成一個(gè)串聯(lián)基因。
FMDV抗原多肽采用O型口蹄疫病毒VP1蛋白中2個(gè)主要抗原表位，即21～40、141～160二個(gè)氨基酸肽段，并將其組成141～160AA-21～40AA-141～160AA的串聯(lián)結(jié)構(gòu)，A型口蹄疫病毒VP1蛋白中2個(gè)主要抗原表位，即21～40、138～160二個(gè)氨基酸肽段，并將其組成138～160AA-21～40AA-138～160AA的串聯(lián)結(jié)構(gòu)并且在肽段連接處加入一些氨基酸多肽作為接頭，如后述實(shí)施例中采用141～160AA-21～40AA-141～160AA的抗原多肽結(jié)構(gòu)，前后兩個(gè)接頭分別是2個(gè)和11個(gè)氨基酸，其中前一接頭的2個(gè)氨基酸為Pro-Gly，后一接頭的11個(gè)氨基酸為Gln-Phe-Glu-Leu-Glu-Phe-Met-Val-Pro-Ser-Arg。
然后將抗O型FMDV結(jié)構(gòu)為141～160AA-21～40AA-141～160AA的抗原多肽和抗A型FMDV結(jié)構(gòu)為138～160AA-21～40AA-138～160AA的抗原多肽連結(jié)成融合蛋白，其結(jié)構(gòu)分別為138～160AA-21～40AA-138～160AA-141～160AA-21～40AA-141～160AA的融合蛋白或141～160AA-21～40AA-141～160AA-138～160AA-21～40AA-138～160AA的融合蛋白，兩個(gè)抗原多肽間的接頭氨基酸序列為Gly-Ser-Met-Leu，該融合基因在大腸桿菌中可表達(dá)抗O型和A型口蹄疫病毒的二價(jià)多肽抗原蛋白，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。
本發(fā)明中，所采用的串聯(lián)結(jié)構(gòu)的O型FMDV抗原基因序列為SEQ ID NO.1，其編碼的抗原多肽氨基酸序列為SEQ ID NO.2，A型FMDV抗原基因序列為SEQ ID NO.3，其編碼的抗原多肽氨基酸序列為SEQ ID NO.4；抗O型FMDV和A型FMDV抗原基因序列其一種為SEQ ID NO.5，其編碼的抗原多肽氨基酸序列為SEQ ID NO.6；抗O型FMDV和A型FMDV抗原基因序列其一種為SEQ ID NO.7，其編碼的抗原多肽氨基酸序列為SEQ ID NO.8；其結(jié)構(gòu)特征為抗原基因的兩端各有一個(gè)拷貝的編碼141～160或138～160位氨基酸的DNA序列，中間是一個(gè)拷貝的編碼21～40位氨基酸的DNA序列；連接這些序列的兩個(gè)接頭分別是2個(gè)和11個(gè)氨基酸。
在基因水平上將二個(gè)串聯(lián)結(jié)構(gòu)連接形成融合基因，表達(dá)獲得融合蛋白。該融合蛋白具有下列特點(diǎn)(1)在基因水平上，整個(gè)融合基因大小約為500bp。
(2)在蛋白水平上，其中21～40位氨基酸肽段是一針對T細(xì)胞的抗原表位，141～160位，138～160氨基酸肽段是一種對B細(xì)胞的抗原表位。整個(gè)融合蛋白分子量約為18kDa。
(3)本發(fā)明中，為了選擇最佳肽段，保持高的抗病毒免疫原性，F(xiàn)MDV抗原多肽中21～40AA可任意改動(dòng)1個(gè)氨基酸；141～160AA可任意改動(dòng)1-5個(gè)氨基酸。
(4)本發(fā)明提出的新型疫苗用于免疫易感動(dòng)物，預(yù)防口蹄疫的發(fā)生。該雙價(jià)口蹄疫病毒多肽疫苗最適用于預(yù)防豬，牛，羊O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的感染。
本發(fā)明還提出了上述抗O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒雙價(jià)多肽疫苗的制備方法，包括基因制備、重組和融合蛋白的表達(dá)等，其步驟如下用化學(xué)合成方法合成編碼VP1蛋白21～40、141～160、138～160位氨基酸的DNA序列，在DNA水平上連接成完整抗原基因，然后將上述融合基因插入表達(dá)質(zhì)粒載體，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株。將菌株置于細(xì)菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度在30℃到37℃之間，培養(yǎng)時(shí)間8到25小時(shí)，然后收集菌體；若所用質(zhì)粒為原核表達(dá)質(zhì)粒，則將菌體破碎，離心收集含有融合蛋白的包含體，將包含體配成油乳劑，即可獲得雙價(jià)多肽疫苗，用于直接注射家畜。
本發(fā)明提出的疫苗在制備過程中，采用了化學(xué)合成，基因克隆與序列測定、序列分析、基因重組等基因工程技術(shù)與方法。并用SDS-PAGE蛋白檢測方法，Western blotting、T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、豚鼠及豬抗病毒能力檢測等免疫學(xué)方法檢測了該疫苗的功效。
SDS-PAGE電泳檢測證明表達(dá)獲得的融合蛋白分子量與預(yù)期一致(見圖2)。圖中條帶“1”是蛋白質(zhì)分子量marker；條帶“2”是空白質(zhì)粒pTrcHis轉(zhuǎn)化Top10蛋白表達(dá)條帶。條帶“3”是重組質(zhì)粒pTrcHis-O-A轉(zhuǎn)化Top10的蛋白表達(dá)條帶，可見表達(dá)出分子量為20KD的蛋白質(zhì)條帶。
Western blotting檢測證明該融合蛋白具有很強(qiáng)的抗原性，能分別與A型口蹄疫病毒標(biāo)準(zhǔn)抗體和O型口蹄疫病毒標(biāo)準(zhǔn)抗體發(fā)生特異的抗原抗體反應(yīng)。條帶“4”，“6”與條帶“2”對應(yīng)，說明菌體及載體自身蛋白與A型口蹄疫病毒標(biāo)準(zhǔn)抗體和O型口蹄疫病毒標(biāo)準(zhǔn)抗體之間無特異性的抗原抗體反應(yīng)。條帶“5”和“7”與條帶“3”對應(yīng)，可見該融合蛋白既能與O型口蹄疫病毒發(fā)生特異的免疫反應(yīng)其中(條帶“5”)，又能與A型口蹄疫病毒發(fā)生特異的免疫反應(yīng)(條帶“7”)，結(jié)果見圖2。
用該疫苗免疫豚鼠，取免疫豚鼠血清，用中國農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所免疫診斷室生產(chǎn)的A型FMDV Elisa試劑盒和O型FMDV Elisa試劑盒測定特異性抗體的滴度，結(jié)果見表1。
用該疫苗免疫豚鼠，一定時(shí)間后以O(shè)型口蹄疫病毒，A型口蹄疫病毒進(jìn)行攻擊。結(jié)果證明該疫苗對豚鼠具有較好的保護(hù)效果(A型口蹄疫病毒的保護(hù)率為71％，O型口蹄疫病毒的保護(hù)率為85％)，保護(hù)效果見表2。


圖1為本發(fā)明多肽疫苗的串聯(lián)基因結(jié)構(gòu)圖示。
圖2為本發(fā)明多肽疫苗的融合蛋白的性能圖示。
具體實(shí)施例方式
下面以抗O型口蹄疫病毒，A型口蹄疫病毒雙價(jià)多肽疫苗為例進(jìn)一步具體描述本發(fā)明。
化學(xué)合成O型口蹄疫病毒VP1基因中編碼21～40、141～160位氨基酸片段的DNA序列，串聯(lián)成為141～160AA-21～40AA-141～160AA(見序列表Seq1及Seq2)，和A型口蹄疫病毒VP1基因中編碼21～40、138～160位氨基酸片段的DNA序列，串聯(lián)成為138～160AA-21～40AA-138～160AA(Seq3及Seq4)的一級結(jié)構(gòu)。將抗O型FMDV結(jié)構(gòu)為141～160AA-21～40AA-141～160AA的抗原多肽和抗A型FMDV結(jié)構(gòu)為138～160AA-21～40AA-138～160AA的抗原多肽連結(jié)成融合蛋白，其結(jié)構(gòu)分別為138～160AA-21～40AA-138～160AA-141～160AA-21～40AA-141～160AA的融合蛋白(Seq5及Seq6)，兩個(gè)抗原多肽間的接頭氨基酸序列為Gly-Ser-Met-Leu，該融合基因在大腸桿菌中可表達(dá)抗O型和A型口蹄疫病毒的二價(jià)多肽抗原蛋白，將質(zhì)粒載體pTrcHis以限制性內(nèi)切酶酶切，將該片段與串聯(lián)抗原基因混合，在T4 Ligase等作用下發(fā)生連接反應(yīng)。獲得的重組DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10菌株的感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)于氨芐青霉素平板中，37℃倒置過夜。隨意挑取轉(zhuǎn)化子，分別以酶切鑒定，DNA測序分析鑒定轉(zhuǎn)化子，從而獲得陽性克隆。序列分析證明插入的基因序列與設(shè)計(jì)相符。將此克隆命名為pTrcHis-O-A。
將pTrcHis以含50ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液為發(fā)酵液，30℃下通氣培養(yǎng)8-25小時(shí)后收集菌體。再將菌體懸浮于破壁液中，用95W功率的超聲儀破壁5分鐘。超聲后5000rpm離心20分鐘收集包涵體。并配成油乳劑，即可獲得一種新型的抗O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的雙價(jià)多肽疫苗。
該疫苗所涉及的融合蛋白SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果表明融合蛋白在大腸桿菌Top10中得到高效表達(dá)結(jié)果(附圖2)，Western blotting檢測結(jié)果表明該融合蛋白具有很強(qiáng)的抗原性，能分別與A型口蹄疫病毒標(biāo)準(zhǔn)抗體和O型口蹄疫病毒標(biāo)準(zhǔn)抗體發(fā)生特異的抗原抗體反應(yīng)(附圖2)。該疫苗免疫豚鼠后檢測FMDV特異性抗體的滴度，結(jié)果表明該融合蛋白誘導(dǎo)豚鼠產(chǎn)生高滴度的抗A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒的特異性抗體，見表1?？笰型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒能力檢測結(jié)果表明該疫苗免疫豚鼠后對A型口蹄疫病毒的保護(hù)率為70％，O型口蹄疫病毒的保護(hù)率為85％，見表2。
表1免疫后豚鼠FMDV特異性抗體的滴度免疫后天數(shù)Test samples 豚鼠個(gè)數(shù) 21 42對照組 70 0(titers to FMDV typeA)0 0(titers to FMDV typeO)免疫組 72.14.3(titers to FMDV type A)2.23.9(titers to FMDV type O)
表2融合蛋白對豚鼠的免疫保護(hù)效果疫 苗 疫苗免疫劑量病毒攻擊劑量實(shí)驗(yàn)豚鼠數(shù) 被保護(hù)豚鼠數(shù) 保護(hù)率免疫組1400ug100ID50/0.2ml(A型FMDV) 7 5 70％免疫組2400ug100ID50/0.2ml(O型FMDV) 7 6 85％對照組10100ID50/0.2ml(A型FMDV) 7 0 0對照組20100ID50/0.2ml(O型FMDV) 7 0 0
本發(fā)明涉及的基因序列及其編碼的氨基酸序列SEQ ID NO.1GTG AGC AAC GTG AGG GGT GAC CTT CAA GTG TTG GCT CAG AAG GCA GAA AGA GTTCAC TCG TTG CAC TCC CCA CTG GAA GTT CAC AAC CGA GTC TTC CGT CTT TCT CAACTG CCC CCC GGT GAG ACA CAG GTC CAG AGA CGC CAG CAC ACG GAT ATC TCG TTTGAC GGG GGG CCA CTC TGT GTC CAG GTC TCT GCG GTC GTG TGC CTA TAG AGC AAAATA CTA GAC AGA TTT GTG CAG TTT GAG CTG GAG TTT ATG GTG CCC AGC AGG GTGTAT GAT CTG TCT AAA CAC GTC AAA CTC GAC CTC AAA TAC CAC GGG TCG TCC CACAGC AAC GTG AGG GGT GAC CTT CAA GTG TTG GCT CAG AAG GCA GAA AGA GTT CTGTCG TTG CAC TCC CCA CTG GAA GTT CAC AAC CGA GTC TTC CGT CTT TCT CAA GACCCCGGGSEQ ID NO.2N端-VSNVRGDLQVLAQKAERVLPPGETQVQRRQHTDISFILDRFVQFELEFMVPSRVSNVRGDLQVLAQKAERVLP-C端SEQ ID NO.3ATG ACA GGT AAT GCA GGC CGT CGC GGT GAT CTT GGC TCT CTT GCG GCG CGC GTTTAC TGT CCA TTA CGT CCG GCA GCG CCA CTA GAA CCG AGA GAA CGC CGC GCG CAAGCT GCA CAG TTT CCC GCT CCC GGC GAG ACA CAA GTT CAA CGC CGC CAG CAC ACCCGA CGT GTC AAA GGG CGA GGG CCG CTC TGT GTT CAA GTT GCG GCG GTC GTG TGGAAT GTT GGC TTC ATC ATG GAC CGC TTT GTT CAA TTC GAG CTG GAG TTC ATG GTTTTA CAA CCG AAG TAG TAC CTG GCG AAA CAA GTT AAG CTC GAC CTC AAG TAC CAACCC TCC CGT ACA GGT AAT GCA GGC CGT CGC GGT GAT CTT GGC TCT CTT GCG GCGGGG AGG GCA TGT CCA TTA CGT CCG GCA GCG CCA CTA GAA CCG AGA GAA CGC CGCCGC GTT GCT GCA CAG TTT CCC GCT TGA GGA TCG AAG CTTGCG CAA CGA CGT GTC AAA GGG CGA ACT CCT AGC TTC GAASEQ ID NO.4N端-MTGNAGRRGDLGSLAARVAAQFPAPGETQVQRRQHTNVGFIMDRFVQFELEFMVPSRTGNAGRRGDLGSLAARVAAQFPAZGSKL-C端
SEQ ID NO.5ATG ACA GGT AAT GCA GGC CGT CGC GGT GAT CTT GGC TCT CTT GCG GCG CGC GTTTAC TGT CCA TTA CGT CCG GCA GCG CCA CTA GAA CCG AGA GAA CGC CGC GCG CAAGCT GCA CAG TTT CCC GCT CCC GGC GAG ACA CAA GTT CAA CGC CGC CAG CAC ACCCGA CGT GTC AAA GGG CGA GGG CCG CTC TGT GTT CAA GTT GCG GCG GTC GTG TGGAAT GTT GGC TTC ATC ATG GAC CGC TTT GTT CAA TTC GAG CTG GAG TTC ATG GTTTTA CAA CCG AAG TAG TAC CTG GCG AAA CAA GTT AAG CTC GAC CTC AAG TAC CAACCC TCC CGT ACA GGT AAT GCA GGC CGT CGC GGT GAT CTT GGC TCT CTT GCG GCGGGG AGG GCA TGT CCA TTA CGT CCG GCA GCG CCA CTA GAA CCG AGA GAA CGC CGCCGC GTT GCT GCA CAG TTT CCC GCT TGA GGA TCG CTC GAG GTG AGC AAC GTG AGGGCG CAA CGA CGT GTC AAA GGG CGA ACT CCT AGC GAG CTC CAC TCG TTG CAC TCCGGT GAC CTT CAA GTG TTG GCT CAG AAG GCA GAA AGA GTT CTG CCC CCC GGT GAGCCA CTG GAA GTT CAC AAC CGA GTC TTC CGT CTT TCT CAA GAC GGG GGG CCA CTCACA CAG GTC CAG AGA CGC CAG CAC ACG GAT ATC TCG TTT ATA CTA GAC AGA TTTTGT GTC CAG GTC TCT GCG GTC GTG TGC CTA TAG AGC AAA TAT GAT CTG TCT AAAGTG CAG TTT GAG CTG GAG TTT ATG GTG CCC AGC AGG GTG AGC AAC GTG AGG GGTCAC GTC AAA CTC GAC CTC AAA TAC CAC GGG TCG TCC CAC TCG TTG CAC TCC CCAGAC CTT CAA GTG TTG GCT CAG AAG GCA GAA AGA GTT CTG CCC AAG CTTCTG GAA GTT CAC AAC CGA GTC TTC CGT CTT TCT CAA GAC GGG TTC GAASEQ ID NO.6N端-MTGNAGRRGDLGSLAARVAAQFPAPGETQVQRRQHTNVGFIMDRFVQFELEFMVPSRTGNAGRRGDLGSLAARVAAQFPAZGSGSLVVSNVRGDLQVLAQKAERVLPPGETQVQRRQHTDISFILDRFVQFELEFMVPSRVSNVRGDLQVLAQKAERVLPML-C端SEQ ID NO.7GTG AGC AAC GTG AGG GGT GAC CTT CAA GTG TTG GCT CAG AAG GCA GAA AGA GTTCAC TCG TTG CAC TCC CCA CTG GAA GTT CAC AAC CGA GTC TTC CGT CTT TCT CAA
CTG CCC CCC GGT GAG ACA CAG GTC CAG AGA CGC CAG CAC ACG GAT ATC TCG TTTGAC GGG GGG CCA CTC TGT GTC CAG GTC TCT GCG GTC GTG TGC CTA TAG AGC AAAATA CTA GAC AGA TTT GTG CAG TTT GAG CTG GAG TTT ATG GTG CCC AGC AGG GTGTAT GAT CTG TCT AAA CAC GTC AAA CTC GAC CTC AAA TAC CAC GGG TCG TCC CACAGC AAC GTG AGG GGT GAC CTT CAA GTG TTG GCT CAG AAG GCA GAA AGA GTT CTGTCG TTG CAC TCC CCA CTG GAA GTT CAC AAC CGA GTC TTC CGT CTT TCT CAA GACCCC GGA TCG CTC GAG ATG ACA GGT AAT GCA GGC CGT CGC GGT GAT CTT GGC TCT CTT GCGGGG CCT AGC GAG CTC TAC TGT CCA TTA CGT CCG GCA GCG CCA CTA GAA CCG AGA GAA CGCGCG CGC GTT GCT GCA CAG TTT CCC GCT CCC GGC GAG ACA CAA GTT CAA CGC CGC CAG CACCGC GCG CAA CGA CGT GTC AAA GGG CGA GGG CCG CTC TGT GTT CAA GTT GCG GCG GTC GTGACC AAT GTT GGC TTC ATC ATG GAC CGC TTT GTT CAA TTC GAG CTG GAG TTC ATG GTTTGG TTA CAA CCG AAG TAG TAC CTG GCG AAA CAA GTT AAG CTC GAC CTC AAG TAC CAACCC TCC CGT ACA GGT AAT GCA GGC CGT CGC GGT GAT CTT GGC TCT CTT GCG GCG CGCGGG AGG GCA TGT CCA TTA CGT CCG GCA GCG CCA CTA GAA CCG AGA GAA CGC CGC GCGGTT GCT GCA CAG TTT CCC GCT TGA GGA TCG AAG CTTCAA CGA CGT GTC AAA GGG CGA ACT CCT AGC TTC GAASEQ ID NO.8N端-VSNVRGDLQVLAQKAERVLPPGETQVQRRQHTDISFILDRFVQFELEFMVPSRVSNVRGDLQVLAQKAERVLPGSLVMTGNAGRRGDLGSLAARVAAQFPAPGETQVQRRQHTNVGFIMDRFVQFELEFMVPSRTGNAGRRGDLGSLAARVAAQFPAZGSKL-C端
權(quán)利要求
1.抗O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒二價(jià)多肽疫苗，其特征在于抗O型FMDV抗原多肽采用O型口蹄疫病毒VP1蛋白中21～40、141～160位氨基酸肽段，并組成141～160AA-21～40AA-141～160AA的串聯(lián)結(jié)構(gòu)；抗A型FMDV抗原多肽采用A型口蹄疫病毒VP1蛋白中21～40、138～160位氨基酸肽段，并組成138～160AA-21～40AA-138～160AA的串聯(lián)結(jié)構(gòu)；并在肽段連接處加入2個(gè)氨基酸(Pro-Gly)和11個(gè)氨基酸(Gln-Phe-Glu-Leu-Glu-Phe-Met-Val-Pro-Ser-Arg)多肽作為接頭構(gòu)成串聯(lián)重復(fù)多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽疫苗，其特征在于將抗O型FMDV結(jié)構(gòu)為141～160AA---21～40AA-141～160AA的抗原多肽和抗A型FMDV結(jié)構(gòu)為138～160AA-21～40AA-138～160AA的抗原多肽連結(jié)成融合蛋白，其結(jié)構(gòu)分別為138～160AA-21～40AA-138～160AA-141～160AA-21～40AA-141～160AA的融合蛋白或141～160AA-21～40AA-141～160AA-138～160AA-21～40AA-138～160AA的融合蛋白，兩個(gè)抗原多肽間的接頭氨基酸序列為Gly-Ser-Met-Leu。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽疫苗，其特征在于具有串聯(lián)結(jié)構(gòu)的O型口蹄疫病毒FMDV抗原基因序列為SEQ ID NO.1，其編碼的抗原多肽氨基酸序列為SEQ IDNO.2；A型口蹄疫病毒FMDV抗原基因序列為SEQ ID NO.3，其編碼的抗原多肽氨基酸序列為SEQ ID NO.4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽疫苗，其特征在于抗O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒抗原基因序列一種為SEQ ID NO.5，其編碼的抗原多肽氨基酸序列為SEQ IDNO.6。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽疫苗，其特征在于抗O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒抗原基因序列另一種為SEQ ID NO.7，其編碼的抗原多肽氨基酸序列為SEQ IDNO.8。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽疫苗，其另一特征是上述FMDV抗原多肽中21～40AA肽段可任意改動(dòng)1個(gè)氨基酸；141～160AA或138～160肽段可任意在各個(gè)肽段中改動(dòng)1-5個(gè)氨基酸。
7.一種O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒多價(jià)疫苗的制備方法，包括基因制備、重組及融合蛋白的表達(dá)，其特征在于具體步驟如下(1)用化學(xué)合成方法合成編碼O型口蹄疫病毒VP1蛋白21～40、141～160位氨基酸的DNA序列，以及編碼A型口蹄疫病毒VP1蛋白21～40、138～160位氨基酸的DNA序列，并在DNA水平上連接成完整抗原基因，構(gòu)成融合基因；(2)將上述融合基因插入表達(dá)質(zhì)粒載體，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株；(3)將菌株置于細(xì)菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度在30℃到37℃之間，培養(yǎng)時(shí)間8至25小時(shí)。然后收集菌體；(4)若步驟(2)中所用質(zhì)粒為原核表達(dá)質(zhì)粒，則將步驟(3)中收集菌體破碎，離心收集表達(dá)的融合蛋白；(5)若步驟(2)中所用質(zhì)粒為真核表達(dá)質(zhì)粒，則抽提質(zhì)粒DNA，用于直接射豬，牛、羊等家畜。
全文摘要
本發(fā)明是一種抗O型和A型口蹄疫病毒的二價(jià)多肽疫苗，用化學(xué)合成法合成編碼O型口蹄疫病毒VP1蛋白中21ヘ40、141ヘ160位氨基酸的小肽基因，將其組成串聯(lián)結(jié)構(gòu)；編碼A型口蹄疫病毒VP1蛋白21ヘ40、138ヘ160位氨基酸的小肽基因，將其組成串聯(lián)結(jié)構(gòu)；加入編碼適當(dāng)氨基酸多肽的核苷酸作為接頭，然后將這兩個(gè)串連重復(fù)序列連接構(gòu)成一編碼O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒VP1蛋白主要抗原決定簇的融合基因，將此融合基因插入表達(dá)載體，經(jīng)發(fā)酵制備成疫苗，該疫苗安全性好，效果顯著，對豚鼠有理想的保護(hù)效果。
文檔編號A61K39/125GK1541710SQ20031010850
公開日2004年11月3日 申請日期2003年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月7日
發(fā)明者鄭兆鑫, 嚴(yán)維耀, 易建中, 劉明秋, 朱彩珠, 陳維灶, 盛祖恬 申請人:復(fù)旦大學(xué)