專利名稱：用重組口蹄疫疫苗基因表達蛋白建立檢測罹病牲畜口蹄疫病毒抗體的技術的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及口蹄疫罹病牲畜病毒抗體的檢測技術，特別是涉及無口蹄疫病毒參與的檢測方法。用一種口蹄疫病毒(FMDV)重組疫苗基因表達的蛋白檢測罹病牲畜FMDV抗體的技術。即將體外重組技術克隆或合成FMD疫苗基因(合成單價、多價多肽疫苗基因、亞單位疫苗基因和非結構蛋白基因等)使其在所構建的表達載體系統(tǒng)中高效表達，產生具有免疫原性的蛋白。經免疫印跡(Western-blotting)分析，其表達蛋白如顯示具有免疫學活性，從而可用該重組蛋白作為抗原來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的使用病毒轉染細胞制備的抗原，這樣可能避免傳統(tǒng)檢測FMDV抗體中制備免疫抗原發(fā)生的病毒擴散的危險性，而且價格低廉。
2.背景技術1口蹄疫(Foot and mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot andmouth disease virus，FMDV)感染引起的偶蹄類動物共患的一種急性、烈性傳染病，以流行廣、傳播快、發(fā)病率高而著稱(殷震，劉景華，動物病毒學[M].第2版.北京科學出版社，1997)。由于豬、牛、羊等主要家畜均可感染此病并形成全球規(guī)模流行，危害性、破壞性極大，故被聯合國糧農組織和國際獸醫(yī)局(IEO)列為必須報告和互相通報、采取措施共同防范的16種A類傳染病之首(Wong H T，Cheng S C，Chan E W，et al，Virology，2000 Dec 5，278(1)27-35.；Chan E W，Wong H T，Cheng S C，et al，Vaccine，2000，19(4-5)538-546.)?？谔阋叩奈：π院艽螅蓢乐赜绊懶竽翗I(yè)生產和動物及其產品的國際貿易，給國民經濟造成巨大的損失，故有“政治經濟病”之稱。由此可知控制和消滅該病的前提—口蹄疫的快速檢測就顯得尤為重要。最初檢測和鑒定FMDV的方法是動物交叉感染試驗，隨著實驗動物(主要是豚鼠和乳鼠)和細胞培養(yǎng)在病毒研究中的應用，建立了許多種FMDV的檢測方法，包括補體結合試驗、中和試驗、凝集試驗等(Chan E W，Wong H T，Cheng SC，et al，Vaccine，2000，19(4-5)538-546.；De prat-Gray G，ArchBiochen Biphys，1997，34199(2)360-369)。近年來，隨著FMD研究的深入，其診斷技術也有了一定的發(fā)展(Kupper H，Keller W，KerzC，et al，Nature，1981，Feb.12，vol.289555-559.；Suryanarayana VV S，et al.E.Coli，ArchVirol，1999，1441701-1712.；Carland A J.，Vaccine，1999，Mar2617(13-14)1760-1766.；Barnett PV，Samuel AR，Statham RJ.，Vaccine，2001，19(15-16)2107-2117.)。
目前我國對牲畜FMDV抗體檢測的方法中，抗原制備均采用病毒接種細胞培養(yǎng)物制備免疫抗原的途徑。這樣就存在病毒擴散的危險，并且用于檢測的抗原和抗體的獲得均需花費很大的人力、物力和財力，還要在密閉的嚴格的隔離區(qū)進行，因而檢測試劑盒非常昂貴(Volpina O M，Yarov A V，Zhmak M N，et al.，vaccine，1996，14(14)1375-1380.)。為了避免病毒擴散的危險性，降低檢測成本，我們利用重組口蹄疫基因(包括單價、多價合成多肽基因、亞單位基因及非結構蛋白基因)表達的蛋白作為免疫性抗原，便大大減少了這種危險性。
3.發(fā)明內容本發(fā)明的一個目的是提供一種重組O型、或A-O型雙價口蹄疫多肽基因所表達的蛋白，且該蛋白可作為免疫性抗原用于檢測口蹄疫病毒。
本發(fā)明的另一個目的是提供利用此類具有免疫原性的抗原檢測口蹄疫病毒的改進的酶聯免疫法(ELISA)。
研究表明FMDV VP1功能區(qū)包含FMDV的主要抗原位點，特別是在位點1，即141～160和200～213位氨基酸殘基組成FMDV的主要抗原區(qū)，能誘導動物產生中和抗體。我們利用基因工程的方法構建了FMDV VP1編碼基因的第141～160和200～213位氨基酸多肽疫苗基因，在原核系統(tǒng)中進行表達，進一步純化表達產物，以這種表達蛋白的免疫原性進行了免疫印跡分析，建立了O型口蹄疫病毒抗體的快速診斷方法。同時，本方法的建立又對進一步研究FMDV結構蛋白VP1的結構和功能以及新型疫苗的研制十分有幫助。
根據研究結果，我們認為該檢測方法適用范圍廣，它不僅可以檢測單一型的口蹄疫病毒(比如O型)抗體，而且還可以通過構建表達其它型(例如A、C等型)及多價的口蹄疫病毒重組抗原蛋白用于不同血清型的檢測。
本發(fā)明還提供了一種利用口蹄疫疫苗基因工程產品為抗原檢測口蹄疫病毒的改進的酶聯免疫法，包括間接酶聯免疫法(IndirectiveELISA)、斑點酶聯免疫法(Dot blot ELISA法)。該方法包括(1)設計與合成O型口蹄疫病毒VP1編碼基因的第141～160和200～213位氨基酸多肽片段，將其串連后與一種載體相連，構建原核表達載體；(2)將所構建的表達載體導入生產型宿主菌中高效表達，并且純化后經Western blotting分析篩選陽性產物；(3)以此陽性產物為免疫原性抗原建立間接和斑點酶聯免疫法。
由于ELISA的聚苯乙烯微量反應板(簡稱酶聯板)比較昂貴且不宜反復使用，并需在酶聯儀上測讀，應用受到限制。Dot blot ELISA法是以硝酸纖維素膜(也可用混合纖維素膜)代替酶聯板，價錢便宜，重復性好，具有較高的敏感性，有更強的結合抗原的能力，且有所需樣品少、白色背景容易用目測分辨陽性和陰性結果、適合于基層和野外操作等優(yōu)點。
建立FMD檢測的診斷方法，就要考慮用何種方法大量生產診斷抗原。本發(fā)明應用分子生物學技術，成功地合成了FMDV VP1基因中具有免疫原性的多肽片段，并將其亞克隆入表達載體pET-28a中，轉化大腸桿菌BL21菌株，使合成的多肽疫苗基因與綠色熒光蛋白(Green fluorescence protein，GFP)基因形成融合基因，表達出了融合蛋白，純化后經聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分析，得到了一條分子量為30KD的特異性蛋白帶。Western blotting分析表明該蛋白能與FMDV陽性血清發(fā)生反應，說明表達產物具有較好的免疫原性。這為建立以口蹄疫基因工程產品為抗原，檢測FMDV提供了材料，為發(fā)展我國擁有自主知識產權的FMDV診斷技術奠定了基礎。
4.


圖1.O型口蹄疫多肽與GFP融合基因構建的原核表達載體5.具體實施方式
實施例1.重組O型口蹄疫多肽疫苗融合基因構建及測序將O型口蹄疫多肽疫苗基因(由BioAsia上海博亞生物技術有限公司根據O型病毒的O58(GeneBank號FDI131469)序列的VP1蛋白的第140-160氨基酸和200-213氨基酸組成的多肽，即O58型病毒的VP1蛋白的20肽、14肽相串聯起來的多肽合成)構建到原核表達載體pET-28a中(Novagen公司)并測序，以確認基因構建的正確性，將O型口蹄疫多肽疫苗基因(200bp)片段經酶切后與酶切的綠色熒光蛋白基因(GFP)相連接于pET-28a中，形成融合基因。1.提取pEGFP-N1(含GFP基因，來自CLONTECHLaboratories Inc)和pET-28a質粒按Sambrook等(1989)堿法制備pET-28a和pEGFP-N1質粒(1)隨機挑取大腸桿菌BL21的單菌落(已導入目的質粒)，分別接種于3mL含卡那霉素100mg/L的LB細菌培養(yǎng)基(酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCL 10g/L，pH 7.0)中37℃搖動過夜。
(2)在1.5mL的Eppendorf管中，12000rpm離心2min，重復一次，收集3mL菌體。
(3)加入100μL溶液I(25mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris.Cl，pH8.0，10mmol/L EDTA)，震蕩均勻。
(4)加入200μL溶液II(0.2mmol/L NaOH，1％SDS)，顛倒離心管數次混合內容物，放置冰上3min。
(5)加入150μL溶液III(5mmol/L醋酸鉀60mL，冰醋酸11.5mL，蒸餾水28.5mL)，混合均勻，放置冰上。
(6)12000rpm離心10min，取上清移至新的Eppendorf管中。
(7)加入等體積酚∶氯仿(1∶1)，充分混合，12000rpm離心5min，取上清。
(8)加入1/10體積3mol/L醋酸鈉(pH 5.2)和兩倍體積預冷的無水乙醇，-20℃放置30min。
(9)離心棄上清，冰預冷的70％乙醇洗沉淀兩次，充分吹干。
(10)加入50μL TE(pH8.0)，溶解pET-28a和pEGFP-N1質粒DNA，以待下一步連接之用。2.綠色熒光蛋白基因(GFP基因750bp大小)的獲得以pEGFP-N1(內含GFP基因，已成為一種商品化的基因，來自CLONTECHLaboratories Inc.)為模板、利用下列引物，進行PCR擴增，擴增出GFP基因。
EcoRI5’GCTGAATTCATGAGTAAAGGAGAAGAACTTSalI5’GCGGTCGACTTATTATTTGTATAGTTCATPCR反應體系10XPCR緩沖液5μL，10mM dNTP 4μL，Pfu DNA聚合酶2U，引物1(30ng/μL)2μL，引物2(30ng/μL)2μL，pEGFP-N1質粒DNA 0.1μL，加水到總體積至50μL，上述成份均加入到0.5mLPCR管，混均后覆蓋一層無菌石蠟油(20-30μL)。
PCR程序為95℃預變性5min；然后94℃變性1min，65℃復性1min，72℃延伸3min，循環(huán)25次。反應結束后取10μL PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
對擴增產物進行酚/氯仿抽提純化。
(1)加入等體積酚∶氯仿(1∶1)，充分混合，12000rpm離心5min，取上清。
(2)加入1/10體積3mol/L醋酸鈉(pH5.2)和兩倍體積預冷的無水乙醇，-20℃放置30min。
(3)離心棄上清，冰預冷的70％乙醇洗沉淀兩次，充分吹干，得到GFP基因的PCR產物片段。3.口蹄疫多肽疫苗基因(200bp大小)的獲得根據O型病毒的O58(GeneBank號FDI131469)序列的編碼VP1蛋白的第140-160氨基酸和200-213氨基酸的核苷酸序列(楊永欽等，1997；Dus Santos MJ，2002)，由BioAsia上海博亞生物技術有限公司合成O型口蹄疫多肽疫苗基因，即編碼O58型病毒的VP1蛋白的20肽、14肽相串聯起來的多肽的核苷酸序列，獲得O型口蹄疫多肽疫苗基因(200bp大小)。4.融合基因的構建及克隆(1)片段及質粒酶切將上海博亞生物技術有限公司合成的O型口蹄疫多肽疫苗基因片段的PCR產物經檢測大小為200bp，即與預期的口蹄疫多肽疫苗基因大小相符合，初步表明它是合成的口蹄疫多肽疫苗基因。用限制性內切酶NcoI和EcoRI酶切。
然后再將GFP基因(為750bp)擴增產物用限制性內切酶EcoRI和SalI酶切。
將質粒pET-28a利用限制性內切酶NcoI和SalI酶切。
(2)片段電泳回收為將上述O型口蹄疫多肽疫苗基因PCR擴增后酶切的片段及綠色熒光蛋白基因PCR擴增后酶切的片段進行連接，從電泳的凝膠上切下這些片段，利用玻璃奶回收試劑盒進行。其中合成O型口蹄疫多肽疫苗基因擴增后酶切片段為200bp大小，GFP基因擴增后酶切片段為約750bp大小。
(3)連接將上述合成的O型口蹄疫多肽疫苗基因擴增后酶切片段和GFP基因的擴增后酶切片段及進行了NcoI和SalI酶切的PET-28a各取1μL加入無菌的0.5mL小離心管中，加入3μL連接緩沖液I(大連寶生生物公司)及T4DNA連接酶混勻，放于-16℃連接過夜，得到合成的O型口蹄疫多肽疫苗基因片段和GFP基因的連接到PET-28a上的連接產物。
(4)轉化(a)轉化用感受態(tài)大腸桿菌的制備挑取BL21的單菌落于10mL液體LB培養(yǎng)基中，37℃ 250rpm培養(yǎng)過夜。
取1mL培養(yǎng)菌液加到100mL新鮮LB培養(yǎng)基中，37℃ 300rpm培養(yǎng)3h左右至OD600值為0.5-0.6。
冰浴菌液30min，4℃ 6000rpm離心5min，收集菌體。
棄掉上清，加入10mL冰浴無菌的0.1mol/L CaCl2溶液中懸浮菌體細胞，冰浴15min。
4℃ 6000rpm離心5min。
棄掉上清，將菌體重懸于2mL 0.1mol/L CaCL2溶液中。
分裝到預冷的1.5mL無菌Eppendorf管中(200μL/管)，加入15％的無菌甘油于-70℃貯存?zhèn)溆谩?br> (b)大腸桿菌的轉化將O型口蹄疫多肽疫苗基因片段和GFP基因的連接到PET-28a上的連接產物通過熱激法轉化感受態(tài)大腸桿菌BL21。
取1μL的O型口蹄疫多肽疫苗基因片段和GFP基因的連接到PET-28a上的連接產物加到200μL BL21感受態(tài)細胞溶液中，混勻后，冰浴30min。
42℃水浴熱激90sec，立即置冰浴中1-2min。
加入800μL LB液體培養(yǎng)基，37℃ 150rpm搖床培養(yǎng)1h。
在Kan(100mg/L)LB固體平板上，涂布40μL X-gal(20μg/μL)和4μL IPTG(200μg/μL)溶液。
從1mL轉化菌液中取100μL菌液涂布于平板上，風干。
37℃培養(yǎng)16小時，平板上出現蘭色和白色菌落，挑取白色菌落進行重組克隆的鑒定。鑒定結果表明，帶有目的基因的原核表達載體已導入到生產型原核表達宿主菌BL21中，將其命名為pET28a-21(見圖1)。5.轉化子鑒定(1)電泳法鑒定按常規(guī)堿裂解法提取轉化菌落的質粒pET28a-21，通過電泳確定質粒的大小，提取的質粒大于原始的PET-28a質粒，為克隆有目的基因的候選質粒(比對照質粒增大)。
進一步用限制性內切酶NcoI和EcoRI酶切進行驗證，電泳檢測切出片段在200bp的為含有O型口蹄疫多肽疫苗基因片段的質粒pET28a-21。
(2)測序法鑒定將含有pET28a-21質粒的菌株用甘油管保存，并交測序公司測序，測序引物為PET-28a質粒上的T7啟動子區(qū)的引物，即T7引物。得到SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列，表明目的基因已正確插入表達載體pET28a(Novagen)中。其中有下劃線區(qū)域為O58多肽的編碼區(qū)(正體是第140-160序列20肽，斜體是第200-213序列14肽)，方框區(qū)域為O86多肽編碼區(qū)(正體是第140-160序列20肽，斜體是第200-213序列14肽)，黑色小寫為PET載體的序列，其余為GFP基因的序列。所構建的原核表達載體見圖1。實施例2.原核表達產物免疫原性的檢測首先將構建好的pET28a-21原核表達載體進行誘導表達并進行蛋白純化(方法按pET技術說明書(Novagen公司)進行)，然后檢測口蹄疫多肽疫苗及綠色熒光蛋白的融合基因的表達產物的免疫原性。
1.蛋白純化(1)將含有pET28a-21的大腸桿菌BL21經IPTG誘導后培養(yǎng)液在4℃、6500g條件下離心15min，以收集菌體，去上清(大腸桿菌IPTG誘導培養(yǎng)方法參照Sambrook的[分子克隆])。
(2)用原培養(yǎng)液1/10體積的1XIB緩沖液(20mmol/LTris-HCl，pH7.5，10mmol/L EDTA，1％TritonX-100)重懸沉淀。
(3)溶菌酶加超聲裂解加入溶菌酶至終濃度100μg/mL，30℃放置15min。攪拌后將樣品緩沖液置于冰浴中，利用超聲儀(國產新芝牌)，200-300W功率，按1秒鐘超聲，3秒種間隔的方式進行60-90次。
(4)加入蛋白酶抑制劑(PSMF)。
(5)在4℃下，10000g離心10min。
(6)去上清，用原培養(yǎng)液1/10體積的1XIB緩沖液重懸沉淀。
(7)重復步驟(6)。
(8)重復步驟(6)，將懸液移入已知重的離心管中。
(9)4℃ 10000g離心10min。徹底去上清。稱重，計算產量。
2.SDS-PAGE電泳SDS-PAGE電泳檢測對上述表達產物按常規(guī)方法進行SDS-PAGE電泳，分離膠濃度8％，考馬斯亮蘭R-250染色，甲醇-乙酸脫色。
結果表明，上述純化蛋白大小大于30KD，即大于GFP蛋白的大小，初步確認是含有pET28a-21的大腸桿菌表達的含有O型口蹄疫多肽疫苗基因和GFP基因融合表達的目的蛋白。
3.Western blotting分析溶液的配制(1)電轉移緩沖液含39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris·HCL(pH6.8)，037％SDS，20％甲醇；配制1000mL稱取甘氨酸2.9g，Tris堿5.8g，SDS 0.37g，溶解于750mL重蒸水后，加入200mL甲醇，定容至1000mL。
(2)洗液溶液150mmol/L NaCL，50mmol/L Tris·HCL pH7.5；(3)封閉液10mL PBST+0.3g BSA；(4)0.5％氨基黑10B染液稱取氨基黑10B 0.5g，加入甲醇45mL，冰乙醇10mL，重蒸水45mL；(5)氨基黑漂洗液45mL 95％的乙醇，5mL冰乙酸，50mL無離子水；(6)底物溶液(30mL)30mL PBST中溶解15mg的DAB(二氨基聯苯胺)和9mg CoCL2，再加入10μL 30％H2O2。
電轉移
(1)戴上手套，剪6張與上述檢測口蹄疫多肽疫苗及綠色熒光蛋白基因融合表達產物的SDS-PAGE電泳凝膠(用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠濃度8％)大小一致的濾紙及一張NC膜，并用轉移緩沖液浸泡3-5min。
(2)依次將海綿、濾紙3張、上述凝膠、NC膜、濾紙3張、海綿放好，然后用篩孔板固定好，插入電轉移槽中，加入轉移緩沖液，確定凝膠在陰極，NC膜在陽極方向。接通電源，電壓為50-100V，4℃下電泳2-3h。
(3)電轉移完畢，取出經過電轉移的NC膜，用鉛筆或剪去一角以標記膜的方向。切下標準分子量Marker，置氨基黑染液浸染5min，取出后用漂洗液脫色，直至藍色背景脫盡。其余NC膜用PBS沖洗，加10mL封閉液浸泡，室溫震蕩1-3h，以封閉未吸附蛋白質的位點。
免疫學檢測(1)封閉結束后，將經過電轉移的NC膜用PBS漂洗液漂洗4-5次，每次5min。
(2)將經過電轉移的NC膜轉至一塑料袋內，加入PBST 1∶800稀釋的口蹄疫病毒陽性血清10mL(0.1mL/cm2)，封口。37℃輕微震蕩結合1.5h，用PBST沖洗4-5次，每次在搖床緩慢搖動。然后加入1∶800稀釋的兔抗豬IgG(二抗)，室溫下輕搖孵育1h，取出用PBST沖洗3-4次，每次10min。以除去未結合的二抗。
(3)將經過電轉移的NC膜轉入到底物溶液，室溫避光輕搖5-10min，觀察顯色情況，等出現條帶時，立即轉入PBST緩沖液終止反應。室溫保存，照相。
4.結果經Western blotting分析，純化蛋白能被口蹄疫陽性血清所識別，證明表達產物具有免疫學活性?？梢宰鳛槊庖咝栽\斷抗原。實施例3.用重組口蹄疫多肽疫苗基因表達蛋白檢測口蹄疫病毒抗體1.用Dot blot ELISA法檢測O型口蹄疫病毒抗體用Dot blot ELISA法檢測口蹄疫病毒，方法簡單、快捷，無需昂貴的設備。是一種易于普及的方法。其程序如下(1)將硝酸或醋酸纖維素膜用打孔機間隔一定距離打5mm孔徑的孔痕。
(2)用制備緩沖液按1∶10-1∶3(w/v)用量稀釋純化抗原(即口蹄疫多肽疫苗與綠色熒光蛋白的融合基因表達蛋白)，滴在圓孔中央，每孔加1滴(約2-4μL)，自然干燥后，于封閉液(含0.25％BSA的PBST)中浸泡30min。
(3)取出膜置于室溫下干燥。再浸入適當稀釋的被檢血清中，室溫浸泡1h。
(4)將膜置于PBST中輕微蕩洗3次，每次3min。
(5)用稀釋液過氧化物酶(HRP)標記的抗種屬動物的球蛋白抗體結合物適當稀釋，并將膜于此液中浸泡1.5h，同步驟(4)洗滌，于鄰苯二胺底物溶液中浸泡5-15min顯色，用蒸餾水漂洗2min終止反應。試驗時須設陰性血清、陽性血清及空白三種對照。
(6)結果判定出現顏色判陽性，無色為陰性。
2.用間接ELISA法檢測O型口蹄疫病毒抗體器材酶標儀，96孔酶標板，濾紙，恒溫培養(yǎng)箱試劑(1)包被緩沖液0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.6(2)洗滌液0.02mol/L PBST緩沖液，pH7.4(3)封閉液稱取1g BSA溶于0.01mol/L PBST緩沖液中。
(4)抗原即口蹄疫多肽疫苗及綠色熒光蛋白的融合基因表達蛋白(5)酶結合物即HRP標記的抗種屬動物的球蛋白抗體(亦稱第二抗體)。
(6)底物溶液為含有鄰苯二胺(Orth-Phenyenediamine，OPD)的pH5.0磷酸鹽—檸檬酸緩沖液。0.2M20μL 0.5mol/L H2O2磷酸氫二鈉(28.4g/L)溶液25.7mL加0.1M檸檬酸(19.2g/L)溶液24.3mL和蒸餾水50mL。臨用前取上述緩沖液100mL加40mg OPD，再加30％過氧化氫(H2O2)0.15mL。
(7)終止液0.5mol/L H2SO2材料 待測血清步驟(1)包被在酶標板內每孔中加入100μL溶于包被液的抗原(即重組表達的蛋白)溶液(1-5ng/mL)，4℃過夜或37℃溫育3h。
(2)洗滌棄去包被液，用PBST洗3次，每次200μL?？鄹蒔BST清洗液。
(3)封閉每孔中加入封閉液200μL，37℃溫育30min。
(4)洗滌同步驟2。
(5)加樣每孔加入用稀釋液(PBST)稀釋的待測血清100μL，置于37℃ 1h。每塊板同時設陰性血清對照、試劑空白對照。
(6)洗滌同步驟2。
(7)加入酶結合物每孔加入100μL酶結合物，37℃放置1h。
(8)洗滌同步驟2。
(9)顯色每孔加入底物溶液100μL，蓋上酶標板蓋，室溫放置15min。此時陽性對照應呈綠色。
(10)終止反應每孔加入50μL 2mol/LH2SO4，輕輕搖動酶標板，終止反應。
(11)在酶標儀上測定波長490nm下的光密度值。
(12)繪制標準曲線，從中查出待測樣品的濃度，計算樣品含量。以被檢樣品OD值＞陰性對照平均OD值加2-3個標準差作為陽性結果的閾值。被檢樣品OD值＞閾值為陽性，＜閾值為陰性。SEQ ID NO 1的信息序列特征(A)(長度)952個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)(拓撲結構)線性序列描述SEQ ID NO 1attcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccATGGTGACCAAAGTGAGAGGCGATCTGCAGGTGCTGGCGCAGAAAGCGGCACGCTCTCTGCCGAGACATAAACAGAAGATTGTGGCACCAGGCAAACGCCTGCTG GAATTCATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCACTTATGGTGTTCAATGCTTTTCAAGATACCCAGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTCAGGAAAGAACTATATTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCNTTGTTAATAGAATCGAGTTTAAAAAAGGTATTGGATTTTTAAAAGAAGATGGGGAAACCATTTTTTGGGACACAAAAATTGGGAATACAACTATTAACTTCACACCAATGGTATNACATTCATTGGCAAGACNAAAACAAT
其中有下劃線區(qū)域為O58多肽的編碼區(qū)(正體是第140-160序列20肽，斜體是第200-213序列14肽)，方框區(qū)域為O86多肽編碼區(qū)(正體是第140-160序列20肽，斜體是第200-213序列14肽)，黑色小寫為PET載體的序列，其余為GFP基因的序列。
權利要求
1.本發(fā)明涉及用一種口蹄疫(Foot and mouth disease，FMD)重組口蹄疫疫苗基因建立的FMD抗體檢測技術，該技術首先使重組疫苗基因在自己構建的表達載體系統(tǒng)中高效表達，生產出具有免疫原性的蛋白，然后使用該表達蛋白作為免疫性抗原來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的用病毒轉染細胞所制備的免疫抗原，建立安全、價格低廉的FMDV的檢測技術。
2.權利要求1所述的重組口蹄疫疫苗基因包括單價合成肽疫苗基因、多價合成肽疫苗基因，也可以是用基因克隆方法從口蹄疫病毒中分離的亞單位疫苗基因或其他有用的序列，如VP1或非結構蛋白3A、3B、3C等序列，在FMD的檢測中用以代替滅活病毒蛋白。
3.一種生產權利要求1所述具有免疫原性蛋白的生產方法，其特征在于，用權利要求2所述的重組序列，構建原核表達載體，導入生產性宿主菌中，使轉化菌種中的重組基因表達為蛋白，經蛋白純化，得到具有免疫原性的口蹄疫重組抗原蛋白。
4.權利要求1所述的安全、價格低廉的FMD檢測方法是以表達產物純化后的重組抗原蛋白，經Western-blotting分析顯示為陽性結果的作為免疫性抗原，并用其建立了簡而易行的Dot blot ELISA或間接ELISA酶聯免疫檢測FMDV抗體的方法。這種重組免疫性抗原蛋白的使用避免了傳統(tǒng)FMDV檢測中用病毒轉染細胞來制備免疫抗原的過程，杜絕了病毒擴散的危險，也降低了檢測成本。
全文摘要
本發(fā)明涉及用一種口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus，FMDV)重組基因表達的蛋白檢測罹病牲畜FMDV抗體技術。其特征在于，利用體外重組技術克隆或合成FMD疫苗基因(合成單價、多價多肽疫苗基因、亞單位疫苗基因和非結構蛋白基因等)，使其在一定表達載體系統(tǒng)中高效表達，產生具有免疫原性的蛋白。經免疫印跡(Western－blotting)分析，其表達蛋白產物能被FMDV陽性血清所識別，顯示該蛋白具有免疫學活性，從而可用該重組蛋白作為具有免疫原性的抗原來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的使用病毒轉染細胞制備的抗原，這樣便可避免傳統(tǒng)檢測FMDV抗體中制備免疫抗原時容易發(fā)生的病毒擴散的危險性，因而更加安全，而且價格低廉。
文檔編號C07K14/09GK1467297SQ03100579
公開日2004年1月14日 申請日期2003年1月20日 優(yōu)先權日2003年1月20日
發(fā)明者周長生, 張勇, 陶玲, 陳正華 申請人:甘肅亞盛鹽化工業(yè)集團有限責任公司