一株豬傳染性胃腸炎病毒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一株豬傳染性胃腸炎病毒弱毒株HB08株及其應(yīng)用。本發(fā)明弱毒株的微生物保藏號(hào)是：CGMCC?No.7807。本發(fā)明TGEV弱毒株安全性好，該毒株對(duì)妊娠母豬、仔豬等各年齡豬均安全。本發(fā)明弱毒株對(duì)3日齡仔豬的主動(dòng)保護(hù)率達(dá)100%，被動(dòng)保護(hù)率達(dá)97.2%，表明本發(fā)明對(duì)于豬傳染性胃腸炎具有良好的免疫保護(hù)效果。
【專利說(shuō)明】一株豬傳染性胃腸炎病毒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株豬傳染性胃腸炎病毒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]豬傳染性胃腸炎(porcinetransmissible gastroenteritis, TGE)是引起豬腹瀉的一種重要接觸性病毒性腸道傳染病，發(fā)病快，對(duì)2周齡以內(nèi)仔豬有高度致死率，幾乎能達(dá)到100%。5周齡以上的豬病死率較低，但是由于腹瀉的影響，生長(zhǎng)慢，飼料報(bào)酬低，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。該病1946年由Doyle 等人確定了病原。從60年代末起，我國(guó)許多省市有該病流行。
[0003]該病自流行以來(lái)，國(guó)內(nèi)外專家做了很多工作，目前，還沒(méi)有特效的制劑抵抗豬傳染性胃腸炎病毒，臨床上多采用對(duì)癥療法以減輕癥狀和降低死亡率。國(guó)內(nèi)外有使用疫苗的報(bào)道，接種途徑不一，效果也不是很滿意。尤其近幾年，豬腹瀉病對(duì)養(yǎng)豬業(yè)已經(jīng)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。除了進(jìn)一步加強(qiáng)飼養(yǎng)管理外，研制出一種能夠有效防制豬傳染性胃腸炎的疫苗迫在眉睫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一株豬傳染性胃腸炎病毒及其應(yīng)用。該弱毒株遺傳穩(wěn)定、安全性好，用其制備的疫苗對(duì)于豬傳染性胃腸炎具有良好的保護(hù)效力。
[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的:
從河北省某豬場(chǎng)送檢豬傳染性胃腸炎陽(yáng)性的病料中分離到TGEV。將分離到的豬傳染性胃腸炎病毒在ST細(xì)胞上連續(xù)傳代120代，并在此過(guò)程進(jìn)行了克隆純化，然后繼續(xù)在ST細(xì)胞上傳代至165代。將第165代病毒進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，擴(kuò)增S基因片段為886bp。從第125代開(kāi)始0RF3基因連同前面的間隔區(qū)序列出現(xiàn)81個(gè)核苷酸的缺失(起始密碼子前30個(gè)核苷酸、后51個(gè)核苷酸連續(xù)81個(gè)核苷酸缺失)，第125代、145代、165代穩(wěn)定缺失81個(gè)核苷酸。
[0006]致弱性試驗(yàn)結(jié)果表明，從第125代開(kāi)始，TGEV對(duì)仔豬失去致病性；將TGEV 145代種毒在豬體連傳5代，毒力依然很穩(wěn)定，沒(méi)有任何返強(qiáng)現(xiàn)象。
[0007]經(jīng)鑒定，分離到的病毒株為豬傳染性胃腸炎病毒新病毒株，將125~165代致弱毒株種毒命名為豬傳染性胃腸炎病毒HB08株，并于2013年06月28日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏登記號(hào)為=CGMCC N0.7807。
[0008]本發(fā)明還提供含有所述毒株的豬傳染性胃腸炎病毒活疫苗。
[0009]在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，所述的活疫苗中，豬傳染性胃腸炎病毒弱毒株HB08株的含量為≥IO5.0 TCID50M。
[0010]本發(fā)明還提供所述毒株在制備治療豬傳染性胃腸炎病毒感染藥物中的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明弱毒株的安全性好，安全試驗(yàn)結(jié)果表明，該毒株對(duì)妊娠母豬、仔豬等各年齡豬均安全。[0012]本發(fā)明對(duì)3日齡仔豬的主動(dòng)保護(hù)率達(dá)100%，被動(dòng)保護(hù)率達(dá)97.2%，而對(duì)照組的發(fā)病率達(dá)100%，表明本發(fā)明對(duì)于豬傳染性胃腸炎具有良好的免疫保護(hù)效果，該效果已高于國(guó)內(nèi)TGEV華毒弱毒株的免疫效果。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1 TGEV CPE 圖片(400X)。
[0014]圖2 TGEV分離毒S基因PCR檢測(cè)結(jié)果。圖中，M:DNA marker DL2000 ；1:樣品；2:陰性對(duì)照。
[0015]圖3不同代次TGEV 0RF3序列比對(duì)。
[0016]圖4 TGEV 分離毒 0RF3 基因 PCR 擴(kuò)結(jié)果。圖中，M:DNA marker DL2000 ；1:樣品；
2:陰性對(duì)照。
[0017]圖5 TGEV豬體傳代前與豬體連傳五代后0RF3序列比對(duì)。
【具體實(shí)施方式】
[0018]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0019]實(shí)施例1豬傳染性胃腸炎病毒的分離鑒定 一、豬傳染性胃腸炎病毒的分離
河北某豬場(chǎng)送檢腹瀉豬小腸，取其內(nèi)容物，用RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果為豬傳染性胃腸炎陽(yáng)性。
[0020]取送檢小腸適量，刮取腸粘膜和內(nèi)容物，按照1:5的比例(重量:體積)加入PBS，反復(fù)凍融3次，離心取上清，0.22 μ m濾膜過(guò)濾，濾液中加入終濃度為20 μ g/ml的胰酶，37°C處理1.5小時(shí)。
[0021]按常規(guī)方法接種長(zhǎng)滿單層的ST細(xì)胞(接種前用pH7.4的PBS洗三次)，按照10%的比例接種病毒，37°C吸附I小時(shí)，補(bǔ)足細(xì)胞維持液(含lOPg/ml的胰酶)，37°C溫箱培養(yǎng)。如此操作盲傳至第10代，觀察是否產(chǎn)生CPE。同時(shí)設(shè)置空白細(xì)胞作為對(duì)照。
[0022]盲傳傳至第8代時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)輕微的CPE變化，傳至第17代時(shí)則出現(xiàn)明顯、穩(wěn)定的CPE變化，細(xì)胞圓縮，顆粒增加，聚堆呈葡萄串樣，細(xì)胞出現(xiàn)損傷和脫落(圖1)。
[0023]二、將第17代病毒進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)
參考行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T1446-2010中反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法進(jìn)行(SOP)。即根據(jù) S 基因設(shè)計(jì)檢測(cè)引物對(duì):S-F:5’ -TATTTGTGGTYTTGGTYGTAATGC-3’ ；S-R:5’ -GGCTGTTTGGTAACTAATTTRCCA-3’，以 95°C 45S、50°C 45S、72°C Imin 進(jìn)行 32 個(gè)循環(huán)后，72°C延伸5min。擴(kuò)增S基因片段為886bp，結(jié)果見(jiàn)圖2。
[0024]擴(kuò)增0RF3序列的引物為:
0RF3-F:AATTGAAAAAGTGCACGTCC-3?；
0RF3-R:CAACAGGACCCAGAAAATGA-3，。
[0025]擴(kuò)增的片段的大小為1202bp (圖3)。
[0026]三、病毒含量測(cè)定
將第17代病毒用DMEM維持液進(jìn)行10倍系列稀釋，取10_4、10_5、10_6、10_7 4個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度分別接種長(zhǎng)滿 ST細(xì)胞單層的96孔細(xì)胞板6孔，100 μ I/孔，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照細(xì)胞6孔，37°C 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72~120小時(shí)，觀察細(xì)胞病變，細(xì)胞顆粒增多，圓縮，細(xì)胞破損，脫落判為感染。同時(shí)陰性對(duì)照組細(xì)胞孔應(yīng)不出現(xiàn)細(xì)胞病變。采用Reed-Muench法，計(jì)算TCID5tlt5經(jīng)測(cè)定，病毒含量為105_°TCID5(l/ml。
[0027]四、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
取TGEV、PEDV中和抗體均小于1:8的母豬所產(chǎn)的3~5日齡仔豬5頭，每頭口服2ml第17代病毒，觀察7日，統(tǒng)計(jì)接種豬的發(fā)病情況，對(duì)試驗(yàn)豬進(jìn)行剖檢，觀察病理變化。刮取發(fā)病豬腸粘膜和內(nèi)容物，提取RNA，按實(shí)施例1第二步提到的檢測(cè)S基因設(shè)計(jì)的引物，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，并將PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果仔豬3/5發(fā)病，發(fā)病豬表現(xiàn)為腹瀉，個(gè)別豬出現(xiàn)嘔吐，剖檢觀察發(fā)現(xiàn) 胃和小腸出現(xiàn)典型的病理變化。從發(fā)病豬的腸粘膜及內(nèi)容物中可擴(kuò)增出886bp的片段，經(jīng)序列分析為TGEV S基因。
[0028]經(jīng)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，已成功的從河北某豬場(chǎng)腹瀉豬小腸內(nèi)容物中分離到豬傳染性胃腸炎病毒。
[0029]實(shí)施例2豬傳染性胃腸炎病毒致弱
一、豬傳染性胃腸炎病毒的致弱培育
將分離到的豬傳染性胃腸炎病毒在ST細(xì)胞上連續(xù)傳代120代，并在此過(guò)程進(jìn)行了克隆純化，然后繼續(xù)在ST細(xì)胞上傳代至165代。將第165代病毒進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，擴(kuò)增S基因片段為886bp。
[0030]TGEV 0RF3基因序列在第20代、40代、70代、100代處于比較穩(wěn)定的的狀態(tài)，有個(gè)別堿基的變化，但沒(méi)有改變氨基酸；而第125代開(kāi)始0RF3基因連同前面的間隔區(qū)序列出現(xiàn)81個(gè)核苷酸的缺失(起始密碼子前30個(gè)核苷酸、后51個(gè)核苷酸連續(xù)81個(gè)核苷酸缺失)，第125代、145代、165代穩(wěn)定缺失81個(gè)核苷酸(序列如SEQ ID N0.5所示)。結(jié)果如圖4。
[0031 ] 將第20代、40代、70代、90代、100代、125代、135代、145代、155代及165代病毒分別用DMEM培養(yǎng)液作10倍系列稀釋，各代次取適當(dāng)稀釋度，每個(gè)稀釋度分別接種長(zhǎng)滿ST細(xì)胞單層的96孔細(xì)胞板6孔，100 μ I/孔，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照細(xì)胞6孔，370C 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72~120小時(shí)，觀察細(xì)胞病變。采用Reed-Muench法，計(jì)算TCID5(I。結(jié)果125~165代毒價(jià)較高，均達(dá)到106_5TCID5tZml以上，詳見(jiàn)表1。
[0032]表1 TGEV不同代次病毒含量測(cè)定結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一株豬傳染性胃腸炎病毒弱毒株HB08株，其保藏號(hào)為CGMCC N0.7807。
2.含有權(quán)利要求1所述毒株的豬傳染性胃腸炎病毒活疫苗。
3.如權(quán)利要求2所述的活疫苗，其特征在于，豬傳染性胃腸炎病毒弱毒株HB08株的含量為≥ I O5.0 TCID50/ml。
4.權(quán)利要求1所述毒株在制備治療豬傳染性胃腸炎病毒感染藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K39/225GK103740653SQ201310722168
【公開(kāi)日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】侯艷紅, 王貴華, 趙亞榮, 于萍萍, 劉明明, 盧會(huì)英, 滿坤, 陳翠云 申請(qǐng)人:北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究中心, 北京科牧豐生物制藥有限公司, 福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司, 北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司