專利名稱：一種豬傳染性胃腸炎病毒毒株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物病毒領(lǐng)域，涉及病毒新毒種，具體涉及一種豬傳染性胃腸炎病毒毒株及其生物學(xué)特性。
背景技術(shù)：
2012年I月，鄭州市新鄭市某豬場豬群10頭7日齡豬只先后發(fā)病，其中一頭小豬在發(fā)病兩天后死亡，發(fā)病豬臨床癥狀為嘔吐、嚴(yán)重腹瀉、脫水。采集發(fā)病豬的腸道、淋巴結(jié)，置于冰盒中并在24h內(nèi)送至實驗室。研磨病料，12000 r/min,離心10 min,過濾上清,接種ST細(xì)胞，結(jié)果分離到一株疑似豬傳染性胃腸炎病毒，經(jīng)分子水平鑒定后確定其為HN-2012豬傳染性胃腸炎病毒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種豬傳染性胃腸炎病毒毒株，分類命名豬傳染性胃腸炎病毒 TGEN HN-2012,拉丁文學(xué)名swine transmissible gastroenteritis virus,保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位簡稱CCTCC，保藏單位地址湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號武漢大學(xué)，保藏日期2012年4月13日，保藏編號CCTCC NO :V201216。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種豬傳染性胃腸炎病毒毒株，豬傳染性胃腸炎病毒(swine transmissible gastroenteritis virus), CCTCC NO :V201216o所述的豬傳染性胃腸炎病毒毒株具有下述特點(diǎn)
(I)所述毒株在電鏡下顯示呈圓形，有的呈橢圓形或多邊形。有雙層膜，囊膜上覆有花瓣狀纖突。病毒粒子的直徑為90 200 nm，符合豬傳染性胃腸炎病毒粒子的形態(tài)特征。
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(2)分離的病毒能夠感染ST細(xì)胞，出現(xiàn)典型的病變。(3)經(jīng)豬傳染性胃腸炎病毒陽性血清中和后不能引起細(xì)胞病變。(4)所述毒株對乙醚、氯仿和酸敏感；日光下6 h、紫外線照射均能使其滅活；不凝集雞、豚鼠和小鼠的紅細(xì)胞。(5)病毒的 TCID5tl 為 I(T7 67A). 2mL。(6)所述毒株的核酸類型是單股RNA病毒。(7)利用TGEV N基因的特異性引物對所述毒株進(jìn)行PCR擴(kuò)增并克隆測序，在NCBI上進(jìn)行blast結(jié)果顯示其為TGEV的N基因序列。(S)TGEV N基因全場1171bp，編碼382個氨基酸，同源性結(jié)果分析顯示，所述毒株與美國強(qiáng)毒株代表DQ811785同源性最高，為99. 5%。進(jìn)化樹結(jié)果分析顯示，所述毒株與韓國AF302264毒株是一大分支。HN-2012豬傳染性胃腸炎病毒毒株可應(yīng)用于制備TGEV疫苗的生產(chǎn)毒種。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明的HN-2012豬傳染性胃腸炎病毒滅活后免疫豬只，可以給豬提供有效的保護(hù)，是一株比較理想的制苗候選毒株。


圖1為TGEV N基因的測序結(jié)果，M =Marker 2000 ；1 =TGEV陽性對照；2 :分離樣品；3 :陰性對照；
圖2為TGEV N基因同源性分析；
圖3為TGEV N基因進(jìn)化樹分析。
具體實施例方式2012年I月，鄭州市新鄭市某豬場豬群10頭7日齡豬只先后發(fā)病，其中一頭小豬在發(fā)病兩天后死亡，發(fā)病豬臨床癥狀為嘔吐、嚴(yán)重腹瀉、脫水。其發(fā)病表現(xiàn)與國內(nèi)報道的其他地區(qū)發(fā)病的豬傳染性胃腸炎癥狀大致相似，初步判斷為豬傳染性胃腸炎。采集發(fā)病豬的腸道、淋巴結(jié)，置于冰盒中并在24 h內(nèi)送至實驗室。研磨病料，12000r/min,離心10 min,過濾上清,接種ST細(xì)胞,結(jié)果分離到一株疑似傳染性胃腸炎病毒,用特異性引物進(jìn)行分子鑒定后確定其為豬傳染性胃腸炎病毒。
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該病毒能夠感·染ST細(xì)胞，造成細(xì)胞拉網(wǎng)脫落等病變。對所述毒株進(jìn)行N基因的PCR擴(kuò)增并克隆測序，NCBI上BLAST得出其為豬傳染性胃腸炎病毒。本發(fā)明中，毒株定名為TGEV HN-2012。1、流行病學(xué)調(diào)查2012年I月，鄭州市新鄭市某豬場豬群10頭7日齡豬只先后發(fā)病，其中一頭小豬在發(fā)病兩天后死亡，發(fā)病豬臨床癥狀為嘔吐、嚴(yán)重腹瀉、脫水。并且具有傳染性，其發(fā)病表現(xiàn)與國內(nèi)報道的其他地區(qū)發(fā)病的豬傳染性胃腸炎癥狀大致相似，初步判斷為豬傳染性胃腸炎。采集發(fā)病豬的腸道、淋巴結(jié)，置于冰盒中并在24 h內(nèi)送至實驗室。2、病毒分離采集病死豬的空腸及腸系膜淋巴結(jié)，用緩沖鹽水或含0.5%乳白蛋白水解物的D-HankJ S液制成1:5 1:10懸液，加入青霉素和鏈霉素各1000 u/ml或1000ug/ml,超聲波出來后,2000 r/min離心沉淀20 min,吸取上清液用濾膜(孔徑0. 2 um)過濾，濾液即為接種材料。接種細(xì)胞為豬睪丸細(xì)胞(ST細(xì)胞)。結(jié)果表明最初幾代無細(xì)胞病變(CPE)，盲傳至5-6代后出現(xiàn)典型的CPE，表現(xiàn)為細(xì)胞聚集、變圓，皺縮，細(xì)胞呈拉網(wǎng)狀，最后出現(xiàn)空泡病變。3、病毒PCR鑒定根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的豬傳染性胃腸炎病毒的N基因核苷酸序列，用Clustal、DNAstar等生物軟件進(jìn)行同源性分析后，選出較為保守的核苷酸區(qū)域，應(yīng)用Primer 5. 0設(shè)計N基因的特異性引物。參照GENEray高純總RNA快速提取試劑盒的說明書進(jìn)行，具體操作步驟如下取新鮮的病毒樣品400 U L加入裝有400 V- L Trizol的1. 5 mL RNase-free離心管中混合均勻，劇烈震蕩直到液體清亮；加入100 u L氯仿/異戊醇,劇烈震蕩混勻30 s ;臺式離心機(jī)上12000 r/min,離心5 min ;將上清液小心轉(zhuǎn)到無菌1. 5 mL RNase-free離心管里,加入150 u L無水乙醇，混勻(此處可能會出現(xiàn)絮狀沉淀物);將上述溶液(包括沉淀)轉(zhuǎn)移到套放于2 mL收集管內(nèi)的GenClean柱中，室溫放置2 min, 12000 r/min離心I min ;小心取出柱子，棄去收集管中的廢液，將柱子放回收集管中，加入450 UL RPE Solution, 12000 r/min,室溫離心30 s ;重復(fù)上一步驟一次；小心取出柱子，棄去收集管中的廢液，將柱子放回收集管中，10000 r/min,室溫離心30 s ;小心取出柱子,放入無菌RNase-free的1. 5 mL離心管里，在柱內(nèi)膜的中央小心加入40 uL DEPC-H2O, 55 58 °C放置2 min (室溫放置產(chǎn)率約低20%左右)；12000 r/min，室溫離心I min。收集管內(nèi)的溶液為RNA樣品，可立即使用或者-70°C保存。反轉(zhuǎn)錄過程，根據(jù)Fermentas 公司的 RevertAid First Strand cDNA SynthesisKit試劑盒說明書進(jìn)行，具體步驟是取11 uL DEPC處理水溶液中的RNA;oligo (dT)18primer I iiL,70°C水浴 10 min,快速放置冰上 5 min ;按順序加入 5XReaction buffer 4U L, RiboLock RNase Inhibitor I u L, 10 mM dNTP Mix 2 u L,瞬時離心后，放入 42°C水浴 2min ;快速加入 I u L RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase,總體積 20 uL,瞬時離心后繼續(xù)放入42 °C水浴60 min, 70 °C水浴15 min,即為反轉(zhuǎn)錄的cDNA,可立即使用或者-70°C保存。PCR反應(yīng)體系
cDNA2 UL
Premix EX Taq12. 5 U L
上游引物PlI UL
上游引物P2I UL
ddH208. 5 u L
Total Volume25 u L
PCR反應(yīng)條件依次加入表中各成分，混勻離心，PCR擴(kuò)增程序為95 °C預(yù)變性5 min,94 °C變性30 s，53 °C退 火30 s，延伸72 °C I min，運(yùn)行30個循環(huán)后于72 °C延伸10 min。反結(jié)束后取PCR產(chǎn)物5 y L，采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。結(jié)果如圖1所示。圖1為TGEV的結(jié)構(gòu)蛋白N基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果，圖中M泳道為DNA ladder marker 2000 (2000, 1000,750，500，250, 100);泳道2為目的基因PCR擴(kuò)增結(jié)果，片段大約都在1171bp，陽性毒株和分尚毒株均在1171bp出擴(kuò)出條帶，與預(yù)期大小相符。4、生物學(xué)特性研究
4.1 TGEV紅細(xì)胞凝性的測定
用新鮮制備的雞、豚鼠、小鼠等動物的I %紅細(xì)胞懸液與新鮮收獲的病毒液做HA試驗，結(jié)果顯示所述毒株對上面幾種動物的紅細(xì)胞均無凝集性。4. 2脂溶劑敏感性試驗
4.2.1對乙醚的敏感試驗
將病毒液加入兩個滅菌小管中，I mL/管，于其中I管內(nèi)加入乙醚0. 2 mL至終濃度為200 mL/L，另一管加滅菌生理鹽水作陰性對照，斡旋振蕩10 min, 4 °C作用24 h。加入乙醚的小管，可分為清晰的兩層。吸取下層病毒液，移入另一小管內(nèi)，使殘余乙醚全部揮發(fā)。然后分別取上述兩份病毒液測定TCID5tl,如經(jīng)過乙醚處理的病毒液和對照組的病毒液血凝價相差2個滴度以上，則判為病毒對乙醚敏感。4. 2. 2對氯仿的敏感試驗
將新鮮病毒液加入兩個滅菌小管中，I mL/管，加入終濃度為48 mL/0.2分析純氯仿混合振蕩，置于4 V作用10 min。另一組用滅菌生理鹽水代替氯仿作陰性對照，每個處理樣品測定TCID5tl,氯仿處理過的病毒液滴度比對照管病毒液滴度下降2個滴度以上，則判為病毒對氯仿敏感。
4. 2. 3對酸(PH 2. 0)的敏感性試驗
取2只經(jīng)高壓滅菌的離心管，在超凈臺內(nèi)分別加入3 mL的新鮮病毒液，一組用0.1mol/L的鹽酸調(diào)PH至2.0，于37°C水浴中作用I h，隨后用500 r/min的速度離心5 min，然后吸取上層液體測定病毒TCID5tlt5另一組加入和鹽酸用量相等的滅菌生理鹽水室溫用作為對照，同樣處理后測定TCID5Q。試驗管和對照管相差2個滴度以上者判為敏感。理化特性試驗表明所述毒株經(jīng)過氯仿、乙醚和酸處理后，不能再感染細(xì)胞，判斷其對脂溶劑敏感。4. 3病毒滴度TCID5tl的測定
將消化吹散的ST細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于5% CO2, 37 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待其貼壁后棄上清及非粘附細(xì)胞。取新鮮病毒液用2% DMEM分別連續(xù)倍比稀釋KT1 10_8，每個稀釋度各做8個重復(fù)，接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔0. 2 mL,設(shè)一行正常細(xì)胞生長對照孔，逐日觀察細(xì)胞病變并統(tǒng)計結(jié)果。按照Reed-Muench法計算病毒滴度TCID5tlt5具體計算如下
權(quán)利要求
1. 一種豬傳染性胃腸炎病毒毒株，其特征在于豬傳染性胃腸炎病毒(SWine transmissible gastroenteritis virus), CCTCC NO :V201216o
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬傳染性胃腸炎病毒毒株，其特征在于豬傳染性胃腸炎病毒(swine transmissible gastroenteritis virus)，CCTCC NOV201216。本發(fā)明的豬傳染性胃腸炎病毒滅活后免疫豬只，可以給豬提供有效的保護(hù)，是一株比較理想的制苗候選毒株。
文檔編號C12R1/93GK103045543SQ20121052232
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月7日
發(fā)明者胡慧, 魏戰(zhàn)勇, 崔保安, 陳雅君, 張莉娟, 劉中原, 寇亞楠 申請人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)