肌肉干細胞體外培養(yǎng)方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及肌肉干細胞體外培養(yǎng)方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的肌肉干細胞體外培養(yǎng)方法，為采用添加有血液細胞的細胞因子的細胞培養(yǎng)基或血液細胞的條件培養(yǎng)基體外培養(yǎng)肌肉干細胞。本發(fā)明還進一步公開了所述肌肉干細胞體外培養(yǎng)方法所用培養(yǎng)基及其應(yīng)用。采用本發(fā)明的方法，肌肉干細胞可以增殖十次以上。更重要的是，在本發(fā)明的培養(yǎng)基中，肌肉干細胞可以連續(xù)傳代，并繼續(xù)保持干性和分化潛能，并且擴增后的肌肉干細胞均保持干性和完整分化潛能，能夠在體內(nèi)修復(fù)肌肉損傷，這就使得利用體外培養(yǎng)的肌肉干細胞用于再生醫(yī)學(xué)治療的策略在臨床上具有可行性。
【專利說明】肌肉干細胞體外培養(yǎng)方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及肌肉干細胞相關(guān)的細胞培養(yǎng)與細胞治 療領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 肌肉干細胞負(fù)責(zé)出生后肌肉組織的生長和再生，且肌肉干細胞在體內(nèi)沒有致癌效 果，不存在應(yīng)用胚胎干細胞時會碰到的倫理問題，因而在肌肉萎縮和重癥肌無力等各種肌 肉退行性疾病的治療方面有廣闊的應(yīng)用前景。肌肉干細胞臨床應(yīng)用的一個重要障礙是無法 在體外長期培養(yǎng)肌肉干細胞。和大多數(shù)成體干細胞一樣，肌肉干細胞從體內(nèi)分離之后，在體 外培養(yǎng)系統(tǒng)中只能再分裂2-4次，幾乎無法傳代。
[0003] 現(xiàn)有培養(yǎng)肌肉干細胞(衛(wèi)星細胞）的方法幾乎都來源于Bischoff博士在1986年 建立的方法，后經(jīng)過Beauchamp等人的改進，形成現(xiàn)有的在FlO基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加10ng/ml FGF進行培養(yǎng)的方法。在此培養(yǎng)條件下，肌肉干細胞可以增殖3-5次。在傳代時，肌肉干細 胞會經(jīng)過一個嚴(yán)重的危機時期，在這一危機時期，絕大多數(shù)細胞都會死去，殘留的細胞則分 化為不具有干性的前體細胞。所以體外培養(yǎng)1-3代（3-12天）后，分離得到的肌肉干細胞 即全部分化為不具有干性的前體細胞，肌肉干細胞的分子標(biāo)記在這些前體細胞中都無法檢 測到。注射入小鼠體內(nèi)后，這些前體細胞參與肌肉損傷修復(fù)的能力非常弱，不能在體內(nèi)形成 有功能的干細胞，完全不能進行移植后二次損傷的修復(fù)。（Bischoff R. A satellite cell mitogen from crushed adult muscle. Dev Biol.,1986. 115(1):140-147. Beauchamp, J. R. , et al. , Expression of CD34and Myf5defines the majority of quiescent adult skeletal muscle satellite cells. J Cell Biol, 2000. 151(6) :p. 1221-34.)也就是說， 采用現(xiàn)有的肌肉干細胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)，培養(yǎng)后的肌肉干細胞傳代后要經(jīng)過一個危機期，危 機期后得到的可以增殖的細胞絕大多數(shù)已經(jīng)分化為肌肉祖細胞，喪失了肌肉損傷修復(fù)的能 力。由于這一問題的存在，使得通過在肌肉干細胞中進行基因修復(fù)治療遺傳性的肌肉退行 性疾病的方法難以在臨床治療中使用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的就是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種肌肉干細胞培養(yǎng)基及其應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明第一方面提供了一種肌肉干細胞體外培養(yǎng)方法，為采用添加有血液細胞的 細胞因子的細胞培養(yǎng)基或血液細胞的條件培養(yǎng)基體外培養(yǎng)肌肉干細胞。本發(fā)明的肌肉干細 胞體外培養(yǎng)方法適合體外長期培養(yǎng)肌肉干細胞。
[0006] 本發(fā)明第二方面提供了一種肌肉干細胞培養(yǎng)基，為添加有血液細胞的細胞因子的 細胞培養(yǎng)基或血液細胞條件培養(yǎng)基。
[0007] 所述添加有血液細胞的細胞因子的細胞培養(yǎng)基中所添加的血液細胞的細胞因子， 用于制備所述血液細胞條件培養(yǎng)基的血液細胞，均與待培養(yǎng)的肌肉干細胞來源于相同的動 物物種。
[0008] 當(dāng)添加動物血清培養(yǎng)細胞時，本發(fā)明所述的添加有血液細胞的細胞因子的細胞培 養(yǎng)基中所添加的血液細胞的細胞因子并不包括所用動物血清中本就含有的細胞因子。
[0009] 所述添加有血液細胞的細胞因子的細胞培養(yǎng)基可由在通用細胞培養(yǎng)基中添加血 液細胞的細胞因子的方法制備獲得。
[0010] 進一步的，所述血液細胞條件培養(yǎng)基為淋巴細胞條件培養(yǎng)基。更進一步的，為B細 胞條件培養(yǎng)基或T細胞條件培養(yǎng)基。
[0011] 所述添加的血液細胞的細胞因子選自以下細胞因子中的多種：GM-CSF (粒細胞集 落刺激因子)、sICAM-1 (人可溶性細胞間粘附分子I) ;IFN gamma ( γ干擾素)、ILl (白介 素 l)、IL_lalpha receptor (白介素 1 α 受體)、ILlalpha (白介素 I a )、IL_3 (白介素 3)、 IL2 (白介素2)、IL-10 (白介素10)、IL-16 (白介素16)、IL13 (白介素13)、IL-17 (白介素 17)、IP-10 (干擾素誘導(dǎo)蛋白10)、SCYA2(小誘導(dǎo)型細胞因子A2)、MIG(干擾素γ誘生單核 因子）、MIP-Ialpha (巨噬細胞炎性蛋白I α )、TGF-beta (轉(zhuǎn)化生長因子β )、IL-4 (白介 素4)、TRAF6 (TNF受體相關(guān)因子6)、FGF(成纖維細胞生長因子）、IGF胰島素樣生長因子）、 TOGF(血小板衍生生長因子）、LIF(白血病抑制因子）、mT0R(哺乳動物雷帕霉素靶蛋白）、 1^3(細胞內(nèi)毒素）、1'1^1(1'〇11-樣受體1)、11^12(白介素12)、11^23(白介素23)、如？（神 經(jīng)生長因子）、TNFalpha (α干擾素)、ILlbeta (白介素1β)。
[0012] 所述添加有血液細胞的細胞因子的細胞培養(yǎng)基或血液細胞的條件培養(yǎng)基中，所述 添加的血液細胞的細胞因子總濃度不低于6ng/ml，較佳地為50-4500ng/ml。
[0013] 進一步的，所述添加有血液細胞的細胞因子的細胞培養(yǎng)基或血液細胞的條件培養(yǎng) 基中，任一添加的血液細胞的細胞因子的濃度均在0. 5ng/ml以上，較佳的為lng/ml以上， 再佳的為l〇ng/ml以上，更佳的，25ng/ml以上，更進一步的，為50ng/ml以上。
[0014] 進一步的，所添加的述血液細胞的細胞因子至少包括IL1、IL4、IL13、TNF alpha、 IL2 和 IFN gamma。
[0015] 進一步的，所述添加有血液細胞的細胞因子的細胞培養(yǎng)基或血液細胞的條件培養(yǎng) 基中，IL1、IL4、IL13、TNF alpha、IL2和IFN gamma的濃度之和不低于6ng/ml，較佳地為 50_1250ng/ml。
[0016] 進一步的，所述添加有血液細胞的細胞因子的細胞培養(yǎng)基或血液細胞的條件培養(yǎng) 基中，所述IL1、IL4、IL13、TNF alpha、IL2和IFN gamma中任一種的濃度均不低于0. 5ng/ ml,較佳的為lng/ml以上，更佳為10ng/ml以上，一般可選擇50_500ng/ml。
[0017] 本發(fā)明第三方面，提供了前述血液細胞的細胞因子或血液細胞條件培養(yǎng)基在肌肉 干細胞體外培養(yǎng)中的用途。
[0018] 所述血液細胞的細胞因子或血液細胞條件培養(yǎng)基可促進肌肉干細胞在體外的增 殖并使體外增殖的肌肉干細胞保持干性。
[0019] 本發(fā)明第四方面，提供了一種用于治療肌肉退行性疾病的制劑，為以采用本發(fā)明 的肌肉干細胞體外培養(yǎng)方法培養(yǎng)獲得的肌肉干細胞為主要活性成分的制劑。
[0020] 進一步的，所述制劑以來源于病人本體的肌肉干細胞采用本發(fā)明的肌肉干細胞體 外培養(yǎng)方法培養(yǎng)獲得的肌肉干細胞為主要活性成分。
[0021] 進一步的，所述制劑為注射劑、手術(shù)植入劑。
[0022] 所述制劑一般包含常用的制劑輔料。
[0023] 本發(fā)明第五方面，提供了一種對病人的肌肉退行性疾病細胞治療方法，包括下列 步驟：
[0024] 1)收集病人的肌肉干細胞；
[0025] 2)采用本發(fā)明的肌肉干細胞培養(yǎng)基體外擴增培養(yǎng)步驟1)收集的肌肉干細胞至得 到足夠多的肌肉干細胞；
[0026] 3)將獲得的肌肉干細胞給藥至病人肌肉損傷部位。
[0027] 其中步驟3)所述給藥方式可采用注射劑的方式將肌肉干細胞肌肉注射至病人肌 肉損傷部位。
[0028] 肌肉干細胞的注射劑可將擴增后的肌肉干細胞經(jīng)胰酶消化從培養(yǎng)皿中取下后，重 懸在生理鹽水中獲得。
[0029] 采用本發(fā)明的肌肉干細胞體外培養(yǎng)、傳代方法，使得肌肉干細胞可以在體外大量 擴增并保持干性，從而大大提高了可以用于再生醫(yī)學(xué)治療的干細胞的數(shù)量，使得由患者提 供少量肌肉組織，分離肌肉干細胞，進行基因修復(fù)，體外擴增后將攜帶正確遺傳信息的肌肉 干細胞注射如體內(nèi)實現(xiàn)對多種遺傳性肌肉退行性疾病的細胞治療的策略成為可能。
[0030] 現(xiàn)有的肌肉干細胞培養(yǎng)方法無法在體外長期培養(yǎng)具有分化潛能的肌肉干細胞，無 法傳代，培養(yǎng)時間超過12天后全部細胞都分化為祖細胞，喪失在體內(nèi)修復(fù)肌肉損傷的能 力。在現(xiàn)有培養(yǎng)條件下，肌肉干細胞只能分裂3-5次，即最多擴增為原始細胞數(shù)的32倍，即 喪失分裂能力，因而要得到足夠多的肌肉干細胞用于治療，就必須取非常大的肌肉組織用 來分離純化肌肉干細胞，在臨床上基本不具有可行性。在本發(fā)明的培養(yǎng)基中，肌肉干細胞可 以增殖十次以上，即在每一代均可以擴增為原始細胞數(shù)的1000倍以上。更重要的是，在本 發(fā)明的培養(yǎng)基中，肌肉干細胞可以連續(xù)傳代，并且繼續(xù)保持干性和分化潛能。這樣最終得到 的肌肉干細胞數(shù)目是起始分離純化的肌肉干細胞數(shù)目的2 mx2n倍，m為每代分裂次數(shù)，η為 傳代數(shù)目。采用本發(fā)明的方法得到的m值至少為12, η值至少為40,即肌肉干細胞數(shù)目至 少可以擴增為原始分離純化的肌肉干細胞數(shù)目的4. 5χ1015倍，并且擴增后的肌肉干細胞均 保持干性和完整分化潛能，能夠在體內(nèi)修復(fù)肌肉損傷。注射入小鼠體內(nèi)后，這些干細胞可以 較高效地參與肌肉損傷的修復(fù)，也可以補充體內(nèi)的干細胞儲備，具有移植后二次損傷的修 復(fù)能力。這就使得通過微創(chuàng)手術(shù)，提取少量肌肉組織(克級)，分離純化少量肌肉干細胞，然 后在體外擴增獲得足夠量的肌肉干細胞用于再生醫(yī)學(xué)治療的策略在臨床上具有可行性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1添加細胞因子的FlO培養(yǎng)基中培養(yǎng)的PO代肌肉干細胞（Pax7染色）
[0032] 圖2添加細胞因子的FlO培養(yǎng)基中培養(yǎng)的對照成纖維細胞（Pax7染色）
[0033] 圖3添加細胞因子的FlO培養(yǎng)基中培養(yǎng)的P8代肌肉干細胞（Pax7染色）
[0034] 圖4添加細胞因子的FlO培養(yǎng)基中培養(yǎng)的P22代肌肉干細胞（Pax7染色）
[0035] 圖5在添加細胞因子的FlO培養(yǎng)基中培養(yǎng)的PO代細胞的分化結(jié)果
[0036] 圖6在添加細胞因子的FlO培養(yǎng)基中培養(yǎng)的P22代細胞的分化結(jié)果
[0037] 圖7在添加細胞因子的FlO培養(yǎng)基中培養(yǎng)的表達RFP的肌肉干細胞在體內(nèi)參與肌 肉損傷修復(fù)結(jié)果
[0038] 圖8.在添加細胞因子的FlO培養(yǎng)基中培養(yǎng)的RFP標(biāo)記的肌肉干細胞能夠參與肌 肉損傷的修復(fù)結(jié)果。
[0039] 體外培養(yǎng)的RFP標(biāo)記的肌肉干細胞注射入沒有熒光標(biāo)記的損傷的肌肉7天后，切 片觀察紅色細胞的整合情況，發(fā)現(xiàn)在損傷部位有來源于注射的表達RFP的肌肉干細胞的紅 色肌纖維形成。
[0040] 圖A為注射加入細胞因子培養(yǎng)的肌肉干細胞的修復(fù)情況；
[0041] 圖B為注射用T細胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的肌肉干細胞的修復(fù)情況。

【具體實施方式】
[0042] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，與血細胞共培養(yǎng)后可以促進肌肉干細胞的增殖，且這一促進作用不 依賴于血細胞與肌肉干細胞之間的細胞接觸。血細胞條件培養(yǎng)基即可以促進肌肉干細胞的 增殖。經(jīng)過進一步細分，B細胞和T細胞條件培養(yǎng)基均可以促進肌肉干細胞的增殖。肌肉 干細胞在T細胞條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，每代可連續(xù)分裂10次以上，并可在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中 至少連續(xù)傳代40代。經(jīng)過一系列分離純化步驟后，分離到T細胞所分泌出的細胞因子，這 些細胞因子的組合可以促進肌肉干細胞在體外的增殖。經(jīng)細胞因子處理過后的肌肉干細胞 表達肌肉干細胞所應(yīng)表達的分子標(biāo)記，其增殖能力顯著提高，可以連續(xù)傳代40代以上。傳 代后的每一代細胞均表達肌肉干細胞的分子標(biāo)記，具有較強的增殖能力，可以高效分化為 成熟肌管。更重要的是，當(dāng)這些用T細胞條件培養(yǎng)基或細胞因子培養(yǎng)的肌肉干細胞注射入 誘導(dǎo)肌肉損傷后的小鼠時，注射的肌肉干細胞可以修復(fù)肌肉損傷，形成新的肌纖維，表明本 發(fā)明得到的是真正的肌肉干細胞。
[0043] 本發(fā)明的肌肉干細胞體外培養(yǎng)方法，為采用添加有血液細胞的細胞因子的細胞培 養(yǎng)基或血液細胞的條件培養(yǎng)基體外培養(yǎng)肌肉干細胞。
[0044] 本發(fā)明的關(guān)鍵在于對體外培養(yǎng)肌肉干細胞的培養(yǎng)基進行了改進，體外培養(yǎng)肌肉干 細胞的其他方面與常規(guī)細胞培養(yǎng)一致。
[0045] 最佳培養(yǎng)條件：C02培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)。CO2培養(yǎng)箱中CO2濃度較佳為5%(v/v)。
[0046] 所述肌肉干細胞的體外培養(yǎng)是貼壁培養(yǎng)。
[0047] 本發(fā)明所采用的肌肉干細胞培養(yǎng)基，為添加有血液細胞的細胞因子的細胞培養(yǎng)基 或血液細胞條件培養(yǎng)基。
[0048] 所述添加有血液細胞的細胞因子的細胞培養(yǎng)基中所添加的血液細胞的細胞因子 與所述待培養(yǎng)的肌肉干細胞應(yīng)當(dāng)來源于相同的動物物種。用于制備所述血液細胞條件培養(yǎng) 基的血液細胞與所述待培養(yǎng)的肌肉干細胞也應(yīng)當(dāng)來源于相同的動物物種。如培養(yǎng)鼠肌肉 干細胞，則采用添加了鼠血液細胞細胞因子的細胞培養(yǎng)基或鼠血液細胞條件培養(yǎng)基，如培 養(yǎng)人肌肉干細胞，則采用添加人血液細胞的細胞因子的細胞培養(yǎng)基或人血液細胞條件培養(yǎng) 基，其余類推。
[0049] 所述物種（Species)，為生物分類學(xué)的基本單位。進一步的，所述動物物種選自哺 乳動物。更進一步的，所述物種選自哺乳動物中的嚙齒目、偶蹄目、奇蹄目、兔形目、靈長目 等的物種，如鼠、兔、羊、豬、猴、人等。
[0050] 當(dāng)添加動物血清培養(yǎng)細胞時，本發(fā)明所述添加有血液細胞的細胞因子的細胞培養(yǎng) 基中所添加的血液細胞的細胞因子并不包括加入培養(yǎng)基的動物血清中本就含有的細胞因 子。亦即，當(dāng)添加動物血清培養(yǎng)細胞時，本發(fā)明還需額外添加與所培養(yǎng)的肌肉干細胞同物種 的血液細胞的細胞因子。
[0051] 本發(fā)明所述添加有血液細胞的細胞因子的細胞培養(yǎng)基是指除常規(guī)細胞培養(yǎng)所需 組分外，還額外添加有血液細胞的細胞因子的細胞培養(yǎng)基。
[0052] 本發(fā)明所述肌肉干細胞培養(yǎng)基中除添加的血液細胞的細胞因子外的其他組分及 含量均與常規(guī)細胞培養(yǎng)基一致。常規(guī)細胞培養(yǎng)基成分一般選自：平衡鹽水、PH調(diào)節(jié)液、抗 生素、動物血清、細胞生長必須的氨基酸、維生素、葡萄糖、PH指示劑等。所述平衡鹽水成分 如氯化鈣、硝酸鐵、硫酸鎂、氯化鉀、氟化鈉、氯化鈉、磷酸鈉等；所述pH調(diào)節(jié)液如3. 7%碳酸 氫鈉、HEPES溶液(二羥乙基哌嗪乙烷磺酸)、丙酮酸鈉等；所述抗生素如青霉素、鏈霉素、等； 常用的動物血清主要有牛血清和馬血清。維生素如氯化膽堿、葉酸、肌醇、煙酰胺、泛酸鈣、 鹽酸吡哆醛、維生素B6、核黃素、硫胺素等。
[0053] 所述添加有血液細胞的細胞因子的細胞培養(yǎng)基可由在通用細胞培養(yǎng)基中添加血 液細胞的細胞因子的方法制備獲得。其中，所述通用細胞培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)細胞培養(yǎng) 基，如 DMEM、RPMI 1640、MEM、DEME/F12、F10、CD293、medium 231、medium 106。本發(fā)明實施 例具體列舉了在FlO培養(yǎng)基中添加各種血液細胞的細胞因子的肌肉干細胞培養(yǎng)基。
[0054] 所述血液細胞條件培養(yǎng)基是指為：培養(yǎng)過血液細胞的細胞培養(yǎng)基。進一步的，所述 血液細胞為淋巴細胞。最佳的，所述血液細胞為B細胞和/或T細胞。
[0055] 所述血液細胞條件培養(yǎng)基可由在通用細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)血液細胞后分離獲得。在 通用細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)B細胞后分離獲得B細胞條件培養(yǎng)基，在通用細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)T 細胞后分離獲得T細胞條件培養(yǎng)基。
[0056] 所述添加的血液細胞的細胞因子選自以下細胞因子中的多種：GM-CSF、sICAM-1 ; IFN gamma、ILl、IL_1 alpha、IL-I alpha receptor、IL_3、IL2、IL-10、IL-16、IL13、IL-17、 IP-10、SCYA2、MIG、MIP-I alpha、TGF-beta、IL-4、TRAF6、FGF、IGF、PDGF、LIF、mTOR、LPS、 TLR1、IL12、IL23、NGF、TNFalpha、ILlbeta。
[0057] 所有上述細胞因子可以在淋巴細胞條件培養(yǎng)基中檢測到，尤其均存在于T細胞條 件培養(yǎng)基中。
[0058] 更佳的，所述血液細胞的細胞因子選自上述細胞因子中的至少六種；或者，所述血 液細胞的細胞因子選自上述細胞因子中的至少七種；或者，所述血液細胞的細胞因子選自 上述細胞因子中的至少八種；或者，所述血液細胞的細胞因子選自上述細胞因子中的至少 九種；或者，所述血液細胞的細胞因子選自上述細胞因子中的至少十種。
[0059] 為了維持肌肉干細胞的增殖并使其傳代細胞保持干性，所述添加有血液細胞的細 胞因子的細胞培養(yǎng)基或血液細胞的條件培養(yǎng)基中，所述血液細胞的細胞因子總濃度不能過 低，一般不應(yīng)低于6ng/ml，較佳地為50-4500ng/ml。
[0060] 所述添加有血液細胞的細胞因子的細胞培養(yǎng)基或血液細胞的條件培養(yǎng)基中，任 一添加的血液細胞的細胞因子的濃度均在0. 5ng/ml以上，較佳的為lng/ml以上，更佳為 10ng/ml以上，一般可選在50-500ng/ml的范圍內(nèi)。上述描述并非指細胞因子的濃度不能高 于500ng/ml，而是認(rèn)為在此濃度范圍內(nèi)細胞因子可以較好地發(fā)揮積極效果，濃度過低效果 不明顯，濃度過高造成浪費。
[0061] 經(jīng)試驗，六種血液細胞的細胞因子：ILl、IL4、IL13、TNF alpha、IL2和IFN gamma 對肌肉干細胞的增殖與干性的保持關(guān)系密切。在本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案中，這6種血液細 胞的細胞因子必須添加，而其余血液細胞的細胞因子可添加也可以不添加。
[0062] 進一步的，所述添加有血液細胞的細胞因子的細胞培養(yǎng)基或血液細胞的條件培養(yǎng) 基中，IL1、IL4、IL13、TNF alpha、IL2和IFN gamma的濃度之和不低于6ng/ml，較佳地為 50_1250ng/ml。
[0063] 進一步的，所述添加有血液細胞的細胞因子的細胞培養(yǎng)基或血液細胞的條件培養(yǎng) 基中，所述 IL1、IL4、IL13、TNF alpha、IL2 和 IFN gamma 中任一種的濃度均在 0. 5ng/ml 以 上，較佳的為lng/ml以上，更佳為10ng/ml以上，一般可選50-500ng/ml。所述細胞因子的 濃度高于500ng/ml并不會對肌肉干細胞的增殖構(gòu)成嚴(yán)重的負(fù)面影響，但考慮到成本因素， 無需添加過多的細胞因子。
[0064] 添加有血液細胞的細胞因子的細胞培養(yǎng)基中，上述各細胞因子的濃度均指：在添 加有血液細胞的細胞因子的細胞培養(yǎng)基中，來源于與所培養(yǎng)的肌肉干細胞同物種的血液細 胞的細胞因子的終濃度。
[0065] 本發(fā)明揭示了血液細胞的細胞因子或血液細胞條件培養(yǎng)基可用于肌肉干細胞體 外培養(yǎng)，可促進肌肉干細胞在體外的增殖并使體外增殖的肌肉干細胞保持干性。
[0066] 本發(fā)明還提供了一種用于治療肌肉退行性疾病的制劑，為以采用本發(fā)明的肌肉干 細胞體外培養(yǎng)方法培養(yǎng)獲得的肌肉干細胞為主要活性成分的制劑。
[0067] 所述制劑以來源于病人本體的肌肉干細胞采用本發(fā)明的肌肉干細胞體外培養(yǎng)方 法培養(yǎng)獲得的肌肉干細胞為主要活性成分。
[0068] 根據(jù)本發(fā)明的試驗，用于人體，推薦的給藥劑量約為3xl06個肌肉干細胞/次?？?單次給藥，也可以根據(jù)病人的肌肉恢復(fù)情況多次給藥。一般的給藥方式為通過肌肉注射的 方式給藥。但本發(fā)明并不排除其他可能的給藥方式。
[0069] 所述制劑一般包含常用的制劑輔料。
[0070] 常用的制劑輔料包括（但并不限于）：鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、多元 醇及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的制劑優(yōu)選被制成針劑形式，例如用 生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。其他可能的制劑形式 可通過常規(guī)方法進行制備。本發(fā)明的制劑宜在無菌條件下制造。此外，本發(fā)明的制劑還可 與其他治療劑一起使用。
[0071] 本發(fā)明進一步提供了一種對病人的肌肉退行性疾病細胞治療方法，包括下列步 驟：
[0072] 1)收集病人的肌肉干細胞；
[0073] 病人肌肉干細胞的收集可通過微創(chuàng)手術(shù)從病人機體中提取少量肌肉樣品，而后從 肌肉樣品中將肌肉干細胞分離純化獲得。該技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。
[0074] 2)采用本發(fā)明的肌肉干細胞培養(yǎng)基體外擴增培養(yǎng)步驟1)收集的肌肉干細胞至得 到足夠多的肌肉干細胞；
[0075] 基于本發(fā)明的肌肉干細胞培養(yǎng)技術(shù)，收集了病人的肌肉干細胞后，可以進一步利 用已知的基因工程手段對肌肉干細胞進行基因工程改造，修復(fù)缺陷基因或進行基因優(yōu)化， 并進一步擴增改造后的肌肉干細胞，以達到克服一些遺傳或突變相關(guān)的肌肉疾病或進一步 優(yōu)化肌肉組織的目的。
[0076] 3)將獲得的肌肉干細胞給藥至病人肌肉損傷部位。
[0077] -般可采用注射劑的方式將肌肉干細胞肌肉注射至病人肌肉損傷部位。注射后應(yīng) 當(dāng)讓病人進行適度鍛煉，促進肌肉干細胞的整合。4-8周后檢查修復(fù)效果。
[0078] 以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書 所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實 施方式加以實施或應(yīng)用，本說明書中的各項細節(jié)也可以基于不同觀點與應(yīng)用，在沒有背離 本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。
[0079] 除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù) 領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細胞培養(yǎng)、重組DNA技 術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻中已有完善說明，具體可參見Sambrook 等 MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989and Third edition,2001 ;Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons,New York,1987and periodic updates ；the series METHODS IN ENZYM0L0GY,Academic Press,San Diego ；ffolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego,1998 ；METH0DS IN ENZYM0L0GY, Vol. 304,Chromatin(P. M. Wassarman and A. P. ffolffe,eds. ),Academic Press,San Diego, 1999;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, Chromatin Protocols (P.B. Becker, ed. )Humana Press，Totowa，1999 等。
[0080] 實施例I
[0081] 鼠T細胞條件培養(yǎng)基的制備：
[0082] 將野生型C57/B6小鼠處死，取出脾臟，置于70um濾網(wǎng)中，加入2-3毫升PBS濕潤 后，使用輾磨棒輾磨脾臟，加適量PBS過濾，收集細胞懸液。IOOOrpm離心5分鐘，棄上清， 使用5毫升紅細胞裂解液重懸細胞，加入5毫升RPMI-1640培液，并用濾網(wǎng)再次過濾去除細 胞碎片，IOOOrpm離心5分鐘收集細胞。使用RPMI-1640培液洗滌細胞兩次，調(diào)整細胞密度 為I xIO9ceIls每升，接種于細胞培養(yǎng)瓶，加入ConA (終濃度為5mg/L)，于37度CO2培養(yǎng)箱 培養(yǎng)48小時后補加等倍RPMI-1640培液，24小時后3000rpm離心5分鐘，將細胞上清轉(zhuǎn)移 至新離心管中，于-80攝氏度保存。
[0083] 經(jīng)檢測，獲得的T細胞條件培養(yǎng)基中含有下列濃度的細胞因子：
[0084] 檢測方法：ELISA 檢測，參見 R&D 公司 Mouse Cytokine Array, Panel A(Catalog#ARY006)
[0085]

【權(quán)利要求】
1. 一種肌肉干細胞體外培養(yǎng)方法，為采用添加有血液細胞的細胞因子的細胞培養(yǎng)基或 血液細胞的條件培養(yǎng)基體外培養(yǎng)肌肉干細胞。
2. 如權(quán)利要求1所述肌肉干細胞體外培養(yǎng)方法，其特征在于，所述添加有血液細胞的 細胞因子的細胞培養(yǎng)基中所添加的血液細胞的細胞因子，或用于制備所述血液細胞條件培 養(yǎng)基的血液細胞，均與待培養(yǎng)的肌肉干細胞來源于相同的動物物種。
3. 如權(quán)利要求2所述肌肉干細胞體外培養(yǎng)方法，其特征在于，所述血液細胞條件培養(yǎng) 基為淋巴細胞條件培養(yǎng)基。
4. 如權(quán)利要求3所述肌肉干細胞體外培養(yǎng)方法，其特征在于，所述血液細胞條件培養(yǎng) 基為B細胞條件培養(yǎng)基或T細胞條件培養(yǎng)基。
5. 如權(quán)利要求2所述肌肉干細胞體外培養(yǎng)方法，其特征在于，所述添加的血液細胞 的細胞因子選自以下細胞因子中的多種：GM-CSF、sICAM-1 ;IFN gamma、IL1、IL-Ialpha receptor、ILlalpha、IL-3、IL2、IL-10、IL-16、IL13、IL-17、IP-10、SCYA2、MIG、MIP-lalpha、 TGF-beta、IL-4、TRAF6、FGF、IGF、PDGF、LIF、mT0R、LPS、TLRl、IL12、IL23、NGF、TNFalpha 和 ILlbeta0
6. 如權(quán)利要求2所述肌肉干細胞體外培養(yǎng)方法，其特征在于，所述添加有血液細胞的 細胞因子的細胞培養(yǎng)基或血液細胞的條件培養(yǎng)基中，所述添加的血液細胞的細胞因子總濃 度不低于6ng/m 1，較佳地為50-4500ng/ml。
7. 如權(quán)利要求2所述肌肉干細胞體外培養(yǎng)方法，其特征在于，所述添加有血液細胞的 細胞因子的細胞培養(yǎng)基或血液細胞的條件培養(yǎng)基中，任一添加的血液細胞的細胞因子的濃 度均在0.5ng/ml以上，較佳的為lng/ml以上，再佳的為10ng/ml以上，更佳的，25ng/ml以 上，更進一步的，為50ng/ml以上。
8. 如權(quán)利要求2所述肌肉干細胞體外培養(yǎng)方法，其特征在于，所添加的述血液細胞的 細胞因子至少包括 ILl、IL4、IL13、TNF alpha、IL2 和 IFN gamma。
9. 如權(quán)利要求8所述肌肉干細胞體外培養(yǎng)方法，其特征在于，所述添加有血液細胞的 細胞因子的細胞培養(yǎng)基或血液細胞的條件培養(yǎng)基中，添加的IL1、IL4、IL13、TNF alpha、IL2 和IFN gamma的濃度之和不低于6ng/ml，較佳地為50_1250ng/ml。
10. 如權(quán)利要求8所述肌肉干細胞體外培養(yǎng)方法，其特征在于，所述添加有血液細胞的 細胞因子的細胞培養(yǎng)基或血液細胞的條件培養(yǎng)基中，所述IL1、IL4、IL13、TNF alpha、IL2 和IFN gamma中任一種的濃度均不低于0. 5ng/ml，較佳的為lng/ml以上，更佳為10ng/ml 以上，一般可選擇50_500ng/ml。
11. 一種肌肉干細胞培養(yǎng)基，為添加有血液細胞的細胞因子的細胞培養(yǎng)基或血液細胞 條件培養(yǎng)基。
12. 如權(quán)利要求11所述的肌肉干細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述添加有血液細胞的細 胞因子的細胞培養(yǎng)基中所添加的血液細胞的細胞因子，或用于制備所述血液細胞條件培養(yǎng) 基的血液細胞，均與待培養(yǎng)的肌肉干細胞來源于相同的動物物種。
13. 如權(quán)利要求12所述的肌肉干細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述血液細胞條件培養(yǎng)基 為淋巴細胞條件培養(yǎng)基。
14. 如權(quán)利要求13所述的肌肉干細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述血液細胞條件培養(yǎng)基 為B細胞條件培養(yǎng)基或T細胞條件培養(yǎng)基。
15. 如權(quán)利要求12所述的肌肉干細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述添加的血液細胞 的細胞因子選自以下細胞因子中的多種：GM-CSF、sICAM-1 ;IFN gamma、IL1、IL-Ialpha receptor、ILlalpha、IL-3、IL2、IL-10、IL-16、IL13、IL-17、IP-10、SCYA2、MIG、MIP-lalpha、 TGF-beta、IL-4、TRAF6、FGF、IGF、PDGF、LIF、mTOR、LPS、TLRl、IL12、IL23、NGF、TNFalpha 和 ILlbeta0
16. 如權(quán)利要求12所述的肌肉干細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述添加有血液細胞的細 胞因子的細胞培養(yǎng)基或血液細胞的條件培養(yǎng)基中，所述添加的血液細胞的細胞因子總濃度 不低于6ng/m 1，較佳地為50_4500ng/ml。
17. 如權(quán)利要求12所述的肌肉干細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述添加有血液細胞的細 胞因子的細胞培養(yǎng)基或血液細胞的條件培養(yǎng)基中，任一添加的血液細胞的細胞因子的濃度 均在0· 5ng/ml以上，較佳的為lng/ml以上，再佳的為10ng/ml以上，更佳的，25ng/ml以上， 更進一步的，為50ng/ml以上。
18. 如權(quán)利要求12所述的肌肉干細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所添加的述血液細胞的細 胞因子至少包括 IL1、IL4、IL13、TNF alpha、IL2 和 IFN gamma。
19. 如權(quán)利要求18所述的肌肉干細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述添加有血液細胞的細 胞因子的細胞培養(yǎng)基或血液細胞的條件培養(yǎng)基中，添加的IL1、IL4、IL13、TNF alpha、IL2 和IFN gamma的濃度之和不低于6ng/ml，較佳地為50_1250ng/ml。
20. 如權(quán)利要求18所述的肌肉干細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述添加有血液細胞的細 胞因子的細胞培養(yǎng)基或血液細胞的條件培養(yǎng)基中，所述ILl、IL4、IL13、TNF alpha、IL2和 IFN gamma中任一種的濃度均不低于0. 5ng/ml，較佳的為lng/ml以上，更佳為10ng/ml以 上，一般可選擇50_500ng/ml。
21. 血液細胞的細胞因子或血液細胞條件培養(yǎng)基在肌肉干細胞體外培養(yǎng)中的用途。
22. 如權(quán)利要求21所述的用途，其特征在于，所述血液細胞的細胞因子或血液細胞條 件培養(yǎng)基用于促進肌肉干細胞在體外的增殖并使體外增殖的肌肉干細胞保持干性。
23. -種用于治療肌肉退行性疾病的制劑，是以權(quán)利要求1-10任一權(quán)利要求所述的肌 肉干細胞體外培養(yǎng)方法培養(yǎng)獲得的肌肉干細胞為主要活性成分的制劑。
24. 如權(quán)利要求23所述的制劑，其特征在于，所述制劑以來源于病人本體的肌肉干細 胞經(jīng)所述的肌肉干細胞體外培養(yǎng)方法培養(yǎng)獲得的肌肉干細胞為主要活性成分。
【文檔編號】A61P21/00GK104212760SQ201310205059
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月29日
【發(fā)明者】胡蘋, 傅鑫, 肖俊, 郭恒江, 李升 , 劉燕, 王紅艷 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院