由具有特定免疫顯性表位的嬰兒利什曼蟲(chóng)pfr1蛋白片段組成的嵌合分子可用于抗利什曼 ...的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種獨(dú)立核苷酸序列，它是編碼嬰兒利什曼蟲(chóng)PFR1蛋白或其片段的序列，其中的PFR1蛋白或其片段含有至少一種從以下組別中選取的免疫顯性表位：SEQ?ID?No：1、SEQ?ID?No：2、SEQ?ID?No：3、SEQ?ID?No：4、SEQ?ID?No：5、SEQ?ID?No：6、SEQ?ID?No：7和SEQ?ID?No：8，其中的免疫顯性表位可以誘導(dǎo)動(dòng)物抗原特異性T細(xì)胞毒性免疫反應(yīng)，該反應(yīng)的對(duì)象為導(dǎo)致利什曼病的動(dòng)質(zhì)體。上述免疫顯性表位激活的T細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞，并對(duì)I類(lèi)A2型MHC分子具有高度結(jié)合親和力。
【專(zhuān)利說(shuō)明】由具有特定免疫顯性表位的嬰兒利什曼蟲(chóng)PFR1蛋白片段組成的嵌合分子可用于抗利什曼病的免疫療法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于化學(xué)和藥品行業(yè)，醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、寄生蟲(chóng)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及用于控制利什曼病的免疫學(xué)工具。所述疾病是由利什曼蟲(chóng)屬中不同種類(lèi)的原蟲(chóng)所引起。
【背景技術(shù)】
[0002]利什曼蟲(chóng)屬的物種(原生動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)寄生蟲(chóng))屬于動(dòng)質(zhì)體目錐蟲(chóng)科，分布于全球的熱帶和亞熱帶地區(qū)，會(huì)引起名叫利什曼病的廣泛臨床癥狀。根據(jù)引發(fā)疾病的物種不同，利什曼病可以分為皮膚型、皮膚粘膜型和內(nèi)臟型(根據(jù)其組織嗜性和臨床引起的癥狀)。利什曼病近年的發(fā)病率大幅上升，成為遍及全大陸88個(gè)國(guó)家的地方病，據(jù)稱(chēng)有3.5億人面臨感染該疾病的風(fēng)險(xiǎn)。(WHO報(bào)告,http: "who, int/ctd/html/leisdis.html)。據(jù)估計(jì)，全球約有1200萬(wàn)人受利什曼病的影響。在每年200萬(wàn)的新發(fā)病例中，500，000例為內(nèi)臟型利什曼蟲(chóng)病(VL)。該疾病是由嬰兒利什曼蟲(chóng)和杜氏利什曼蟲(chóng)引起的，癥狀包括間歇熱、貧血、脾腫大、肝腫大和淋巴結(jié)病。VL會(huì)使受影響病人的免疫力下降，引起合并感染，所以常導(dǎo)致死亡。近年，利什曼蟲(chóng)/HIV合并感染成為地中海地區(qū)國(guó)家的主要健康問(wèn)題。在這些國(guó)家中，犬類(lèi)是主要宿主，是人類(lèi)該疾病的儲(chǔ)主(Alvar等人.2004國(guó)際寄生蟲(chóng)學(xué)期刊57:1_88)。
[0003]接種疫苗是預(yù)防傳染病因子引起疾病和死亡的最有效治療方法。盡管如此，目前對(duì)抗病原體的高效疫苗非常少，其中一種疫苗能有效對(duì)抗傳染病因子。近年，在不同的利什曼原蟲(chóng)中對(duì)多種抗原疫苗及其制品進(jìn)行試驗(yàn)，并得出了迥然不同的結(jié)果(Kedzierski等人.2010.世界傳染病雜志 2(2):177-85 ；Kedzierski 等人.2006.寄生蟲(chóng)學(xué)，133:87-112 ；Requena等人.2004.生物療法專(zhuān)家評(píng)論4 (9): 1505-17)。但到目前為止，還沒(méi)找到令人完全滿(mǎn)意的疫苗。
[0004]對(duì)抗疾病的另一個(gè)選擇是治療藥物，或在沒(méi)有治療藥物時(shí)，采用化學(xué)免疫療法。試驗(yàn)在含佐劑的巴氏消毒完整寄生蟲(chóng)(Convit等人.2003醫(yī)學(xué)和衛(wèi)生學(xué)97:469-72)以及寄生蟲(chóng)和抗原的混合物中進(jìn)行(Badaro等人.2006感染性疾病雜志194:1151-9)，但和疫苗的情況相類(lèi)似，試驗(yàn)沒(méi)有取得最終的成功(El-OnJ.2009.以色列醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)期刊11(10):623-8)。
[0005]如上文所述，犬類(lèi)是該疾病的主要儲(chǔ)主，所以也從對(duì)抗這種人畜共患病的免疫學(xué)角度出發(fā)，做出了一些嘗試。事實(shí)上，利什曼病對(duì)犬類(lèi)來(lái)說(shuō)是嚴(yán)重的寄生蟲(chóng)病。最常見(jiàn)的臨床癥狀是脫毛，特別是眼睛、耳朵和鼻子周?chē)拿?。?dāng)疾病進(jìn)一步惡化時(shí)，狗沒(méi)有食欲且體重下降，且皮膚通常會(huì)出現(xiàn)傷口，特別是頭部和腿部，并出現(xiàn)腎衰竭的相關(guān)癥狀。該疾病是西班牙大部分地區(qū)以及地中海地區(qū)絕大部分國(guó)家的地方病。
[0006]和在人類(lèi)中的情況相似，人們?yōu)榭刂圃摷膊∽龀隽硕喾矫娴膰L試，但迄今為止還未得到完全令人滿(mǎn)意的成功(Alvar等人.2004.國(guó)際寄生蟲(chóng)學(xué)期刊57:1_88 ;Reis等人.2010寄生蟲(chóng)學(xué)趨勢(shì)26 (7): 341-9).[0007]無(wú)論是人類(lèi)還是犬利什曼病，最具有潛力的控制方法之一都指向使用DNA疫苗。該疫苗攜帶多個(gè)編碼特定利什曼蟲(chóng)抗原或含不同寄生蟲(chóng)抗原的嵌合重組蛋白的基因(De Oliveira 等人.2009 國(guó)際寄生物學(xué) 58(4):319-24 ；Palatnik-de-Sousa, 2008.疫苗26:1709-1724).[0008]PFR蛋白(副鞭毛桿蛋白)代表了一個(gè)tripanosomatids相關(guān)特定抗原的家族,位于這些寄生蟲(chóng)的副鞭毛區(qū)(Fouts等人.，1998生物化學(xué)雜志273 (34): 21846-21855 ；Clark等人.，2005.寄生蟲(chóng)學(xué)研究雜志96 (5):312-320)。該抗體家族某些成員(PFR1-3蛋白)的高免疫原性尤為突出(Michailowsky等人.，傳染與免疫71 (6):3165-3171)。從克氏錐蟲(chóng)中純化出帶PFRl和PFR2的小鼠免疫，其所誘導(dǎo)的Thl免疫反應(yīng)在實(shí)驗(yàn)性感染試驗(yàn)中，可以減少已接種疫苗并已感染克氏錐蟲(chóng)寄生蟲(chóng)小鼠的心臟組織中克氏錐蟲(chóng)的載量(Morell等人.2006疫苗24:7046-7055)。這些結(jié)果顯示，PFR蛋白可能適合作疫苗使用。根據(jù)這些結(jié)果，發(fā)現(xiàn)從接種PFR小鼠中分離到的淋巴細(xì)胞⑶4+可以激活寄生蟲(chóng)感染的巨噬細(xì)胞，通過(guò)釋放 NO 使寄生蟲(chóng)死亡(Wrightsman 等人.2000 疫苗 18 (14): 1419-27，Miller 等人.1997免疫學(xué)雜志158(11):5330-7)，還可以在缺少B細(xì)胞，但不缺少功能性⑶4+和⑶8+淋巴細(xì)胞的情況下，減少血液中的寄生蟲(chóng)水平。從基因免疫的角度出發(fā)，對(duì)不同動(dòng)質(zhì)體的不同副鞭毛蛋白進(jìn)行了研究。L.mexicana PFR2蛋白在作為DNA和重組蛋白接種后，顯示出免疫原性和保護(hù)能力(Saravia等人.2005疫苗23:984-995)。小鼠在接種含僅編碼克氏錐蟲(chóng)PFR2蛋白基因或嵌合相同病原體的Hsp70蛋白基因的DNA載體后，誘導(dǎo)出高水平的IgG2a型抗PFR抗體。但是，只有接種嵌合疫苗的小鼠激發(fā)產(chǎn)生出IL-12和IFN- Y，并使產(chǎn)生IL-4的細(xì)胞減少，引發(fā)抗克氏錐蟲(chóng)的保護(hù)反應(yīng)(Morell等人.2006疫苗24:7046-7055).[0009]Hsp70蛋白屬于熱休克蛋白(HSP)家族，在多個(gè)不同物種中都具有廣泛的保守性(真核生物和原核生物)。他們通過(guò)發(fā)揮伴護(hù)作用，成為維持細(xì)胞自動(dòng)調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)(Smith, Whitesell等人.1998藥理學(xué)評(píng)論50(4):493-513)。它們有趣的地方在于可以激活免疫系統(tǒng)，突出Hsp70的免疫多功能性。Hsp70蛋白是從腫瘤細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞中獲取，它在體內(nèi)和體外都可以激活CD8+CTL反應(yīng)，對(duì)抗純化出免疫原蛋白細(xì)胞中的多種表達(dá)抗原(Srivastava.2002自然免疫學(xué)評(píng)論2:185-194 ;Wu等人.，2005.癌癥研究65(11):4947-4954)。因此，細(xì)胞外的Hsp70可以和抗原肽形成復(fù)合物，同時(shí)激活A(yù)PCs。這種相互作用激發(fā)一連串事件，包括肽交叉呈遞到⑶8+(限制MHC I)和T⑶4+細(xì)胞(限制MHC II)、分泌促炎細(xì)胞因子、以及樹(shù)突細(xì)胞(DCs)表型及功能的成熟(Asea等人.2000自然醫(yī)學(xué)6:435-442 ；Basu等 人.2001免疫學(xué)14:303-313 ；Harmala等人.2002免疫學(xué)雜志169:5622-5629 ;Tobian 等人.2004 免疫學(xué)雜志 173:5130-5137)。
[0010]我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室進(jìn)行了體外試驗(yàn)，顯示克氏錐蟲(chóng)Hsp70蛋白對(duì)首次接受試驗(yàn)小鼠的脾和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞產(chǎn)生特有的刺激效應(yīng)(MaraPi ? η等欠2QQQ.國(guó)際免疫學(xué)12(12):1685-1693)，導(dǎo)致T細(xì)胞產(chǎn)生快速而強(qiáng)烈的刺激。此外，這種蛋白可以在體外和體內(nèi)產(chǎn)生抗相關(guān)半抗原的混合免疫反應(yīng)(IgGl和IgG2a)。有趣的是，這種反應(yīng)獨(dú)立于TLR2和TLR4受體(Qazi等人.2007疫苗25 (6):1096-1103)。小鼠接種了攜帶編碼克氏錐蟲(chóng)HSP70蛋白和KMPlI蛋白序列的載體后，這種克氏錐蟲(chóng)HSP70蛋白可以引發(fā)抗KMPlI蛋白的特異反應(yīng)。該反應(yīng)是通過(guò)激活I(lǐng)gG2a型特異抗體的產(chǎn)生，以對(duì)抗KMPll (Thomas, Olivares等人.2000DNA和細(xì)胞生物學(xué)19(1):47-57 ；Thomas, Olivares等人.2000熱帶學(xué)報(bào)75⑵:203-210)。此外，小鼠接種了 KMP11-HSP70融合蛋白后，出現(xiàn)細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞反應(yīng)，抗表達(dá)KMPlI蛋白的Jurkat-A2/Kb細(xì)胞，以及那些攜帶對(duì)A2分子具親和力的KMPll衍生肽的細(xì)胞。接種分離KMPll蛋白的小鼠則不出現(xiàn)該反應(yīng)。將Hsp70和杜氏利什曼蟲(chóng)的gp63金屬蛋白酶用于利什曼蟲(chóng)屬時(shí)，獲得了相似的結(jié)果(Kaur等人.2011寄生蟲(chóng)免疫學(xué)33(2):95-103)。
[0011]近年，為對(duì)抗不同種類(lèi)的利什曼蟲(chóng)，疫苗含有滅活的完整寄生蟲(chóng)和/或改良后的抗原及其片段。在對(duì)這些和重組體一樣純化的疫苗進(jìn)行試驗(yàn)后，得出了不同的結(jié)果。因此，根據(jù)我們的數(shù)據(jù)，直到目前為止，之前的試驗(yàn)在人用或犬用疫苗上都沒(méi)有取得完全的成功。盡管現(xiàn)時(shí)使用的化學(xué)療法在許多病例中顯示出一定的療效，但它無(wú)法產(chǎn)生出足夠完全控制和消除疾病的寄生蟲(chóng)清除率。
[0012]5年前，對(duì)PFRl蛋白的A*0201分子限制T細(xì)胞結(jié)合表位進(jìn)行了識(shí)別，以及生成了由嬰兒利什曼蟲(chóng)PFRl蛋白或其片段編碼序列形成的嵌合分子(DNA疫苗)。其中PFRl蛋白作為載體分子，獨(dú)立使用或與HSP70蛋白和/或其片段產(chǎn)物相關(guān)。此外，還在接種小鼠中研究相關(guān)嵌合分子引起的PFRl特異免疫反應(yīng)。
[0013]在文獻(xiàn)記載中，之前的試驗(yàn)并不建議使用從克氏錐蟲(chóng)PFR蛋白分離的肽誘發(fā)CTL反應(yīng)。特別是Wrightsman R.A.等人于2002年發(fā)表的文章中，提到對(duì)多種從克氏錐蟲(chóng)PFR蛋白分離的肽進(jìn)行試驗(yàn)，并評(píng)估這些肽在I類(lèi)-MHC的環(huán)境中，和在該寄生蟲(chóng)人工感染的過(guò)程中是否能被有效處理和呈現(xiàn)，以及它們是否能被接種動(dòng)物的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTLs)識(shí)別(Wrightsman等人.2002寄生蟲(chóng)免疫學(xué)24(8):401-12)。在該研究中，確認(rèn)了 PFRl表位可以結(jié)合鼠類(lèi)的I類(lèi)HLA分子(H-2Kb和H-2Db)，但作者認(rèn)為小鼠接種PFRl或PFR3蛋白無(wú)法使CTLs殺傷這些蛋白或殺傷所識(shí)別的肽。
[0014]因此，就當(dāng)前發(fā)展水平的資料看來(lái)，目前需要證實(shí)嬰兒利什曼蟲(chóng)PFRl抗原蛋白編碼序列所形成嵌合分子的有效性(DNA和/或重組疫苗)。PFRl蛋白含有特殊的表位，獨(dú)立使用或和HSP70蛋白和/或其片段相關(guān)時(shí)，都能作為載體分子誘導(dǎo)CTL反應(yīng)。同時(shí)，還必須測(cè)試其作為抗利什曼蟲(chóng)感染的預(yù)防和治療疫苗，對(duì)人類(lèi)和犬類(lèi)的有效性和安全性。`
【發(fā)明內(nèi)容】
[0015]本發(fā)明是對(duì)抗動(dòng)物和人類(lèi)利什曼病的有用工具。它是以含一系列肽的嬰兒利什曼蟲(chóng)PFRl蛋白或其片段的編碼核苷酸序列(單獨(dú)使用或連同克氏錐蟲(chóng)的Hsp70蛋白)以及含有其基因編碼序列的質(zhì)粒為基礎(chǔ)。這些肽存在于嬰兒利什曼蟲(chóng)的PFRl蛋白中，通過(guò)作為免疫原性介質(zhì)的PFRl蛋白的誘導(dǎo)，CD8+T淋巴球?qū)⑵渥鳛槊庖唢@性表位識(shí)別后顯示出細(xì)胞毒性。人類(lèi)HLA-A*0201會(huì)優(yōu)先表達(dá)被識(shí)別的表位。通過(guò)這些基因和蛋白分子，本發(fā)明為宿主對(duì)抗原蟲(chóng)性寄生蟲(chóng)提供細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，可以有效控制或預(yù)防利什曼蟲(chóng)感染。本發(fā)明所涉及的分子作為預(yù)防醫(yī)療以及治療藥物，可以單獨(dú)使用或結(jié)合抗病毒化學(xué)療法，在對(duì)抗利什曼病的免疫療法中發(fā)揮作用。在單獨(dú)使用的情況下，且開(kāi)發(fā)更多傳統(tǒng)的治療藥物存在許多困難和不便時(shí)，這些分子的使用呈現(xiàn)出一種產(chǎn)業(yè)優(yōu)勢(shì)。盡管藥物治療在大多數(shù)病例中存在一定療效，但主要缺點(diǎn)包括:在其他許多病例中(特別是犬類(lèi))無(wú)法徹底清除寄生蟲(chóng)、整個(gè)治療非常昂貴、存在許多副作用、且耐藥性病例的發(fā)生率正不斷上升。
[0016]本發(fā)明主張一種獨(dú)立核苷酸序列的所有權(quán)。該核苷酸序列的特點(diǎn)是編碼嬰兒利什曼蟲(chóng)的PFRl蛋白或其片段。該P(yáng)FRl蛋白或其片段含有至少一個(gè)以下基因組中的特定優(yōu)勢(shì)免疫表位:SEQ ID No: 1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5、SEQ IDNo:6, SEQ ID No:7和SEQ ID No:8，該優(yōu)勢(shì)免疫表位可以誘導(dǎo)動(dòng)物T細(xì)胞的抗原特異性細(xì)胞毒性免疫反應(yīng)，對(duì)抗動(dòng)質(zhì)體所引起的利什曼病。優(yōu)勢(shì)免疫表位是具細(xì)胞毒性的T淋巴細(xì)胞的活化因子，他們對(duì)A2型I類(lèi)MHC分子具有高度的結(jié)合親和力。
[0017]在本發(fā)明中，“優(yōu)勢(shì)免疫表位”是指可以被淋巴細(xì)胞受體識(shí)別，且可以產(chǎn)生表位特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)的肽片段。
[0018]在本發(fā)明的優(yōu)選方案中，“動(dòng)物”可以是人類(lèi)或?qū)櫸?，更多的時(shí)候是指犬類(lèi)。
[0019]在本發(fā)明的優(yōu)選方案中，“核苷酸序列”是指任何含有DNA的核算序列，特別是基因組DNA、人工合成DNA、RNA、體外轉(zhuǎn)錄RNA、信使RNA、正義或反義序列。因此，本發(fā)明不考慮這些序列的獲得條件，發(fā)明包含從克隆、化學(xué)合成、或酶促過(guò)程得到的生物樣本中所獲取的序列。
[0020]在本發(fā)明的優(yōu)選方案中，“編碼蛋白或其片段的核苷酸序列”是指核苷酸序列在相關(guān)調(diào)控元件(啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)等)對(duì)其表達(dá)具有充分控制的情況下，可以轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)譯所需蛋白或其片段的一個(gè)氨基酸序列。在本發(fā)明中，所需蛋白及其片段以它們的氨基酸序列為特征，也可以以它們的細(xì)胞、成熟過(guò)程以及表達(dá)時(shí)存在的環(huán)境條件為特征。
[0021]在本發(fā)明的優(yōu)選方案中，術(shù)語(yǔ)“氨基酸序列”是指寡肽、肽、蛋白或這三種物質(zhì)片段的序列，可以是天然產(chǎn)生或人工合成。由于本發(fā)明涉及到核苷酸序列編碼的序列，該術(shù)語(yǔ)不僅限于完整的氨基酸序列或與上述蛋白分子相關(guān)的天然氨基酸序列，還指帶有這些天然氨基酸序列的變種。
[0022]在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明主張上述定義的核苷酸序列所有權(quán)。即編碼由SEQID No:12決定的，嬰兒利什曼蟲(chóng)PFRl蛋白的1-595氨基酸。該片段編碼完整的蛋白。
[0023]在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明主張上述定義的核苷酸序列所有權(quán)。即編碼由SEQ ID No:9決定的，嬰兒利什曼蟲(chóng)PFRl蛋白的160-595氨基酸。
[0024]在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明主張上述定義的核苷酸序列所有權(quán)。即編碼由SEQ ID No:10決定的，嬰兒利什曼蟲(chóng)PFRl蛋白的160-548氨基酸。
[0025]在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明主張上述定義的核苷酸序列所有權(quán)。即編碼由SEQ ID No:11決定的，嬰兒利什曼蟲(chóng)PFRl蛋白的160-385氨基酸。
[0026]本發(fā)明還要求保護(hù)一種嵌合分子，成分如下:
[0027](a)最好融合到其中的上述定義的核苷酸序列
[0028](b)編碼克氏錐蟲(chóng)Hsp70蛋白或其片段的核苷酸序列；
[0029]該嵌合分子可以誘導(dǎo)T細(xì)胞的抗原特異性細(xì)胞毒性免疫反應(yīng)，對(duì)抗動(dòng)質(zhì)體引起的利什曼病。
[0030]在本發(fā)明的優(yōu)選方案中，“嵌合分子”是指含有來(lái)自?xún)蓚€(gè)不同物種的核苷酸序列的DNA分子，特別是指來(lái)自嬰兒利什曼蟲(chóng)和克氏錐蟲(chóng)的物種。
[0031]在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明主張上述定義的嵌合分子所有權(quán)。該分子攜帶由SEQ ID No:13所決定，編碼克氏錐蟲(chóng)Hsp70蛋白的核苷酸序列，或帶載體活體的HSP70片段。
[0032] 在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明主張上述定義的嵌合分子所有權(quán)。該分子合并在對(duì)應(yīng)160到595氨基酸的PFRl蛋白基因編碼片段的3’末端(以SEQ ID No:9為特征的)，以及編碼克氏錐蟲(chóng)Hsp70蛋白的核苷酸序列(由SEQ ID n0.:13決定)或帶載體活體的HSP70片段。
[0033]在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明主張上述定義的嵌合分子所有權(quán)。該分子合并在對(duì)應(yīng)160到548氨基酸的PFRl蛋白基因編碼片段的3’末端(以SEQ ID No:10為特征的)，以及編碼克氏錐蟲(chóng)Hsp70蛋白的核苷酸序列(由SEQ ID n0.:13決定)或帶載體活體的HSP70片段。
[0034]在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明主張上述定義的嵌合分子所有權(quán)。該分子合并在對(duì)應(yīng)160到365氨基酸的PFRl蛋白基因編碼片段的3’末端(以SEQ ID No:11為特征的)，以及編碼克氏錐蟲(chóng)Hsp70蛋白的核苷酸序列(由SEQ ID n0.:13決定)或帶載體活體的HSP70片段。
[0035]在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明主張上述定義嵌合分子的所有權(quán)。并在基因編碼片段的3’末端加上編碼克氏錐蟲(chóng)Hsp70蛋白的核苷酸序列(由SEQ ID n0.:13決定)或帶載體活體的HSP70片段。
[0036]本發(fā)明還主張一種重組體或表達(dá)載體的所有權(quán)，它包含:
[0037](a)上述定義的核苷酸序列，或
[0038](b)上述定義的嵌合分子。
[0039]本發(fā)明還主張含上述定義載體的一種重組質(zhì)粒的所有權(quán)。
[0040]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案主張一種成分，尤指藥物或免疫原性成分的所有權(quán)。它包含:
[0041](a)上述定義的核苷酸序列，或
[0042](b)上述定義的嵌合分子。
[0043]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及上述藥物或免疫原性成分用于治療和/或預(yù)防導(dǎo)致利什曼病動(dòng)質(zhì)體感染。
[0044]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種用于治療和/或預(yù)防動(dòng)質(zhì)體感染的預(yù)防或治療疫苗的生產(chǎn)方法，該動(dòng)質(zhì)體會(huì)導(dǎo)致利什曼病。該生產(chǎn)方法使用上述藥物或免疫原性成分。該使用或方案以包含如下階段為特征:
[0045]a)確定所需編碼序列，特別是對(duì)至少一個(gè)以上定義的核苷酸序列進(jìn)行識(shí)別，
[0046]b)使用來(lái)自導(dǎo)致利什曼病的動(dòng)質(zhì)體的基因組DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增至少一種a)中定義的核苷酸序列，以及含有限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)的寡核苷酸。后者的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)被這些內(nèi)切酶消解后，可以讓擴(kuò)增子直接克隆到原核和真核表達(dá)載體中，
[0047]c)克隆至少一種在b)中擴(kuò)增的核苷酸序列，用于產(chǎn)生由該核苷酸序列編碼的蛋白，
[0048]d)通過(guò)親和層析法純化至少一種在c)中獲得的蛋白，即重組蛋白(嵌合體或非嵌合體)，和
[0049]e)產(chǎn)生至少一種無(wú)內(nèi)毒素的DNA載體，用于一種預(yù)防或治療疫苗的安全接種。該疫苗用于治療和/或預(yù)防導(dǎo)致利什曼病的動(dòng)質(zhì)體感染。
[0050] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及上述定義的核苷酸序列、嵌合分子、重組體載體、重組質(zhì)粒、或藥物或免疫原性成分的使用。[0051]較明確的說(shuō)法是，本發(fā)明涉及使用上述定義的核苷酸序列、嵌合分子、重組體載體、重組質(zhì)粒、或藥物或免疫原性成分生成保護(hù)性免疫記憶，為未受導(dǎo)致利什曼病的動(dòng)質(zhì)體感染的動(dòng)物對(duì)抗感染。
[0052]最為確切的說(shuō)法是，本發(fā)明提供使用上述定義的核苷酸序列、嵌合分子、重組體載體、重組質(zhì)粒、或藥物或免疫原性成分，為未受導(dǎo)致利什曼病的動(dòng)質(zhì)體感染的動(dòng)物部分或完全凈化或清除動(dòng)質(zhì)體。
[0053]本發(fā)明在免疫療法方面主要有兩個(gè)明確的選擇一作為預(yù)防疫苗以及將其用于免疫療法對(duì)抗利什曼蟲(chóng)的感染。同樣地，本發(fā)明所涉及的分子/產(chǎn)物可以重組蛋白形式使用，即作為DNA質(zhì)粒(基因疫苗)，或以結(jié)合形式使用。
[0054]因此，所提供產(chǎn)品的第一個(gè)應(yīng)用是通過(guò)這些分子生成保護(hù)性免疫記憶，以對(duì)抗上述原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)在人類(lèi)或犬類(lèi)中所引起的感染，使流行地區(qū)的疾病得到控制(疫苗)。另一個(gè)應(yīng)用是將這些分子作為免疫治療藥物用于已受感染的個(gè)體，以加強(qiáng)宿主的免疫反應(yīng)，以對(duì)抗并控制寄生蟲(chóng)?？梢詥为?dú)使用該治療方法，也可以結(jié)合其它現(xiàn)有的化學(xué)療法，提高寄生蟲(chóng)的整體清除率。如此一來(lái),就能激活和調(diào)節(jié)宿主對(duì)抗寄生蟲(chóng)的免疫反應(yīng),特別是通過(guò)誘導(dǎo)T細(xì)胞毒性抗原特異性反應(yīng)，免疫系統(tǒng)可以消滅大部分化學(xué)治療藥物無(wú)法根治的組織內(nèi)寄生蟲(chóng)，如骨髓或脾臟內(nèi)的寄生蟲(chóng)。
[0055]整個(gè)說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中的詞語(yǔ)“包含”及其變格不排除其它技術(shù)特征、添加劑、成分或步驟。該領(lǐng)域的專(zhuān)家、其它對(duì)象、本發(fā)明表現(xiàn)出的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)都是該說(shuō)明的一部分，也是本發(fā)明實(shí)踐的一部分。以下的圖形和例子用于說(shuō)明本發(fā)明，而非用于限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。
【專(zhuān)利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0056]圖1.純化的PFR-1重組蛋白是在10%的SDSPAGE膠中進(jìn)行電泳，并通過(guò)馬斯亮藍(lán)染色法顯色。麗.蛋白分子。`
[0057]分子量標(biāo)志。
[0058]圖2.測(cè)定巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的一氧化氮(NO)濃度。該巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)脂多糖(LPS)刺激；脂多糖+多粘菌素B(LPS+PolB);純化的PFR-1蛋白(PFR-1);純化的PFR-1蛋白+多粘菌素B(PFRl+PolB) ;L_單甲基檸檬酸精氨酸(LNMMA);純化的PFR-1蛋白+L-單甲基檸檬酸精氨酸(PFR1+LNMMA)。濃度單位為ymol/升。
[0059]圖3.對(duì)經(jīng)pCMV4空白載體(通道2)和pCMV4PFRl (通道3)轉(zhuǎn)染的C0S-7細(xì)胞所表達(dá)的PFR-1和PFR1-Hsp70蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析；pCMV4PFRl-Hsp70 (通道4)和pCMV4PFRl-Th70(通道5)的構(gòu)建。沒(méi)用使用轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對(duì)照(通道I)。蛋白分子量標(biāo)志(通道6)?？筁iPFRl的多克隆抗體(A組)、TcHsp70 (B和C組)。
[0060]圖4.A組。來(lái)自于接種生理鹽水，以及接種pCMV4PFR-l和pCMV4PFRlHsp70載體的小鼠，第四次接種后的第14天(灰色條)和第40天(黑色條)血清中抗PFR-1重組蛋白的IgG抗體水平。B組。在A組小鼠(第4次接種后的第14和40天)中檢測(cè)到的PFR-1重組蛋白特異性IgGl (灰色條)和IgG2a(黑色條)抗體的水平。條形代表每組光密度的平均值。
[0061]圖5.C57BL/6小鼠接種生理鹽水(SS)、pCMV4質(zhì)粒(pCMV4)或接種PCMV4PFR-1 (PFRl)、pCMV4PFR-l_Hsp70 (70c)和 pCMV4PFR_l 截短型 Hsp70 (70t)重組載體，經(jīng)嬰兒利什曼蟲(chóng)感染性前鞭毛體激發(fā)14和21天后，血清中的抗利什曼蟲(chóng)可溶性抗原(SLA、A、B25和C組)和PFRl重組蛋白(D組)的抗體水平。
[0062]圖6.接種生理鹽水(SS)和pCMV4空白載體(pCMV4)以及接種pCMV4PFR_l (PFRl)、pCMV4接PFR-1-Hsp70 (70c)和pCMV4PFR_l截短型Hsp70 (70t)小鼠的淋巴增殖性反應(yīng)。刺激指數(shù)的計(jì)算方法是[(cpm(刺激培養(yǎng)物)算術(shù)均數(shù)_cpm(對(duì)照培養(yǎng)物)算術(shù)均數(shù))/cpm算術(shù)均數(shù)]。結(jié)果代表3個(gè)獨(dú)立免疫實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0063]圖7.C57BL/6小鼠接種生理鹽水(SS)和pCMV4空白載體(pCMV4)以及接種PCMV4PFR-1 (PFRl)、pCMV4PFR-l_Hsp70 (70c)和 pCMV4PFR_l 截短型 Hsp70 (70t)，經(jīng)嬰兒利什曼蟲(chóng)激發(fā)后，應(yīng)對(duì)脂多糖(LPS)、培養(yǎng)基(Medium)、利什曼蟲(chóng)可溶性抗原(SLA)和PFRl重組蛋白的腹膜巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的一氧化氮(NO)。
[0064]圖8.小鼠接種生理鹽水(SS)和pCMV4空白載體(pCMV4)以及接種PCMV4PFR-1 (PFRl)、pCMV4PFR-l_Hsp70 (70c)和 pCMV4PFR_l 截短型 Hsp70 (70t)，經(jīng)嬰兒利什曼蟲(chóng)感染性前鞭毛體激發(fā)14和21天后，脾臟、肝臟和骨髓的寄生蟲(chóng)負(fù)載量。
[0065]圖9.HLA*02:01限制型PFRl衍生肽與TAP缺失型T2細(xì)胞的結(jié)合測(cè)定。配合物最大穩(wěn)定性的計(jì)算是以HB-ENV334 - 342肽熒光指數(shù)為參照物。在每種肽的不同濃度下測(cè)定每種肽的集合。
[0066]圖10.B6-A2/KL.小鼠接種生理鹽水(SS)或接種pCMV4PFRl (PFRl)或CMV4PFR1-Hsp70 (PFR1-HSP70)重組載體后，通過(guò)脾細(xì)胞中ELISP0T分泌的GzB，評(píng)估8種選定PFRl肽的⑶8+T淋巴球特異性細(xì)胞毒活性。通過(guò)KS ELISP0T設(shè)備(Zeiss)可以看見(jiàn)斑點(diǎn)。只講邊界模糊的大斑點(diǎn)作為斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC)進(jìn)行評(píng)分。假如(i)在減去陰性對(duì)照(不含肽的脾細(xì)胞)后，檢測(cè)到至少150SFC/106個(gè)脾細(xì)胞，以及(ii)反應(yīng)至少為陰性對(duì)照的兩倍，則認(rèn)為反應(yīng)是顯著的。
[0067]圖11.B6-A2/KL.小鼠`感染利什曼蟲(chóng)感染性前鞭毛體后，通過(guò)脾細(xì)胞中ELISP0T分泌的GzB，評(píng)估8種選定PFRl肽的⑶8+T淋巴球特異性細(xì)胞毒活性。通過(guò)KS ELI SPOT設(shè)備(Zeiss)可以看見(jiàn)斑點(diǎn)。只講邊界模糊的大斑點(diǎn)作為斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC)進(jìn)行評(píng)分。假如
(i)在減去陰性對(duì)照(不含肽的脾細(xì)胞)后，檢測(cè)到至少250SFC/106個(gè)脾細(xì)胞，以及(ii)反應(yīng)至少為陰性對(duì)照的兩倍，則認(rèn)為反應(yīng)是顯著的。
[0068]圖12.B6-A2/KL.小鼠感染利什曼蟲(chóng)感染性前鞭毛體后，通過(guò)脾細(xì)胞中ELISP0T分泌的GzB，評(píng)估8種選定PFRl肽的CD8+T淋巴球特異性細(xì)胞毒活性。使用未接種動(dòng)物作為對(duì)照。通過(guò)KS ELISP0T設(shè)備(Zeiss)可以看見(jiàn)斑點(diǎn)。只講邊界模糊的大斑點(diǎn)作為斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC)進(jìn)行評(píng)分。假如(i)在減去陰性對(duì)照(不含肽的脾細(xì)胞)后，檢測(cè)到至少75SFC/106個(gè)脾細(xì)胞，以及(ii)反應(yīng)至少為陰性對(duì)照的兩倍，則認(rèn)為反應(yīng)是顯著的。
[0069]圖13.通過(guò) 3 種 HLA-A2-結(jié)合親和性算法-SYPFEI TH I (http://www.syfpeith1.de)、RANKPEP(http://immunax.dfc1.harvard.edu/Tools/rankpep.html)和 BIMAS(理論
半離解期，www.bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)-對(duì)推導(dǎo)的 PFRl 基因氨基酸序
列進(jìn)，以預(yù)測(cè)嬰兒利什曼蟲(chóng)PFRl蛋白中的潛在HLA-A*02:01配體。
[0070]圖14.A 組。小鼠第 4 次接種生理鹽水、pCMV4436aaPFRl 和 pCMV4436aaPFRlHsp70載體后的第14天(黑色條)和第40天(灰色條)，血清中抗PFRl重組蛋白的IgG抗體水平。B組。在A組小鼠(第4次接種后的第14天和第40天)中所檢測(cè)到的PFRl重組蛋白特異性IgGl (黑色條)和IgG2a(灰色條)抗體水平。條形代表每組光密度的平均值。
[0071]圖15.接種生理鹽水(SS)或接種 pCMV4436aaPFRl(436aaPFRl)和 pCMV4436aaPFR1-HSP70 (436aa PFR1HSP70)小鼠的淋巴增殖性反應(yīng)。刺激指數(shù)的計(jì)算方法是[(cpm(刺激培養(yǎng)物)算術(shù)均數(shù)-cpm (對(duì)照培養(yǎng)物)算術(shù)均數(shù))/cpm算術(shù)均數(shù)]。結(jié)果代表3個(gè)獨(dú)立免疫實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0072]圖16.B6-A2/KL.小鼠接種生理鹽水(SS)或接種 pCMV4436aaPFRl 或 pCMV4436aaPFR1-Hsp70重組載體后，通過(guò)脾細(xì)胞中ELISP0T分泌的GzB，評(píng)估8種選定PFRl肽的CD8+T淋巴球特異性細(xì)胞毒活性。通過(guò)KS ELISP0T設(shè)備(Zeiss)可以看見(jiàn)斑點(diǎn)。只講邊界模糊的大斑點(diǎn)作為斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC)進(jìn)行評(píng)分。假如(i)在減去陰性對(duì)照(不含肽的脾細(xì)胞)后，檢測(cè)到至少150SFC/106個(gè)脾細(xì)胞，以及(ii)反應(yīng)至少為陰性對(duì)照的兩倍，則認(rèn)為反應(yīng)是顯著的。
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【具體實(shí)施方式】
[0107]本說(shuō)明書(shū)提供以下具體實(shí)例用于說(shuō)明本發(fā)明的性質(zhì)。這些例子僅用于說(shuō)明，不應(yīng)被解讀為對(duì)本發(fā)明的限制。因此，以下例子用于說(shuō)明本發(fā)明，但不限制本發(fā)明在相同領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0108]實(shí)施例1
[0109]1.1.PFRl蛋白誘導(dǎo)一氧化氮(NO)的表達(dá)。
[0110]PFRl蛋白屬于來(lái)自動(dòng)質(zhì)體副鞭毛桿蛋白的特異蛋白家族。在圖1中，我們展示了嬰兒利什曼蟲(chóng)PFRl重組蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)，以及通過(guò)親和層析法進(jìn)行的純化。我們確定該蛋白具有激活一氧化氮(NO)生成的能力，這是巨噬細(xì)胞消除病原體的主要機(jī)制之一，可以消除首次受試小鼠肺泡巨噬細(xì)胞所吞噬的病原體，即無(wú)需治療且以往未感染。一氧化氮產(chǎn)物的這種活化作用給予上述蛋白相關(guān)免疫特性，因?yàn)镹O有助于清除宿主巨噬細(xì)胞中繁殖的利什曼蟲(chóng)的無(wú)鞭毛體。在圖2中，使用LPS(對(duì)照)和PFRl蛋白刺激這些肺泡巨噬細(xì)胞，以獲取其產(chǎn)生的NO數(shù)值。有趣的是，和PFRl蛋白不同，LPS誘導(dǎo)的活化作用被多粘菌素B(LPS誘導(dǎo)活化作用的抑制劑)抑制。多粘菌素B會(huì)去掉PFRl重組蛋白中任何來(lái)自L(fǎng)PS的污染。另一方面，加入L-單甲基檸檬酸精氨酸(LNMMA)后，PFRl蛋白誘導(dǎo)的NO活化作用會(huì)被抑制，表明了這種蛋白的作用機(jī)制。該結(jié)果和PFR1-HSP70融合蛋白的結(jié)果相似。其中，L-單甲基檸檬酸精氨酸(LNMMA)是一種一氧化氮合酶抑制劑。
[0111]1.2.PFRl蛋白在真核細(xì)胞中的表達(dá)。
[0112]通過(guò)分析攜帶編碼PFRl蛋白和克隆到pCMV4質(zhì)粒的HSP70-PFR1和PFR1-H70T嵌合融合蛋白基因的C0S-7轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在真核細(xì)胞中測(cè)定這些蛋白的正確表達(dá)。通過(guò)對(duì)上述各種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和誘導(dǎo)PFRl蛋白多克隆抗體的細(xì)胞提取物進(jìn)行蛋白印跡分析。因此，在圖3中可以分別看到代表70kDa (對(duì)應(yīng)pCMV4PFRl細(xì)胞通道中的PFRl蛋白)、pCMV4PFRl_Hsp70質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C0S-7cells細(xì)胞通道中的140kDa、以及pCMV4PFRl_Hsp70T質(zhì)粒細(xì)胞通道中的96kDa識(shí)別帶。不檢測(cè)含有空白PCMV4質(zhì)粒的細(xì)胞。
[0113]1.3受試分子誘導(dǎo)的抗原特異性體液反應(yīng)。
[0114] 如例子所示，使用100 μ g的不同研究質(zhì)粒和陰性對(duì)照(空白質(zhì)粒和生理鹽水)，對(duì)12只C57BL/6AS系小鼠分組進(jìn)行肌內(nèi)注射接種，然后獲取結(jié)果。每只小鼠接種4次，每?jī)芍芤淮?。?次接種六周后，對(duì)每組的6只小鼠靜脈注射JPCM5 (MCAN/s/98/LLM-724)系嬰兒利什曼蟲(chóng)105感染性前鞭毛體進(jìn)行激發(fā)。
[0115]為分析不同組別小鼠所產(chǎn)生的液體反應(yīng)，每次接種2周后都會(huì)采集血樣并測(cè)定特異性抗體。所獲得的結(jié)果顯示，單獨(dú)接種PFRl基因的小鼠在第2次接種15天后會(huì)出現(xiàn)抗-PFRlIgG抗體，而接種HSP70-PFR1或PFR1-HSP70T融合基因的小鼠則在第3次接種2周后出現(xiàn)。圖4展示了每種分子在第四次接種后第14天和第40天的結(jié)果。小鼠接種融合HSP70基因的PFRl基因后血清中的IgG水平高于接種獨(dú)立PFRl基因的小鼠，峰值在第4次接種后的2周內(nèi)。該同型分析顯示產(chǎn)生的抗體在對(duì)IgG2a同型(Thl型免疫反應(yīng))的反應(yīng)上出現(xiàn)明顯的兩極分化。在PPFR1-H70T分子中獲得相似的結(jié)果。
[0116]圖5給出了 PFRl蛋白體液反應(yīng)試驗(yàn)的結(jié)果，以及小鼠接種所研究分子并經(jīng)嬰兒利什曼蟲(chóng)激發(fā)后的利什曼蟲(chóng)(SLA)總抗原數(shù)。對(duì)這些結(jié)果的分析顯示利什曼蟲(chóng)感染不會(huì)導(dǎo)致抗PFRl的IgG水平出現(xiàn)顯著變化，且在感染前觀察到對(duì)于IgG2a同型存在相同的兩極化結(jié)果O
[0117]1.4研究分子誘導(dǎo)的抗原特異性細(xì)胞反應(yīng)。
[0118]在第四次接種的3周后，進(jìn)行了淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)。在無(wú)菌條件下提取脾細(xì)胞，并在濃度漸增的PFRl重組蛋白中(0.4、2和10 μ g/ml)，對(duì)所獲得的脾細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。此外，在該試驗(yàn)中，分別將一種有絲分裂原(ConA)和未受刺激的脾細(xì)胞作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。如圖6所示，在所獲得的結(jié)果中，當(dāng)重組PFRl存在時(shí)可以觀察到顯著的細(xì)胞增殖率。此外，在接種重組試驗(yàn)蛋白小鼠的脾細(xì)胞中，該刺激是劑量依賴(lài)性的。有趣的是，接種HSP70和HSP70T融合PFRl基因組別的該指數(shù)顯著較高。接種這些融合分子的小鼠的脾細(xì)胞增殖率(IE)約為25，而小鼠接種僅含PFRl基因的質(zhì)粒后，脾細(xì)胞的測(cè)量指數(shù)約為20。兩個(gè)例子的數(shù)值都高于對(duì)照；接種空白質(zhì)粒小鼠的IE = 13，而接種生理鹽水小鼠的IE = 4。在第4次接種的8周后，接種受試分子小鼠的脾細(xì)胞增殖率維持相似的數(shù)值。此外，激發(fā)后的刺激能力保持不變，提示該數(shù)值是小鼠接種獨(dú)立PFRl基因并經(jīng)2 μ g/ml PFRl重組蛋白刺激后的最大增殖率(細(xì)胞反應(yīng))。
[0119]1.5小鼠接種和感染嬰兒利什曼蟲(chóng)后，一氧化氮(NO)的表達(dá)。
[0120]如圖7所示，與接種對(duì)照物的小鼠相比，無(wú)論是否經(jīng)過(guò)刺激，接種受試分子，特別是融合蛋白(PFR1-HSP70或PFR1-HSP70T)小鼠的腹膜巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮(NO)的能力較高。此外，經(jīng)重組PFRl蛋白刺激后，上述接種組別小鼠的NO分泌能力顯著增加。另一方面，與未經(jīng)激發(fā)的小鼠相比，受感染小鼠會(huì)產(chǎn)生更多的NO。
[0121]1.6測(cè)定誘導(dǎo)抗嬰兒利什曼蟲(chóng)感染的保護(hù)能力。
[0122]圖8給出了感染14天和28天后，通過(guò)有限稀釋分析肝臟、脾臟和骨髓(寄生蟲(chóng)目標(biāo)組織)的寄生蟲(chóng)載量(Buffet等人，1995，抗菌物和化學(xué)療法39 (9): 2167-2168)的結(jié)果總結(jié)。感染14天后，所有組別小鼠的肝臟都有寄生蟲(chóng)，但對(duì)照組(ss和pCMV4)的寄生蟲(chóng)載量明顯高于接種了不同受試分子的組別，顯示數(shù)值至少高一個(gè)量級(jí)。此外，和對(duì)照組不同，接種受試分子的小鼠肝臟寄生蟲(chóng)載量在感染28天后沒(méi)有增加。事實(shí)上，接種完整HSP70基因(pPFRl-HSP70)融合PFRl基因的小鼠顯示出較大的肝臟寄生蟲(chóng)清除率。分析脾臟寄生蟲(chóng)載量后，得出相似的結(jié)果。感染14天后，與接種小鼠相比，在對(duì)照小鼠(ss和pCMV4)脾臟組織觀察到的寄生蟲(chóng)載量顯著較高(至少高一個(gè)量級(jí))。事實(shí)上，感染2周后，接種了 HSP70T基因(pPFRl-H70T)融合PFRl基因的小鼠脾臟沒(méi)有寄生蟲(chóng)存在。至于骨髓方面，進(jìn)對(duì)照組(ss和PCMV4)存在寄生蟲(chóng)，檢測(cè)是在感染28天后進(jìn)行。有趣的是，經(jīng)過(guò)接種的小鼠該組織內(nèi)都沒(méi)有寄生蟲(chóng)?？傊诟腥酒陂g，所有分析組別在被分析組織中的寄生蟲(chóng)載量都顯著低于對(duì)照組別(減少值在2到4個(gè)量級(jí)之間)，顯示靜脈注射這些分子能提供高水平的抗嬰兒利什曼蟲(chóng)保護(hù)。
[0123]對(duì)接種小鼠和對(duì)照組別脾細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)模式進(jìn)行對(duì)比(使用小鼠Thl/Th2細(xì)胞因子CBA - BD生物科學(xué)試劑盒，測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的血細(xì)胞計(jì)數(shù))，顯示與對(duì)照組相比，接種PFR1-HSP70和PFR1-H70T嵌合物的小鼠，經(jīng)rPFRl和/或SLA刺激后或未經(jīng)刺激時(shí)，存在具統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的較高水平TNF- α和IFN- y (Ρ〈0.01)。但是，在IL-2或IL-4水平方面，各個(gè)組別之間不存在具統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的差異。同樣地，在利什曼蟲(chóng)激發(fā)后，通過(guò)測(cè)量⑶80、⑶86和⑶40表面分子的表達(dá)模式，對(duì)所有小鼠組別(試驗(yàn)組和對(duì)照組)的脾臟巨噬細(xì)胞活化水平進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，感染21天后，與對(duì)照組相比，接種PFR1-HSP70和PFR1-H70T嵌合物組別的⑶86和⑶40的表達(dá)明顯較高(P〈0.01)。
[0124]1.7確定嬰兒利什曼蟲(chóng)PFRl蛋白中的T⑶8+表位。
[0125]可以通過(guò)⑶8+T細(xì)胞的識(shí)別作用，確定嬰兒利什曼蟲(chóng)PFRl蛋白序列的表位。作為宿主細(xì)胞毒性抗原特異性反應(yīng)激活的結(jié)果，希望通過(guò)T CD8+表位的確認(rèn)，找到可以結(jié)合HLA-A*0201的表位(在半數(shù)人類(lèi)種群中有表達(dá))。所使用的三個(gè)程序是:SYFPEITH1、RANKPEP和BIMAS。將所推導(dǎo)出的嬰兒利什曼蟲(chóng)PFRl蛋白序列(基因號(hào):AY702344)導(dǎo)入到每個(gè)程序中，然后選擇與HLA-A*0201結(jié)合的算法。頭兩個(gè)程序按照每種肽與HLA分子的理論親和力，分別對(duì)其進(jìn)行評(píng)分。另一方面，BIMAS關(guān)注的是理論結(jié)合時(shí)間，對(duì)肽與HLA分子的結(jié)合穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)分。綜合這些結(jié)果，選取了 8種在理論上與I類(lèi)HLA分子有高度結(jié)合親和力的表位，并合成相對(duì)應(yīng)的肽=SEQ ID No: 1-1864(FMDIIGVKKV),SEQ ID No:2-1865 (QLDATQLAQV)、SEQ ID No:3-1866 (KLLELTVYNC)、SEQ ID No:4-1868 (KMMEDIMNA), SEQ ID No:5-1869 (AMHDGETQV)、SEQ ID No:6-1871 (QLQERLIEL) SEQID No:7-1872 (MLYLTLGSL)和 SEQ ID No:8-1873 (KMVEYKSHL)。圖 13、表 I 和表 2 給出了不同肽在上述軟件中的分?jǐn)?shù)。
[0126]為測(cè)定與HLA_A*0201分子的結(jié)合能力，對(duì)表達(dá)能力較低的抗原轉(zhuǎn)運(yùn)分子T2進(jìn)行了結(jié)合試驗(yàn)。結(jié)果如圖9所示，顯示所有受試肽對(duì)HLA-A*0201分子都有較好或非常好的結(jié)合親和力，在某些試驗(yàn)中，表現(xiàn)出比對(duì)`照物HB-ENV334_242肽更好的親和力。HB-ENV334_242肽的預(yù)期結(jié)合百分比是100%。
[0127]在肌內(nèi)注射接種pPFRl和pPFRl-HSP70分子的C57BL/6_A2/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠中(對(duì)它們的嵌合基因HLA-A2.1/Kb產(chǎn)物的表達(dá)進(jìn)行了修改，其α I和α 2域與人HLA_A*0201分子相同，而α 3域的穿膜穿質(zhì)機(jī)制都與鼠H_2Kb分子相對(duì)應(yīng))，在試驗(yàn)性免疫的環(huán)境下，對(duì)這些表位的有效表達(dá)能力進(jìn)行分析。用注射生理鹽水(Sigma)的小鼠做陰性對(duì)照。第4次免疫的6周后，在ELISP0T試驗(yàn)環(huán)境中，以抗顆粒酶B抗體做探針，使用受試肽對(duì)不同組別的小鼠進(jìn)行刺激。所獲得的結(jié)果(圖10)顯示，在接種嵌合分子PPFR1-HSP70的小鼠中，有5種肽對(duì)顆粒酶B (CTLs特異性抗原的活化作用)呈陽(yáng)性反應(yīng)，而在接種僅含PFRl基因的分子的小鼠中，有I種肽對(duì)呈陽(yáng)性反應(yīng)。這些結(jié)果表明，以上分子在I類(lèi)-MHC環(huán)境中可以有效加工和表達(dá)。此外，這些結(jié)果還表明，這些獲得陽(yáng)性反應(yīng)的肽可以被接種小鼠的細(xì)胞毒性T淋巴球(CTLs)識(shí)別。
[0128]通過(guò)靜脈注射IO6嬰兒利什曼蟲(chóng)(JPCM5系)感染性前鞭毛體，對(duì)C57BL/6_A2/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行試驗(yàn)性感染后，評(píng)估在該過(guò)程中小鼠產(chǎn)生細(xì)胞毒性反應(yīng)的能力。感染170天后，殺死受感染小鼠，取出它們的脾細(xì)胞或非實(shí)質(zhì)性的肝細(xì)胞，在ELISP0T試驗(yàn)環(huán)境下暴露于受試肽，并使用顆粒酶B做探測(cè)抗體。結(jié)果顯示(圖11和12)，4種受試肽在脾細(xì)胞中對(duì)顆粒酶B呈陽(yáng)性反應(yīng)，3種受試肽在非實(shí)質(zhì)性的肝細(xì)胞中也呈陽(yáng)性反應(yīng)。因此，在寄生蟲(chóng)的試驗(yàn)性感染過(guò)程中，這些肽出現(xiàn)在CTLs中。有趣的是，這四種肽中只有一種在接種小鼠中也呈陽(yáng)性反應(yīng)，顯示抗原表達(dá)在質(zhì)粒免疫接種和試驗(yàn)性感染過(guò)程中存在不同。
[0129]結(jié)論
[0130]例I結(jié)論:結(jié)果顯示小鼠在接種受試分子并激發(fā)后，骨髓中沒(méi)有出現(xiàn)寄生蟲(chóng)。而接種PCMV4空白質(zhì)?；蛏睇}水(對(duì)照)的組別在感染28天后，同一組織出現(xiàn)高寄生蟲(chóng)載量。此外，接種小鼠脾臟和肝臟的寄生蟲(chóng)載量比對(duì)照組別(空白PCMV4質(zhì)?；蛏睇}水)低2到4個(gè)量級(jí)。小鼠接種PPFR1-H70T分子并被利什曼蟲(chóng)感染14天后，脾臟沒(méi)有出現(xiàn)寄生蟲(chóng)。
[0131]實(shí)施例2
[0132]2.1抗原特異性體液反應(yīng)。
[0133]如例所示，結(jié)果來(lái)自于肌內(nèi)注射接種100 μ g不同受試質(zhì)粒以及陰性對(duì)照(注射生理鹽水的小鼠)的C57BL/6系小鼠(12只)。在該例子中，受試質(zhì)粒含有與嬰兒利什曼蟲(chóng)PFRl蛋白片段(氨基酸長(zhǎng)度436)相對(duì)應(yīng)的序列。該片段由PFRl蛋白160到595的氨基酸組成。每只小鼠接種4次，每?jī)芍芤淮巍?br>
[0134]為分析不同組別小鼠生成的體液反應(yīng)，接種兩周后采集了小鼠的血液，并測(cè)量了動(dòng)物血清中的抗體水平。結(jié)果顯示，接種僅含436aaPFRl基因的小鼠在第四次接種的15天后，出現(xiàn)抗PFRlIgG抗體；而接種攜帶融合436aaPFRl-HSP70基因的小鼠，在第三次接種的2周后出現(xiàn)該抗體。圖14(A)展示了每種受試分子在第14天和第40天的結(jié)果。與接種436aaPFRl基因融合HSP70基因的小鼠相比，接種僅含436aaPFRl基因的小鼠IgG水平較低?？贵w的最大值出現(xiàn)在第4次接種后的2周內(nèi)。在所有案例中，抗PFRl抗體水平在第四次注射的6周后顯著下降。同型分析`(B)顯示，抗體中的IgG2a同型(Thl型免疫反應(yīng))反應(yīng)呈現(xiàn)兩極分化。
[0135]2.2抗原特異性細(xì)胞反應(yīng)
[0136]在第四次接種3周后，進(jìn)行了淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)。在無(wú)菌條件下對(duì)脾臟進(jìn)行提取，并將獲得的脾細(xì)胞在濃度漸增(0.4、2和10 μ g/ml)的rPFRl蛋白中進(jìn)行體外培養(yǎng)。此外，分別將一種有絲分裂原(ConA)和未經(jīng)刺激的脾細(xì)胞作為試驗(yàn)的陽(yáng)性和陰性對(duì)照。圖15給出了所獲得的結(jié)果，當(dāng)重組PFRl (rPFRl)存在時(shí)，可以觀察到顯著的細(xì)胞增殖率，此外，在接種重組試驗(yàn)分子的小鼠脾細(xì)胞中，該刺激是劑量依賴(lài)型的。有趣的是，該指數(shù)在接種HSP70和HSP70T融合PFRl基因的組別中明顯較高。接種融合分子小鼠的脾細(xì)胞增殖率(IE)約為22，而對(duì)于接種僅含PFRl基因小鼠，所測(cè)得的脾細(xì)胞增殖率約為18。在兩個(gè)案例中，都高于對(duì)照；生理鹽水，IE = 4。在第四次接種8周后，接種受試分子小鼠的脾細(xì)胞增殖率維持在相似水平。
[0137]在肌內(nèi)注射接種436aaPFRl 和 436aaPFRl_HSP70 分子的 C57BL/6_A2/Kb 轉(zhuǎn)基因小鼠中(對(duì)它們的嵌合基因HLA-A2.Ι/Kb產(chǎn)物的表達(dá)進(jìn)行了修改，其α?和α 2域與人HLA-A*0201分子相同，而α 3域的穿膜穿質(zhì)機(jī)制都與鼠H_2Kb分子相對(duì)應(yīng))，在試驗(yàn)性免疫的環(huán)境下，對(duì)這些表位的有效表達(dá)能力進(jìn)行分析。用注射生理鹽水(Sigma)的小鼠做陰性對(duì)照。第4次免疫的6周后，在ELISP0T試驗(yàn)環(huán)境中，以抗顆粒酶B抗體做探針，使用受試肽對(duì)不同組別的小鼠進(jìn)行刺激。所獲得的結(jié)果(圖16)顯示，在接種嵌合分子436aaPFRl-HSP70的小鼠中，有5種肽對(duì)顆粒酶B(CTLs特異性抗原的活化作用)呈陽(yáng)性反應(yīng)，而在接種僅含436aaPFRl基因的分子的小鼠中，有I種肽對(duì)呈陽(yáng)性反應(yīng)。這些結(jié)果表明，以上分子在I類(lèi)-MHC環(huán)境中可以有效加工和表達(dá)。此外，這些結(jié)果還表明，這些獲得陽(yáng)性反應(yīng)的肽可以被接種小鼠的細(xì)胞毒性T淋巴球(CTLs)識(shí)別。
[0138]總結(jié)例2:結(jié)果顯示PFRl蛋白的436氨基酸片段與完整的蛋白非常相似，擁有相似的免疫反應(yīng)模式(體液、細(xì)胞和細(xì)胞毒性)。因此，由于這些參數(shù)涉及到抗寄生蟲(chóng)的保護(hù)作用，我們認(rèn)為該片段在各個(gè)方面`都可以作為完整蛋白進(jìn)行研究。
【權(quán)利要求】
1.一種用于編碼嬰兒利什曼蟲(chóng)及其片段PFRl蛋白的核苷酸序列，含有以下任一組中至少一個(gè)免疫顯性表位:SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ IDNo:5、SEQ ID No:6、SEQ ID No:7和SEQ ID No:8，該免疫顯性表位可以誘導(dǎo)動(dòng)物T細(xì)胞的抗原特異性細(xì)胞毒性免疫反應(yīng)，對(duì)抗引起利什曼病的動(dòng)質(zhì)體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，編碼嬰兒利什曼蟲(chóng)PFRl蛋白1-595氨基酸是由SEQ ID No:12 決定。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，編碼嬰兒利什曼蟲(chóng)PFRl蛋白160-595氨基酸是由 SEQ ID No:9 決定。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，編碼嬰兒利什曼蟲(chóng)PFRl蛋白160-548氨基酸是由 SEQ ID No:10 決定。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，編碼嬰兒利什曼蟲(chóng)PFRl蛋白160-385氨基酸是由 SEQ ID No:11 決定。
6.一種嵌合分子，包含: (a)權(quán)利要求1-5所述的核苷酸序列，融合到: (b)編碼克氏錐蟲(chóng)Hsp70蛋白及其片段的核苷酸序列； 該嵌合分子可以誘導(dǎo)動(dòng)物T細(xì)胞的抗原特異性細(xì)胞毒性免疫反應(yīng)，對(duì)抗引起利什曼病的動(dòng)質(zhì)體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的嵌合分子，含有由SEQID No:13決定的編碼克氏錐蟲(chóng)Hsp70蛋白的核苷酸序列或其片段。
8.—種重組載體，包含:` (a)權(quán)利要求1-5所述的核苷酸序列，或 (b)權(quán)利要求6-7所述的嵌合分子。
9.一種包含權(quán)利要求8所述的載體的重組質(zhì)粒。
10.一種藥物組合物，包含: (a)權(quán)利要求1-5所述的核苷酸序列，或 (b)權(quán)利要求6-7所述的嵌合分子。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的核苷酸序列的用途，用于治療和/或預(yù)防導(dǎo)致動(dòng)物換利什曼病的動(dòng)質(zhì)體感染。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的權(quán)利要求1-5的核苷酸序列的用途，其中，所述動(dòng)物是指人或犬。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的核苷酸序列的用途，用于生產(chǎn)治療或預(yù)防疫苗。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的生產(chǎn)治療或預(yù)防疫苗的方法，包含以下步驟: (a)確定至少一種權(quán)利要求1-5所述的核苷酸序列， (b)使用來(lái)自導(dǎo)致利什曼病的動(dòng)質(zhì)體的基因組DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增至少一種a)中定義的核苷酸序列，以及含有限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)的寡核苷酸。后者的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)被這些內(nèi)切酶消解后，可以讓擴(kuò)增子直接克隆到原核和真核表達(dá)載體中， (c)克隆至少一種在b)中擴(kuò)增的核苷酸序列，用于產(chǎn)生由該核苷酸序列編碼的蛋白， (d)通過(guò)親和層析法純化至少一種在c)中獲得的蛋白，和 (e)產(chǎn)生至少一種無(wú)內(nèi)毒素的DNA載體，用于預(yù)防或治療疫苗的安全接種。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的核苷酸序列的用途，用于對(duì)照方法中，以測(cè)量引起動(dòng)物利什曼病的動(dòng)質(zhì)體感染程度。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的核苷酸序列的用途，其中，所述動(dòng)物是指人或犬。
17.權(quán)利要求1-5所述的核苷酸序列的用途，用以生成抗導(dǎo)致未感染動(dòng)物換利什曼病動(dòng)質(zhì)體感染的保護(hù)性免疫記憶。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的核苷酸序列的用途，所述動(dòng)物是指人或犬。
19.權(quán)利要求1-5所述的核苷酸序列的用途，用于闡明或清除感染動(dòng)物組織中的部分或全部會(huì)導(dǎo)致利什曼病的動(dòng)質(zhì)體。
20.根據(jù) 權(quán)利要求19所述的核苷酸序列的用途，所述動(dòng)物是指人或犬。
【文檔編號(hào)】A61K39/008GK103890004SQ201280045285
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2012年7月17日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月21日
【發(fā)明者】瑪麗亞·戴爾·卡門(mén)·托馬斯·卡佐拉, 曼紐爾·卡洛斯·洛佩茲·洛佩茲, 達(dá)里安·萊德斯馬·阿羅約 申請(qǐng)人:西班牙國(guó)家研究委員會(huì)