專利名稱：：用于診斷和治療利什曼病的化合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明總的來說涉及利什曼原蟲感染的血清i會斷。更詳細地講本發(fā)明涉及一種或多種利什曼原蟲多肽在方法和診斷試劑盒中的用途，以從生物體和血液供給中篩選利什曼原蟲，并以鑒定有可以發(fā)展成急性內(nèi)臟利什曼病的那些個體。本發(fā)明也涉及用于治療和免疫接種生物體對抗利什曼病的疫苗和藥物組合物。
背景技術(shù)：
：利什曼原蟲生物體是巨噬細胞的胞內(nèi)原生動物寄生蟲，在人體和家禽，主要是狗中引起范圍廣的臨床疾病。在一些感染中，寄生蟲可以在體內(nèi)潛伏許多年。在其它情況下，宿主可以發(fā)展成多種利什曼病形式中的一種。例如，疾病可以無癥狀或可以征^疾為亞臨床的內(nèi)臟利什曼病，它表征為不適、腹瀉和間斷性肝腫大的輕孩i癥狀。亞臨床或無癥狀疾病的患者通?？贵w滴度低，致使疾病難以用標準技術(shù)檢測。或者，利什曼病可以征候為皮膚疾病，所述皮膚疾病是嚴重的醫(yī)學(xué)問題但一般自身限制，或征候為高破壞性粘膜病，該粘膜病不自身限制。最終和最嚴重地，疾病可以征候為涉及脾臟、肝臟和淋巴結(jié)的急性內(nèi)臟感染，該感染不治療的話一般會成為不治之癥。急性內(nèi)臟利什曼病的癥狀包括肝脾大、發(fā)熱、白細胞減少、貧血和血內(nèi)丙種球蛋白過多。利什曼病在全世界的許多地區(qū)，包括巴西、中國、東非、印度和中東地區(qū)，是嚴重的問題。該疾病也是地中海地區(qū)，包括法國南部、意大利、希臘、西班牙、葡萄牙和北非，的地方病。在最近的20年中利什曼病的病例數(shù)量已經(jīng)急劇增加，并且現(xiàn)在全世界存在該疾病的數(shù)百萬病例。現(xiàn)在每年診斷約2百萬新病例，其中的25%為內(nèi)臟利什曼病。然而，目前沒有疫苗或有效的治療可利用。內(nèi)臟利什曼病可以不總是僅基于臨床癥狀來診斷，因為內(nèi)臟利什曼病與通常發(fā)生于同一病區(qū)的其它疾病例如瘧疾、傷寒和肺結(jié)核具有相同的臨床特征。因此，內(nèi)臟利什曼病的診斷多半依賴于寄生蟲學(xué)或血清學(xué)方法。前者是顯微鏡檢測脾臟和骨髓的抽吸物中的無鞭毛體或通過培養(yǎng)抽吸物檢測前鞭毛體。不幸的是，該方法要求骨髓、肝臟、脾臟、或可能需要淋巴結(jié)的活組織檢查，這可以引起患者的繼發(fā)性感染或甚至毀容。另外，連同是侵入性診斷一起，它花費長時間診斷，并且結(jié)果通常是非結(jié)論性的。因此，該方法是侵入的、費時的、和不夠靈敏的，因此使它無效。的確存在侵入性和耗時較小的實驗室方法，然而，這些方法具有缺乏靈敏度或執(zhí)行麻煩的缺點。例如液體直接凝集試驗(LQDAT:AhfadUniversity,KhartoumandIPB,AddisAbbeba)和冷凍干步桑DAT(FDDAT:Meredith等.1995)具有良好的靈敏度，但需要多個吸液和溫育步驟，這使所述試驗難以在發(fā)展中國家施行。相似地，尿中膠享L抗原凝集試驗(LatexAntigenAgglutinationTestinUrine)(KATEX:KalonBiologicalLtd-UK)具有良好的靈敏度和特異性，但需要麻煩的尿液煮沸步驟并還具有低重現(xiàn)性的缺點。最終，rK39和rK26浸漬檢查法(dipsticktest)(Inbios,Seattle,WA)可以在約幾分鐘10內(nèi)快速給出結(jié)果，但這些試驗在某些地理區(qū)域例如蘇丹、埃塞俄比亞和肯尼亞缺乏靈敏度。因為浸漬檢查法可以容易地、快速地、和提供得起地實現(xiàn)，但仍然具有缺乏抗原靈敏度的缺點，所以新抗原的發(fā)現(xiàn)對于利什曼病的更準確診斷是必需的。在先前報道的確定的利什曼原蟲抗原中，在靈敏度和特異性方面rK39似乎是內(nèi)臟利什曼病血清診斷的最佳抗原。rK39甚至在試驗紙形式(stripformat)上是靈敏的和可靠的，該試驗紙形式可在野外使用，并且rK39試驗紙檢驗在印度、尼泊爾和巴西具有高靈敏度。然而，在蘇丹、埃塞俄比亞和肯尼亞，試驗紙檢驗的靈敏度下降到67%,并且試驗紙檢驗的陰性反應(yīng)通過ELISA似乎與較低反應(yīng)性有關(guān)。因此，需要新診斷性抗原來彌補rK39的不足，以促進利什曼病的更準確診斷的發(fā)展。本發(fā)明滿足了這些需要和許多其它相關(guān)的需要。發(fā)明概述簡要地陳述，本發(fā)明涉及用于檢測與治療個體和血液供給中的利什曼病的化合物和方法。更具體地講，公開了提供診斷、預(yù)防、治療和檢測利什曼病感染和刺激患者的免疫應(yīng)答的化合物和方法。所公開的化合物包括多肽和融合蛋白或它們變體，其含有一種或多種利什曼原蟲抗原的至少一個免疫原性部分。另外，公開了從篩選文庫中篩選具有免疫原性的串聯(lián)重復(fù)蛋白質(zhì)的方法。描述了含多核苷酸、多肽、融合蛋白及其變體的可用于預(yù)防和治療利什曼病、以及用于檢測利什曼病感染的疫苗和藥物組合物。在一個實施方案中，公開了檢測利什曼原蟲感染的方法，該方法包括以下步驟首先，使生物樣品與包含至少一個串聯(lián)重復(fù)單位的多肽接觸，其中該串聯(lián)重復(fù)單位包含與選自SEQIDNO:l-59的氨基酸序列具有同源性的氨基酸序列；第二，檢測生物樣品中抗體的存在情況以檢測利什曼病感染。相關(guān)的實施方案包括使用包含SEQIDiiNO:I-59中的一種或多種氨基^列的串聯(lián)重復(fù)蛋白質(zhì)和融合蛋白的類似方法。在又一實施方案中，公開了用于檢測利什曼原蟲感染的、包含上述多肽的診斷試劑盒。在本發(fā)明的又一實施方案中，公開了編碼上述多肽的DNA序列以及所述DNA的表達載體和宿主細胞。公開了另外的實施方案，其中所公開的多肽用于藥理學(xué)組合物中，并公開了使用這些藥理學(xué)組合物來治療、檢測和免疫接種對抗利什曼原蟲感染的相關(guān)方法。在其他實施方案中，公開了用于篩選免疫原性多肽的方法，該方法包括以下步驟構(gòu)建篩選文庫、用生物樣品篩選該文庫并分析經(jīng)鑒定的序列以選出串聯(lián)重復(fù)基因。對于本發(fā)明的實施方案而言還公開了又一方法，其中選擇一種或多種多肽或多核苷酸序列，然后篩選出串聯(lián)重復(fù)域，從而篩選免疫原性多核苷酸或免疫原性多肽。附圖簡迷參考以下附圖下面詳細描述本發(fā)明的優(yōu)選的和替換的實施方案圖l顯示串聯(lián)重復(fù)基因的代表性PCR分析。使用嬰兒利什曼原蟲(丄.Zw/朋riwm)(Li)、杜氏利什曼原蟲(丄.心wovam')(Ld)、碩大利什曼原蟲(丄.wq/w)(Lm)、亞馬遜矛H十曼原蟲(L.amazowe"w'力(La)和克氏錐蟲(r.craa)(Tc)的總DNA為模板，用對LinJ16.1750、LinJ22.1590和LinJ33.2870的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域或?qū)耸襄F蟲(r.cn^!')基因特異的引物組進行PCIL良應(yīng)。以堿基對顯示大小。圖2舉例說明嬰兒利什曼原蟲(Z.z'"/a""ww)重組蛋白的例示性的表達和純化。所顯示的是未誘導(dǎo)的大腸桿菌(五.co/Z)裂解物(泳道1)、誘導(dǎo)的裂解物(泳道2)和純化的蛋白質(zhì)(泳道3)的考馬斯藍染色的SDS/4-20。/。聚丙烯酰胺梯度凝膠。以kDa顯示大小。圖3呈現(xiàn)對嬰兒利什曼原蟲(Z.z'w/aw"ww)重組蛋白的患者血清反應(yīng)性的指示性酶聯(lián)免疫吸附測定評估。^使用內(nèi)臟利什曼病患者(VL，n-lO)、皮膚利什曼病患者(CL,n=10)、肺結(jié)核患者(TB,n=10)、瘧疾患者(『6)的患者血清、或美國健康對照者的血清(n-lO)。顯示了每組中OD值的平均數(shù)和SEM。圖4顯示人內(nèi)臟利什曼病患者血清對串聯(lián)重復(fù)蛋白質(zhì)的典型的反應(yīng)性。通過ELISA測試內(nèi)臟利什曼病患者(n-35)和健康對照(n-20)的(A)血清對rLinJl6.1750r2或rK39的反應(yīng)性。每組的平均值顯示為實線。虛線代表計算為健康對照的0D值的平均值+3SD的截斷值。圖5例示性地闡明通過8個內(nèi)臟利什曼病患者血清識別重組蛋白，這些血清顯示對rK39的反應(yīng)性低(OD〈1.0,在A中的圓圏)。圖6顯示內(nèi)臟利什曼病患者血清對串聯(lián)重復(fù)蛋白質(zhì)的指示性抗體應(yīng)答。通過ELISA測試內(nèi)臟利什曼病患者(封閉的圓圈n=16)和健康對照(開放的圓圈n-8)的血清對串聯(lián)重復(fù)蛋白質(zhì)的反應(yīng)性，顯示了每個個體的OD值。條代表各組的平均值。詳述如上所述，本發(fā)明涉及用于檢測和防御對抗生物樣品或生物體中利什曼原蟲感染的組合物和方法，另外還涉及用于篩選和鑒定對檢測和防御對抗生物樣品或生物體中利什曼原蟲感染有效的化合物的方法。在一個實施方案中，本發(fā)明提供用于檢測在生物樣品或生物體中利什曼原蟲感染的方法和化合物，包括(a)在足以使樣品中的抗體與下述多肽發(fā)生結(jié)合的條件和持續(xù)時間下，使生物樣品與一種以上多肽或其僅在保守的取代和修飾方面不同的變體接觸，所述多肽中至少一種包含一個以上串聯(lián)重復(fù)單位，其串聯(lián)重復(fù)單位在某些實施方案中包含具有至少8個保守氨基酸并且與選自SEQIDNO:l-59的氨基酸序列有至少70%序列同源性的氨基酸序列；和(b)檢測在生物樣品中與所述多肽特異性結(jié)合的一種或多種抗體的存在情況，從而檢測生物樣品中的利什曼原蟲感染。在另一實施方案中，本發(fā)明提供用于;f企測在生物樣品或生物體中利什曼原蟲感染的方法和組合物，包括(a)在足以使樣品中的抗體與下述多肽發(fā)生結(jié)合的條件和持續(xù)時間下，使生物樣品與包含多肽或其僅在保守的取代或修飾方面不同的變體的組合物接觸，所述多肽具有串聯(lián)重復(fù)單位；和(b)檢測在生物樣品中與多肽結(jié)合的抗體的存在情況，從而檢測在生物樣品中的利什曼原蟲感染。在這些和其它相關(guān)的實施方案中，所述組合物可以包括如本文提供的單個串聯(lián)重復(fù)，或可以包括可相同或不同的兩個或多個串聯(lián)重復(fù)單位。因此該組合物可以包含一個或多個物種的串聯(lián)重復(fù)單位，和/或也可以包括含一個或多個物種的串聯(lián)重復(fù)單位的融合蛋白。在又一實施方案中，本發(fā)明提供用于篩選和選擇對檢測生物樣品或生物體中的利什曼原蟲感染有效的串聯(lián)重復(fù)蛋白質(zhì)的方法，包括(a)構(gòu)建利什曼原蟲篩選文庫；(b)篩選利什曼原蟲篩選文庫；和(c)分析從篩選利什曼原蟲篩選文庫中鑒定的基因，以選出為串聯(lián)重復(fù)基因的基因。在另一實施方案中，本發(fā)明提供用于治療和檢測具有臨床或亞臨床利什曼病感染的患者的利什曼病的系統(tǒng)和方法。本發(fā)明的某些實施方案考慮的多肽包括但不限于包含利什曼原蟲抗原的免疫原性部分的多肽，所述多肽包含在SEQIDNO:l-59中列舉序列。本文所用術(shù)語"多肽"包括任何長度的氨基酸鏈，其包括全長蛋白(即抗原)，其中氨基酸殘基通過肽鍵共價連接成線性聚合物。因此，包含以上抗原中的一種的免疫原性部分的多肽可以完全由免疫原性部分組成，或可以包含添加序列。所述添加序列可以是天然存在的序列(例如得自天然利什曼原蟲抗原的序歹'])或可以是異源的(例如得自包括外源性的天然存在序列和/或人工序列的其它來源)，并且這樣的序列可以(但不必須)是免疫原性的。"具有"詳細列舉序列的抗原是包含所列舉序列的抗原，例如，在其全長序列中包含所列舉的序列。天然抗原可以，或可以不，包含一個或多個添加的氨基酸序列。"分離的"材料、分子、制品指已經(jīng)將它從其天然存在的環(huán)境或來源中移出。例如，在對象或生物源(例如完好的活動物)中染色體上的基因的一部分中存在的多核苷列不是分離的，而從已經(jīng)得自這樣的對象或生物源的生物樣品中提取的DNA將被認為是分離的。在類似的模式中，"分離"可以指在用于從所述材料存在的自然環(huán)境中將其移出的過程或方法中所采取的步驟。本文所用術(shù)語"串聯(lián)重復(fù)"指多核苷酸序列(例如DNA、RNA、重組工程的或合成的寡核苷酸的序列，其包括非天然存在的核苷酸或核苷酸類似物等(包括核普酸才莫擬物)的線性聚合物)的區(qū)域、或分別包含約6-1200個核苷酸序列或2-400個氨基酸序列的多肽或蛋白質(zhì)的區(qū)域，所述區(qū)域重復(fù)串聯(lián)致使序列存在至少兩次。本文所用術(shù)語"串聯(lián)重復(fù)單位"指以串聯(lián)方式重復(fù)的序列的單個單位。此外，術(shù)語"串聯(lián)重復(fù)"也包括DNA的區(qū)域，其中多于單個2-至400-氨基酸或6-至1200-核苷酸的串聯(lián)重復(fù)單位以串聯(lián)或帶有插入堿基或氨基酸的方式重復(fù)，前提是所述序列中至少一種以串聯(lián)方式重復(fù)至少兩次。此外，術(shù)語"串聯(lián)重復(fù)"也包括DNA或蛋白的區(qū)域，其中所述串聯(lián)重復(fù)單位是不同一的。當兩種或多種序列互相之間具有至少70%的同源性，或者是互相之間的合理變體時，這些序列出于包含或構(gòu)成串聯(lián)重復(fù)的意圖將被認為是串聯(lián)重復(fù)單位。同樣地，當序列為至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或更多個氨基酸的串聯(lián)重復(fù)單位時，該序列出于包含或構(gòu)成串聯(lián)重復(fù)的意圖將被認為是串聯(lián)重復(fù)單位。同樣地，當序列為至少約18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51個或任何插入整數(shù)的核苷酸時，該序列出于包含或構(gòu)成串聯(lián)重復(fù)的意圖將被認為是串聯(lián)重復(fù)單位。此外，術(shù)語"串聯(lián)重復(fù)"也包含串聯(lián)重復(fù)其中串聯(lián)重復(fù)的一個或多個串聯(lián)重復(fù)單位是其它串聯(lián)重復(fù)單位的反向序列。反向串聯(lián)重復(fù)單位和非反向串聯(lián)重復(fù)可以以任何方式和具有或不具有插入核苷酸堿基或氨基酸來裝配。反向和非反向序列的構(gòu)型包括但不限于以下的那些構(gòu)型非反向序列后接反向序列；反向序列后接非反向序列；和反向序列后接反向序列。在具有串聯(lián)重復(fù)的雙鏈多核苷酸的情況下，兩個或多個這樣的重復(fù)可以存在于同一鏈上或可以發(fā)生在相反鏈上。在某些優(yōu)選的實施方案中，串聯(lián)重復(fù)可以包含利什曼原蟲抗原的免疫原性部分。利什曼原蟲抗原的免疫原性部分是能夠在目前或以前感染利什曼原蟲的患者(例如人或狗)中和/或在從目前或以前感染利什曼原蟲的個體中分離的淋巴結(jié)細胞或外周血單核細胞(PBMC)的培養(yǎng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答(即細胞和/或體液免疫應(yīng)答)的部分。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將熟悉用于確定是否已經(jīng)引發(fā)免疫應(yīng)答的廣泛多樣的方法學(xué)和標準中的任何一種。(參見例如，CurrentProtocolsImmunology,JohnWiley&SonsPublishers,NY)。在其中引發(fā)應(yīng)答的細胞可以包含混合的細胞類型或可以包含分離的成分細胞(包括但不限于T細胞、NK細胞、巨噬細胞、單核細胞和/或B細胞)。詳細地講，免疫原性部分能夠誘導(dǎo)T細胞增殖和/或占優(yōu)勢的Thl型細胞因子應(yīng)答(例如，由T細胞和/或NK細胞產(chǎn)生的IL-2、IFN-y、和/或TNF-a;和/或由單核細胞、巨噬細胞和/或B細胞產(chǎn)生的IL-12)。本文所述抗原的免疫原性部分一般可以使用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的技術(shù)、包括本文所提供的代表性方法來鑒定。本發(fā)明的組合物和方法也包含以上多肽的變體。當用于本文時，與另一蛋白質(zhì)"同源"的多肽"變體"或多肽是在一個或多個替換、缺失、添加和/或插入方面不同于天然(例如天然存在)蛋白質(zhì)的多肽，致使多肽的免疫原性基本上沒有降低。例如，相對于天然蛋白質(zhì)而言，變體與抗原特異性抗體、抗血清或T細胞反應(yīng)的能力可以被提高或沒有變化，或相對于天然蛋白質(zhì)而言，可以被降低少于50%,和優(yōu)選少于20%。這樣的變體一i!S:可以通過修飾本文描述的多肽序列之一并評16估修飾的多肽與如本文描述的抗原特異性抗體或抗血清的反應(yīng)性來鑒定。優(yōu)選的變體包括已經(jīng)在其中去除一個或多個部分(例如N-末端前導(dǎo)序列或跨膜區(qū))的那些變體。其它優(yōu)選的變體包括已經(jīng)在其中從成熟蛋白質(zhì)的N-和/或C-末端去除了小部分(例如l-30個氨基酸，優(yōu)選5-15個氨基酸)的變體。本發(fā)明所包括的多肽變體包括顯示與本文公開的多肽有至少約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性(如下所述確定的)的那些多肽變體。優(yōu)選地，變體包含保守取代。"保守取代"是其中的氨基酸被具有相似特性的另一氨基酸取代，致使肽化學(xué)領(lǐng)域中的技術(shù)人員期望多肽的二級結(jié)構(gòu)和親水性基本上沒有改變。氨基酸的取代一般可以在殘基的極性、電荷、可溶性、疏水性、親水性和/或兩親性相似的基礎(chǔ)上進行。例如，帶負電的氨基酸包括門冬氨酸和谷氨酸；帶正電的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；而具有相似親7jc值的不帶電極性頭基的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；和絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸?？梢源肀Ｊ刈兓钠渌M別的氨基酸包括(l)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr;(2)cys、ser、tyr、thr;(3)val、ile、leu、met、ala、phe;(4)lys、arg、Ws;和(5)phe、tyr、trp、his。或可供選擇的是，變體也可以非保守的變化。在優(yōu)選的實施方案中，變體多肽與天然序列有取代、缺失或添加五個或更少氨基酸的不同。變體也可以(或備選)通過，例如，對多肽的免疫原性、二級結(jié)構(gòu)和親水性具有最小影響的氨基酸的缺失或添力口來修飾。可以用本領(lǐng)域已知的任何合適的方法來制備本發(fā)明的多肽。這樣的多肽包括天然存在的多肽、重組產(chǎn)生的多肽、合成產(chǎn)生的多肽、或由這些方法的組合產(chǎn)生的多肽。本文公開的某些相似的實施方案考慮由天然存在的多核苷酸組成的多核苦酸，其具有以5，-至-3，鍵合的糖(例如核糖或脫氧核糖)磷酸鹽骨架，但本發(fā)明不限于此，也考慮由任何許多天然的和/或人造的多核苷酸類似物和/或模擬物組成的多核普酸，例如設(shè)計用于對抗降解或具有其它所需理化性質(zhì)的那些核苦酸，例如具有硫代磷酸骨架的合成多核香酸等等。多核苦酸可以包含天然序列(即編碼蛋白質(zhì)或其部分的內(nèi)源性序列)或可以包含變體、或這樣的序列的生物學(xué)或抗原功能等價物。如以下進一步描述的，多核苷酸變體可以包含一種或多種取代、添加、缺失和/或插入，優(yōu)選致使相對于天然腫瘤蛋白而言所編碼的多肽的免疫原性不降低。一般可以如本文所述的那樣評估對所編碼的多肽免疫原性的影響。術(shù)語"變體"也包括異種來源的同源基因。在比較多核苷酸或多肽序列時，如果在兩個序列中核苷酸或氨基酸的序列當進行如下所述的最大限度對應(yīng)比對時是相同的，則認為這兩個序列是"同一的"。通常通過在比較窗口上比較序列以鑒定和比較序列的局部區(qū)域的相似性，來進行兩個序列之間的比4交。本文所用的"比較窗口"指至少約20、通常30-約75、40-約50個鄰接位點的區(qū)段，其中序列可以與相同數(shù)量鄰接位點(position)的參考序列在兩個序列最優(yōu)化比對之后進行比較。可以使用生物信息學(xué)軟件的Lasergene程序組中的Megalign程序(DNASTAR,Inc.,Madison,Wis.)，使用默認參數(shù)，來進行用于比較的序列的最優(yōu)化比對。該程序包含在以下參考文獻中描述的幾種比3于方案在Dayhoff，M.0.(纟扁壽辱)ylf/oso//Vofe/"Se《wewce5^w"wre,美國生物醫(yī)學(xué)研究基金會，華盛頓市，第5巻，增刊3，第345-358頁中的Dayhoff,M.O.(1978)蛋白質(zhì)進化的模型-用于檢測遠緣關(guān)系的矩P車(Amodelofevolutionarychangeinproteins~Matricesfordetectingdistantrelationships);HeinJ.(1990)比對的統(tǒng)一方法和種系基因(UnifiedApproachtoAlignmentandPhylogenes),第626-645頁，MeA油z'w￡"2^膨/，第183巻，AcademicPress,Inc.,SanDiego，Calif;Higgins:D.G.和Sharp,P.M.(1989)5:151-153;Myers,E.W.和MullerW.(1988)C45/OS4:11誦17;Robinson，E.D.(1971)CowZ.T7^or11:105;Santou,N.Nes,M.(1987)Mo/.說o/.￡vo/.4:406-425;Sneath,P.H.A.和Sokal,R.R.(1973)A^謹en'ca/Zhxowowy~Wwc^p/as朋d尸rac"'ceo/池wzm'ca/r<3xowom_y,FreemanPress,SanFrancisco,Calif;Wilbur,W.J.和Lipman,D.J.(1983)尸rac.iVa".爿cac.，t7X480:726-730。或者，可以通過以下來進行用于比較的序列的最優(yōu)化比對Smith和Waterman(1981)^W.AP丄.Ma^2:482的局部同一性算法、Needlem和Wunsch(1970)/Mo/.5z'o/.48:443的同一性比對算法、Pearson和Lipman(19$8)尸rac.iVa".85:2444的搜索相似性方法、計算機執(zhí)行這些算法(在WisconsinGeneticsSoftwarePackage中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、和TFASTA,GeneticsComputerGroup(GCG),575ScienceDr.,Madison，Wis.)、或檢,瞼(inspection)。適用于確定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一個優(yōu)選的實例是BLAST和BLAST2.0算法，分別在AltschuI等.(1977)M/c/.爿c!A25:3389-3402和Altschul等.(1990)Mo/.所o/.215:403-410中描述了這兩種算法。BLAST和BLAST2.0可以例如與本文所述的參數(shù)一起用于確定本發(fā)明的多核苦酸和多肽的序列同一性百分比。執(zhí)行BLAST分析的軟件通過美國生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)是公開可用的。在一個例i正性實施例中，對于核苷酸序列而言，可以使用參數(shù)M(對匹配的殘基加分；總是X))和參數(shù)N(對不匹配的殘基扣分；總是<0)計算累積分數(shù)。對于氨基酸序列而言，可以使用記分矩陣計算累計分數(shù)。當累計比對分數(shù)由其最大實現(xiàn)值(achievedvalue)下降X個量；當由于一個或多個負分的殘基比對的積累導(dǎo)致累計分數(shù)變?yōu)?或更低；或者當?shù)竭_任一序列的末端的時候，停止代碼擊中(wordhit)向各個方向的延伸。BLAST算法參數(shù)W、T和X確定比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(對于核苷酸而言)使用作為默認值的字長(W)ll、和期望值(E)IO、和BLOSUM62記分矩陣(參見Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915)比對、(B)50、期望值(E)IO、M=5、N;4和兩鏈的比較。優(yōu)選地，"序列同一性的百分比，，通過在至少20個位點的比較窗口上比較兩個最優(yōu)化比對的序列來確定，其中當為了兩個序列的最佳比對與參考序列(不包含添加或缺失)進行比較時，比較窗口中的多核苷酸或多肽序列部分可以包含20%或更少、通常5-15%、或10-12%的添加或缺失(即缺口)。通過以下來計算百分比確定在兩個序列中存在的位于同一核苷酸堿基或氨基酸殘基的位點數(shù)目，以得到配對位點的數(shù)目；配對位點的數(shù)目除以在參考序列中的總位點數(shù)(即窗口大小)并將該結(jié)果乘以100從而得到序列同一性的百分比。因此，本發(fā)明包括與本文公開的序列相比基本上具有同一性的多核普酸和多肽序列，例如使用本文描述的方法(例如，如下文描述的使用標準參數(shù)的BLAST分析)與本發(fā)明的多核苷酸或多肽序列比較，包含至少50o/。序列同一性，優(yōu)選至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、850/0、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的那些多核苷酸和多肽序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到可以通過考慮密碼子簡并性、氨基酸相似性、讀碼框定位等，對這些值適當?shù)剡M行調(diào)整以確定由兩個核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的相應(yīng)的同一性。在此外的實施方案中，本發(fā)明提供分離的多核苷酸和多肽，其包含與本文公開的一個或多個序列同一或互補的不同長度的鄰接序列段。例如，本發(fā)明提供包含以下的多核苷酸本文公開的一個或多個序列中的至少約15、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500或IOOO或更多個以及在此之間的所有中間長度的鄰接核苷酸。容易理解的是，在該上下文中，"中間長度"意指所引用的值之間的任何長度，例如16、17、18、19等;21、22、23等;30、31、32等;50、51、52、53等;100、101、102、103等;150、151、152、153等;包括200-500;500-1,000的所有整數(shù)，等等。本發(fā)明的多核苷酸或其片段，不管編碼序列自身的長度，可以與其它的DNA序列組合，例如啟動子、多腺苦酸化信號、添加的限制性內(nèi)切酶位點、多克隆位點、其它的編碼區(qū)段等，致使它們的總長度可以大幅度地改變。因此所考慮的是，可以使用幾乎任何長度的核苦酸片段，優(yōu)選總長度受到制備的筒易性和在預(yù)期重組DNA方案中的使用的限制。例如，總長度為約10,000、約5000、約3000、約2,000、約l，OOO、約500、約200、約IOO、約50磁基對長度的例示性DNA區(qū)段被考慮為在本發(fā)明的許多實踐中有用。在其它的實施方案中，本發(fā)明涉及能在適度嚴格的條件下與本文提供的多核苷酸序列雜交的多核苷酸或其片段、或其互補序列。雜交技術(shù)在分子生物學(xué)領(lǐng)域是眾所周知的。為了例證，用于測試本發(fā)明的多核苷酸與其它多核苷酸的雜交的合適的適度嚴格條件包括在5倍SSC、0.5%SDS、1.0mMEDTA(pH8.0)溶液中預(yù)洗；在50。C-65°C、5xSSC雜交，過夜；接著分別用含0.1%SDS的2xSSC、0.5xSSC和0.2xSSC在65。C下洗滌20分鐘兩次。此外，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認識的是，由于遺傳密碼的簡并性，有許多編碼如本文所述的多肽的核苷酸序列。這些多核苷酸中的一些與任何天然基因核苷,列相比具有最小同源性。但是，由于密碼子選擇的差異而改變的多核苷酸為本發(fā)明所明確考慮。此外，包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因在本發(fā)明的范圍內(nèi)。等位基因是由于一個或多個突變而改變的內(nèi)源性基因，例如核苷酸的缺失、添加和/或置換。產(chǎn)生的mRNA和蛋白質(zhì)可以但非必須具有改變的結(jié)構(gòu)或功能。等位基因可以使用標準技術(shù)(例如雜交、擴增和/或數(shù)據(jù)庫序列比較)來鑒定。本文描述的"多肽"也包括組合多肽，也稱為融合蛋白。"組合多肽"或"融合蛋白"是包含至少一個上述的免疫原性部分和一個或多個添加的免疫原性利什曼原蟲序列的多肽，經(jīng)由肽鍵連接到單個氨基酸鏈中。序列可以直接連接(即沒有插入氨基酸)或可以經(jīng)由不顯著21降低成分多肽的免疫原性的接頭序列(例如Gly-Cys-Gly)連接。融合蛋白一般可以使用標準技術(shù)包括化學(xué)綴合來制備。優(yōu)選融合蛋白在表達系統(tǒng)中作為重組蛋白表達，致使有相對于非融合蛋白而言提高水平的生產(chǎn)。簡而言之，編碼多肽組分的DNA序列可以單獨裝配，并連接入合適的表達載體中。用或不用肽接頭，將編碼一種多肽組分的DNA序列的3'末端連接到編碼第二多肽組分的DNA序列的5'末端，致使序列的讀碼框在框內(nèi)。這允許翻譯成保留兩種成分多肽的生物活性的單個融合蛋白?？梢岳秒慕宇^序列，通過足以確保每個多肽折疊入其二級和三級結(jié)構(gòu)的距離，來使第一與第二多肽組分分開。使用本領(lǐng)域熟知的標準技術(shù)將這樣的肽接頭序列摻入融合蛋白中?？梢曰谝韵乱蛩剡x擇合適的肽接頭序列(l)它們采用(adopt)彈性伸展構(gòu)象的能力；(2)它們不能采用與第一和第二多肽上的功能性表位相互作用的二級結(jié)構(gòu)；和(3)缺乏可與多肽功能性表位反應(yīng)的疏水的或帶電的殘基。優(yōu)選的肽接頭序列包含Gly、Asn和Ser殘基。其它近中性氨基酸，例如Thr和Ala也可以用于接頭序列中?？梢杂行У赜米鹘宇^的氨基酸序列包括在以下中公開的那些氨基酸序列Maratea等，GWze40:39-46,1985;Murphy等，尸rac.iVa".A^c.t/5L483:8258-8262，1986;美國專利第4,935,233號和美國專利第4，751，180號。接頭序列的長度一般可以為1-約50個氨基酸。當?shù)谝缓偷诙嚯木哂锌梢杂糜诜珠_功能域和防止空間干擾的非必需N末端氨基酸區(qū)時，不需要接頭序列。連接的DNA序列可操作地與合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)元件連接。負責DNA表達的調(diào)節(jié)元件僅位于編碼第一多肽的DNA序列的5'端。類似地，結(jié)束翻譯和轉(zhuǎn)錄終止信號所需的終止密碼子僅出現(xiàn)在編碼第二多肽的DNA序列的3'端。在本發(fā)明的實施方案中，融合蛋白包含一個或多個串聯(lián)重復(fù)單位。在又一實施方案中，一個或多個串聯(lián)重復(fù)單位選自SEQIDN0.1-59。在再一實施方案中，融合蛋白還包含蛋白質(zhì)的抗原部分，例如但不限于在SEQIDNO.119-121中明確公開的rK26、rK39和rLiA2。免疫原性多肽的篩選方法在一個實施方案中，本發(fā)明提供用于篩選和選擇可用于診斷、治療和/或免疫接種對象或生物源例如人類患者，例如用于檢測生物樣品或生物體中的利什曼原蟲感染的串聯(lián)重復(fù)蛋白質(zhì)的方法，該方法包括(a)構(gòu)建利什曼原蟲篩選文庫；(b)篩選利什曼原蟲篩選文庫；和(c)分析從篩選利什曼原蟲篩選文庫中鑒定的基因，以選出為串聯(lián)重復(fù)基因的基因。在又一的實施方案中，可以從例如以下的任何生物體的基因組DNA中構(gòu)建篩選文庫，例如為了舉例說明而并非限制，傳染性的或非傳染性的生物體、或可以是致病性的或非致病性的傳染性生物體，例如細菌、病毒、原生動物、真菌、酵母、雙滴蟲目(diplomonoadid)和動基體目(kinetoplastid)原生動物。在某些實施方案中，可以從遺傳物質(zhì)(即核苷酸)或以下的生物體構(gòu)建篩選文庫引起或能引起利什曼病的生物體，例如嬰兒利什曼原蟲(丄d^wa"/aZ"/a"加w)、杜氏利什曼原蟲(丄e&Awam'flco"ovam')、石貞大矛M十曼原蟲(Z^sAmam-"wq/or)、亞馬遜利什曼原蟲(丄e^/zmam-aflwazo"e似&)、克氏錐蟲(T^i^wcwomacn^')、或引起利什曼病的天然的或非天然的細菌林。在又一實施方案中，可以用核苷酸類包括但不限于DNA和cDNA來構(gòu)建文庫。例如，一個這樣的實施方案考慮用于診斷、治療或免疫接種患者的免疫原性多肽的鑒定方法，該方法包括(a)在一種或多種宿主細胞中，表達多核苷酸表達文庫的表達產(chǎn)物，該多核苷酸表達文庫包含一種或多種編碼候選免疫原性多肽的多核苷酸，該多核苷酸中的至少一種能夠表達包含串聯(lián)重復(fù)的候選免疫原性多肽，以獲得包含表達產(chǎn)物的宿主細胞群；(b)在足以使下述生物材料中的至少一種抗體與至少一種表達產(chǎn)物特異性結(jié)合的條件和持續(xù)時間下，使(i)與(ii)接觸，其中(i)為包含(a)的表達產(chǎn)物的宿主細胞群，(ii)為從已經(jīng)感染以下生物體的對象或生物源獲得的生物材料傳染性的或非傳染性的生物體、或致病性的或非致病性的傳染性生物體，例如細菌、病毒、原生動物、真菌、酵母、雙滴蟲目(diplomonoadid)和動基體目(kinetoplastid)原生動物，或利什曼原蟲生物體或能夠引起利什曼病的其它生物體，其中所述生物材料包含至少一種抗體，并選自血液、血清和尿液；(c)檢測包含至少一種表達產(chǎn)物的至少一種宿主細胞，該表達產(chǎn)物與至少一種抗體特異性結(jié)合；(d)從在(C)中檢測的宿主細胞分離編碼所述表達產(chǎn)物的多核苷酸以獲得分離的多核苷酸，該表達產(chǎn)物與至少一種抗體特異性結(jié)合；和(e)分析(d)所分離的多核苷酸的核香,列是否存在串聯(lián)重復(fù)，其中存在串聯(lián)重復(fù)表明分離的多核苷酸編碼免疫原性多肽，并從此鑒別免疫原性多肽。通過用本領(lǐng)域熟知的方法例如超聲處理或限制性酶切割或剪切DNA,可以完成構(gòu)建多核苷酸篩選文庫例如本文所述的多核苷酸表達文庫。產(chǎn)生的核苷酸片段可以是任何大小的，然而，優(yōu)選平均為1、2或3kb。然后通過本領(lǐng)域熟知的方法例如連接入重組多核苷酸載體中，包括擴增和/或表達載體和用表達載體例如X噬菌體載體或ZAPExpress②載體(Stratagene，LaJolla,CA)表達，來擴增產(chǎn)生的核苷酸片段，以產(chǎn)生多核苷酸篩選文庫例如多核苷酸表達文庫。然后通過將生物材料暴露(expose)至包含所表達的表達文庫產(chǎn)物的宿主細胞來篩選篩選文庫，其中所述生物材料可以是血清、血液、尿液、唾液或已得自已被或正被以下感染的對象或生物源的任何生物材料嬰兒利什曼原蟲(丄eb/imam.az'w/aw似m)、》土氏利fi"曼原蟲(Leb/imam'at/cwovam')、石頁大利"f十曼原、蟲(Le^/i/nam'amaj'oz-)、亞馬遜利4十曼原、蟲(丄eh/zmam'fl"附azo"e"y^y)、克氏4,蟲(T)j^""ayowflcrwzi)、或引起利什曼病的其它天然的或非天然的細菌抹。宿主細胞可以是高等真核細胞，例如哺乳動物細胞(包括腫瘤細胞)，或低等真核細胞，例如酵母細胞，或者宿主細胞可以是原核細胞，例如細菌細胞。本發(fā)明的合適的宿主細胞的代表性實例包括但不必限于細菌細胞例如E.coli、鏈霉菌(5V^ptom少cas)、鼠傷寒沙門氏菌(5"a/moweZ/a&_p/n>ww7'wm);真菌纟田月包，例如酵母；昆蟲細胞，例如果蠅S2和貪夜蛾(&o^/tera)Sf9;動物細胞，例如CHO、COS或293細胞；腺病毒；植物細胞、或已經(jīng)適應(yīng)于體外增殖或由此重新確立的任何合適的細胞。根據(jù)本文的教導(dǎo)，選擇合適的宿主被認為在本領(lǐng)域的技術(shù)人員的范圍內(nèi)。也可以利用各種哺乳動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)來表達重組蛋白。哺乳動物表達系統(tǒng)的實例包括Gluzman,Cell23:175(1981)描述的猴腎成纖維細胞的COS-7系、和能夠表勤目容性載體的其它細胞系，例如，C127、3T3、CHO、HeLa、和BHK細胞系。哺乳動物表達載體將包含復(fù)制起始區(qū)、合適的啟動子和增強子，也包含任何必須的核糖體結(jié)合位點、多腺苷酸化位點、間接供體和受體位點、轉(zhuǎn)錄的終止序列、和5，側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列。得自SV40剪接、和多腺苷酸化位點的DNA序列可以用于提供必需的不轉(zhuǎn)錄的遺傳成分。將構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細胞可以通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉的多種方法實現(xiàn)，所述方法包括但不限于例如磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔法(例如Davis等，1986BasicMethodsinMolecularBiology)或本領(lǐng)域已知的其它技術(shù)。表達包含免疫原性多肽(例如通過特異性結(jié)合相互作用與存在于測試生物材料的抗體反應(yīng)的多肽)的表達產(chǎn)物的宿主細胞可以按照許多已知方法學(xué)中的任何一種來鑒定。容易觀察到宿主細胞表達表達文庫產(chǎn)物(例如在表達文庫內(nèi)產(chǎn)生噬斑)，然后可以進行檢測，并將可以編碼原始抗原表位的多核苷酸片段從表達載體切除并回收。在備選的實施方案中，所述篩選文庫得自已經(jīng)暴露于被以下生物體(例如有傳染性的生物體)感染的生物材料的對象或生物源例如致病性或非致病性細菌、原生動物、真菌、酵母、病毒、雙滴蟲目(diplomonoadid)、動基體目(kinetoplastid)原生動物或其它的傳染性生物體。然后可以佳_用本領(lǐng)域熟知的方法測序一皮切除的核苷酸片段。在此外的實施方案中，將這些序列與可以在以下數(shù)據(jù)庫中找到的已知基因比較例如嬰兒利什曼原蟲(丄e/Amam'a/"/a^ww)數(shù)據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(GeneDB:TheWellcomeTrustSangerIstitute，www.genedb.org)、或GenBan逸因數(shù)據(jù)庫(NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)www.ncbi.nih.gov)。然后分析從核普酸片段測序所獲得的核苷酸序列，以確定這些序列是否包含串聯(lián)重復(fù)?？梢岳缡褂肨andemRepeatsFinder01|^:/^]1(16111上11.6€111/1^/^.11^1)或鑒定串聯(lián)重復(fù)的其它類似的程序或方法，來鑒定串聯(lián)重復(fù)。通常這些程序或方法鑒定串聯(lián)重復(fù)的周期大小和經(jīng)過與共有模式(consensuspattern)比對的拷貝數(shù)。在本發(fā)明的一個實施方案中，篩選可以排除具有約24、21、18、15、12或10個》咸基對或更少堿基對的周期大小(例如周期性)的小串聯(lián)重復(fù)模體。在另一個實施方案中，可以篩選任何生物體的序列文庫或基因組的串聯(lián)重復(fù)，以找到可以用于以下疾病的血清診斷或治療的表位包括但不限于，利什曼病、肺結(jié)核、HIV和癌癥。當已知任何生物體的DNA、cDNA、RNA或氨基酸的一種或多種序列時，可以篩選這些序列的串聯(lián)重復(fù)。如上所述，這樣的TandemRepeatsFinder^呈序可以用于分析和鑒定包含串聯(lián)重復(fù)的序列，該序列可能包含可用于疾病的血清診斷或治療的表位。在一個實施方案中，篩選嬰兒利什曼原蟲(厶fn/"""wm)基因組的串聯(lián)重復(fù)。在又一個實施方案中，從序列文庫鑒定出的串聯(lián)重復(fù)序列隨后通過暴露于來自受感染個體或血液供給的生物樣品來篩選，以鑒定在疾病的血清診斷或治療中具有最大效能的串聯(lián)重復(fù)序列。在再一個實施方案中，將來自經(jīng)鑒定的序列的一個或多個串聯(lián)重復(fù)單位分離，并用于構(gòu)建具有一種或多種串聯(lián)重復(fù)單位序列的一個或多個串聯(lián)重復(fù)單位的新蛋白質(zhì)。例如，在其它的可能性之中，構(gòu)建的蛋白質(zhì)可以包含單個串聯(lián)重復(fù)單位、多個串聯(lián)重復(fù)單位、或者是以下的融合蛋白具有一個或多個串聯(lián)重復(fù)單位、具有不同的或同源的序列的串聯(lián)重復(fù)單位。在SEQIDNOl-59中公開了通過這些和其它方法發(fā)現(xiàn)的串聯(lián)重復(fù)單位的實例。在本發(fā)明的再一個實施方案中，隨后篩選由上迷方法鑒定的串聯(lián)重復(fù)單位或串聯(lián)重復(fù)序列與其它已知的或未知的蛋白質(zhì)的同源性。本文所用術(shù)語"最少的同源性，，是指一個或多個序列的亞群，其與群內(nèi)的至少個一個序列相比，與一個或多個參考序列的同源性更低。參考序列可以是，例如潛在感染潛在感染利什曼病的生物體的生物體或者潛在感染利什曼病的生物體的多肽序列。同源性篩選可以通過上述的同源性篩選的方法、或通過本領(lǐng)域熟知的許多方法來完成。例如，可以篩選串聯(lián)重復(fù)序列或串聯(lián)重復(fù)單位與已知的寄生蟲例如克氏錐蟲(rr/7a"(womaCn^')的同源性，該寄生蟲潛在地存在于將被檢驗利什曼病的患者內(nèi)。通過篩選與所述寄生蟲內(nèi)的蛋白質(zhì)沒有同源性的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)可出于藥學(xué)和診斷意圖經(jīng)過選擇，這將使其對待治療的或待^r驗的疾病更具特異性(在該實例中是利什曼病)。通過篩選對利什曼病具有高特異性的蛋白質(zhì)，可以避免,￡陽性和誤診。在又一個實施方案中，隨后篩選由上述方法鑒定的串聯(lián)重復(fù)單位或串聯(lián)重復(fù)序列與以下哺乳動物中的其它已知的或未知的蛋白質(zhì)的同源性例如鼠、狗或人，其對于利什曼病而言是潛在宿主或試驗宿主。再次篩選與這些哺乳動物中的蛋白質(zhì)的低同源性，將致使藥學(xué)上的和診斷的應(yīng)用對利什曼病更具特異性，從而減少或消除假陽性或誤診。在再一個實施方案中，上述的篩選方法可以應(yīng)用于任何疾病。用于檢測利什曼原蟲感染的化合物和方法如上所述，本發(fā)明公開篩選和選擇對檢測生物樣品或生物體中的利什曼原蟲感染有效的串聯(lián)重復(fù)蛋白質(zhì)的方法，該方法包括步驟(a)構(gòu)建利什曼原蟲篩選文庫；(b)篩選利什曼原蟲篩選文庫；和(c)分析從篩選利什曼原蟲篩選文庫中鑒定的基因，以選擇是串聯(lián)重復(fù)基因的基因。由本發(fā)明的這個方法和其它方法篩選和選擇的多肽可用于不同的應(yīng)用，包括f旦不限于在生物體或血液供給品中檢測、治療、預(yù)防、監(jiān)控和免疫對抗利什曼病感染的系統(tǒng)和方法。因此，在本發(fā)明的另一個實施方案中，公開了用于在個體和血液供給品中檢測和監(jiān)測利什曼原蟲感染的方法。一般而言，可在包含抗體的任何生物樣品中檢測利什曼原蟲感染。優(yōu)選樣品是血液、血清、血漿、唾液、腦脊液或尿液。更優(yōu)選樣品是得自患者或血液供給品的血液或血清樣品。簡而言之，可以使用以上討論的一種或多種串聯(lián)重復(fù)多肽、融合蛋白或其它多肽、或它們的變體，來檢測利什曼原蟲感染。然后將所述一種或多種串聯(lián)重復(fù)多肽、融合蛋白或其它多肽用于確定能與所述多肽或樣品中的多肽特異性結(jié)合的抗體的存在或否。在本發(fā)明的范圍內(nèi)的多肽包括但不限于包含在SEQIDNO:1-59列舉的序列的包含利什曼原蟲抗原的免疫原性部分。本文所用術(shù)語"串聯(lián)重復(fù)，，指包含至少兩次串聯(lián)重復(fù)的4-40個400的核苷酸或氨基酸的序列的DNA區(qū)域或蛋白質(zhì)區(qū)域。本文所用術(shù)語"串聯(lián)重復(fù)單位，，指串聯(lián)重復(fù)的序列的單個單位。如本文中所4吏用的，對兩種分子間(例如抗體和它的相應(yīng)抗原之間)的"結(jié)合"相互作用的引用，可以包括可根據(jù)非限制性理論的以下作用中的一種或多種的結(jié)果的結(jié)合靜電相互作用、疏水性相互作用、空間相互作用、范德華力、氫鍵等、或影響所述結(jié)合事件(例如抗體與多肽結(jié)合、^r測試劑與抗體/多肽復(fù)合體結(jié)合)的其它類型的相互作用；或者可以包括分子的任何其它結(jié)合相互作用，包括在優(yōu)選的實施方案中的特異性結(jié)合相互作用，其中"特異性"結(jié)合的親和常凄tKa通?？梢孕∮诩s10一M、小于約10-8M、小于約l(^M、小于約l(^M、小于約10-5M或小于約10'4M。有使用多肽來檢測樣品中抗體的本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的多種觀寸定形式。參見，例長口CurrentProtocolsinImmunology(Coligan等，編輯，JohnWiley&Sons出版公司)，和Harlow和Lane,Antibodies.ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,1988，這些文獻通過引用結(jié)合至本文中。在優(yōu)選的實施方案中，所述測定包括使用固定在固相支持體上的多肽(例如如本文描述的包含一個或多個串聯(lián)重復(fù)單位的多肽抗原)，與樣品中的所述抗體結(jié)合并將其除去。然后可以使用與抗體/多肽復(fù)合體特異性結(jié)合的、且包含易檢測部分例如可檢測的報道基團的檢測試劑，來檢測所述被結(jié)合的抗體。合適的檢測試劑包括與抗體/多肽復(fù)合體結(jié)合且用報道基團標記的游離多肽(例如在半竟爭性測定中)的抗體?？晒┻x擇的是，可以用竟爭性測定，其中與所述多肽結(jié)合的抗體用報道基團來標記，并允許在多肽與樣品溫育之后與固定化的多肽結(jié)合。樣品的成分抑制標記的抗體結(jié)合至多肽的程度，是樣品與固定化多肽的反應(yīng)性的指示。固相支持體可以是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多肽可以附著的任何材料。例如，所述支持體可以是在微孔滴定板上的測試孔或硝基纖維素薄膜或其它合適的薄膜。可供選擇的是，載體可以是珠或盤，例如玻璃、玻璃纖維、膠乳或塑料例如聚苯乙烯或聚氯乙烯。支持體也可以是磁性顆?；蚶w維光學(xué)傳感器，例如在美國專利第5,359,681號中公開的那些。可以使用在專利和科學(xué)文獻中詳細描述的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種技術(shù)使多肽與固相支持體結(jié)合。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"結(jié)合"指非共價締合，例如吸附，和共價附著(可以是在支持體上抗原和官能團之間的直接連接，或可以是通過交聯(lián)劑方式的連接)。優(yōu)選通過吸附到微孔滴定板中的孔或吸附到膜的結(jié)合。在這些情況下，吸附可以通過使多肽與固相支持體在合適的緩沖液中接觸持續(xù)合適的時間來實現(xiàn)。接觸時間隨溫度而改變，但通常是約1小時-l天。一般而言，y使塑料微孔滴定板(例如聚苯乙烯或聚氯乙烯)的孔與約lOng-約l(ig(.mu.g)，優(yōu)選約100ng的多肽接觸，足以結(jié)合足夠量的抗原。每cm^肖基纖維素將結(jié)合約100mg的蛋白質(zhì)。多肽共價附著到固相支持體一般可以通過首先使所述支持體與雙功能試劑反應(yīng)來實現(xiàn)，該雙功能試劑將與所述支持體和多肽上的官能團(例如羥基或氨基)兩者反應(yīng)。例如，可以使用苯醌或通過使支持體上的醛基與多肽上的活性氫和胺縮合，將多肽結(jié)合至具有合適聚合物涂層的支持體(參見例如，PierceImmunotechnologyCatalogandHandbook(1991)在A12漏A13)。在某些實施方案中，所述測定法是酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)?？梢酝ㄟ^首先使已經(jīng)固定在固相支持體(通常是微孔滴定板的孔)上的多肽抗原與樣品接觸，致使允許樣品中的針對多肽的抗體與固定化的多肽結(jié)合來完成該測定。然后從固定化的多肽中去除沒有結(jié)合的樣品，并加入能夠與固定化的抗體-多肽復(fù)合體結(jié)合的檢測試劑。然后使用適用于特異性檢測試劑的方法，測定保持與固相支持體結(jié)合的檢測試劑的量。所述多肽被固定在支持體上后，通常馬上阻斷支持體上剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點。可以使用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的任何合適的阻斷劑，例如牛血清白蛋白(BSA)或吐溫20TM(SigmaChemicalCo.，St.Louis,Mo.)。然后將固定化的多肽與樣品溫育，并允許抗體(如果在樣品中存在的話)與抗原結(jié)合?？梢栽跍赜坝煤线m的稀釋劑(例如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS))稀釋樣品。一般而言，合適的接觸時間(即溫育時間)是足以允許檢測抗體在感染利什曼原蟲的樣品中存在情況的時間。優(yōu)選所述接觸時間為足以實現(xiàn)在結(jié)合抗體和非結(jié)合抗體之間平衡時實現(xiàn)至少95%結(jié)合的水平。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認識到達到平衡的所需時間可以通過測定在一段時間內(nèi)發(fā)生的結(jié)合水平而容易地確定。然后可以通過用合適的緩沖液(例如含有0.1%吐溫20TM的PBS)洗滌固相支持體，除去非結(jié)合的樣品。然后可以將檢測試劑添加至固相支持體。合適的檢測試劑是與固定化的抗體-多肽復(fù)合體結(jié)合并可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法中的任何一種^r測的任何化合物。優(yōu)選所述檢測試劑含有與報道基團綴合的結(jié)合劑(例如蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白、凝集素或游離抗原)。優(yōu)選的報道基團包括酶(例如辣根過氧化物酶)、底物、輔助因子、抑制劑、染料、放射性核素、發(fā)光基團、熒光基團和生物素。可以使用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的標準方法，來完成結(jié)合劑與報道基團的綴合。也可以從許多來源(例如，ZymedLaboratories,SanFrancisco,Calif，和Pierce,Rockford，Ill.)購買與多種報道基團綴合的普通結(jié)合劑。然后將檢測試劑與固定化抗體多肽復(fù)合體溫育持續(xù)足以檢測被結(jié)合的抗體的時間。一般可以從制造者的說明書或通過測定在一段時間內(nèi)發(fā)生的結(jié)合的水平來確定合適的時間。然后去除未結(jié)合的沖企測試劑，并使用報道基團檢測被結(jié)合的檢測試劑。所采用的用于檢測報道基團的方法取決于報道基團的性質(zhì)。對于放射性基團而言，閃爍計數(shù)或放射自顯影的方法一般是合適的。分光鏡方法可以用于檢測染料、發(fā)光基團和熒光基團。生物素可以使用與不同的報道基團(通常為放射性基團或熒光基團或酶)偶聯(lián)的抗生物素蛋白來檢測，。酶報道基團一般可以通過加入底物(一般需要特定的時間)，隨后通過反應(yīng)產(chǎn)物的分光鏡分析或其它分析來^r測。為了測定抗-利什曼原蟲抗體在樣品中的存在或否，一般將從保持與固相支持體特異性結(jié)合的報道基團所檢測到的信號，與對應(yīng)于合適的對照信號(按照在技術(shù)上可接受的方法例如預(yù)定的截斷值)進行比較。在一個優(yōu)選的實施方案中，截斷值可以是當固定化的多肽與來自非感染患者的樣品溫育時獲得的信號平均值。一般而言，產(chǎn)生超過預(yù)定的截斷值三個標準差的信號的樣品被認為是陽性(即與多肽反應(yīng))。在備選的優(yōu)選實施方案中，按照Sackett等，C"m'ca/5^z.c;fem/o/ogy..爿5as7'c5bz.ewceC7Zm'ca/Me6^'c/"e,第106-7頁(LittleBrownandCo.,19S5)的方法，使用ReceiverOperatorCurve確定截斷值。簡而言之，在該實施方案中，可以從對應(yīng)關(guān)于診斷試驗結(jié)果的各個可能的截斷值的真陽性率(即靈敏度)和假陽性率(100%-特異性)的成對曲線來確定截斷值。在曲線上最接近左上角(upperlefthandcomer)(即包圍最大面積的值)的截斷值是最準確的截斷值，而所產(chǎn)生的信號高于由該方法測定的截斷值的樣品可以被認為是陽性的?？晒┻x擇的是，所述截斷值可以沿著曲線左移，以最小化假陽性率，或右移，以最小化假陰性率。在相關(guān)的實施方案中，以流過檢驗或試驗紙檢驗形式執(zhí)行測定，其中將抗原(例如，一種或多種多肽，各包含至少一個串聯(lián)重復(fù)單位)固定在固相支持體(例如，膜例如硝基纖維素)上。在流過檢驗中，使液體樣品與固相支持體在足以允許當樣品通過薄膜時抗體(如果樣品中存在抗體)與固定化的多肽特異性結(jié)合的條件和持續(xù)時間下接觸。檢測試劑(例如蛋白質(zhì)A-膠體金)可存在于固相支持體中，或者備選地被施用，然后隨含檢測試劑的溶液流過所述薄膜而與抗體-多肽復(fù)合物結(jié)合。然后可以如上所述執(zhí)行對結(jié)合檢測試劑的測定。在試驗紙檢驗形式的某些相關(guān)實施方案中，將結(jié)合多肽抗原的固相支持體薄膜的一端浸入含樣品的溶液中。樣品沿著薄膜移行，穿過含檢測試劑的區(qū)域，并到達固定化多肽抗原的區(qū)域。才企測試劑在固定化多肽抗原區(qū)域的聚集表明在樣品中存在利什曼原蟲抗體。通常檢測試劑聚集在那個位置產(chǎn)生容易目測的圖形，例如一條線或一連串的兩條或多條線。沒出現(xiàn)這樣的圖形指示陰性結(jié)果。一般而言，如上所述，當生物樣品包含足以在ELISA中產(chǎn)生陽性信號的水平的抗體時，選擇固定在薄膜上的多肽的量，以產(chǎn)生可目測辨別的圖形。優(yōu)選固定在薄膜上的多肽的量為約25ng-約l嗎，更優(yōu)選約50ng-約500ng。通?？梢杂煤苌倭?例如一滴)的患者血清或血液執(zhí)行此類試驗。當然，存在適用于本發(fā)明的多肽的眾多其它測定方案，它們將被熟悉本領(lǐng)域的人所熟知用于檢測能夠特異性地結(jié)合特定多肽抗原的抗體的存在。以上說明旨在4又作為范例。治療、預(yù)防、和免疫對抗利什曼病的系統(tǒng)和方法如上所述，本發(fā)明公開了在生物樣品或生物體中篩選和選擇有效檢測利什曼原蟲感染的串聯(lián)重復(fù)蛋白質(zhì)的方法，該方法包括步驟(a)構(gòu)建利什曼原蟲篩選文庫；(b)篩選利什曼原蟲篩選文庫；和(c)分析從篩選利什曼原蟲篩選文庫中鑒定的基因，以選出為串聯(lián)重復(fù)基因的基因。如本文所述，由本發(fā)明的這個方法和其它方法篩選和選擇的多肽可以用于不同的應(yīng)用，包括^旦不限于在生物體或血液供給品中檢測、治療、預(yù)防、監(jiān)控和免疫對抗利什曼病感染的系統(tǒng)和方法。因此，在下面詳述的本發(fā)明的某些方面，本發(fā)明的多肽、抗原表位、串聯(lián)重復(fù)單位、免疫原性序列、融合蛋白和/或可溶性利什曼原蟲抗原可以被摻入藥物組合物或疫苗中。為了清楚，當描述發(fā)明的治療性組合物和診斷方法的特定實施方案時，將使用術(shù)語"多肽"；然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將清楚本發(fā)明的抗原表位、多肽、串聯(lián)重復(fù)單位和融合蛋白也可以用于這樣的組合物和方法中。藥物組合物包含一種或多種多肽，每種多肽可以含有一種或多種上述序列(或其變體)和生理學(xué)上可接受的載體。疫苗(也稱為免疫原性組合物)包含一種或多種上述的多肽和免疫刺激劑，例如佐劑(例如LbelF4A、白介素-12或其它細胞因子)或脂質(zhì)體(將多肽摻入其中)。許多佐劑含有設(shè)計用于保護抗原不被快速分解代謝的物質(zhì)，例如氬氧化鋁或液狀石蠟、和免疫應(yīng)答刺激劑，例如脂質(zhì)A、百日咳桿菌(BoWac/e//a/eWw^&)或肺結(jié)核分4支4干菌(聊co6a"en.w附^6ercw/ow's)書亍生的蛋白質(zhì)。某些佐劑可以市購自，例如，弗氏不完全佐劑和完全佐劑(DifcoLaboratories,Detroit,Mich.);Merck佐劑65(MerckandCompany,Inc.,Rahway,N丄)；AS-2(SmithKlineBeecham,Philadelphia,Pa.);鋁鹽例如氫氧化鋁凝膠(明礬)或磷酸鋁；鈣、鐵或鋅的鹽；?；野彼岬牟蝗苄曰鞈乙?；?；牵魂栯x子或陰離子衍生化多糖；聚磷嗪；生物可降解的微球；單磷酰脂質(zhì)A和quilA。細胞因子例如GM-CSF、白介素-2、白介素-7、白介素-12、和其它類似的生長因子也可以用作佐劑。在本發(fā)明的某些實施方案中，所述佐劑組合物優(yōu)選為主要誘導(dǎo)Thl型免疫應(yīng)答的組合物。由于其能夠誘導(dǎo)特異的Thl免疫應(yīng)答，所以特別優(yōu)選LbelF4A及其變體作為佐劑用于本發(fā)明的疫苗中。激發(fā)主要的Thl型應(yīng)答的某些其它優(yōu)選的佐劑包括，例如，咪喹莫特、Res-咪喹莫特、單磷酰脂質(zhì)A,優(yōu)選3-脫-0-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A與鋁鹽的組合物?？蓮腃orixaCorporation獲得MPL.RTM.佐劑(Seattle,Wash;參見，例如，美國專利第4,436,727;4,877,611;4,866,034和4,912,094號)。含CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸是非甲基化的)也誘導(dǎo)主要的Thl應(yīng)答。這樣的寡核苷酸眾所周知，例如在WO96/02555、WO99/33488和美國專利第6，008,200號和5,856,462號中描述。例如，Sato等，Sde"ce273:352,1996也描述了免疫刺激的DNA序列。另一優(yōu)選的佐劑包含皂甙，例如QuilA或其衍生物，包括QS21和QS7(AquilaBiopharmaceuticalsInc.，F(xiàn)ramingham，Mass.);七葉急芬；洋地黃急式；或絲石竹或昆諾阿藜急戒。其它優(yōu)選的制劑包括本發(fā)明的佐劑組合物中的多于一種的急戒，例如下述組別中的至少兩種的組合物，包括QS21、QS7、QuilA、|3-七葉皂苷或洋地黃皂甙。備選地，皂甙制劑可以與由以下組成的疫苗載體組合殼聚糖或其它聚陽離子聚合物、聚丙交酯和丙交酯-乙交酯的共聚物顆粒、基于聚-N-乙酰葡糖胺聚合物的基質(zhì)、由多糖或化學(xué)修飾的多糖組成的顆粒、脂質(zhì)體和基于脂質(zhì)的顆粒、由甘油單酯組成的顆粒等。也可以在膽固醇的存在下配制皂戒，以形成微粒結(jié)構(gòu)例如脂質(zhì)體或ISCOM。此外，可以以非微粒溶液或混懸液，或以微粒結(jié)構(gòu)例如paucilamelar脂質(zhì)體或ISCOM，與聚氧乙烯醚或酯一起配制皂戒。也可以用賦形劑例如卡波普(Carbopol"配制皂甙，以提高粘度，或可以用粉末賦形劑例如乳糖，以干粉形式配制。在一個優(yōu)選的實施方案中，佐劑系統(tǒng)包括單磷酰脂質(zhì)A與皂戒衍生物的組合物，例如QS21和3D-MPLRTM佐劑的組合物，如在WO94/00153中所述，或反應(yīng)原性更小的組合物，其中QS21用膽固醇淬滅，如在WO96/33739中所述。其它優(yōu)選的制劑包含水包油型乳劑和維生素E。在WO95/17210中描述了在水包油型乳劑中使用QS21、3D-MPLRTM佐劑和維生素E的另一特別優(yōu)選的佐劑制劑。另一增強的佐劑系統(tǒng)包括含CpG的寡核苷酸與皂戒衍生物的組合物，尤其是在WO00/09159中公開的CpG與QS21的組合物。優(yōu)選所述制劑另外還包含水包油型乳劑和維生素E。用于本發(fā)明的組合物的此外的例示性佐劑包括MontanideISA720(Seppic，F(xiàn)rance)、SAF(Chiron，Calif,UnitedStates)、ISCOMS(CSL)、MF-59(Chiron)、SBAS系列的佐劑(例如SBAS-2或SBAS-4，可從SmithKlineBeecham，Rixensart,Belgium獲得)、EnhanZyn.TM.(Corixa,Hamilton,MT)、RC-529(Corixa，Hamilton,Mont.)和其它的氨基烷基氨基葡萄糖苷4-磷酸酯(AGP),例如在美國專利第6,113,918號和未決的美國專利申請序列號09/074,720中所述的那些佐劑，這些文獻的公開內(nèi)容通過整體引用結(jié)合至本文中，和聚氧乙烯醚佐劑例如在WO99/52549A1中所述的那些佐劑。其它優(yōu)選的佐劑包括以下通式(I)的佐劑分子HO(CH2CH20)n-A—R，其中n是l-50，A是鍵或-C(O)-，R是d.so烷基或苯基Cwo烷基。本發(fā)明的一個實施方案包括包含通式(I)的聚氧乙烯醚的疫苗制劑，其中n為l-50,優(yōu)選4-24，最優(yōu)選9;R組分是Cw。，優(yōu)選C4-C2o烷基和最優(yōu)選Cn烷基，A是鍵。聚氧乙烯醚的濃度應(yīng)該為0.1-20%，優(yōu)選O.l-10%,和最優(yōu)選O.l-1%。優(yōu)選的聚氧乙烯醚選自聚氧乙烯-9-十二烷基醚、聚氧乙烯-9-十八烷基醚、聚氧乙烯-8-十八烷基醚、聚氧乙烯-4-十二烷基醚、聚氧乙烯-35-十二烷基醚、和聚氧乙烯-23-十二烷基醚。在默克指南(第12版條目7717)中描述了聚氧乙烯醚，例如聚氧乙烯十二烷基醚。在WO99/52549中描述了這些佐劑分子。若有需要，以上通式(I)的聚氧乙烯醚可以與另一佐劑組合。例如，優(yōu)選的佐劑組合物是優(yōu)選與CpG組合，如在未決的UK專利申請GB9820956.2中所述。疫苗還可以此外含有釋放載體，例如生物可降解的微球(例如，在美國專利第4,897，268和5,075,109號中公開的)。在本發(fā)明的范圍內(nèi)的藥物組合物和疫苗也可以含有摻入多肽組合中的或存在于一種或多種單獨的多肽中的其它利什曼原蟲抗原。備選地，藥物組合物或免疫原性組合物可以含有免疫刺激劑，例如佐劑(例如，LbelF4A、白介素-12或其它細胞因子、或編碼此類增強劑的DNA)、和編碼上述一種或多種多肽或融合蛋白的致使原位產(chǎn)生所述多肽的多核苷酸(例如DNA)。在這樣的組合物中，DNA可以存在于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的多種遞藥系統(tǒng)中的任何一種之內(nèi)，該遞藥系統(tǒng)包括核苷酸表達系統(tǒng)、細菌表達系統(tǒng)和病毒表達系統(tǒng)。合適的核苷酸表達系統(tǒng)含有在患者中表達所必需的DNA序列(例如合適的啟動子和終結(jié)信號)。細菌遞藥系統(tǒng)涉及給予在其細胞表面上表達所述多肽的免疫原性部分的細菌(例如結(jié)核菌(Bacillus-Calmette-Guerrin))。在優(yōu)選的實施方案中，可以使用病毒表達系統(tǒng)(例如，痘苗病毒或其它的痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒)引入DNA，該病毒表達系統(tǒng)可以涉及使用不致病的(缺陷型的)、有復(fù)制能力的病毒。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知將DNA摻入這樣的表達系統(tǒng)的技術(shù)。DNA也可以是"棵露的"，如例如在Ulmer等，5We"ce259:1745-1749(1993)中所描述的和由Cohen,5b/ewce259:1691-1692(1993)所綜述的。可以通過將棵露的DNA包纟皮在有效地輸送入細胞內(nèi)的可生物降解的珠上，來提高棵露的DNA的纟聶取。當本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的任何合適的載體可以被用于本發(fā)明的藥物組合物中時，載體的類型將依賴于給藥的模式而改變。對于胃腸外給藥，例如皮下注射，載體優(yōu)選包含水、鹽、乙醇、脂肪、蠟或緩沖液。對于口服給藥，可以使用以上載體或固相載體中的任何一種，例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖、和碳酸鎂。生物可降解的微球(例如polylacticgalactide)也可以用作本發(fā)明的藥物組合物的載體。例如在美國專利第在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組合物包括為了提供增強的保護對抗多種利什曼原蟲而選擇的多種多肽。可以才艮據(jù)天然抗原的起源的物種或根據(jù)在不同種的利什曼原蟲之間高度保守的氨基酸序列，來選擇這樣的多肽。個體多肽的組合可以特別有效地用作預(yù)防性的和/或治療性的疫苗，因為(l)個體多肽(individualpolypeptide)的組合對增殖和/或細胞因子生產(chǎn)的刺激可以相加，(2)個體多肽的組合對增殖和/或細胞因子生產(chǎn)的刺激可以協(xié)同，(3)個體多肽的組合可以以互補的方式剌激細胞因子譜(cytokineprofile),和/或(4)當在單個感染性利什曼原蟲的種或林上更大量地表達個體多肽中的某些時，所述個體多肽可以互相補充。優(yōu)選的組合含有包含M15、Ldp23、Lbhsp83、Lt-I和LbelF4A的免疫原性部分的多肽。作為備選或此外，所述組合可包括含本文公開的其它利什曼原蟲抗原的免疫原性部分、和/或可溶性的利什曼原蟲抗原的一種或多種多肽。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組合物包括為了提供增強的對抗多種利什曼原蟲的保護作用而選擇的單種多肽。因為上述的那些原因，用于個體多肽組合的單種個體多肽可以特別有效地用作預(yù)防性的和/或治療性的疫苗。在另一個實施方案中，本發(fā)明的組合物包括個體多肽和上述使用的多肽與多種佐劑例如IL-12(蛋白質(zhì)或DNA)的組合物，以賦予保護性應(yīng)答對抗多種利什曼原蟲。在又一個實施方案中，本發(fā)明的組合物包括單用或與多種佐劑例如IL-12(蛋白質(zhì)或DNA)聯(lián)用的DNA構(gòu)建體，以賦予保護性應(yīng)答對抗多種利什曼原蟲的各種利什曼原蟲。以上藥物組合物和疫苗可以用于，例如在患者例如人和狗中誘發(fā)保護性免疫對抗利什曼原蟲，以預(yù)防利什曼病。下面詳細地描述了用于該目的的合適的給藥劑量和方法。本文描述的藥物組合物和免疫原性組合物也可以用于刺激免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答在患者中可以是細胞的和/或體液的。對于感染利什曼原蟲的患者，可以產(chǎn)生的免疫應(yīng)答包括優(yōu)先的Thl免疫應(yīng)答(即特征在于產(chǎn)生細胞因子白介素-1、白介素-2、白介素-12和/或，干擾素、以及a-胂瘤壞死因子的應(yīng)答)。對于非感染性患者而言，所述免疫應(yīng)答可以產(chǎn)生白介素-12和/或白介素-2,或刺激丫5T-細胞。在任一類的患者中，刺激的應(yīng)答可以包括IL-12的產(chǎn)生。也可以在得自感染或未感染利什曼原蟲的個體的PBMC或其成分的生物樣品中激發(fā)這樣的應(yīng)答。如上所述，一般可以使用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的方法，例如酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA),來執(zhí)行對于以上細胞因子中的任何一種的分析。用于本發(fā)明的這方面的合適的藥物組合物和疫苗是含有至少一種多肽的那些藥物組合物和疫苗，所述多肽包含本文公開的利什曼原蟲抗原(或其變體)的免疫原性部分。優(yōu)選，如上所述，用于藥物組合物中的多肽和疫苗是互補的。也可以使用具有或不具有另外的多肽的可溶性利什曼原蟲抗原。本文描述的藥物組合物和疫苗還可以用于治療遭受對IL-12刺激敏感的疾病折磨的患者。所述患者可以是任何溫血動物，例如人或狗。這樣的疾病包括感染(可以是例如細菌、病毒或原生動物感染)或諸如癌癥的疾病。在一個實施方案中，所述疾病是利什曼病，患者可以顯示臨床癥狀或可以無癥狀。一般而言，可以通過評估用本發(fā)明的藥物組合物或疫苗治療在臨床相關(guān)的免疫方面的效果，來確定特定疾病對IL-12刺激的應(yīng)答性。例如，如果治療導(dǎo)致增強的Thl應(yīng)答或Th2轉(zhuǎn)變成Thl的模式(profile),伴隨在治療的患者中的臨床改善，那么所述疾病為對IL-12刺激敏感。多肽的給藥可以按照下面所述，或可以根據(jù)指征延長更長的時間。優(yōu)選，如上所述，用于藥物組合物中的多肽和疫苗是互補的。特別優(yōu)選的組合物包含含Lm^ni、Ldp23、Lbhsp83、Lt-l和LbelF4A、Lmspla、Lmsp9a和TSA的免疫原性部分的多肽。也可以使用具有或不具有另外多肽的可溶性利什曼原蟲抗原。用于本發(fā)明以上方面的給藥途徑和頻率、以及劑量將隨個體而改變，并可比得上當前用于免疫對抗其它感染(包括原生動物、病毒和細菌感染)的那些給藥途徑和頻率、以及劑量。一般而言，所述藥物組合物和疫苗可以通過注射(例如皮內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下注射)、鼻內(nèi)(例如通過吸入)或口服給藥。在一年時間內(nèi)可以給予l-12個劑量。對于治療性疫苗(即治療受感的染個體)而言，優(yōu)選4姿1個月間隔，給予12個劑量。對于預(yù)防性用途而言，優(yōu)選按3個月間隔，給予3個劑量。在任一情況下，此后可以周期性地給予增強的疫苗接種。備選方案可適用于各別的患者。合適的劑量是當如上所述給藥時，能夠在經(jīng)免疫接種的患者中引起足以保護患者至少l-2年不患利什曼病的免疫應(yīng)答的一定量的多肽或DNA。一般而言，存在于劑量中的(或由劑量中的DNA在原位產(chǎn)生的)多肽的量為約100ng-約lmg/kg宿主，通常為約10嗎-約100jLig。合適的劑量容量隨患者的體型而改變，但將通常為約0.1mL-約5mL。在另一方面，本發(fā)明提供在采用皮膚試驗的患者中使用一種或多種上述多肽診斷利什曼原蟲感染的方法。當用于本文時，"皮膚試驗"是在患者身上直接進行的任何測定，在皮內(nèi)注射如上所述的一種或多種多肽之后，在該患者中測量遲發(fā)型超敏(DTH)反應(yīng)(例如硬結(jié)和伴隨的發(fā)紅)。可以使用足以使一種或多種多肽與患者真皮細胞接觸的任何合適的裝置(例如結(jié)核菌素注射器或lmL注射器)來完成這樣的注射。優(yōu)選在注射之后至少48小時，更優(yōu)選在注射之后72小時對反應(yīng)進行測量。DTH反應(yīng)是細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，在先前已經(jīng)暴露于試驗抗原(即所使用的多肽的免疫原性部分或其變體)的患者中該反應(yīng)更強烈。應(yīng)答可以使用尺進行目測測量。一般而言，直徑大于約0.5cm,優(yōu)選直徑大于約l.Ocm的硬結(jié)是陽性反應(yīng)，表明是利什曼原蟲感染，可以或不可以i正明為活動性疾病。為了用于皮膚試驗，優(yōu)選將本發(fā)明的多肽如上所述配制成含至少一種多肽和生理學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。這樣的組合物通常包含以下量的一種或多種上述多肽在O.lmL的體積中約l嗎-lOO(ig,優(yōu)選約10嗎-50(ig。優(yōu)選地，用于這樣的藥物組合物的載體是具有合適的防腐劑(例如苯酚和/或吐溫80T)的鹽水溶液。在使用諸如上述皮膚試驗的利什曼病的診斷中，本發(fā)明的多肽也可以與一種或多種已知的利什曼原蟲抗原:眹用。優(yōu)選以這種方式選擇個體多肽，以至于相互補充?？梢耘c本發(fā)明的多肽有效聯(lián)用的已知利什曼原蟲抗原的實例包括K39(Bums等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,199390:775-779)。提供以下實施例，作為例證而非旨在限制。實施例實施例l:寄生蟲和感染倉鼠嬰兒利什曼原蟲(I^s/mxam'fl!'"/a打似附)、杜氏利什曼原蟲(丄e/sAwwwZczc/owovam')、石貞大利4十曼原蟲(丄e^Amam'awq/or)、亞馬遜利^十曼原蟲(丄ds/imflw.""附azo"e"s&)和克氏4偉蟲(7>7/7a"oso/nflcrw。力用于感染倉鼠，由此產(chǎn)生感染的血清。用穩(wěn)定期的1><107嬰兒利什曼原蟲(Z^'s/zmam'az'Wj^w&m)、沖土氏矛H十曼原蟲OLe^/imam'adowovam')、石貞大利4十曼原蟲(Zez'A附am'amayor)、亞馬遜利4十曼原蟲(丄ez'j/ma"/"omc(zo"g""s)或克氏錐蟲(7>7尸""0犯附"cn/2/)前鞭毛體4吏倉鼠心內(nèi)感染。在8-12周之后，處死受感染的倉鼠并收集血清。實施例2:患者血清從臨床診斷和在寄生蟲學(xué)上證明有活動性疾病的患者收集蘇丹人內(nèi)臟利什曼病患者血清。從具有表征充分的患者(包括寄生蟲學(xué)診斷(表皮利什曼病、瘧疾)或培養(yǎng)陽性診斷(結(jié)核病)的患者)收集表皮利什曼病(巴西)、結(jié)核病(美國)和瘧疾(巴西)的患者血清。從美國的健康個體獲得正常血清。實施例3:嬰兒利什曼原蟲(丄.!'w/aw"wm)表達文庫的血清學(xué)篩選進行文庫的構(gòu)建和篩選。簡而言之，來自嬰兒利什曼原蟲(丄./w/awriMm)的總DNA通過超聲處理隨機剪切成平均大小為2kb，用T4DNA聚合酶使末端平整，并隨后加入EcoRI銜接頭。插入物隨后連接入用EcoRI(Stratagene,LaJolla,CA)預(yù)消化的ZAPExpress②載體中并使用GigapackIIIGoldPackagingExtract(Stratagene)包裝。擴增噬菌體文庫，然后用上述的混合的嬰兒利什曼原蟲(丄.！'"/朋rtwm)感染的倉鼠血清或混合的蘇丹人內(nèi)臟利什曼病患者血清，根據(jù)生產(chǎn)商的指示進行篩選。使用l:100稀釋的血清來篩選大約5xl()S的噬斑，用堿性磷酸酶綴合的山羊抗-倉鼠IgG或山羊抗-人IgG(KPL,Gaithersburg,MD)和底物BCIP/NBT(KPL)來檢測免疫反應(yīng)性噬斑。根據(jù)生產(chǎn)商的方案從免疫反應(yīng)性噬菌體克隆切除PBK-CMV噬菌粒載體。測序插入物并使用嬰兒利什曼原蟲(丄eZWmam'a—fawmm)基因數(shù)據(jù)庫(GeneDB:TheWellcomeTrustSangerInstitute,www.genedb.org)來分沖斤。實施例4:串聯(lián)重復(fù)基因分析[OOllO]分析通過篩選鑒定的基因，以確定它們是否是串聯(lián)重復(fù)基因。TandemRepeatsFinder(在DN騎列中定位并顯示串聯(lián)重復(fù)的程序)用于該分析(http:〃tandem,bu.edu/trf/trf.html)(5)。作為篩選的基因的對照，也分析從嬰兒利什曼原蟲(丄.！'w/aw"wm)基因數(shù)據(jù)庫中隨機挑選的108種基因的串聯(lián)重復(fù)模體存在。程序依照串聯(lián)重復(fù)基因的屬性例如重復(fù)的周期大小、按共有模式比對的拷貝數(shù)和全部相鄰拷貝之間配對的百分比，來計算得分。在該研究中，假如從TandemRepeatsFinder分析的得分高于500，那么所述基因被認為是串聯(lián)重復(fù)基因，從而排除含小的串聯(lián)重復(fù)模體的基因例如LinJ01.0470和LinJ13.0810(表1)。表I.經(jīng)血清學(xué)篩選鑒定的嬰兒利什曼原蟲(丄.z'"/a加'iwz)蛋白質(zhì)基因DBTR分析ID基因大小PSCN分數(shù)LinJOl.04704叚擬的蛋白質(zhì)(hypotheticalprotein)15131166LINJ03.0120假擬的蛋白質(zhì)23711731.87033LinJ05.0380微管締合蛋白16511428.56336LinJ05.05卯假擬的蛋白質(zhì)86LinJ08.0860線粒體DNA聚合酶p-PAK154LinJ08.1010應(yīng)激誘導(dǎo)性蛋白stil62Li禱.1130假擬的蛋白質(zhì)50LinJ10.1460假擬的蛋白質(zhì)56LinJ13.0810假擬的蛋白質(zhì)76153.774LinJ14.1160驅(qū)動蛋白K39(rK39)24111727.95237LinJ14.1190驅(qū)動蛋白K39951056.21198LinJ14.1540假擬的蛋白質(zhì)112726,1806LitJ15.0490tb-292membraneassociatedprotein-like16410531.66027LinJ16.1540驅(qū)動蛋白23042138.510588LinJ16.1560驅(qū)動蛋白88422.5172LinJ16.1750假擬的蛋白質(zhì)3462198.73691LinJI7細0延伸因子I-a49LinJ17.0610假擬的蛋白質(zhì)86LinJ18雄0假擬的蛋白質(zhì)68LinJ18.1150假擬的蛋白質(zhì)107LinJ2.0440laRNA結(jié)合蛋白37LinJ22細0假擬的蛋白質(zhì)453034.21137LinJ22.1590假擬的蛋白質(zhì)2348429.23993LinJ24,1570基體組分164LinJ26.0980動力蛋白重鏈458LinJ26.1200Hsp70.4熱休克蛋白7070LinJ27.02卯核孔蛋白159272.474LinJ27,0410鈣激活蛋白酶樣半胱氨酸肽酶702122.653LinJ27.1480假擬的蛋白質(zhì)247LinJ28.2310糖蛋白96-92613152.21398LinJ28.3170假擬的蛋白質(zhì)756023.42546LinJ31.0530無鞭毛蛋白21LinJ31.14304艮擬的蛋白質(zhì)95ID基因大小PSCN分數(shù)LinJ32.2730假擬的蛋白質(zhì)17315010,32916LinJ32.2780膜締合性蛋白1313060.93125LinJ33.2870假擬的蛋白質(zhì)41344476041LinJ34.0710假擬的蛋白質(zhì)30616816.34487LinJ34.2140假擬的蛋白質(zhì)2962497.43604LinJ35.0590蛋白褲酸聚糖(proteophosphoglycan)ppg453645246.110667LinJ35.0600蛋白磷酸聚糖ppg3-13537.88773LinJ35.4250多聚(A)結(jié)合蛋白65363.6111LinJ36.4560線粒體的陪伴蛋白Hsp6059LinJ36.4930甾醇24-c-曱基轉(zhuǎn)移酶40在GeneDB中ID號是臨時性的并可以改變。以kDa顯示大小。在TR分析中PS、CN和得分的數(shù)據(jù)來自使用TandemRepeatsFinder的程序分析。以粗體字母顯示串聯(lián)重復(fù)基因。PS、CN和得分欄中的空白表示在該基因中沒有發(fā)現(xiàn)重復(fù)。PS:重復(fù)的周期大小(bp),CN:與共有模式比對的拷貝數(shù)。實施例5:串聯(lián)重復(fù)基因的PCR分析和克隆使用與串聯(lián)重復(fù)的單拷貝兩端對應(yīng)的引物(引物序列顯示于表II中)，通過PCR擴增LinJ16.1750、LinJ22.1590或LinJ33.2870的串聯(lián)重復(fù)序列。通過PCR擴增LinJ28.2310的全基因序列，用于該反應(yīng)的引物也顯示于表II中。為了分析那些基因在利什曼原蟲(Z^/Wmaw'a)種間是否保守，以嬰兒利什曼原蟲(丄.z'"/a"^/m)、杜氏利什曼原蟲(丄Jowovflw/)、碩大利什曼原蟲(丄.wayor)、亞馬遜利什曼原蟲(丄.amazowe"w》和克氏錐蟲(7>y;^wasomacn^')的總DNA用作才莫豐反。作為對照，使用嬰兒利什曼原蟲(丄./"/a油'ww)和克氏錐蟲(7b^a"owm"cn/d)DNA作為模板(表II中的引物序列)，通過PCR擴增克氏錐蟲(71.m/z/)基因(GenBank:XM—810936)。為了克隆產(chǎn)生重組蛋白的基因，將嬰兒利什曼原蟲(丄./w/a油'ww)總DNA用作PCR^應(yīng)的模板。表II:用于該研究的引物基因引物序列LinJ16.1750CAATTACATATGTACCCGTTCCTACGGCTGCAATTAGGATCCCTAGCGCGACGCCAGCTCGTCLinJ22.1590CAAT丁ACATATGGCTGACCTGAGGGAGCAGCAAT丁AGGATCCCTACACCTCGGCGTCCCTGTCLinJ28.2310CAATTACATATGAGCGCTGCACCGTCCCAATTAGAATTCCTACGCAAGTCCGAGGGCLinJ33.2870CAATTACATATGCAGCGGCTGGTGCTCCAATTAGGATCCCTACGACGTCCGCGGCAGCGC克氏錐蟲(r.crazOCAATTACATATGTGCATTGCTCTTGGCATCGTCXM—8畫6CAATTAAAGCTTCTGGGGCGTGAAGCGTATGTACTC實施例6:重組蛋白的表達將:與LinJ16.1750重復(fù)的兩個拷貝(LinJ16.1750r2)、LinJ22.1590重復(fù)的三個拷貝(LinJ22.1590r3)、LinJ33.2870重復(fù)的一個拷貝(LinJ33.2870rl)或LinJ28,2310的全基因?qū)?yīng)的PCR產(chǎn)物插入pET28載體的Ndel/BamHI或Ndel/EcoRI位點。然后分析插入物的序列。為了表達重組蛋白將這些pET28載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Rosetta中。通過用1M異丙基-(3-D-硫代半乳糖苷培養(yǎng)，來誘導(dǎo)重組蛋白的表達。然后使用Ni-NTA瓊脂糖(QiagenInc.,Valencia,CA)將重組蛋白純化為6xHis-標記的蛋白。在SDS-PAGE之后通過考馬斯藍染色評價蛋白質(zhì)的純化。通過BCA蛋白測定法(PierceBiotechnologyInc.,Rockford,IL)測量這些蛋白質(zhì)的濃度。實施例7:酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)在ELISA包被緩沖液中稀釋rLinJ16.1750r2、rLinJ22.1590r3、rLinJ28.2310、rLinJ33.2870、rK39或嬰兒利什曼原蟲(L.infantium)前鞭毛體可溶性裂解物抗原(LiSLA)，并用rLinJ16.1750r2、rLinJ22.15卯r3、rLinJ28.2310、rLinJ33.2870(200ng)、rK39(50ng)或LiSLA(l嗎)涂覆96孔板，隨后用含0.05%吐溫20和1%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖鹽水封阻。然后，將該板與患者血清(稀釋1:100)以及健康對照孵育，然后與辣根過氧化物酶綴合的蛋白G(Zymedlaboratories,SouthSanFrancisco,CA)孵育。用TMB過氧化物酶底物(KPL)使該板顯色并通過微量培養(yǎng)板閱讀器在450nm波長處讀數(shù)。實施例8:在血清學(xué)篩選基因中串聯(lián)重復(fù)基因的檢測來自感染嬰兒利什曼原蟲(Lz'"/a油'wm)的倉鼠或蘇丹人內(nèi)臟利什曼病患者的混合血清用于篩選嬰兒利什曼原蟲(丄.！'"/a"tow)表達文庫。篩選出覆蓋約8倍(x8)嬰兒利什曼原蟲(丄.!'"/朋^w)基因組等價物的50萬噬斑。從陽性克隆切除PBK-CMV噬菌粒；對插入物測序并使用GeneDB分析?？偣?3種基因鑒定為編碼B細胞抗原的基因(表I)。一些基因編碼先前鑒定的抗原例如HSP70和K39(9,20)，但它們中的大多數(shù)編碼先前未鑒定的抗原。然后通過TandemRepeatsFinder分析通過篩選鑒定的基因。在該研究中，假如從分析的得分為500或更高，則此基因被認為是串聯(lián)重復(fù)基因，從而排除含小串聯(lián)重復(fù)域的基因。在經(jīng)血清學(xué)篩選而鑒定的43種基因中，有19種基因被鑒定為串聯(lián)重復(fù)基因(表I)。例如，LinJ16.1750含有8.7個拷貝的219bp序列，而LinJ28.3170含有23.4個拷貝的60bp序列。除LinJ14.1160(稱為rK39)之外，這些基因新鑒定為編碼B細胞抗原的基因。也用TandemRepeatsFinder分析從數(shù)據(jù)庫(來自各染色體的3種基因)隨機挑選的108種基因，以比較它們中的與在經(jīng)篩選而鑒定的基因中的串聯(lián)重復(fù)基因的普遍性(prevalence)。與經(jīng)篩選的基因相比，在隨機挑選的108種基因中沒有發(fā)現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)基因。實施例9:串聯(lián)重復(fù)基因的PCR分析用來自利什曼原蟲(丄e&Amam'a)種和克氏錐蟲(r.crwzz')的總DNA來進行PCR擴增，以分析串聯(lián)重復(fù)基因在這些寄生蟲之中是否保守。使用LinJ16.1750和LinJ22.1590的串聯(lián)重復(fù)域的特異性引物組，PCR產(chǎn)物顯示與一個或多個拷貝的重復(fù)對應(yīng)的梯度條帶(圖1)。這些基因在利什曼原蟲(L^Amam'a)種間是保守的，因為通過所有4個種的利什曼原蟲(Z^/w^m'力的試驗均觀察到相似的帶型。當使用LinJ33.2870的串聯(lián)重復(fù)域的引物時，PCR產(chǎn)物也顯示了一些條帶，其大小與在利什曼原蟲(Z^Wmam'a)種中但非亞馬遜利什曼原蟲(丄.amazorae"w;s)中的一個或兩個拷貝的重復(fù)相對應(yīng)(圖l)。當使用LinJ33.2870的全基因的引物時，在嬰兒利什曼原蟲(丄.^/flw"wm)和杜氏利什曼原蟲(Uo"ovam〕中發(fā)現(xiàn)了1.5kb的帶，而在碩大利什曼原蟲(丄.mq/o。和亞馬遜利什曼原蟲(丄.amazowm^)中分別發(fā)現(xiàn)了2.1kb和1.8kb的帶。在所有的情況下，在使用克氏錐蟲(r.cn^)DNA的PCR^應(yīng)中均沒有發(fā)現(xiàn)帶。相反，當克氏錐蟲(:T.cn^)基因的引物用于PCR時，在克氏錐蟲(T.cn^')中但非嬰兒利什曼原蟲(丄.z'"/awriwm)中發(fā)現(xiàn)了預(yù)期大小的單個條帶。因此，所述串聯(lián)重復(fù)基因在利什曼原蟲(丄^Amam'a)和克氏錐蟲(Zm^)之間不保守，而它們在利什曼原蟲各個種(丄eWmam'a^;.)之間充分保守。實施例10:經(jīng)內(nèi)臟利什曼病患者血清識別重組串聯(lián)重復(fù)蛋白質(zhì)為了正式檢驗作為潛在的診斷候選物的經(jīng)鑒定串聯(lián)重復(fù)蛋白質(zhì)，將LinJ16.1750r2、LinJ22.1590r3、LinJ28.2310和LinJ33.2870rl表達成為重組蛋白(圖2)。通過ELISA在10份蘇丹人內(nèi)臟利什曼病患者血清的初步篩選中針對重組蛋白抗體的情況(prevalence)。內(nèi)臟利什曼病患者血清顯示比非內(nèi)臟利什曼病組(即結(jié)核病、瘧疾和表皮利什曼病患者或健康個體)的血清顯著更強的對所有重組蛋白的反應(yīng)性，盡管發(fā)現(xiàn)表皮利什曼病患者顯示對LiSLA的抗體應(yīng)答(圖3)。在試驗的蛋白質(zhì)之中，rLinJ16.1750r2是被內(nèi)臟利什曼病患者血清強烈地識別的最佳抗原，具有高度特異性。然后，用另外的蘇丹人內(nèi)臟利什曼病患者血清試驗rLinJ16.1750r2。在試驗的35份血清中，34份顯示對rLinJ16.1750r2的抗體應(yīng)答(截斷值是健康對照的均值+3SD:圖4A)。使用rLinJ16.1750r2的靈敏度是97%,相得上rK39(35/35，100%:圖4A)的靈敏度。rLinJ16.1750r2和rK39的O.D.均值分別為1.159和1.771。雖然這35份血清使用rK39呈100。/。陽性，但8份血清顯示對rK39的低反應(yīng)性(OD值〈1.0'.圖4A)。測試這8個樣品對rLinJ16.1750r2、rLinJ22.1590r3、rLinJ28.2310或rLinJ33.2870rl的反應(yīng)性，以檢驗?zāi)切┛乖欠窨梢匝a充rK39的更靈敏抗體^r測。8份血清中的5份顯示對新抗原的反應(yīng)比對rK39更好(在圖4B中的No.3-7)。5名患者(No.3-7)顯示對rLinJ22.1590r3，4名患者(No.4-7)對rLinJ28.2310，和3名患者(No.3、5和6)對rLinJ33.2870rl有更好的反應(yīng)。通過所有8份血清與rK39比較，rLinJ22.1590r3被微弱地識別。實施例11:查找串聯(lián)重復(fù)基因的生物信息學(xué)計算機分析從嬰兒利什曼原蟲(L./"/a^'ww)GeneDB(http:〃www.genedb.org/genedb/linfantum/index.jsp)獲得了8,191種嬰兒利什曼原蟲(I.化/a""t/7w)基因的DN耕列。TandemRepeatsFinder(用于在DNA序列中定位和顯示串聯(lián)重復(fù)的程序)用于該分析(http:〃tandem,bu,edu/trmrf.html)。該程序根據(jù)串聯(lián)重復(fù)基因的屬性例如重復(fù)的周期大小、與共有模式比對的拷貝數(shù)和全部相鄰拷貝之間配對的百分比，來計算得分。因此，在基因分析中高分的輸出指基因具有大的串聯(lián)重復(fù)序列和重復(fù)在拷貝之間高度保守。低分意味著相反；例如，具有36bp重復(fù)的3.6拷貝的基因的得分是111。在該研究中，假如來自TandemRepeatsFinder分析的得分高于500，那么將基因作為串聯(lián)重復(fù)基因，因此排除含小串聯(lián)重復(fù)模體的基因。使用這些篩選參數(shù)，從嬰兒利什曼原蟲(丄.!'w/fl油'wm)GeneDB鑒定以下基因。(表3)表III.經(jīng)TandemRepeatsFinder鑒定的嬰兒利什曼原蟲(Lz'"/a"riww)TR基因基因ID1C/I2產(chǎn)物大小PS3CN3分數(shù)3參考4<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>LinJ31.3360C假擬的蛋白質(zhì)713011.1556LinJ32.2730C假擬的蛋白質(zhì)17315010.32916LinJ32.2780cmembraneassociatedprotein-like1323060.93125LinJ32.3710c假擬的蛋白質(zhì)292993.9730LinJ33.2870c假擬的蛋白質(zhì)41344476041LinJ34.0710I假擬的蛋白質(zhì)3369.54517LinJ34.2140c假擬的蛋白質(zhì)2962497.43604LinJ34.4250c假擬的蛋白質(zhì)1681686.11960LinJ35.0590c蛋白磷酸聚糖ppg453645246.1腿7LinJ35細0I蛋白磷酸聚糖ppg313537.88773LinJ35.0610c蛋白磷酸聚糖ppg429145183.213275LinJ35.0620I蛋白磷酸聚糖549590152.515050LinJ35.0630I蛋白磷酸聚糖ppg428145176.610813LinJ35.0640I假擬的蛋白質(zhì)954558.44766LinJ35.1530c假擬的蛋白質(zhì)3281412.4661LinJ35.1620I假擬的蛋白質(zhì)1268.71855LinJ35.4500c假擬的蛋白質(zhì)601654.51438LinJ36.0320c組氨酸分泌性酸性磷酸酶71726.5861LinJ36.5810c假擬的蛋白質(zhì)3652764.32341以下注解對應(yīng)于在表m中上標的注解(1)在GeneDB中ID號是臨時性的并可以改變；(2)C或I分別指基因是完整的或不完整的基因；(3)在TR分析中PS、CN和得分的數(shù)據(jù)來自使用TandemRepeatsFinder的程序分析。TR基因以粗體字母顯示。PS、CN和得分欄中的空白表示在基因中沒有發(fā)現(xiàn)重復(fù)。PS:重復(fù)的周期大小(bp)，CN:與共有模式比對的拷貝數(shù)；和(4)已經(jīng)在參考文獻中報導(dǎo)了蛋白質(zhì)的抗原性。實施例12:串聯(lián)重復(fù)蛋白質(zhì)的M酸成分的分析使用軟件EditSeq(DNASTARInc.，Madison，WI)分析串聯(lián)重復(fù)蛋白質(zhì)(由經(jīng)生物信息學(xué)分析而鑒定的串聯(lián)重復(fù)基因編碼)的同組異序點(isometricpoint)和氨基酸組成。將賴氨酸和精氨酸分類為強堿性氨基酸，天冬氨酸和谷氨酸分類為強酸性氨基酸，天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸分類為其它的極性氨基酸，而丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和纈氨酸分類為疏水性氨基酸。以同樣的方式分析串聯(lián)重復(fù)蛋白質(zhì)的串聯(lián)重復(fù)域。作為對照，也分析108種基因(隨機選自嬰兒利什曼原蟲(丄./"/a油'wm)基因數(shù)據(jù)庫)演繹的氛基酸序列的同組異序點和氨基酸組成。實施例13:重組蛋白的表達為了評估串聯(lián)重復(fù)蛋白質(zhì)的抗原性，在96孔板中使用200ng抗原/孔執(zhí)行ELISA。內(nèi)臟利什曼病患者(蘇丹)、表皮利什曼病患者(巴西)和健康個體(美國)的血清按1:100稀釋度用于ELISA。內(nèi)臟利什曼病患者血清顯示比非內(nèi)臟利什曼病組(即結(jié)核病、癡疾和表皮利什曼病患者或健康個體)的血清顯著更強的對所有重組蛋白的反應(yīng)性，盡管發(fā)現(xiàn)了表皮利什曼病患者顯示對LiSLA的抗體應(yīng)答(圖6)。在被試驗的蛋白質(zhì)之中，rLinJ16.1750r2是最佳抗原，被內(nèi)臟利什曼病患者血清強烈地識別，具有高度特異性。然后，用另外的蘇丹人內(nèi)臟利什曼病患者血清試驗rLinJ16.1750r2。在試驗的35份血清中，34份顯示對rLinJ16.1750r2的抗體應(yīng)答(截斷值是健康對照的均值+3SD:圖6)使用rLinJ16.1750r2的靈敏度是97Q/。，比得上rK39(35/35,100%:圖6)的靈敏度。rLinJ16.1750r2和rK39的O.D.均值分別為1.159和1.771。雖然這35份血清使用rK39呈100。/。陽性，但8份血清顯示對rK39的低反應(yīng)性(OD值〈1.0:圖6)。測試這8個樣品對rLinJ16.1750r2、rLinJ22.1590r3、rLinJ28.2310或rLinJ33.2870rl的反應(yīng)性，以檢驗?zāi)切┛乖欠窨梢匝a充rK39的更靈敏抗體檢測。8份血清中的5份顯示對新抗原的反應(yīng)比對rK39更好(在圖6中的No.3-7)。5名患者(No.3-7)顯示對rLinJ22.1590r3,4名患者(No.4-7)對rLinJ28.2310,和3名患者(No.3、5和6)對rLinJ33.2870rl有更好的反應(yīng)。最終，與rK39比較，rLinJ22.1590r3被所有8份血清微弱地識別。實施例15:經(jīng)血清學(xué)篩選和生物信息學(xué)鑒定的串聯(lián)重復(fù)蛋白質(zhì)的ELISA分析在ELISA包被緩沖液中稀釋重組串聯(lián)重復(fù)蛋白或嬰兒利什曼原蟲(Z.z'"/""riww)前鞭毛體可溶性裂解物抗原(LiSLA)，并用rK39(50ng)、其它重組蛋白(200ng)或LiSLA(1嗎)涂覆96孔板，隨后用含0.05%吐溫20和1%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖鹽水封阻。然后，使該板與按l:100稀釋的患者血清(n-16)以及健康對照(n-8)將育，然后與辣根過氧化物酶綴合的抗-人IgG(RocklandImmunochemicals,Inc.,Gilbertsville,PA)孵育。用TMB過氧化物酶底物(KPL)使該板顯色并通過微量培養(yǎng)板閱讀器在450nm波長處(570nm作為參照)讀數(shù)。不僅從血清學(xué)篩選中而且單獨從生物信息學(xué)分析中，都可在VL患者中檢測到與健康對照相比更高水平的抗體串聯(lián)重復(fù)蛋白質(zhì)(表IV)(圖6)。這證明不僅從血清學(xué)篩選中而且單獨經(jīng)生物信息學(xué)分析鑒定，串聯(lián)重復(fù)蛋白質(zhì)都是抗原性的。表IV.嬰兒利什曼原蟲(丄.化/a"riwm)串聯(lián)重復(fù)蛋白質(zhì)在ELISA中的反應(yīng)性O(shè)D:OD:OD:重組體PSa(aa)CNa大小(kDa)VLHCP值經(jīng)血清學(xué)鑒定rLinJ05.0380r6386280.7860.142rLinJ16.1750r2732180.8470.058rLinJ22.5卯r3283120.4740.042rLinJ28.2310TR1052.2351.3260.123rLinJ33.2870rl1481180.4760.137rLinJ34.2140r2832200.3270.126單獨從生物信息學(xué)鑒定rLinJ1.0070r2462120.3590.065rLinJ21.2010TR645.3380.2740.048承承，rLinJ25.1100TR229.6270.5200.032rLinJ27.0德2682180.7480.117rLinJ29.0110TR828.8310.7240.185*承rLinJ32.3710TR333.8170.1920.124天然的(CRUDE)LiSLA0.8850.082注解aPS:在氨基酸的單位中一個拷貝的重復(fù)的長度，CN:拷貝數(shù)。b顯示了VL患者(VL:n-16)和健康對照(HC:n-8)的OD平均值。P值是來自使用Mann-Whitney試驗的統(tǒng)計分析。*P<0.05、**P<0.01、娟P(guān)O週。從上述將可認識到的是，雖然本文為了闡述目的而已經(jīng)描述了本發(fā)明特定的實施方案，但在不違背本發(fā)明的精神和范圍下可以進行各種修改。因此，除了附加的權(quán)利要求之外本發(fā)明不被限制。權(quán)利要求1.用于檢測對象中利什曼原蟲感染的方法，所述方法包括(a)在足以使樣本中的抗體發(fā)生結(jié)合的條件和持續(xù)時間下，使疑有利什曼原蟲感染的對象的生物樣品與一種或多種多肽接觸，其中每種多肽包含至少一個串聯(lián)重復(fù)單位，其中所述串聯(lián)重復(fù)單位包含以下氨基酸序列具有選自SEQIDNO1-59的氨基酸序列的至少8個鄰接的氨基酸并與這些氨基酸序列有至少70％的同源性；和(b)檢測所述生物樣品中的與所述多肽特異性結(jié)合的一種或多種抗體的存在情況，從而檢測出在所述生物樣品中的利什曼原蟲感染。2.權(quán)利要求1的用于檢測在生物樣品中利什曼原蟲感染的方法，其中所述一種或多種多肽各包含至少兩個串聯(lián)重復(fù)單位，其中各個串聯(lián)重復(fù)單位包含以下氨基酸序列具有選自SEQIDNO:1-59的氨基酸序列的至少8個鄰接的氨基酸并與這些氨基酸序列有至少70%的同源性。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種多肽中的至少一種為包含至少第一和第二串聯(lián)重復(fù)單位的融合蛋白，其中所述第一串聯(lián)重復(fù)單位包含以下氨基酸序列具有選自SEQIDNO:l-59的氨基酸序列的至少8個鄰接的氨基酸并與這些氨基酸序列有至少70%的同源性；而所述第二串聯(lián)重復(fù)單位包含以下氨基酸序列具有選自SEQIDNO:1-59的氨基酸序列的至少8個鄰接的氨基酸并與這些氨基酸序列有至少70%的同源性。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述第一串聯(lián)重復(fù)單位和第二串聯(lián)重復(fù)單位是同一的。5.權(quán)利要求3的方法，其中所述第一串聯(lián)重復(fù)單位具有所述第二串聯(lián)重復(fù)單位的至少8個鄰接的氨基酸并與第二串聯(lián)重復(fù)單位有至少70%的同源性。6.權(quán)利要求l、權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的方法，其中串聯(lián)重復(fù)單位包含以下氨基酸序列具有選自SEQIDNO:14、17、26、27、;33、43、44的氨基酸序列的至少8個鄰接的氨基酸并與這些氨基酸序列有至少70%的同源性。7.權(quán)利要求l、權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的方法，其中檢測臨床的或亞臨床的內(nèi)臟利什曼病感染，其中至少一個串聯(lián)重復(fù)單位包含以下氨基,列具有選自SEQIDNO:14、26、33、44的氨基財列的至少8個鄰接的氨基酸并與這些氨基酸序列有至少70%的同源性。8.權(quán)利要求l、權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的方法，其中檢測臨床的或亞臨床的內(nèi)臟利什曼病，其中至少一個串聯(lián)重復(fù)單位包含以下氨基酸序列具有選自SEQIDNO:17、27、43的氨基酸序列的至少8個鄰接的氛基酸并與有至少70%的同源性。9.權(quán)利要求l、權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的方法，其中所述一種或多種多肽與固相支持體結(jié)合。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述一種或多種多肽與固相支持體非共價結(jié)合。11.權(quán)利要求9的方法，其中所述固相支持體包含硝基纖維素、膠乳或塑料。12.權(quán)利要求9的方法，其中檢測一種或多種抗體的步驟包括(a)從所述固相支持體去除非結(jié)合的樣品；(b)使檢測試劑暴露至所述固相支持體；和(c)測定相對于預(yù)定截斷值的、與所述固相支持體結(jié)合的抗體水平，從而檢測所述生物樣品中的利什曼原蟲感染。13.用于檢測生物樣品中利什曼原蟲感染的診斷試劑盒，所述診斷試劑盒包含(a)—種或多種多肽，其中各種所述多肽包含至少一個串聯(lián)重復(fù)單位，其中所述串聯(lián)重復(fù)單位包含以下氨基酸序列具有選自SEQIDNO:1-59的氨基酸序列的至少8個鄰接的氨基酸并與這些氨基酸序列有至少70%的同源性；和(b)沖企測試劑。14.權(quán)利要求13的診斷試劑盒，所述診斷試劑盒還包含多肽，所述多肽包含在SEQIDNO:119闡述的氨基酸序列的并與該氨基^列有至少70%的同源性的至少8個鄰接氨基酸。15.權(quán)利要求13的診斷試劑盒，所述診斷試劑盒還包含多肽，所述多肽包含選自SEQIDNO:119-121的氨基*列的并與這些氨基酸序列有至少70%同源性的至少8個鄰接氨基酸。16.包含至少第一和第二串聯(lián)重復(fù)單位的融合蛋白，其中所迷第一串聯(lián)重復(fù)單位包含以下氨基酸序列具有選自SEQIDNO:1-59的氨基酸序列的至少8個鄰接的氨基酸并與這些序列有至少70%的同源性；而所述第二串聯(lián)重復(fù)單位包含以下氨基酸序列具有選自SEQIDNO:1-59的氨基酸序列的至少8個鄰接的氨基酸并與這些序列有至少70%的同源性。17.編碼多肽的分離的多核苷酸，所述多肽選自(i)包含至少一個串聯(lián)重復(fù)單位的多肽，其中所述串聯(lián)重復(fù)單位包含以下氨基酸序列具有選自SEQIDNO:1-59的氨基酸序列的至少8個鄰接的氨基酸并與這些氨基酸有至少70%的同源性，(ii)包含至少兩個串聯(lián)重復(fù)單位的多肽，其中每個串聯(lián)重復(fù)單位包含以下氨基酸序列具有選自SEQIDNO:1-59的氨基酸序列的至少8個鄰接的氨基酸并與這些氨基酸有至少70%的同源性，和(iii)包含融合蛋白的多肽，所述融合蛋白包含至少第一和第二串聯(lián)重復(fù)單位，其中所述第一串聯(lián)重復(fù)單位包含以下氨基酸序列具有選自SEQIDNO:1-59的氨基酸序列的至少8個鄰接的氨基酸并與這些氨基酸有至少70%的同源性，和其中所述第二串聯(lián)重復(fù)單位包含以下氨基酸序列具有選自SEQIDNO:1-59的氨基酸序列的至少8個鄰接的氨基酸并與這些氨基酸有至少70%的同源性。18.權(quán)利要求17的多核苷酸，所述多核苷酸包含以下核苷酸序列具有選自SEQIDNO:60-118的序列的至少24個鄰接的核苷酸并與這些序列有至少70%的同源性。19.包含權(quán)利要求18的多核苷酸的重組表達載體。20.用權(quán)利要求19的表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。21.包含生理學(xué)上可接受的載體和一種或多種多肽的藥物組合物，其中每種多肽包含至少一個串聯(lián)重復(fù)，其中串聯(lián)重復(fù)單位包含以下氨基酸序列具有選自SEQIDNO:1-59的M酸序列的至少8個鄰接的氨基酸并與這些氨基酸有至少70%的同源性。22.包含至少一種權(quán)利要求16的融合蛋白和生理學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。23.包含免疫刺激劑和一種或多種多肽的免疫原性組合物，其中每種多肽包含至少一個串聯(lián)重復(fù)單位，其中所述串聯(lián)重復(fù)單位包含以下氨基酸序列具有選自SEQIDNO:1-59的氨基酸序列的至少8個鄰接的氨基酸并與這些氨基酸有至少70%的同源性。24.包含免疫刺激劑和一種或多種權(quán)利要求16的融合蛋白的免疫原性組合物。25.權(quán)利要求20或權(quán)利要求21的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物還包含遞藥載體。26.在患者中誘導(dǎo)保護性免疫對抗利什曼病的方法，所述方法包括給予權(quán)利要求21和22中任一項的藥物組合物。27.在患者中誘導(dǎo)保護性免疫對抗利什曼病的方法，所述方法包括給予權(quán)利要求23和24中任一項的免疫原性組合物。28.診斷、治療或免疫接種患者或血液供給的免疫原性多肽的篩選方法，所述方法包括(a)構(gòu)建多核苷酸篩選文庫；(b)表達(a)的表達產(chǎn)物；(c)通過使所述表達產(chǎn)物與生物樣品接觸，篩選所述篩選文庫的表達產(chǎn)物；和(d)分析通過篩選所述篩選文庫的表達產(chǎn)物而鑒定的序列，以選出為串聯(lián)重復(fù)基因的基因，從而選出含串聯(lián)重復(fù)的免疫原性多肽。29.權(quán)利要求28的方法，所述方法還包括步驟當分析通過篩選所述篩選文庫而鑒定的基因以選出為串聯(lián)重復(fù)基因的基因時，排除具有鄰接的8個或更少氨基酸的串聯(lián)重復(fù)模體的多核苷酸。30.權(quán)利要求28或29的方法，其中所述篩選文庫通過嬰兒利什曼原蟲(L.—"riwm)構(gòu)建。31.診斷、治療或免疫接種患者或血液供給的免疫原性多肽的篩選方法，所述方法包括(a)選擇一種或多種多肽序列或多核苷^列；(b)分析所選擇的一種或多種多肽序列或多核苷酸序列，并選出含串聯(lián)重復(fù)的序列；(c)表達所選擇的(b)的序列；和(d)通過使(c)的表達產(chǎn)物暴露于從感染利什曼病的一個或多個患者獲得的一個或多個生物樣品，來篩選(c)的表達產(chǎn)物，從而選出免疫原性多肽。32.權(quán)利要求31的方法，其中所述免疫原性多肽用于診斷或治療利什曼病，或免疫接種對抗利什曼病。33.權(quán)利要求28、權(quán)利要求29、權(quán)利要求30、權(quán)利要求31或權(quán)利要求32的方法，所述方法還包括步驟通過比較所選擇的免疫原性多肽的序列與潛在感染利什曼病的才幾體的多肽序列的同源性，來篩選所選擇的免疫原性多肽，從而選出與潛在感染利什曼病的機體的多肽同源性最小的一種或多種多肽。34.權(quán)利要求28、權(quán)利要求29、權(quán)利要求30、權(quán)利要求31或權(quán)利要求32的方法，所述方法還包括步驟通過比較所選擇的免疫原性多肽的序列與潛在感染被利什曼病潛在感染的生物體的生物體的多肽序列的同源性，來篩選所選擇的免疫原性多肽，從而選出與潛在感染被利什曼病潛在感染的生物體的生物體的多肽同源性最小的一種或多種多肽。35.鑒定用于診斷、治療或免疫接種患者的免疫原性多肽的方法，所述方法包括(a)在一種或多種宿主細胞中表達多核苷酸表達文庫的表達產(chǎn)物，所迷多核苷酸表達文庫包含一種或多種編碼候選免疫原性多肽的多核苷酸，所述多核苷酸中的至少一種能夠表達含串聯(lián)重復(fù)的候選免疫原性多肽，以獲得含表達產(chǎn)物的宿主細胞群；(b)在足以使生物材料中的至少一種抗體與至少一種表達產(chǎn)物特異性結(jié)合的條件和持續(xù)時間下，使(i)含(a)的表達產(chǎn)物的宿主細胞群與(ii)從已經(jīng)被利什曼原蟲生物體感染的對象或生物源中獲得的生物材料接觸，其中所述生物材料包含至少一種抗體并選自血液、血清和尿；(c)檢測含至少一種表達產(chǎn)物的至少一種宿主細胞，所述表達產(chǎn)物與所述至少一種抗體特異性結(jié)合；(d)從在(c)中所檢測的宿主細胞分離編碼所述表達產(chǎn)物的多核苷酸，以獲得分離的多核苷酸，所述表達產(chǎn)物與所述至少一種抗體特異性結(jié)合；和(e)分析(d)的所述分離的多核苷酸的核苷酸序列是否存在串聯(lián)重復(fù)，其中串聯(lián)重復(fù)的存在表明所述分離的多核苷酸編碼免疫原性多肽，并由此鑒定所述免疫原性多肽。36.權(quán)利要求35的方法，其中所述多核苷酸表達文庫從得自生物體的核苷酸序列構(gòu)建，所述生物體選自傳染性生物體和非傳染性生物體。37.權(quán)利要求35的方法，其中所述多核苷酸表達文庫從引起利什曼病的生物體構(gòu)建。38.權(quán)利要求37的方法，其中所述引起利什曼病的生物體選自嬰兒利4十曼原蟲(Ze/Awa"/a/w/aWwm)、；^土氏利fh曼原蟲(丄e&A/wflm'acfowovam〕、碩大利什曼原蟲(丄e^/wmm'a7wq/or)、亞馬遜利什曼原蟲(丄e/s/jmaw'flamflzowem^)、克氏錐蟲(r^pa"(Womacraz()、和引起利什曼病的天然的或非天然的細菌林。39.權(quán)利要求35的方法，其中所述多核苷酸表達文庫構(gòu)建自選自細菌、病毒、原生動物、真菌、酵母、雙滴蟲目(diplomonoadid)和動基體目(kinetoplastid)原生動物的致病性或非致病性微生物體。40.鑒定用于診斷、治療或免疫接種患者的免疫原性多肽的方法，所述方法包括(a)在一種或多種宿主細胞中表達多核苷酸表達文庫的表達產(chǎn)物，所述多核苦酸表達文庫包含一種或多種編碼候選免疫原性多肽的多核苷酸，所述多核苷酸中的至少一種能夠表達含串聯(lián)重復(fù)的候選免疫原性多肽，以獲得含表達產(chǎn)物的宿主細胞群；(b)在足以使下述生物材料中的至少一種抗體與至少一種表達產(chǎn)物特異性結(jié)合的條件和持續(xù)時間下，使(i)含(a)的表達產(chǎn)物的宿主細胞群與(ii)從已經(jīng)感染了傳染性生物體的對象或生物源中獲得的生物材料接觸，其中所述生物材料包含至少一種抗體并選自血液、血清和尿；(c)檢測含至少一種表達產(chǎn)物的至少一種宿主細胞，所述表達產(chǎn)物與所述至少一種抗體特異性結(jié)合；(d)從在(c)中所檢測的宿主細胞分離編碼所述表達產(chǎn)物的多核苷酸，以獲得分離的多核苷酸，所述表達產(chǎn)物與所述至少一種抗體特異性結(jié)合；和(e)分析(d)的所述分離的多核苷酸的核苷酸序列是否存在串聯(lián)重復(fù)，其中串聯(lián)重復(fù)的存在表明所述分離的多核苷酸編碼免疫原性多肽，并從此鑒定所述免疫原性多肽。41.權(quán)利要求40的方法，其中所述多核苷酸表達文庫從得自生物體的核苷酸序列構(gòu)建，所述生物體選自傳染性生物體和非傳染性生物體。42.權(quán)利要求40的方法，其中所述多核苷酸表達文庫由引起利什曼病的生物體構(gòu)建。43.權(quán)利要求42的方法，其中引起利什曼病的生物體選自嬰兒利4十曼原蟲(丄e&Amam'fl、4土氏利什曼原蟲(丄ei^mfl"/adcmovam')、碩大利什曼原蟲(Z^s/wumz'ama/o。、亞馬遜利什曼原蟲(丄e^/jmam'aamazo"era&)、克氏4,蟲(TV^pawosomacrwd)、和引起利1"十曼病的天然或非天然的細菌林。44.權(quán)利要求40的方法，其中所述多核苷酸表達文庫構(gòu)建自選自細菌、病毒、原生動物、真菌、酵母、雙滴蟲目(diplomonoadid)和動基體目(kinetoplastid)原生動物的致病性或非致病性微生物體。全文摘要公開了提供用于診斷、預(yù)防、治療和檢測利什曼病感染并刺激患者免疫應(yīng)答的化合物和方法。所公開的化合物包括多肽和融合蛋白或它們的變體，其含有一種或多種利什曼原蟲抗原的至少一個免疫原性部分。另外，公開了從篩選文庫中篩選出具有免疫原性的串聯(lián)重復(fù)蛋白質(zhì)的方法。描述了可以用于預(yù)防和治療利什曼病以及檢測利什曼病感染的包含多核苷酸、多肽、融合蛋白及其變體的疫苗和藥物組合物。文檔編號C12N15/00GK101466831SQ200780021420公開日2009年6月24日申請日期2007年4月10日優(yōu)先權(quán)日2006年4月10日發(fā)明者S·G·里德,后藤康之申請人:傳染病研究所有限公司