專利名稱：具有iNOS的表達控制作用的正義寡核苷酸以及含有其的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于控制iNOS (誘導(dǎo)型一氧化氮合酶，inducible nitric oxide synthase)的表達且具有與下述單鏈RNA (反義轉(zhuǎn)錄物)互補的序列的正義 寡核苷酸(sense oligonucleotide),所述單鏈RNA具有與iNOS基因的mRNA
互補的堿基序列。
背景技術(shù)：
生物體內(nèi)的一氧化氮(NO)從巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)區(qū)域等 各處產(chǎn)生，作為其作用，有殺菌作用、血管松馳作用，或者也作為神經(jīng)信 號傳達物質(zhì)而發(fā)揮作用。
已知介由一氧化氮產(chǎn)生的是一氧化氮合成酶(NOS， nitric oxide synthase),根據(jù)在體內(nèi)的作用場所的不同，NOS分為誘導(dǎo)型NOS (iNOS, inducible NOS)、神經(jīng)型NOS (nNOS， neuronal NOS)和血管內(nèi)皮型NOS (eNOS, endothelial NOS) 3類，特別是，介由iNOS的NO產(chǎn)生與其它的 NO合成系統(tǒng)即神經(jīng)型NOS和血管內(nèi)皮型NOS相比較，能長時間地持續(xù)其 活性，并能產(chǎn)生更多量的NO (lnM以上)。
iNOS主要是在巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞、消化道上 皮細胞、支氣管上皮細胞、肝細胞、小膠質(zhì)細胞等受到細胞毒素、感染或 炎癥性病灶中產(chǎn)生的IL-lp (白細胞介素-lj3， Interleukin-lf3)、 TNF-a (腫瘤 壞死因子-a， Tumor Necrosis Factor-a)、 IFN-丫 (干擾素-y， Interferon- )等 炎癥性細胞因子的攻擊時表達，從而產(chǎn)生NO。過剩生成的NO作為生物體 的感染防御反應(yīng)中的主要炎癥性介質(zhì)而發(fā)揮作用。
iNOS的表達也伴隨炎癥反應(yīng)或細菌、真菌、病毒、原生動物等多種病 原體的感染而產(chǎn)生。例如己知通過作為革蘭氏陰性菌的普遍構(gòu)成成分的脂 多糖(LPS)和作為革蘭氏陽性菌的細胞壁成分的脂磷壁酸(LTA)的刺激、 或介由炎癥性細胞因子的間接的產(chǎn)生誘導(dǎo)，會引起iNOS的誘導(dǎo)。另夕卜，最近發(fā)現(xiàn)，各種病毒的生物體內(nèi)增殖也會引起NO合成的亢進，這種情況下
的iNOS的誘導(dǎo)主要是介由IL-lf3、 IFN-y等炎癥性細胞因子的產(chǎn)生。
來源于iNOS的NO顯示出殺菌、抗病毒、抗寄生蟲、抗腫瘤作用，在 生物體系的生命維持中不可缺少地存在。然而，另一方面， 一旦由于炎癥 反應(yīng)等引起iNOS活化而產(chǎn)生過剩的NO，則與活性氧反應(yīng)而生成的強過氧 亞硝酸鹽(過氧亞硝酸根、過氧化亞硝酸)會損傷DNA，從而產(chǎn)生引起突 變和致癌等負面作用。
目前已知，通過多種因素引起iNOS過剩地表達，產(chǎn)生過剩的NO，由 此會引起毒性休克或利用某種細胞因子的治療等引起的全身性血壓降低、 血壓響應(yīng)降低、自身免疫疾病、炎癥、關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、 炎癥性腸病、血管功能不全、病原性血管擴張、組織損傷、心血管缺血、 痛覺過敏癥、腦缺血、惡液質(zhì)、癌癥等各種疾病。
因此，控制iNOS的表達在生物體防御或NO過剩產(chǎn)生相關(guān)的疾病、例 如致癌和炎癥性疾病、細菌感染等引起的內(nèi)毒素休克等的治療和預(yù)防方面 是非常重要的。
以往已知被稱為RNAi (RNA干擾RNA interference)的方法，即用 雙鏈RNA切斷目標(biāo)mRNA來抑制轉(zhuǎn)錄的方法，但通常的RNAi都是20個 堿基對左右的堿基長(專利文獻l:特開2005-13224號公報)，并公開了其 雙鏈寡核苷酸和其反義RNA的篩選方法。另外，還公開了下述化合物，該 化合物可用于通過使用小核酸分子、例如短干擾核酸(siNA)、短干擾RNA (siRNA)、雙鏈RNA( dsRNA )、微小RNA( miRNA )和短發(fā)夾RNA( shRNA) 分子的RNA干擾(RNAi)來調(diào)節(jié)白細胞介素基因、白細胞介素超家族基 因或與基因表達和/或活性的白細胞介素路徑相關(guān)的基因的表達和活性(專 利文獻2:特開2005-524393號公報)。
當(dāng)細胞內(nèi)存在反義RNA時，其和與之互補的mRNA雜交，從mRNA 向蛋白質(zhì)的翻譯受到阻礙，因此可以阻礙基因的表達。如果人為地將反義 RNA導(dǎo)入細胞內(nèi)，就可以阻礙靶基因的表達，因而目前作為闡明基因功能 的技術(shù)來使用，也在研究其向醫(yī)藥品的應(yīng)用。至今為止，對于iNOS基因， 反義RNA的存在并未得到確認。另外，至今為止，雖然暗示了存在著從 mRNA轉(zhuǎn)錄時有助于mRNA的穩(wěn)定化的蛋白質(zhì)(非專利文獻1: Eur. J.
4Pharmacol. 500: 255-266(2004))，但其詳細情況并不明了，關(guān)于iNOS的表 達控制還有很多不明確的問題。
專利文獻l:特開2005-13224號公報
專利文獻2:特開2005-524393號公報
非專利文獻1: Eur. J. Pharmacol. 500: 255-266(2004)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供用于iNOS的表達控制且具有與下述單鏈RNA (反義轉(zhuǎn)錄 物)互補的序列的正義寡核苷酸，所述單鏈RNA具有與iNOS基因的mRNA
互補的堿基序列。
本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)在細胞內(nèi)存在具有與mRNA互補的序列的單鏈RNA (反義轉(zhuǎn)錄物)、其與以往的反義RNA不同、且會有助于mRNA的穩(wěn)定化 的情況，并在同一天申請了專利。
進而，本發(fā)明人等對iNOS的表達控制進行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了下 述方法，從而完成了本發(fā)明，該方法使用具有與上述單鏈RNA (反義轉(zhuǎn)錄 物)互補的序列的正義寡核苷酸來與反義轉(zhuǎn)錄物雜交以抑制其功能，從而 干擾mRNA的穩(wěn)定性，結(jié)果抑制iNOS的表達，從而抑制NO的過剩產(chǎn)生。
艮卩，本發(fā)明涉及具有與以下的iNOSmRNA反義RNA (iNOSmRNA反 義轉(zhuǎn)錄物)互補的序列的正義寡核苷酸、具有NO產(chǎn)生抑制活性的組合物、 以及iNOS產(chǎn)生量的抑制方法。
1. 一種正義寡核苷酸，其具有與下述iNOSmRNA反義RNA (iNOSmRNA反義轉(zhuǎn)錄物)互補的序列，所述iNOSmRNA反義RNA具有
與iNOS (誘導(dǎo)型一氧化氮合酶)mRNA互補的序列。
2. 根據(jù)上述1記載的正義寡核苷酸，其具有與含有序列號1所示的核 酸序列的上述iNOSmRNA反義RNA (iNOSmRNA反義轉(zhuǎn)錄物)互補的序 列。
3. 根據(jù)上述1或2記載的正義寡核苷酸，其在與上述iNOSmRNA反 義RNA (iNOSmRNA反義轉(zhuǎn)錄物)中熱力學(xué)不穩(wěn)定的環(huán)結(jié)構(gòu)對應(yīng)的區(qū)域具 有互補的序列。
4. 根據(jù)上述1 3的任意一項記載的正義寡核苷酸，其具有16個堿基 335個堿基的堿基長。
5. 根據(jù)上述1 4的任意一項記載的正義寡核苷酸及其衍生物，其經(jīng)過
對核酸分解酶引起的分解的穩(wěn)定化。
6. 根據(jù)上述5中記載的正義寡核苷酸，其中，穩(wěn)定化是利用LNA、PNA、 ENA、嗎啉和其它修飾方法進行的。
7. —種組合物，其含有上述1 6的任意一項記載的正義寡核苷酸，且 具有促進iNOSmRNA的分解的NO產(chǎn)生抑制活性。
8. —種iNOS產(chǎn)生量的抑制方法，其特征在于，在細胞內(nèi)導(dǎo)入下述正 義寡核苷酸，該正義寡核苷酸具有與iNOSmRNA反義RNA (iNOSmRNA 反義轉(zhuǎn)錄物)互補的序列。
本發(fā)明的具有和具有與iNOSmRNA互補的序列的反義轉(zhuǎn)錄物互補的 序列的正義寡核苷酸、以及其硫代磷酸酯型、即S代正義寡核苷酸可以作 為對與NO的過剩產(chǎn)生相關(guān)的疾病即炎癥性疾病、細菌感染造成的內(nèi)毒素 休克、致癌等有效的醫(yī)藥品組合物、即作為醫(yī)藥品來使用，或作為對這些 疾病有效的保健食品組合物、即作為保健食品來使用。


圖1為表示利用RT-PCR法的大鼠肝細胞中的mRNA量的測定結(jié)果的 電泳圖。
圖2為表示利用實時PCR法的大鼠肝細胞中的mRNA量的測定結(jié)果 的圖。
圖3為表示iNOSmRNA通過小鼠iNOS反義轉(zhuǎn)錄物而被分解的電泳圖。
圖4為表示顯示投予肝臟保護劑(IGF-I)的大鼠的iNOSmRNA增加 被抑制的利用鏈特異性RT-PCR的iNOSmRNA的檢測結(jié)果的電泳圖。
圖5為顯示投予肝臟保護劑(IGF-I)的大鼠的iNOS反義轉(zhuǎn)錄物增加 被抑制的利用鏈特異性RT-PCR的iNOS反義轉(zhuǎn)錄物的檢測結(jié)果(電泳圖)。
圖6為表示將投予肝臟保護劑(IGF-I)的大鼠的iNOS反義轉(zhuǎn)錄物的 增加用實時PCR來定量的結(jié)果的圖。圖中，"f'表示相對于GalN/LPS大鼠 (n二3 6只大鼠/組)，p<0.05。
圖7為表示顯示投予肝臟保護劑(FR183998)的大鼠的iNOSmRNA增加被抑制的利用鏈特異性RT-PCR的iNOSmRNA的檢測結(jié)果的電泳圖。 圖8為表示顯示投予肝臟保護劑(FR183998)的大鼠的iNOS反義轉(zhuǎn) 錄物增加被抑制的利用鏈特異性RT-PCR的iNOS反義轉(zhuǎn)錄物的檢測結(jié)果的 電泳圖。
圖9為表示將投予肝臟保護劑(FR183998)的大鼠的iNOS反義轉(zhuǎn)錄 物的增加用實時PCR來定量的結(jié)果的圖。圖中，"*"表示相對于GalN/LPS 大鼠(n二3 6只大鼠/組)，p<0.05。
圖10為表示實施例10中iNOS蛋白質(zhì)和培養(yǎng)基中的一氧化氮(NO) 量的測定結(jié)果的電泳圖和圖。
圖11為表示實施例11中4種RNA的利用Northern法得到的分析結(jié) 果的X射線放射自顯影圖。從左開始表示"無刺激大鼠肝細胞的全RNA"、 "IL-1(3刺激大鼠肝細胞的全RNA"、 "IL-1(3刺激大鼠肝細胞的Poly (A) 十RNA"和"IL-l(3刺激大鼠肝細胞的的Poly (A)—脂A"的結(jié)果。
圖12為表示顯示實施例11中RACE的結(jié)果和核糖核酸酶保護分析的 結(jié)果的圖。
圖13為實施例12中構(gòu)建的載體的示意圖。
圖14為表示在實施例12中iNOS反義轉(zhuǎn)錄物表達載體加入時(AS( + )) 和未加入時(AS ( — ))的Luc/pGal值的隨時間變化的圖。
圖15為表示在實施例12中使用連結(jié)有SVpA的報告基因(reporter) 作為對照時的Luc/(3Gal值的隨時間變化的圖。
具體實施例方式
本發(fā)明是在細胞內(nèi)使用具有與下述單鏈RNA (反義轉(zhuǎn)錄物)互補的序 列的正義寡核苷酸來與反義轉(zhuǎn)錄物雜交以抑制其功能，從而干涉mRNA的 穩(wěn)定性，結(jié)果抑制iNOS的表達，從而抑制NO的過量產(chǎn)生，所述單鏈RNA (反義轉(zhuǎn)錄物)具有與有助于誘導(dǎo)型一氧化氮合酶iNOS mRNA的穩(wěn)定化 的iNOSmRNA互補的序列。
具有與iNOSmRNA互補的序列的單鏈RNA是含有和序列號1表示的 堿基序列相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的堿基序列的核苷酸。實質(zhì)上相同的核苷酸是 指含有序列號1或與之具有75%以上、優(yōu)選90%以上、更優(yōu)選95%以上的同源性的堿基序列、且使誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的合成量增加的物 質(zhì)，可以用化學(xué)合成、公知的表達方法以及精制法或者實施例中記載的方 法來制備。
本發(fā)明的具有與iNOSmRNA的上述反義轉(zhuǎn)錄物互補的序列的正義寡 核苷酸(以下將之稱為"本發(fā)明的正義寡核苷酸")是可以和反義轉(zhuǎn)錄物發(fā)生 雜交的寡核苷酸或其衍生物，按照不會被核內(nèi)的核酸分解酶分解的方式進 行修飾的物質(zhì)即可。
正義寡核苷酸設(shè)計可以使用Nucleic Acids Res. 31, 3406-3415(2003)和J. Mol. Biol. 288, 911-940(1999)中公開的程序"mfold"(參照http:〃www.bioinfo. rpi-edu廠zukerm/rna/)預(yù)測RNA的二級結(jié)構(gòu)來進行。正義寡核苷酸的候補 序列設(shè)計為與熱力學(xué)不穩(wěn)定的部分(例如莖環(huán)(stem-loop)結(jié)構(gòu)中莖部分 之外的區(qū)域)、優(yōu)選與含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)(loop)結(jié)構(gòu)的部分相對的正義寡 核苷酸。
關(guān)于上述的正義寡核苷酸的候補序列，可以選擇不含有會在細胞中引 起序列非特異性反應(yīng)的5，-CG-3，、 5，-GGGG-3，以及5'-GGGGG-3，等序列的 序列，在大鼠基因組中進行同源性檢索，確認不存在類似的序列后，選擇 優(yōu)選的序列(參照J. Neurochem. 86， 374382(2003))。
作為正義寡核苷酸，可以列舉出序列號2 4所示的寡核苷酸等(下述 序列都省略了修飾來表示)。
5,-GCCTCATACTTCCTCAGAGC-3，(序列號36)
5，-TAGCTGCATTGTGTACAGAT-3，(序列號37)
5，-GTGTATAATTCCTTGATGAA-3，(序列號38)
它們可以用化學(xué)合成、公知的表達方法以及精制法或者實施例中記載 的方法來制備。
本發(fā)明的正義寡核苷酸修飾成不會被核內(nèi)的核酸分解酶分解即可，該 修飾沒有特別的限制。由于正義寡核苷酸在細胞內(nèi)會被從5'或3'末端依次 除去核苷酸的酶即核酸外切酶(exonudease)從兩端消化，因此優(yōu)選修飾為 例如從兩端開始將1個以上的磷酸鍵P = 0置換為P = S、且對分解酶穩(wěn)定 的硫代磷酸酯型(以下將之稱為"S代正義寡核苷酸")(參照J. Neurochem. 86: 374-382(2003))。但是， 一旦全部的磷酸鍵都發(fā)生硫代，則會產(chǎn)生光學(xué)異構(gòu)性，從雜交方面來說變得不利。
作為S代正義寡核苷酸的具體例子，可以列舉出下述等(序列中，*表 示S代的部分)。
5，-G*C*C*TCATACTTCCTCAG*A*G*C-3，，
5'-PAWCTGCATTGTGTACAWA叮-3，
5，-G*T*G*TATAATTCCTTGAT*G*A*A-3'
作為其它的修飾方法，可以列舉出PNA(肽核酸，peptide nucleic acids)、 LNA (鎖核酸，Locked Nucleic Acids) 、 ENA (2，-O， 4，-C-亞乙基-橋核酸，2 ，-O, 4，-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids; Sigma-Aldrich公司)、嗎啉(Morpholino) 寡核苷酸(GeneTools公司，OR, USA)等。
本發(fā)明的正義寡核苷酸通過導(dǎo)入到已確認存在iNOSmRNA的反義轉(zhuǎn) 錄物的細胞內(nèi)，從而與反義轉(zhuǎn)錄物反應(yīng)(雜交)，降低細胞內(nèi)的反義轉(zhuǎn)錄物 的有效量，因而，通過正義寡核苷酸的投予，可以使原來的基因產(chǎn)物(iNOS) 的表達量減少，從而抑制NO的過剩產(chǎn)生。
實施例
以下示出實施例來具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受它們的限定。 (1)與iNOSmRNA互補的序列、即反義轉(zhuǎn)錄物的序列和區(qū)域(堿基 長)的確定方法
實施例1:大鼠iNOS反義轉(zhuǎn)錄物
用以下的方法對大鼠iNOS的mRNA研究是否存在從基因的反義鏈轉(zhuǎn) 錄而成的"反義轉(zhuǎn)錄物"，并研究該"反義轉(zhuǎn)錄物"與正義基因產(chǎn)物的產(chǎn)生的控 制是怎樣相關(guān)的。另外，大鼠iNOS的mRNA的堿基序列通過 DDBJ/EMBL/GenBank國際堿基序列數(shù)據(jù)庫(http:Vwww.ddbj.nig.ac.jp/、 http:〃www.ebi,ac.uk/embl八http:〃www.ncbi.nlm.nih,gov/Genbank)可矢口。
在細胞因子和急性期蛋白等引起誘導(dǎo)表達的基因的mRNA的3'非翻譯 區(qū)域(3'UTR)中存在被稱為AU-rich dement (AU富含元素，ARE)的序 歹U，即5，-AUUUA-3，或5'-AUUUUA-3，的序列(參照Proc Natl Acad SciUSA 83: 1670-1674 (1986))。由于ARE也存在于人、大鼠和小鼠的iNOSmRNA 的3'UTR中，因而通過鏈特異性RT-PCR法研究了與含有該ARE的3'UTR相對應(yīng)(序列互補的)反義轉(zhuǎn)錄物是否存在。該方法是下述的方法使用
寡聚dT引物之類的僅與mRNA雜交(鏈特異性)的引物來進行逆轉(zhuǎn)錄， 合成互補的DNA (cDNA)后，進行PCR法以擴增cDNA，從而測定mRNA
艮P，使用以下所示的iNOS基因的正義鏈的引物5，-TGCCCCTCCCC CACATTCTCT-3，(序列號2)，對向培養(yǎng)基中添加IL-1(3而誘導(dǎo)了 iNOSmR NA的大鼠原代培養(yǎng)肝細胞的全RNA進行RT-PCT，從而合成cDNA。
將從大鼠原代培養(yǎng)肝細胞制備的RNA (l昭)和2pmol的引物混合后， 在70'C加熱10分鐘，然后迅速冷卻至Ot:。向其中加入ReverTraAce反應(yīng) 緩沖液(東洋紡)、dNTP (N=A、 C、 G、 T)(最終濃度為lmM)、 20 units RNase抑制劑(東洋紡)和200 units ReverTra Ace逆轉(zhuǎn)錄酶(東洋紡)，使 總量為25pl。在47。C下保溫60分鐘以進行逆轉(zhuǎn)錄，然后在70。C加熱15分 鐘使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。之后，加入5units的TthRNaseH (東洋紡)，在37°C 加熱20分鐘以分解模板RNA。合成的cDNA進行乙醇沉淀來回收，并用 2(Hil的TE緩沖液溶解。
向如此獲得的cDNA2pl中加入PCR反應(yīng)緩沖液(Nippon Gene公司)、 dNTP (N二A、 C、 G、 T; Nippon Gene公司)(最終濃度為125pM)、下述 2種引物、正向(Forward)引物40pmo1、反向(Reverse)引物40pmo1、 1 unit Gene Taq DNA聚合酶(Nippon Gene公司)以及anti-Taq high (=抗Taq 聚合酶抗體，東洋紡)#，使總量為4(Hi1，進一步進行PCR。
正向
5，-ACCAGGAGGCGCCATCCCGCTGC-3,(序列號3)
反向
5 ， -CTTGATCAAACACTCATTTTATTAAA-3 ，(序列號4) PCR的溫度方案可以依照公知的方法、即步減(step-down)法(參照 Nishizawa M, Nakajima T, Yasuda K, Kanzaki H, Sasaguri Y, Watanabe K, and Ito S. Close kinship of human 2Oa勿droxysteroid dehydrogenase gene with three aldo-keto reductase genes. Genes Cells(2000)5, 111-125)來進《亍。進《亍 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果可見186個堿基對(bp)的條帶的擴增。 將該條帶從凝膠中切下并精制，確定堿基序列，結(jié)果確認了其為夾在上述的引物序列間、與大鼠iNOSmRNA的3，UTR的序列互補的序列。艮卩， 通過使用iNOS基因的正義引物的鏈特異性RT-PCR法，證明了反義轉(zhuǎn)錄物 的存在。
為了進一步研究iNOS基因的反義轉(zhuǎn)錄物的全部結(jié)構(gòu)，嘗試了用RACE 法(參照Frohman MA. Rapid amplification of complementary DNA ends for generation of full-length complementary DNAs: thermal RACE. Methods Enzymol. (1993) 218: 340-356)來解析。RACE法是由已知的cDNA序列制
作鏈特異性引物來進行逆轉(zhuǎn)錄、從而確定5'側(cè)和3'側(cè)的cDNA的序列的方法。
向大鼠原代培養(yǎng)肝細胞中添加IL-lf3以誘導(dǎo)iNOS mRNA，并用Trizol 試劑(Invitrogen)制備RNA。以該RNA為模板，使用序列號2的引物(iNOS 的正義(正向)引物；5 ，-TGCCCCTCCCCCACATTCTCT-3 ，)合成雙鏈cDNA 。 在該cDNA上連接CA cassette adapter (接頭)(cDNA PCR文庫試劑盒
(TakaraBio株式會社)附帶)之后，使用序列號3的引物(針對iNOS mRNA 的3'UTR的正義(正向)引物)和CA引物(cDNAPCR文庫試劑盒(Takara Bio株式會社)附帶)進行PCR。將反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 約250bp大小的條帶發(fā)生了擴增。切下該條帶，克隆至pGEM-TEasy載體
(Promega)，從而確定堿基序列。 [3'側(cè)的cDNA的序列的確定]
與上述同樣地由用IL-1J3誘導(dǎo)的大鼠原代培養(yǎng)肝細胞制備RNA。使用 PolyATract mRNA Isolation System (PolyATract mRNA分離體系)(Prome ga)來精制PolyA—級分的RNA，以該RNA為模板，使用帶有錨定(ancho r)序列(下劃線部分)的隨機引物(錨定隨機引物5,-TTCCCTCCCGTT TTCTCTGCCACTAGAATTCTCGAGCGGCCGCNNNNNNN-3，(序列號5)) 來合成雙鏈cDNA。在該雙鏈cDNA上連接CA cassette adapter之后，使用 序列號4的引物(針對iNOS mRNA的3'UTR的反義(反向)引物)和C A引物進行PCR。精制該反應(yīng)液并將之作為模板，使用針對iNOS mRNA 的3，UTR的反義(反向)引物(5，-ATATTAGAGCAGCGGGATGGCGCCT C-3，(序列號6))和錨定引物(針對上述"錨定隨機引物"的錨定序列的引物；
ii5，-ACTAGAATTCTCGAGCGGCCGC-3，(序列號7))進行2次PCR。將反 應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)200 500bp大小的條帶發(fā)生了擴增。 切下該條帶，克隆至pGEM-T Easy載體，從而確定堿基序列。
根據(jù)其結(jié)果推測反義轉(zhuǎn)錄物的全長大致為600個堿基以上。以下表示 了其序列(序列號l，顯示的是cDNA序列)。即，反義轉(zhuǎn)錄物對應(yīng)于iNOS mRNA的3'UTR，轉(zhuǎn)錄起始點(5'側(cè))位于iNOS mRNA的polyA附加部 位的互補鏈。
實施例2:人iNOS反義轉(zhuǎn)錄物
用以下的方法對人iNOS的mRNA研究是否存在由基因的反義鏈轉(zhuǎn)錄 而成的"反義轉(zhuǎn)錄物"。另外，人iNOS的mRNA的堿基序列通過 DDBJ/EMBL/GenBank國際堿基序列數(shù)據(jù)庫(http:〃www.ddbj .nig.ac.jp/ 、 http:〃www.ebi.ac.uk/embl八http:〃www.ncbi.nlm.nih,gov/Genbank)可矢卩。
依照通常的方法，使用Trizol試劑(Invitrogen公司)，從人的組織(胎 盤、肝臟、胃粘膜)或細胞(未刺激的淋巴細胞)中提取全RNA。將獲得 的全RNA用含有DNase的TURBO DNA-free試劑盒(Applied Biosystems 公司)進行處理，除去混入的基因組DNA。以該全RNA為模板，使用如 下所示的人iNOS基因的正義鏈的引物5'-CTGAGTGCACCACTTCAAGT GAC-3'(序列號8)，進行逆轉(zhuǎn)錄，從而合成cDNA。具體來說，除了不使 用實施例1中的由大鼠原代培養(yǎng)肝細胞制備的RNA l嗎和用序列號2表示 的引物2pmo1，而是使用從人的組織或細胞制備的全RNA (lpg)和上述序 列號8表示的引物(2pmo1)以外，用和實施例1相同的方法合成cDNA。
向如此獲得的cDNA2fi1中加入PCR反應(yīng)緩沖液(Nippon Gene公司)、 dNTP (N=A、 C、 G、 T; Nippon Gene公司)(最終濃度為125pM)、下述 2種引物、正向引物40pmo1、反向引物40pmo1、 1 unit Gene Taq DNA聚合 酶(Nippon Gene公司)以及anti-Taqhigh (二抗Taq聚合酶抗體，東洋紡) #，使總量為40(^1，進一步進行PCR。
正向
5，-CAGGAGGTGCTATCGCACCACT-3，(序列號9)
反向5，-GCAATTCATGTAAATATCTCCATC-3，(序列號10) 用和實施例1相同的方法進行PCR。進行PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在使用人胎盤來源的cDNA時可見151個堿基對(bp)的條帶的 擴增。而在其它的cDNA(肝臟、胃粘膜或未刺激的淋巴細胞)中未見擴增。 將擴增的條帶從凝膠中切下并精制，確定堿基序列，結(jié)果確認了其為 夾在上述的引物序列間、與人iNOSmRNA的3'UTR的序列互補的序列。 即，通過使用iNOS基因的正義引物的鏈特異性RT-PCR法，證明了人iNOS 反義轉(zhuǎn)錄物的存在。iNOS反義轉(zhuǎn)錄物的序列如序列號11所示。是以cDNA 序列的形式表示的。
實施例3:小鼠iNOS反義轉(zhuǎn)錄物
用以下的方法對小鼠iNOS的mRNA研究是否存在由基因的反義鏈轉(zhuǎn) 錄而成的"反義轉(zhuǎn)錄物"。另外，小鼠iNOS的mRNA堿基序列通過 DDBJ/EMBL/GenBank國際堿基序列數(shù)據(jù)庫(http:〃www.ddbj.nig.ac.jp/ 、 http:〃www.ebi.ac.uk/embl/、 http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank)可矢口 。
依照通常的方法，使用Trizol試劑(Invitrogen公司)，從RAW264細 胞中提取全RNA。將獲得的全RNA用含有DNase的TURBO DNA-free 試劑盒(Applied Biosystems公司)進行處理，除去混入的基因組DNA。 以該全RNA為模板，使用如下所示的小鼠iNOS基因的正義鏈的引物5'-CCTTCTTCTCCACTCCCCAGCT-3，(序歹iJ號12)進行逆轉(zhuǎn)錄，從而合成c DNA。具體來說，除了不使用實施例1中的由大鼠原代培養(yǎng)肝細胞制備的 RNA l嗎和用序列號2表示的引物2pmo1，而是使用從RAW264細胞制備 的全RNA (l嗎)和序列號12表示的引物(2pmo1)以外，用和實施例1 相同的方法合成cDNA。
向如此獲得的cDNA2jil中加入PCR反應(yīng)緩沖液(Nippon Gene公司)、 dNTP (N=A、 C、 G、 T; Nippon Gene公司)(最終濃度為125pM)、下述 2種引物、正向引物40pmo1、反向引物40pmo1、 1 unit Gene Taq DNA聚合 酶(Nippon Gene公司)以及anti-Taqhigh (二抗Taq聚合酶抗體，東洋紡) #，使總量為40(il，進一步進行PCR。
正向5，-GACCACCAGGAGGCACCATGCCG-3，(序列號13)
反向
5，-ATACAGGAAAGGCCCAAGCCATC畫3，(序列號14) 用和實施例1相同的方法進行PCR。進行PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳， 結(jié)果可見127個堿基對(bp)的條帶的擴增。
將擴增的條帶從凝膠中切下并精制，確定堿基序列，結(jié)果確認了其為 夾在上述的引物序列間、與小鼠iNOS mRNA的3，UTR互補的序列。艮P， 通過使用iNOS基因的正義引物的鏈特異性RT-PCR法，證明了小鼠iNOS 反義轉(zhuǎn)錄物的存在。小鼠iNOS反義轉(zhuǎn)錄物的序列如序列號15所示。是以 cDNA序列的形式表示的。
(2)利用與iNOSmRNA互補的反義轉(zhuǎn)錄物(以下僅簡稱為"反義")
使iNOSmRNA穩(wěn)定化
實施例4:利用與大鼠iNOS反義轉(zhuǎn)錄物使iNOSmRNA穩(wěn)定化 為了明確大鼠反義是否能使iNOSmRNA穩(wěn)定化，將具有與大鼠反義互
補的序列、并具有與大鼠反義雜交的性質(zhì)的iNOS的正義寡核苷酸導(dǎo)入大鼠
原代培養(yǎng)肝細胞中并研究iNOSmRNA的量。
正義寡核苷酸通過將寡核苷酸中的一個磷酸二酯鍵的磷酸的氧原子置
換為硫原子(S代)，從而防止了細胞內(nèi)核酸分解酶導(dǎo)致的寡核苷酸的分解。
通過IB A公司(Gottingen， Germany)的禾ll用Magnet assisted transfection
法的基因?qū)朐噭┖?MATm-A試劑)，將S代正義寡核苷酸導(dǎo)入至大鼠原
代培養(yǎng)肝細胞中。
大鼠原代培養(yǎng)肝細胞用公知的方法(J. Hepatol， 40, 616-623, 2004)制備， 并接種在6孔板中(每孔3xl()S個細胞)。2小時后，更換為每孔L5ml的新 培養(yǎng)基(在Williams'E培養(yǎng)基(WE)中含有10%胎牛血清、10nM地塞米 松和lOnM胰島素的培養(yǎng)基。簡稱為WES-DI)。然后4小時后，將寡核苷 酸(2嗎)和WE (200^1)混合，接著混合2^1的MATra-A試劑(IBA公司)， 在室溫下靜置20分鐘后，將之全部滴加至加入有肝細胞的孔中。將6孔板 置于磁盤(IBA公司)上，在室溫下靜置15分鐘，從而將寡核苷酸導(dǎo)入細 胞內(nèi)。更換為含有10%胎牛血清的WE (每孔1.5ml)，之后在37。C下放置
14一夜。第二天早晨，更換為含有l(wèi)nM的IL-l(3的WE培養(yǎng)基，在37t:下放 置4小時后，制備了全RNA。
用IL-lj3刺激肝細胞時，iNOSmRNA的量顯著增加，導(dǎo)入上述的S代 正義寡核苷酸后用IL-1卩刺激，用RT-PCR法和實時PCR法進行mRNA量 的測定。結(jié)果如圖l和2所示。
此處使用的iNOS基因的正義鏈序列、即具有與iNOSmRNA相同的序 列的S代寡核苷酸為如下所示的序列。在實驗中相當(dāng)于S2、 S4和S5。
S2: 5，-G*C*C*TCATACTTCCTCAG*A*G*C-3'
S4: 5，-T*A*G*CTGCATTGTGTACA*G*A*T-3'
S5: 5,-G*T*G*TATAATTCCTTGAT*G*A*A-3' "代的部分用*表示。)
另一方面，作為陰性對照，堿基組成相同但序列不同，因而導(dǎo)入具有 確認不會與iNOSmRNA或其轉(zhuǎn)錄物、或其它的RNA發(fā)生雜交的序列的"隨 機寡核苷酸(scramble oligo)"。隨機寡核苷酸的序列如下所示。
Scr2: 5，-G*G*T*ATTGCCCACCCAAC*T*C*T-3，
Scr4: 5，-G*G*C*TCCATATGATTAGA*T*G*T-3，
Scr5: 5,-G*A*T*TGTTACTTAGAGAC*T*A*T-3，
為了防止細胞內(nèi)的分解，這些隨機寡核苷酸也和正義寡核苷酸同樣， 在硫代后使用。對于"隨機寡核苷酸"，通過進行與大鼠基因組的同源性檢 索，確認了不存在類似的序列。
進而，作為另一個陰性對照，導(dǎo)入相對于iNOSmRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖 部分的硫代正義寡核苷酸S1。 Sl的序列如下所示。
SI: 5'-C*A*T*TCTCTTTCCTTTGC*C*T*C-3' (*表示和上述相同的意義。)
使用與正義鏈(具有與mRNA相同序列的鏈)相同序列的引物進行鏈 特異性RT-PCR法時，由于僅有相對于"反義轉(zhuǎn)錄物"cDNA被逆轉(zhuǎn)錄，因而 可以測定"反義轉(zhuǎn)錄物"的量。另外，設(shè)置在不進行逆轉(zhuǎn)錄的情況下進行PCR 的對照，確認了肝細胞的全RNA中混入的基因組沒有通過PCR而擴增。 在圖中用RT ( — )表示。
結(jié)果是，導(dǎo)入了 S2、 S4和S5的硫代正義寡核苷酸時，iNOSmRNA的量減少。這表示，硫代正義寡核苷酸和iNOS的反義轉(zhuǎn)錄物發(fā)生雜交，反 義轉(zhuǎn)錄物被分解，因而iNOSmRNA也被分解。另一方面，在導(dǎo)入隨機寡核 苷酸時，iNOSmRNA的量沒有大的變動。另外，在導(dǎo)入相對于莖部分的Sl 時，iNOSmRNA的量也沒有大的變動。
另外，在向肝細胞中導(dǎo)入正義寡核苷酸S5或隨機寡核苷酸Scr5時， 以經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，使用實時PCR法來測定添加IL-ip后的 iNOSmRNA的量。其結(jié)果是，導(dǎo)入隨機寡核苷酸Scr5時，iNOSmRNA的 量變?yōu)?倍所需要的時間為119分鐘。與之相對，導(dǎo)入正義寡核苷酸S5 時為461分鐘(圖2)。
與iNOS同樣，iNOS之外的早期應(yīng)答基因Cytokine-Induced Neutrophil Chemoattractant (細胞因子誘導(dǎo)的中性粒細胞趨化因子)1、 CINC-1也在肝 細胞中在IL-ip刺激下引起顯著的mRNA的誘導(dǎo)。而且，在CINC-l的mRNA 的3，非翻譯區(qū)域(3'UTR)中也與iNOSmRNA同樣地存在ARE序列。在 將iNOS的正義寡核苷酸導(dǎo)入肝細胞時測定CINC-1的mRNA量，結(jié)果發(fā) 現(xiàn)與未導(dǎo)入正義寡核苷酸時的mRNA量沒有差別。即，顯示了iNOS的正 義寡核苷酸的作用僅限于iNOS (圖1)。
綜合以上結(jié)果可見，iNOS的正義寡核苷酸與iNOS反義轉(zhuǎn)錄物特異性 地雜交，從而促進iNOSmRNA的分解，結(jié)果使iNOSmRNA的量特異性地 減少。
實施例5:利用小鼠iNOS反義轉(zhuǎn)錄物使iNOSmRNA穩(wěn)定化
向來源于小鼠巨噬細胞的RAW264細胞中導(dǎo)入具有與小鼠反義雜交的 性質(zhì)的iNOS正義寡核苷酸的硫代正義寡核苷酸，研究小鼠反義轉(zhuǎn)錄物對 iNOSmRNA的表達抑制。
以下未記載的操作采用和實施例4相同的方法進行。將小鼠RAW264 細胞按每孔5x105細胞接種，更換為DMEM培養(yǎng)基，用C02恒溫器培養(yǎng)。
通過IBA公司(Gottingen， Germany)的Magnet assisted transfection 法，在RAW264細胞內(nèi)導(dǎo)入硫代正義寡核苷酸。更換為含有10%胎牛血清 的DMEM培養(yǎng)基(每孔1.5ml)，之后在37C放置一夜。第二天早晨，更 換為含有大腸桿菌LPS (lpg/ml)的DMEM培養(yǎng)基，在37'C放置4小時，
16之后提取全RNA以供于RT-PCR。另夕卜，全RNA用含有DNase的TURBO DNA-free試劑盒(Applied Biosystems公司)進行處理，除去混入的基因 組DNA。
正義寡核苷酸相對于對應(yīng)于小鼠反義轉(zhuǎn)錄物的小鼠iNOSmRNA來制作。
此處使用的小鼠iNOS基因的正義鏈的序列、即具有與iNOSmRNA相 同的序列的硫代寡核苷酸以序列表示。在實驗中相當(dāng)于S1、 S2和S3。 S1: 5，-G*A*A*GCACTTTGGGTGAC*C*A*C-3' S2: 5，-T*A*G*CTGCACTATGTACA*G*A*T-3' S3: 5，-C*A*G*ATATTTATACTTCA*T*A*T-3,
(硫代的部分用*表示。) 依照在實施例4中進行的鏈特異性RT-PCR法，測定小鼠iNOSmRNA
結(jié)果是小鼠iNOSmRNA的量減少。這表明，硫代正義寡核苷酸和iNOS 的反義轉(zhuǎn)錄物發(fā)生雜交，反義轉(zhuǎn)錄物被分解或被競合，因而，iNOSmRNA 也被分解(圖3)。
由實施例4和5的結(jié)果顯示，不僅是大鼠，對于小鼠，iNOS的正義寡 核苷酸也通過和iNOS反義轉(zhuǎn)錄物特異性地雜交而促進iNOSmRNA的分 解，結(jié)果使iNOSmRNA的量特異性地減少。
這樣，在大鼠肝細胞和小鼠細胞中都可以使用正義寡核苷酸來抑制 iNOSmRNA的表達。因此，使用正義寡核苷酸的iNOSmRNA的表達抑制 會減輕肝臟等的炎癥時的iNOS誘導(dǎo)和NO產(chǎn)生，可以說是肝功能障礙的有 效治療方法。
(3)和iNOS基因之外的早期應(yīng)答基因的mRNA互補的序列即反義轉(zhuǎn) 錄物的序列和區(qū)域(堿基長)的確定方法
在炎癥時被誘導(dǎo)而表達的基因(所謂的"早期應(yīng)答基因")中，不僅有 iNOS，還包含細胞因子和趨化因子等生理活性物質(zhì)的基因。這些早期應(yīng)答 基因具有使炎癥惡化、或使其改善等多種作用。調(diào)節(jié)早期應(yīng)答基因的表達
17最終與調(diào)節(jié)炎癥有關(guān)。因此，除了 iNOS基因的反義轉(zhuǎn)錄物之外，也研究 了其它早期應(yīng)答基因是否也表達反義轉(zhuǎn)錄物。接著，推定對于在物種間高
保守的、且含有多個ARE序列的3'UTR序列，反義轉(zhuǎn)錄物也被表達。而 且，對該部分設(shè)計逆轉(zhuǎn)錄用的正義引物和PCR用的一對引物，與用大鼠的 iNOS基因來檢測反義轉(zhuǎn)錄物的實施例4同樣地進行鏈特異性RT-PCR法， 研究在大鼠肝細胞中是否有反義轉(zhuǎn)錄物的表達。
在iNOS之外的早期應(yīng)答基因中，以3'UTR中含有多個ARE序列、且 物種間(人、小鼠、大鼠)3'UTR序列高度類似的3個典型的基因為例進 行研究。即，使用以下的3個基因。
(a) 細胞因子誘導(dǎo)的中性粒細胞趨化因子l(CINC-l):也被稱為趨化 因子(C-X-C motif)配體l (CXCL1)，是被IL-1(3刺激的大鼠肝細胞中誘導(dǎo) 的趨化因子。
(b) NF-KBp50:轉(zhuǎn)錄因子NF-kb的亞型之一，是與炎癥密切相關(guān)的 蛋白質(zhì)。
(c) IkB-cx:抑制NF-KB的活性的蛋白質(zhì)。
另外，人、小鼠以及大鼠的這些mRNA的堿基序列通過 DDBJ/EMBL/GenBank國際堿基序列數(shù)據(jù)庫(http:〃www.ddbj.nig.ac.jp/、 http:〃www.ebi.ac.uk/embl/、 http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank)可知。
實施例6:大鼠CINC-1反義轉(zhuǎn)錄物
用以下方法對大鼠CINC-1的mRNA研究是否存在由基因的反義鏈轉(zhuǎn) 錄而成的"反義轉(zhuǎn)錄物"。以下沒有特別記載的操作用和實施例1相同的方 法進行。
用IL-1卩剌激原代培養(yǎng)大鼠肝細胞，然后依照通常的方法，使用Trizol 試劑(Invitrogen公司)提取全RNA。將獲得的全RNA用含有DNase的 TURBO DNA-free試劑盒(Applied Biosystems公司)進行處理，除去混入 的基因組DNA。以該全RNA為模板，使用如下所示的大鼠CINC-1基因的 正義鏈的引物5，-TGTCTGGTGAACGCTGGCTTCTGA-3，(序列號16)進 行逆轉(zhuǎn)錄，從而合成cDNA。
使用獲得的cDNA和以下所示的大鼠CINC-1基因的正義鏈的2種引物正向5，-TGTGGATGCGTTTCATCGATGGT-3，(序列號17);反向5' -CTAGCACAGTGGTTGACACTTA-3'(序列號18)，用和實施例1相同的 步減法進行PCR。
進行PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果可見122個堿基對(bp)的條
帶的擴增。將該擴增的條帶從凝膠中切下并精制，確定堿基序列，結(jié)果確 認了其為夾在上述的引物序列間的大鼠CINC-1 mRNA的3'UTR的序列。 即，通過使用iNOS基因的正義引物的鏈特異性RT-PCR法，證明了大鼠 CINC-1基因的反義轉(zhuǎn)錄物的存在。大鼠CINC-1基因的反義轉(zhuǎn)錄物的序列 如序列號19所示。是以cDNA序列的形式表示的。
實施例7:大鼠NF-KBp50反義轉(zhuǎn)錄物
用以下方法對大鼠NF-kB p50的mRNA研究是否存在由基因的反義鏈 轉(zhuǎn)錄而成的"反義轉(zhuǎn)錄物"。以下沒有特別記載的操作用和實施例6相同的 方法進行。
用IL-1(3刺激原代培養(yǎng)大鼠肝細胞，然后依照通常的方法，使用Trizol 試劑(Invitrogen公司)提取全RNA。將獲得的全RNA用含有DNase的 TURBO DNA-free試劑盒(Applied Biosystems公司)進行處理，除去混入 的基因組DNA。以該全RNA為模板，使用如下所示的大鼠NF-kB p50基 因的正義鏈的引物5，-CTGTCATTAAGGTATCGCAGTCC-3，(序列號20) 進行逆轉(zhuǎn)錄，從而合成cDNA。
使用獲得的cDNA和以下所示的大鼠NF-kB p50基因的正義鏈的2種 引物正向5，-CATCTACAGTACAGTCATGCACTC-3，(序列號21);反 向5，-GGGAAAATACTATTTTCAGCACTGAT-3，(序列號22)，用和實施 例1相同的步減法進行PCR。
進行PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果可見192個堿基對(bp)的條 帶的擴增。將該條帶從凝膠中切下并精制，確定堿基序列，結(jié)果確認了其 為夾在上述的引物序列間的大鼠NF-KBp50mRNA的3'UTR的序列。艮口， 通過使用iNOS基因的正義引物的鏈特異性RT-PCR法，證明了大鼠NF-kB p50基因的反義轉(zhuǎn)錄物的存在。大鼠NF-kb p50基因的反義轉(zhuǎn)錄物的序列如 序列號23所示。是以cDNA序列的形式表示的。實施例8:大鼠IKB-(x反義轉(zhuǎn)錄物
用以下方法對大鼠IkB-(x的mRNA研究是否存在由基因的反義鏈轉(zhuǎn)錄 而成的"反義轉(zhuǎn)錄物"。以下沒有特別記載的操作用和實施例6相同的方法 進行。
用IL-1(3刺激原代培養(yǎng)大鼠肝細胞，然后依照通常的方法，使用Trizol 試劑(Invitrogen公司)提取全RNA。將獲得的全RNA用含有DNase的 TURBO DNA-free試劑盒(Applied Biosystems公司)進行處理，除去混入 的基因組DNA。以該全RNA為模板，使用如下所示的大鼠IkB-(x基因的正 義鏈的引物5，-TCCAGAATCTGATAAAAGGACCAC-3，(序列號24)進行 逆轉(zhuǎn)錄，從而合成cDNA。
使用獲得的cDNA和以下所示的大鼠IkB-(x基因的正義鏈的2種引物 正向5，-TGAACCGCCATAGACTGTAGCTG-3，(序列號25);反向 5，-GCACATACCACTGAACACCTGGT-3，(序列號26)，用和實施例1相同 的步減法進行PCR。
進行PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果可見102個堿基對(bp)的條 帶的擴增。將該條帶從凝膠中切下并精制，確定堿基序列，結(jié)果確認了其 為夾在上述的引物序列間的大鼠lKB-amRNA的3'UTR的序列。艮P，通過 使用iNOS基因的正義引物的鏈特異性RT-PCR法，證明了大鼠lKB-a基因 的反義轉(zhuǎn)錄物的存在。大鼠IkB-oc基因的反義轉(zhuǎn)錄物的序列如序列號27所 示。是以cDNA序列的形式表示的。
作為炎癥時表達的早期應(yīng)答基因，選擇了 iNOS之外的代表性的3個 基因(CINC-1、 NF-KBp50、 IkB-oi)，每一個都在3，UTR中含有多個ARE 序列，且物種(人、小鼠、大鼠)之間3'UTR的序列高度相似。和iNOS 相同，這3種基因也確認了有反義轉(zhuǎn)錄物表達。
由此推測，反義轉(zhuǎn)錄物是在含有ARE序列、且在物種間3'UTR序列 高度相似的早期應(yīng)答基因中均可見的分子。進而，強烈地暗示了反義轉(zhuǎn)錄 物調(diào)節(jié)這些mRNA的穩(wěn)定性的可能性。因此，期待可以通過抑制肝臟等的 炎癥中的早期應(yīng)答基因的反義轉(zhuǎn)錄物的作用來抑制炎癥。(4)使用大鼠急性肝功能衰竭模型的生物體內(nèi)(in vivo)的iNOS和 反義轉(zhuǎn)錄物的表達誘導(dǎo)和肝臟保護劑(IGF-I和FR183998)對iNOS和反 義轉(zhuǎn)錄物的表達誘導(dǎo)的抑制效果
由實施例1和實施例4的結(jié)果顯示，在大鼠原代培養(yǎng)肝細胞(in vitro) 體系中，iNOS誘導(dǎo)時，與iNOSmRNA的3'-非翻譯區(qū)域(3'UTR)對應(yīng)的 反義轉(zhuǎn)錄物表達，從而促進iNOSmRNA的穩(wěn)定化。如下示出在肝功能障礙 大鼠(in vivo)中，iNOS反義轉(zhuǎn)錄物也隨著iNOS誘導(dǎo)而表達。另外，胰 島素樣生長因子I (Insulin-like growth factor-I， IGF-I)和Na+7H+交換抑制 劑(FR183998)等肝臟保護劑的投予所引起的存活率的變化和炎癥性細胞 因子、iNOSmRNA以及反義轉(zhuǎn)錄物的誘導(dǎo)之間的關(guān)系如下所示。
實施例9
(I) 急性肝功能衰竭模型的制作和肝臟保護劑的投予
對雄性Sprague-Dawley大鼠(250-300g)靜脈注射D-半乳糖胺 (400g/kg)和細菌內(nèi)毒素LPS (16嗎/kg)的混合液(D-GalN/LPS)，制造 急性肝功能衰竭的模型。在D-GalN/LPS處理的30分鐘前投予胰島素樣生 長因子I (IGF-I， 3.2mg/kg)或NaVH+交換抑制劑(FR183998， lmg/kg)。 測定血中和肝臟的炎癥性細胞因子(TNF-a、IL-l卩、IL-6、干擾素Y、CINC-l)、 MIP-2和一氧化氮(NO)。由肝臟制備全RNA，通過RT-PCR來研究 iNOSmRNA和iNOS反義轉(zhuǎn)錄物。
(II) RNA的分析
靜脈注射D-半乳糖胺和LPS的混合液3或6小時后，取出大鼠的肝臟， 依照通常的方法，使用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取全RNA。以該全 RNA為模板，使用寡聚dT引物進行逆轉(zhuǎn)錄，之后通過和實施例1等相同 的方法進行PCR (RT-PCR法)。對于iNOSmRNA和內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)延伸因子(e longation factor) -la (EF1) mRNA的定量，逆轉(zhuǎn)錄時使用寡聚dT引物， PCR時使用iNOSmRNA: CCAACCTGCAGGTCTTCGATG (序歹ij號28) 和GTCGATGCACAACTGGGTGAAC (序列號29); EFmRNA: TCTGGT TGGAATGGTGACAACATGC (序列號30)禾卩CCAGGAAGAGCTTCACT CAAAGCTT (序列號31)。另外，在PCR反應(yīng)液中加入了 anti-Taqhigh (=抗Taq聚合酶抗體，東洋紡)。
另外，iNOS反義轉(zhuǎn)錄物的定量依照實施例1的方法進行。設(shè)置在不進 行逆轉(zhuǎn)錄的情況下進行PCR的對照，確認了肝細胞的全RNA中混入的基 因組沒有通過PCR而擴增。iNOSmRNA檢測結(jié)果如圖4所示，iNOS反義 轉(zhuǎn)錄物的檢測結(jié)果如圖5所示。圖中，RT ( — )表示逆轉(zhuǎn)錄(一)的陰性 對照。
(III) 利用實時PCR進行mRNA和反義轉(zhuǎn)錄物的定量 逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA使用日本Bio-Rad公司的iCycler System,也通過
實時PCR進行了定量。在PCR反應(yīng)液中添加SYBR Green I (Roche-Diagnostics公司)和anti-Taq high(=抗Taq聚合酶抗體，東洋紡)， 用公知的方法即觸減(TouchDown)法進行PCR。實際的PCR方案如下所 述。
1個循環(huán)(94°C， 1分鐘)
50個循環(huán)(94°C， 30秒鐘;(72-0.3xn) °C， 1分鐘;72°C， 30秒鐘)， n為循環(huán)數(shù)。結(jié)果如圖6所示。圖中，"*"表示"相對于GalN/LPS大鼠(n =3 6只大鼠/組)，p<0.05"。
(IV) 肝臟保護劑帶來的iNOSmRNA和iNOS反義轉(zhuǎn)錄物量的變化 未投予肝臟保護劑時，在D-GalN/LPS的靜脈注射后，約24小時內(nèi)幾
乎全部的動物(90%以上)死亡。隨著時間的推移(1 12小時)，血中和 肝臟中的炎癥性介質(zhì)(TNF-a、 IL-1卩、IL-6、干擾素丫、 CINC-1、 MIP-2、 NO)增加。顯示出反義轉(zhuǎn)錄物隨著肝臟的iNOSmRNA誘導(dǎo)而增加 (iNOSmRNA和iNOS反義轉(zhuǎn)錄物都在6小時后達到最大)，其結(jié)果可見過 剩的NO產(chǎn)生。
IGF-I的投予使死亡率減少至20 30。/。以下。而且，除了上述的炎癥性 細胞因子、NO產(chǎn)生被抑制以外，iNOSmRNA和反義轉(zhuǎn)錄物誘導(dǎo)的增加也 同樣被抑制(圖4 6)。
FR183998的投予也使死亡率減少至20 30%以下，除了上述的炎癥性 細胞因子、NO產(chǎn)生被抑制以外，iNOSmRNA和反義轉(zhuǎn)錄物誘導(dǎo)的增加也 同樣被抑制(圖7 9)。
(IV-1)大鼠急性肝功能衰竭模型中肝臟保護劑IGF-I對iNOSmRNA和反義轉(zhuǎn)錄物的表達誘導(dǎo)的效果
由圖4的結(jié)果可知，投予了 D-半乳糖胺和LPS的大鼠(GalN/LPS大 鼠)在3 6小時內(nèi)iNOSmRNA水平增加，但投予了 IGF-I的大鼠中其增 加被抑制。
由圖5和6的結(jié)果所示，在RT( — )中幾乎未見擴增的cDNA，因而 可以認為全RNA中混入的基因組DNA是極微量的。GalN/LPS大鼠在3 6小時內(nèi)反義轉(zhuǎn)錄物水平增加，但投予了 IGF-I的大鼠中其增加被抑制。
(IV-2)大鼠急性肝功能衰竭模型中肝臟保護劑FR183998對 iNOSmRNA和反義轉(zhuǎn)錄物的表達誘導(dǎo)的效果
由圖7的結(jié)果可知，GalN/LPS大鼠在3 6小時內(nèi)iNOSmRNA水平增 加，但投予了 FR183998的大鼠中其增加被抑制。
由圖8和9的結(jié)果所示，在RT ( — )中幾乎未見擴增的cDNA，因而 可以認為全RNA中混入的基因組DNA是極微量的。GalN/LPS大鼠在3 6小時內(nèi)反義轉(zhuǎn)錄物水平增加，但投予了FR183998的大鼠中其增加被抑制。
(5) 大鼠肝細胞中的正義寡核苷酸的效果(iNOS蛋白質(zhì)和一氧化氮 (NO)量的變化)
實施例10
通過和實施例4相同的方法，將在實施例4中獲得的正義寡核苷酸S5 或隨機寡核苷酸Scr5導(dǎo)入肝細胞中，用一氧化氮比色法分析試劑盒(Nitric Oxide Colorimetric Assay Kits (Roche-Diagnostics公司))測定培養(yǎng)基中的一 氧化氮(NO)的量。第二天早晨，更換為含有InM的IL-ip的WE培養(yǎng)基， 在37'C下放置8 10小時，之后進行測定。另夕卜，從細胞中提取全蛋白質(zhì)， 通過使用ECL試劑盒(GE Healthcare公司)的Western法來檢測iNOS蛋 白質(zhì)。結(jié)果如圖10所示。
其結(jié)果顯示，通過在大鼠肝細胞中導(dǎo)入正義寡核苷酸S5， iNOS蛋白 質(zhì)和培養(yǎng)基中的一氧化氮(NO)量減少。
(6) 利用Northern法來檢測iNOS反義轉(zhuǎn)錄物 實施例ll
23通過Northern blot analysis (以下簡稱為Northern法)確認了在用IL-1J3 刺激的大鼠肝細胞中存在iNOS基因的反義轉(zhuǎn)錄物。
(I) RNA的制備
用IL-ip刺激大鼠肝細胞一定時間，然后使用Trizol試劑(Invitrogen 公司)提取全RNA。將獲得的全RNA用含有DNase的TURBO DNA-free試 劑盒(Applied Biosystems公司)進行處理，除去混入的基因組DNA。用 PolyATract mRNA分離體系(Promega公司)對Poly (A) +和Poly (A) 一RNA進行分級。為了防止非特異性的雜交，使核糖體RNA (rRNA)在 最終濃度為5%的聚乙二醇6000和最終濃度為0.75M的NaCl存在下沉淀除 去，將上清通過乙醇沉淀來回收，用于電泳。
(II) Northern法電泳
將上述4種RNA、即無刺激大鼠肝細胞的全RNA、 IL-1(3刺激大鼠肝 細胞的全RNA、 IL-l卩剌激大鼠肝細胞的Poly (A) +RNA和IL-lp刺激大 鼠肝細胞的Poly (A) —RNA，用含有2.2M福爾馬林的瓊脂糖進行電泳和 分離。
(III) Northern法雜交
依照常法，將凝膠中的RNA轉(zhuǎn)移至NytranN過濾器(Whatman公司)。 之后，在DIG EasyHyb緩沖液(Roche-Diagnostics公司)中，與地高辛(DIG) 標(biāo)記的iNOS的3'UTR的正義探針在73。C下進行一夜的雜交。第二天早晨， 依照Roche-Diagnostics公司的操作手冊，將過濾器進行洗滌。另外，iNOS 的3'UTR的正義探針是通過使用DIG-ll-UTP (Roche-Diagnostics公司)和 T3RNA聚合酶(Stratagene公司)在試管內(nèi)合成RNA而制得的。
(IV) Northern法檢測
依照Roche-Diagnostics公司的操作手冊進行封閉，將其和與堿性磷酸 酶結(jié)合了的抗DIG抗體(Roche-Diagnostics公司) 一起孵育。洗滌后，使 其與底物CDP-Star (Applied Biosystems公司)反應(yīng)，然后通過X射線膠片 來檢測與iNOS正義探針雜交的RNA的條帶。
(V) 結(jié)果和考察
上述4種RNA的利用Northern法得到的分析結(jié)果(X射線膠片的放射 自顯影圖)如圖11所示。在"IL-1卩刺激大鼠肝細胞的全RNA"和"IL-1卩刺激大鼠肝細胞的Poly (A) —RNA"中觀察到了 600 1000個核苷酸(nt)的涂片(smear)狀的 深色條帶。由于使用了iN0S的3'UTR的正義探針，因而可以認為這些涂 片狀條帶是iNOS的反義轉(zhuǎn)錄物的條帶。因此可知，iNOS的反義轉(zhuǎn)錄物的 長度并非恒定，而是各種長度(600 1000個核苷酸)的轉(zhuǎn)錄物的集合。
綜合RACE的結(jié)果和核糖核酸酶保護分析(Ribonuclease Protection Assay)的結(jié)果，可以認為，如圖12所示，iNOS的反義轉(zhuǎn)錄物被合成。圖 中，虛線表示形成了 600個核苷酸以上的各種長度的反義轉(zhuǎn)錄物。圖中的 數(shù)字為iNOS基因的外顯子的編號，黑色部分為蛋白質(zhì)的翻譯區(qū)域，反白 框是位于外顯子27中的3'UTR。 iNOS的mRNA示于基因的圖中上側(cè)。
(7) iNOS反義轉(zhuǎn)錄物的過剩表達所帶來的mRNA的穩(wěn)定化 實施例12
當(dāng)在大鼠肝細胞中使iNOS基因的反義轉(zhuǎn)錄物過剩表達時，確認了 mRNA通過iNOS的3'UTR而穩(wěn)定化。
在一般的報告基因的情況下，將螢光素酶基因與iNOS基因的啟動子 結(jié)合。由于iNOS基因的啟動子是"誘導(dǎo)型啟動子"，因此在大鼠肝細胞中， 由于IL-1卩刺激，啟動子活性發(fā)生較大的變化，經(jīng)常不能觀察到報告基因 后結(jié)合的3'UTR的作用。因此，使用了無論是否受到剌激都能促成恒定量 的表達的"組成型啟動子"即延伸因子-lcc (EF)基因的啟動子。因此，由 EF啟動子控制的螢光素酶基因和卩半乳糖苷酶基因無論是否受到剌激都能 以恒定量表達。由此，可以單純地觀察到含有poly (A)信號序列的 iNOSmRNA的3'UTR對螢光素酶mRNA的穩(wěn)定性所帶來的影響。
以pGL3-Basic質(zhì)粒(Promega公.司)為基礎(chǔ)構(gòu)建以下3種載體。構(gòu)建 的載體的示意圖如圖13所示。
(i)報告基因(螢光素酶載體)
EF啟動子+螢光素酶基因(Luc)十iNOS3'UTR
EF啟動子+螢光素酶基因(Luc)十SVpA (螢光素酶mRNA組成型地表達，但可以通過光素酶基因的后部控制 mRNA的穩(wěn)定性)(ii) iNOS反義轉(zhuǎn)錄物表達載體
CMV啟動子+反向插入iNOS 3'UTR十SVpA (iNOS反義轉(zhuǎn)錄物在細胞內(nèi)過剩地表達)
(iii) 內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)(p半乳糖苷酶載體) EF啟動子+卩半乳糖苷酶(lacZ)基因+ SVpA
(P半乳糖苷酶mRNA組成型地表達) 另外，SVpA是來源于SV40病毒的poly (A)信號的序列，已知是穩(wěn) 定的3，UTR，加成了 SVpA的mRNA難以被破壞。作為iNOS 3'UTR的對 照的CMV啟動子是來源于巨細胞病毒的比EF啟動子更強的組成型啟動 子。
將(i)和(iii)的質(zhì)粒同時導(dǎo)入大鼠肝細胞時，由于EF啟動子是組 成型的，因此螢光素酶mRNA (Luc)和卩半乳糖苷酶mRNA (卩Gal)的 合成量大致是恒定的。進而，如果iNOS反義轉(zhuǎn)錄物表達載體(ii)添加時 和未添加時存在差別，則Luc mRNA/卩Gal mRNA (Luc/(3Gal值)應(yīng)該也存 在差別。如果Luc/(3Gal值根據(jù)iNOS反義轉(zhuǎn)錄物表達載體的有無而變化， 則iNOS反義轉(zhuǎn)錄物的過剩表達通過iNOS 3'UTR而影響螢光素酶mRNA 的穩(wěn)定性。
對于iNOS反義轉(zhuǎn)錄物表達載體添加和未添加的情況，隨時間變化顯 示了 Luc/(3Gal值。結(jié)果如圖14所示。
(i)報告基因(EF啟動子+Luc+iNOS3，UTR)、 ± (ii) iNOS反義轉(zhuǎn)錄物表達載體、 (iii)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。
此時，比較添加了 iNOS反義轉(zhuǎn)錄物表達載體時AS ( + )和未添加時AS (—)，可見Luc/(3Gal值顯著地增加。圖中，"**"表示"相對于AS(—)，
po.or，o
即，iNOS反義轉(zhuǎn)錄物通過iNOS 3'UTR使螢光素酶mRNA穩(wěn)定化。 作為對照，使用連結(jié)有SVpA的報告基因的結(jié)果如圖15所示。
(i)報告基因(EF啟動子+Luc+SVpA)、 ± (ii) iNOS反義轉(zhuǎn)錄物表達載體、
(iii)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。
此時，比較添加了 iNOS反義轉(zhuǎn)錄物表達載體時[AS (+)]和未添加時 [AS ( — )]，未見Luc/(3Gal值增加。艮卩，SVpA并不影響mRNA的穩(wěn)定性。 [意義]
根據(jù)以上結(jié)果(iNOS反義轉(zhuǎn)錄物的過剩表達實驗)，可以認為，iNOS 反義轉(zhuǎn)錄物具有作用于iNOS 3'UTR而使mRNA穩(wěn)定化的作用。與利用硫 代反義寡核苷酸的iNOSmRNA的knockdown實驗的結(jié)果綜合來看，可以 說iNOS反義轉(zhuǎn)錄物通過iNOS 3'UTR而使iNOSmRNA穩(wěn)定化。
因此，強烈暗示了利用iNOS反義轉(zhuǎn)錄物來控制iNOSmRNA的穩(wěn)定性 的機理會在肝臟等的炎癥中發(fā)揮重要的作用。另外，該機理可以成為NO 所相關(guān)的多種疾病的治療靶的。
通過投予肝臟保護劑，抑制了 iNOSmRNA和反義轉(zhuǎn)錄物的誘導(dǎo)。以上 的結(jié)果強烈暗示了反義轉(zhuǎn)錄物在體內(nèi)(in vivo)也作為iNOSmRNA表達誘 導(dǎo)的控制因子而相關(guān)。因此認為，使用肝臟保護劑的反義轉(zhuǎn)錄物的表達抑 制會減少肝臟等的炎癥時的iNOS誘導(dǎo)和NO產(chǎn)生，是肝功能障礙的有效治 療方法。
權(quán)利要求
1. 一種正義寡核苷酸，其具有與下述iNOSmRNA反義RNA、即iNOSmRNA反義轉(zhuǎn)錄物互補的序列，所述iNOSmRNA反義RNA具有與誘導(dǎo)型一氧化氮合酶iNOS mRNA互補的序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1記載的正義寡核苷酸，其具有與含有序列號1所示 的核酸序列的所述iNOSmRNA反義RNA、即iNOSmRNA反義轉(zhuǎn)錄物互補 的序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2記載的正義寡核苷酸，其在與所述iNOSmRNA 反義RNA、即iNOSmRNA反義轉(zhuǎn)錄物中熱力學(xué)不穩(wěn)定的環(huán)結(jié)構(gòu)對應(yīng)的區(qū) 域具有互補的序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1 3的任意一項記載的正義寡核苷酸，其具有16個 堿基 335個堿基的堿基長。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1 4的任意一項記載的正義寡核苷酸及其衍生物，其 經(jīng)過對核酸分解酶弓I起的分解的穩(wěn)定化。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5中記載的正義寡核苷酸，其中，穩(wěn)定化是通過LNA、 PNA、 ENA、嗎啉和其它修飾方法來進行的。
7. —種組合物，其含有權(quán)利要求1 6的任意一項記載的正義寡核苷 酸，且具有促進iNOSmRNA的分解的NO產(chǎn)生抑制活性。
8. —種iNOS產(chǎn)生量的抑制方法，其特征在于，在細胞內(nèi)導(dǎo)入下述正 義寡核苷酸，所述正義寡核苷酸具有與iNOSmRNA反義RNA、即 iNOSmRNA反義轉(zhuǎn)錄物互補的序列。
全文摘要
本發(fā)明提供用于iNOS(誘導(dǎo)型一氧化氮合酶)的表達控制且具有與下述單鏈RNA(反義轉(zhuǎn)錄物)互補的序列的正義寡核苷酸，所述單鏈RNA(反義轉(zhuǎn)錄物)具有與iNOS基因的mRNA互補的堿基序列。使用本發(fā)明的正義寡核苷酸，可以控制iNOS的表達，對生物體防御或NO的過剩產(chǎn)生所相關(guān)的疾病、例如致癌和炎癥性疾病、細菌感染等所引起的內(nèi)毒素休克等的治療和預(yù)防是有用的。
文檔編號C12N15/09GK101460624SQ20078002110
公開日2009年6月17日 申請日期2007年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月8日
發(fā)明者三浦健人, 上山泰男, 奧村忠芳, 若命浩二, 西澤干雄 申請人:阿明諾化學(xué)株式會社;學(xué)校法人關(guān)西醫(yī)科大學(xué)