專利名稱：用于診斷和治療利什曼病的多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了用于在疑似感染了利什曼蟲(chóng)屬原生動(dòng)物寄生物的個(gè)體中檢測(cè)抗利什曼原蟲(chóng)抗體的化合物和方法，特別地，感染物為印度株(Indian strain)并且與印度利什曼原蟲(chóng)株類似或密切相關(guān)。此外，本發(fā)明提供了用于在個(gè)體中檢測(cè)利什曼原蟲(chóng)抗體的診斷試劑盒，其由SEQ IDNO5或者SEQ ID NO6所示的多肽組成，在所述的個(gè)體中激發(fā)了針對(duì)印度株和與印度利什曼原蟲(chóng)株類似或密切相關(guān)的物種的免疫應(yīng)答，其還被用作疫苗和治療劑以預(yù)防和治療利什曼病。該發(fā)明還提供了用于檢測(cè)利什曼原蟲(chóng)抗原的診斷試劑盒，其由針對(duì)SEQ ID NO5或者SEQ ID NO6所示多肽的抗體組成。
背景技術(shù)：
利什曼病是一種由專性巨噬細(xì)胞內(nèi)原生動(dòng)物引起的媒介傳播的寄生物病。其特點(diǎn)是多樣性和復(fù)雜性。其以多種臨床類型出現(xiàn)。但是，主要有4種臨床類型。內(nèi)臟利什曼病(VL)，也被稱為黑熱病(kala-azar)(KA)，是該疾病最嚴(yán)重的類型，如果得不到治療的話，其死亡率將會(huì)是100％。皮膚利什曼病(CL)在身體暴露部分例如臉，胳膊和腿產(chǎn)生皮膚潰瘍。潰瘍的數(shù)量可以從1處到一些區(qū)域的200處，引起嚴(yán)重的失能并給患者留下永久性疤痕。第三種類型是粘膜皮膚利什曼病(MCL)，或者鼻咽粘膜利什曼病，。其它可以導(dǎo)致鼻、口和喉腔的粘膜的廣泛損壞，甚至還會(huì)影響軟骨。所述的皮膚類型可以導(dǎo)致被稱為彌散性皮膚利什曼病(DCL)的彌散類型。利什曼病是由總共大約21個(gè)種類所引起，其由大約30個(gè)種類的PhlebotonzinePhlebotomine沙蠅所傳播[Herwaldt BL.，1999]。
目前，利什曼病在5大州的88個(gè)國(guó)家是地方性流行病非洲、亞洲、歐洲、南美和北美，并且共計(jì)有3億5千萬(wàn)人口處于感染的危險(xiǎn)。據(jù)估計(jì)世界范圍內(nèi)1千2百萬(wàn)的人口被利什曼病感染，該數(shù)字包括明顯被感染病例以及無(wú)明顯癥狀的病例。在每年發(fā)生的1.5-2百萬(wàn)預(yù)計(jì)新病例中，只有60萬(wàn)病例被官方宣布。在每年發(fā)生的五十萬(wàn)VL新病例中，90％發(fā)生在五個(gè)發(fā)展中國(guó)家孟加拉國(guó)，巴西，印度，尼泊爾和蘇丹。所有MCL病例中，大約90％發(fā)生在玻利維亞，巴西和秘魯，并且在所有CL病例中，90％發(fā)生在阿富汗，巴西，伊朗，秘魯，沙特阿拉伯和敘利亞。，每年全世界范圍報(bào)道的新病例數(shù)為1百萬(wàn)-1百50萬(wàn).5百萬(wàn)。利什曼病的地理分布受限于沙蠅的分布，其對(duì)寒冷氣候的敏感性，其只從人或者動(dòng)物吸血的趨勢(shì)，及其支持利什曼病的特殊種類在內(nèi)部發(fā)展的能力[Desjeux P2001]。
從1993年，利什曼原蟲(chóng)地方流行的區(qū)域顯著擴(kuò)大，該疾病的記錄病例數(shù)量也隨之明顯增加。這種地理蔓延是由于與發(fā)展最為相關(guān)的那些因素造成的。這些因素包括大量農(nóng)村-都市遷移和將非免疫的都市居民帶入到地方性流行的農(nóng)村地區(qū)的農(nóng)業(yè)-工業(yè)項(xiàng)目。具有環(huán)境影響的人為項(xiàng)目例如壩，灌溉系統(tǒng)和井，以及采伐森林，也促成了利什曼病的蔓延。AIDS和其它免疫抑制疾病增加了利什曼原蟲(chóng)感染人群形成內(nèi)臟疾病的危險(xiǎn)[Desjeux P 2001，Paredes R et al.，1997]。
在印度次大陸和非洲，VL主要由杜氏利什曼原蟲(chóng)(Leishmaniadonovani)引起，在地中海區(qū)域由尹氏利什曼原蟲(chóng)(Leishmania infantum)引起，在新大陸由恰氏利什曼原蟲(chóng)(Leishmania chagasi)引起。在這些物種中，尹氏利什曼原蟲(chóng)和恰氏利什曼原蟲(chóng)密切相關(guān)。盡管所有以上的物種均引起VL，它們之間是遺傳上不同的。這些由Cupolillo E等， 使用數(shù)字酶分類學(xué)獲得的數(shù)據(jù)顯示恰氏利什曼原蟲(chóng)，新大陸內(nèi)臟物種(visceralising species)類似于舊大陸的尹氏利什曼原蟲(chóng)。Zymodeme，serodeme，和核DNA片段圖譜的量化比較均表明恰氏利什曼原蟲(chóng)和尹氏利什曼原蟲(chóng)密切相關(guān)并且可能代表相同的物種。而且，基于核DNA限制片段圖譜的Beverley S.M等 的研究揭示恰氏利什曼原蟲(chóng)和尹氏利什曼原蟲(chóng)是相似的而且象兩個(gè)來(lái)自相同種群的隨機(jī)個(gè)體那樣緊密相關(guān)，而且，杜氏利什曼原蟲(chóng)與這兩個(gè)物種是不同的。在另一個(gè)Piarroux R等， 的使用重復(fù)DNA序列的分析中觀察到在引起VL的利什曼原蟲(chóng)中，從人為主要貯主的病灶所分離出來(lái)的杜氏利什曼原蟲(chóng)聚在一個(gè)獨(dú)立的分枝，而與此對(duì)照，尹氏利什曼原蟲(chóng)和恰氏利什曼原蟲(chóng)是很少感染人類的犬科寄生物，因而它們是不同的。
近來(lái)Mauricio I.L等.， 使用3種不同的途徑在不同的分辨率水平研究探討了來(lái)自利什曼原蟲(chóng)物種的遺傳信息，結(jié)果揭示了杜氏利什曼原蟲(chóng)復(fù)合體中大量的差異。此外，RAPD已經(jīng)依照地理來(lái)源，特別是印度和肯亞，對(duì)杜氏利什曼原蟲(chóng)株進(jìn)行了分組，結(jié)果顯示了分類群中主要的趨異。
遺傳差異不僅僅對(duì)杜氏利什曼原蟲(chóng)是普遍的，甚至在引起皮膚利什曼病的L.major中也是這樣，分離自相同地理區(qū)域的株在其分子染色體組型中顯示較少的染色體大小多態(tài)性，而來(lái)自不同地理區(qū)域的株顯示出較顯著的差異，這提示利什曼原蟲(chóng)物種的基因組是非常易受影響的并且在各種物種的演化過(guò)程中發(fā)生了染色體重組[Samaras N等，1987]。目前，一個(gè)WHO資助的對(duì)L.major進(jìn)行基因組繪圖的計(jì)劃正在進(jìn)行中。盡管有爭(zhēng)議一種株的基因組圖譜對(duì)另一個(gè)株也適用，但是幾乎沒(méi)有證據(jù)能夠證實(shí)這一斷言。實(shí)際上，已知在杜氏利什曼原蟲(chóng)，恰氏利什曼原蟲(chóng)，L.major，和其它物種間，基因拷貝數(shù)和結(jié)構(gòu)存在差異。此外，協(xié)調(diào)由相同基因型的不同物種所引起的臨床癥狀中的巨大差異是困難的[Ghosh S.S.，等，1998]。由于這些原因，有必要表征重要的基因，所述基因具有潛在成為來(lái)自不同地理區(qū)域的診斷或疫苗或治療候選物的可能。單獨(dú)基于地理位置或者感染位點(diǎn)的寄生物物種的任務(wù)是不令人滿意的。因此，正確診斷和分類致病利什曼原蟲(chóng)分離株對(duì)于確定臨床預(yù)后和物種特異的治療途徑是必要的[Marfurt J.，etal.，2003]。一個(gè)這樣的在來(lái)自不同地理區(qū)域的不同物種間被廣泛研究的潛在基因是大小為63kDa的Gp63糖脂-錨定的鋅蛋白酶(glycolipid-anchored zinc protease)[Webb J.R.，et al.，1991；Steinkraus HB etal.，1993；Roberts S C et al.，1993]。
在印度，VL在比哈爾省，西孟加拉省和東北方邦是一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題，存在黑熱病(KA)和黑熱病后皮膚利什曼病(post kala-azar dermalleishmaniasis)在婦女和0-9歲齡兒童病例被少報(bào)的情況。1992年的新近VL流行病爆發(fā)在印度和蘇丹奪取了10萬(wàn)人的生命。在印度，噴灑DDT被用來(lái)幫助控制KA，但是有報(bào)道媒介白蛉屬Phlebotomus argentipes對(duì)其形成了抗性。同樣，一種目前印度的主要病癥，淋巴結(jié)病，升高了新媒介或者該疾病變體的可能性[Bora D，1999]。
在印度和蘇丹，黑熱病后皮膚利什曼病(PKDL)是KA的繼發(fā)病。該疾病在患者中從KA痊愈數(shù)月到數(shù)年后形成。皮膚損害是該疾病的特征，并且這些損害表現(xiàn)出很大的變化性，從低色素沉著到紅斑丘疹并且從丘結(jié)節(jié)到斑塊。在麻風(fēng)病中，PKDL的廣泛臨床譜反映了個(gè)體對(duì)利什曼病生物的免疫應(yīng)答。損害可以是大量的并且持續(xù)數(shù)十年。從損傷分離的寄生物同那些引起原生內(nèi)臟疾病的相同。
在利什曼病中的臨床和流行病學(xué)的發(fā)現(xiàn)不是特異的(pathgnomic)，這些發(fā)現(xiàn)可以類似于幾種地方性流行病例如瘧疾，結(jié)核病，梅毒和真菌感染。因此，需要實(shí)驗(yàn)室診斷來(lái)確定這些臨床猜測(cè)。用于每種利什曼綜合征(即內(nèi)臟、皮膚和粘膜類型)的診斷工具是不同的，但是在每個(gè)病例中的金標(biāo)準(zhǔn)依然是從合適的組織中證實(shí)和分離寄生物[Singh S etal.，2003]。
所述的臨床指征和綜合征用來(lái)將VL從其它類似病癥如瘧疾，具有門(mén)靜脈高壓的熱帶脾大綜合征血吸蟲(chóng)病或者硬化，非洲錐蟲(chóng)病，栗粒性結(jié)核，布魯氏菌病，傷寒，細(xì)菌性心內(nèi)膜炎，組織胞漿菌病，營(yíng)養(yǎng)不良，淋巴瘤，和白血病區(qū)分開(kāi)來(lái)是不夠的。因此，需要其它的診斷方法[Herwaldt BL，1999；Davidson RN，1998]。在這些方法中，最特異和標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)是寄生物學(xué)證實(shí)或者分離病原體。從胸骨或者骼骨嵴穿刺獲得的骨髓是一種非常安全但是痛苦很大的方法。將抽取物涂抹在玻璃片上并且用羅氏(Romanowsky)染色法染色以證實(shí)寄生物的無(wú)鞭毛體形式。但是，在培養(yǎng)物上，該方法可以在高到80％的情況下產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果。淋巴腺穿刺在60％的情況下得到陽(yáng)性結(jié)果。從任何變大的淋巴腺中抽取液體并進(jìn)行雙向檢查，而且對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)以得到診斷的最好機(jī)會(huì)[Williams，J.E，1995；Manson-Bahr PEC，1987]。在具有20％-30％的兔血的固體Novy-MacNeal-Nicolle(NNN)培養(yǎng)基或者補(bǔ)充了10％ v/v胎牛血清(FCS)的液體施氏(Schneider’s)昆蟲(chóng)培養(yǎng)基上進(jìn)行杜氏利什曼原蟲(chóng)的原代分離。其它合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基也可以被特定用于保持前鞭毛體的再次繼代培養(yǎng)，其使用FCS或者其它包括人尿在內(nèi)的補(bǔ)充物[Singh S et al/.2000]。在脾和肝臟中證實(shí)這些寄生物是可以被用來(lái)確定利什曼原蟲(chóng)感染的最準(zhǔn)確的方法之一。90％的活性病例中顯示了在脾和肝抽取物中的寄生物?？赡艿淖钚〉尼?，優(yōu)選地，21-規(guī)格(0.8mm)應(yīng)被用于最小化并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，如脾出血[Williams，J.E，1995]。脾抽取物中的部分可以被用來(lái)制造涂片來(lái)直接顯微檢查，其余應(yīng)該被用來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)。肝活檢材料不大可能在直接檢驗(yàn)或者在培養(yǎng)物上證實(shí)寄生物；但是組織檢查將會(huì)在門(mén)靜脈系統(tǒng)的肝巨噬細(xì)胞(Kupffer cell)中顯示無(wú)鞭毛體。
在來(lái)自肯尼亞和印度的黑熱病患者的血中發(fā)現(xiàn)利什曼原蟲(chóng)寄生物的偶然報(bào)道已經(jīng)被刊登。在2000g下離心抗凝劑中的血10分鐘并移除白細(xì)胞層的細(xì)胞并且將其用來(lái)制備涂片和接種培養(yǎng)物。在巨噬細(xì)胞中和周圍可以發(fā)現(xiàn)無(wú)鞭毛體。在培養(yǎng)接種中使用的體積是重要的，在NNN或者施氏培養(yǎng)基中的1-3滴已經(jīng)獲得了成功的結(jié)果[Manson-Bahr PEC，1987]。
常規(guī)的顯微方法是侵入性的并且是痛苦的，并具有醫(yī)源性感染和致命性出血的危險(xiǎn)。盡管在組織中證明寄生物的無(wú)鞭毛體形式從將其在1903年發(fā)現(xiàn)為寄生物疾病后就被使用，但是其很不敏感而且無(wú)法檢測(cè)隱匿的和亞臨床感染。亞臨床的和潛在類型的感染已經(jīng)成為近些年來(lái)主要關(guān)心的問(wèn)題，這是因?yàn)檫@些感染可能由于免疫抑制如HIV感染而突然爆發(fā)，并且這些感染可能會(huì)通過(guò)器官移植被傳遞。對(duì)于內(nèi)臟利什曼病，血清學(xué)診斷是基于特異體液應(yīng)答存在；或者對(duì)于皮膚和粘膜皮膚利什曼病，其基于細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答存在，其是由指向病原體的免疫系統(tǒng)引起的。存在多種可用于診斷VL的血清學(xué)方法，其準(zhǔn)確性和特異性不同。這些方法包括非特異的和特異的檢測(cè)。隨著研究的進(jìn)行，更新更好的方法持續(xù)地出現(xiàn)。
甲醛凝膠試驗(yàn)是最古老的血清學(xué)測(cè)試并且具有廉價(jià)和易于操作的優(yōu)點(diǎn)。將獲得自約5ml血液的血清與1滴30％的甲醛混合。如果混合物在20分鐘內(nèi)固化并形成白色不透明的沉淀，則表明陽(yáng)性反應(yīng)。陽(yáng)性測(cè)試直到感染后3個(gè)月才能被檢測(cè)出來(lái)并且于治愈后6個(gè)月后轉(zhuǎn)陰。該測(cè)試是非特異的，這是由于該測(cè)試基于檢測(cè)升高水平的IgG和IgM免疫球蛋白，而這些免疫球蛋白在其它感染如非洲錐形蟲(chóng)病，瘧疾，和血吸蟲(chóng)病等[WHOexpert committee report，1991]中也升高。幾種其它基于該原理的測(cè)試已經(jīng)在先前被使用，但是如今已經(jīng)很少再被使用[Singh S，1999]。
存在許多特異性血清學(xué)測(cè)試并且所有這些測(cè)試都具有對(duì)疾病診斷的不同的敏感性和特異性。這些測(cè)試中的一些包括間接血細(xì)胞凝集作用(IHA)，逆流免疫電泳(counter current immune electrophoresis(CCIEP))，免疫擴(kuò)散(ID)等等，但是所有這些測(cè)試都是很麻煩的并且缺乏靈敏性和特異性，因此不被普遍使用。一些更為普遍使用的測(cè)試描述如下1.利什曼原蟲(chóng)素(leishmanin)皮膚測(cè)試(LST)遲發(fā)性超敏是人利什曼病皮膚形式的一個(gè)重要特征并且可以由利什曼原蟲(chóng)素測(cè)試來(lái)測(cè)定，該測(cè)試也被稱為Montenegro反應(yīng)。利什曼原蟲(chóng)素是被殺死的全部(0.5-1×107/ml)或者破壞的(250μg蛋白/ml)前鞭毛體在無(wú)熱原的酚鹽水(phenol saline)中的懸液。沒(méi)有發(fā)生與查格斯病的交叉反應(yīng)，但是發(fā)現(xiàn)一些與腺結(jié)核病和瘤型麻風(fēng)病的交叉反應(yīng)。利什曼原蟲(chóng)素皮膚測(cè)試通常被用作人和動(dòng)物群體中皮膚型和粘膜皮膚利什曼病的流行和內(nèi)臟利什曼病的成功治愈的指征[Singh S，1999，Sassi A，等，1999]。在活性黑熱病中，不存在或者存在可忽略不計(jì)的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。但是，利什曼原蟲(chóng)素抗原是在印度是無(wú)法商購(gòu)的并且沒(méi)有進(jìn)行過(guò)現(xiàn)場(chǎng)研究。
2.間接熒光抗體測(cè)試(IFAT)間接熒光抗體測(cè)試是當(dāng)前一種最敏感的測(cè)試之一。該測(cè)試基于抗體測(cè)定，這些抗體被證實(shí)在感染的非常早期存在而在治愈后6-9個(gè)月無(wú)法檢測(cè)出來(lái)。如果這些抗體持續(xù)低滴度存在，則其為很可能復(fù)發(fā)的好的表征。大于1/20的滴度是顯著的并且高于1/128的滴度是有診斷意義的[Williams，J.E，1995]?？赡艽嬖谂c錐蟲(chóng)血清的交叉反應(yīng)，但是這可以通過(guò)將利什曼原蟲(chóng)無(wú)鞭毛體而不是前鞭毛體作為抗原而克服[Gari-Toussaint M，等，1994]。
3.凝集測(cè)試DAT是一種高特異而且高靈敏的測(cè)試。其廉價(jià)并且容易操作，這使得它對(duì)場(chǎng)地使用和實(shí)驗(yàn)室使用來(lái)說(shuō)都是理想的。抗原是從杜氏利什曼原蟲(chóng)的前鞭毛體制備的，并且該測(cè)試可以使用血漿，血清，血斑點(diǎn)和全血。在很長(zhǎng)時(shí)間，DAT在資源貧乏的國(guó)家保持為首選診斷方法。該方法使用懸液或者凍干形式的全部的，染色的前鞭毛體。所述的凍干形式是熱穩(wěn)定的并且其便利了將DAT在場(chǎng)地中使用。但是，DAT的主要不足是相對(duì)長(zhǎng)的18小時(shí)的孵育時(shí)間以及需要對(duì)血液或者血清進(jìn)行系列稀釋[Schallig HD等，2001]。DAT的另一個(gè)主要缺點(diǎn)是其對(duì)于評(píng)價(jià)該疾病的寄生物治愈沒(méi)有預(yù)后價(jià)值，這是由于該測(cè)試在治愈后的數(shù)年中可能保持陽(yáng)性。近來(lái)Schoone等 已經(jīng)研制了一種快速凝集-篩選測(cè)試用來(lái)快速測(cè)定(＜3h)血清樣品和濾紙上收集血液中的抗利什曼原蟲(chóng)抗體。該FAST利用僅一種血清稀釋就能得到定性的結(jié)果。該FAST提供了基于凍干抗原的DAT的以下優(yōu)點(diǎn)抗原穩(wěn)定性，重現(xiàn)性，特異性和敏感性。
4.免疫印跡使用免疫印跡的血清診斷已經(jīng)被進(jìn)行了嘗試并且據(jù)報(bào)道其更為優(yōu)越且階段專一。感染過(guò)程中表達(dá)的各種抗原也可以用文件證明。但是，該技術(shù)使用困難并且僅限于研究實(shí)驗(yàn)室[Herwaldt BL.，1999；Singh S，1999；Schallig HD等，2001]。
5.抗原測(cè)定患者血清中抗原的測(cè)定由于高水平的抗體，循環(huán)免疫復(fù)合物，血清淀粉樣物，類風(fēng)濕因子，和自體抗體的存在而復(fù)雜化，這些物質(zhì)可能覆蓋免疫學(xué)重要的抗原決定簇或者完全抑制自由抗原的結(jié)合。原則上，抗原檢測(cè)將會(huì)提供較好的利什曼病診斷方法。因?yàn)榭乖奖活A(yù)計(jì)與寄生物的負(fù)荷量廣泛相關(guān)，抗原檢測(cè)可以作為一個(gè)理想的候選來(lái)在抗體應(yīng)答非常差的無(wú)免疫應(yīng)答患者中檢測(cè)抗體。盡管已經(jīng)公布了幾個(gè)報(bào)道，但是目前沒(méi)有可用的令人滿意的抗原檢測(cè)系統(tǒng)[Senaldi G等，2001；Attar ZJ等，2001]。近來(lái)，研制出了用來(lái)在VL患者的尿液中檢測(cè)利什曼原蟲(chóng)抗原的膠乳凝集測(cè)試(KATEX)。使用從不同VL病灶收集的樣品，用KATEX獲得的結(jié)果表明不管樣品的地理來(lái)源如何，該測(cè)試工作進(jìn)行得很好。該測(cè)試的特異性為100％并且敏感性為68-100％[Attar ZJ等，2001]。該測(cè)試是否可以用于檢測(cè)無(wú)癥狀VL和監(jiān)測(cè)治療尚需要被進(jìn)行確定。
6.酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試(ELISA)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試(ELISA)在利什曼病的血清學(xué)診斷中是有價(jià)值的工具。該測(cè)試用于實(shí)驗(yàn)室分析或區(qū)域應(yīng)用。ELISA的操作十分容易并且適于用于純化的或確定的抗原。傳統(tǒng)上，利什曼病的免疫診斷測(cè)試設(shè)計(jì)中使用的抗原衍生于被體外培養(yǎng)的前鞭毛體或者來(lái)自重組體蛋白，用于ELISA和DAT的抗原的改變已經(jīng)提高了VL診斷，其中的改變是從整個(gè)前鞭毛體或者溶解抗原變?yōu)楦禺惡蜐撛诘闹亟M體利什曼原蟲(chóng)和肽抗原[Senaldi G等，2001]。免疫診斷受到使用抗原的極大影響。近來(lái)已經(jīng)報(bào)道了幾種抗原分子[Martin SK et al.，1998；Rajasekariah GH et al.，2001]。杜氏利什曼原蟲(chóng)前鞭毛體釋放到無(wú)蛋白培養(yǎng)基中的排泄的、分泌的和代謝的抗原(Ld-ESM)被通過(guò)ELISA來(lái)用來(lái)VL的血清診斷。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Ld-ESM是100％特異的并且是敏感的，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值是99.99％并且陰性預(yù)測(cè)值是95.45％。但是，需要進(jìn)一步的回顧性和預(yù)期的多位點(diǎn)(multisite)評(píng)估來(lái)確認(rèn)這些發(fā)現(xiàn)[Schoone GJ等，2001]。近來(lái)，研制了多種重組體抗原，近來(lái)已經(jīng)鑒定了一種與編碼表達(dá)在L.major前鞭毛體和無(wú)鞭毛體表面的親水蛋白L.major基因B相關(guān)的基因，所述蛋白被表征為5.5個(gè)拷貝14個(gè)氨基酸序列的氨基酸重復(fù)基序，該基因被顯示在杜氏利什曼原蟲(chóng)中表達(dá)。由杜氏利什曼原蟲(chóng)基因B同系物編碼的蛋白含有高達(dá)22拷貝的重復(fù)元件，其中14個(gè)殘基中的9個(gè)在兩種物種間是完全保守的。研制了使用來(lái)自杜氏利什曼原蟲(chóng)GBP和重組杜氏利什曼原蟲(chóng)GBP的重復(fù)肽序列作為固定相配基的ELISA。但是，該抗原的限制是其僅可以被用于地方性流行杜氏利什曼原蟲(chóng)區(qū)域的內(nèi)臟利什曼病的血清學(xué)診斷，而不能用于其它利什曼原蟲(chóng)物種的共地方性流行的區(qū)域而且其特異性和靈敏性也不是很高[Jensen AT等，1999]。
Raj等(1999)研制了另一種用于診斷印度VL的尹氏利什曼原蟲(chóng)源的重組蛋白rORFF。該ORFF蛋白在尹氏利什曼原蟲(chóng)的染色體35的LD1基因座中被編碼，使用該抗原的ELISA證實(shí)，當(dāng)用不同組的患者如證實(shí)的VL，懷疑的VL，間斷治療的地方流行性正常和非地方流行性正常患者進(jìn)行測(cè)試的時(shí)候，其具有低到5ng r-ORFF的敏感性。此外，使用全前鞭毛體的DAT和使用全部可溶抗原的ELISA被用于相同的患者組。發(fā)現(xiàn)使用rORFF的ELISA比其它的更為敏感。盡管該抗原對(duì)VL是高度靈敏的(95-100％)和特異的(＞90％)，但是在40％被確認(rèn)L.major或者L.tropica引發(fā)的CL中也發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性。仍需要通過(guò)其它方式評(píng)估測(cè)試并且其在診斷領(lǐng)域的用途尚待研究。在最近的一個(gè)在尹氏利什曼原蟲(chóng)為病原體的地中海VL進(jìn)行的研究中，使用Maalej等， 的ELISA方法比較10個(gè)重組體和純化的利什曼原蟲(chóng)抗原。在這些重組體抗原中rgp63-不存在于Trypanosoma cruzi或其它運(yùn)動(dòng)質(zhì)體(kinetoplastid)的利什曼原蟲(chóng)的一個(gè)主要表面抗原-和rGBP具有良好的性能，但是其并不非常敏感并且對(duì)可靠的診斷并不特異。其暗示使用來(lái)自尹氏利什曼原蟲(chóng)而不是L.major的重組體蛋白將會(huì)得到更好的結(jié)果。
Burns等 研制的一個(gè)重組體抗原K39(rK39)屬于發(fā)動(dòng)蛋白(motor protein)的驅(qū)動(dòng)蛋白家族，其已經(jīng)被顯示特異于由杜氏利什曼原蟲(chóng)復(fù)合體成員引起的VL過(guò)程中產(chǎn)生的抗體，所述的復(fù)合體包括恰氏利什曼原蟲(chóng)和尹氏利什曼原蟲(chóng)。該抗原是驅(qū)動(dòng)蛋白家族的一員，其編碼一種具有重復(fù)表位的蛋白，這個(gè)由39個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白(K39)是高度敏感并且對(duì)急性疾病具有預(yù)測(cè)性。在VL患者中已經(jīng)證實(shí)了其高抗-rK39的抗體滴度，但是在皮膚或者粘膜皮膚利什曼病中其沒(méi)有顯示可見(jiàn)測(cè)得到的抗rK39抗體。對(duì)該抗原的抗體滴度與活性疾病直接相關(guān)，并且其具有很大潛能作為監(jiān)測(cè)化療和預(yù)測(cè)臨床復(fù)發(fā)的方法[Burns JM Jr等1993；SinghS等1995；Badaro R等.1996；Singh S等.2002；Maalej IA等.，2003，美國(guó)專利號(hào)5,411,865和5,719,263]。此外，rK39 ELISA對(duì)于在無(wú)免疫應(yīng)答的人如艾滋病患者中檢測(cè)VL具有高預(yù)測(cè)價(jià)值[Houghton RL等，1998]。該抗原如今以適合在現(xiàn)場(chǎng)條件下使用的抗原-浸透的硝化纖維紙帶形式商購(gòu)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)rK39帶測(cè)試在印度的黑熱病現(xiàn)場(chǎng)診斷中是有用的[Sundar S等，1998]。但是，該測(cè)試在蘇丹[Zijlstra EE等，2001]和歐洲南部卻具有顯著小的敏感性。重要的是在此強(qiáng)調(diào)盡管已經(jīng)表明驅(qū)動(dòng)蛋白相關(guān)抗原基因在所有的內(nèi)臟物種中都是保守的，這里卻不是這樣，因?yàn)槎攀侠猜x(chóng)是印度以及蘇丹黑熱病的病原體，并且在兩個(gè)地理區(qū)域它們會(huì)引起VL繼發(fā)的PKDL。但是據(jù)Zijlstra等， 觀察，rK39帶測(cè)試在蘇丹(只有達(dá)67％)甚至歐洲南部(只有達(dá)71.4％)都較不敏感[Jelinek T等，1999]，這引起了對(duì)該抗原是否普遍合適的疑慮。對(duì)該變化的敏感性的一個(gè)經(jīng)常提供的解釋是可能不同種族群體誘發(fā)的抗體反應(yīng)顯著不同[Sundar S等，2002]?；蛘?，也可能是這樣的當(dāng)將來(lái)自恰氏利什曼原蟲(chóng)的存在的rK39被用于診斷的時(shí)候，抗原基因其本身從株與株之間顯著變化，在不同地理區(qū)域間也顯著變化，或者在一些情況下作為疾病未被發(fā)覺(jué)的結(jié)果，該抗原的變體存在并逃避免疫監(jiān)視(immune elucidation)。此外，世界范圍內(nèi)每年發(fā)生的500,000個(gè)新的VL病例中，超過(guò)90％報(bào)道自印度，孟加拉國(guó)，蘇丹南部，和巴西東北部[Sundar S等，2002]。
世界的大部分VL病例都在印度，并且驅(qū)動(dòng)蛋白相關(guān)抗原還沒(méi)有被從杜氏利什曼原蟲(chóng)的印度分離株中表征。同樣清楚的是恰氏利什曼原蟲(chóng)具有動(dòng)物儲(chǔ)存宿主而杜氏利什曼原蟲(chóng)卻沒(méi)有。來(lái)自恰氏利什曼原蟲(chóng)的基因顯著不同是可能的，并且該基因的表征也可以解釋rK39帶測(cè)試在某些地理區(qū)域敏感性差的原因。在一次解決該問(wèn)題的嘗試中，我們克隆并表征了來(lái)自分離自兩個(gè)被印度同一個(gè)地理區(qū)域的杜氏利什曼原蟲(chóng)感染的個(gè)體中分離的不同株的驅(qū)動(dòng)蛋白基因。一個(gè)株MHOM/IN/DD8是被WHO參考株很好的表征的分離自1980年印度的株，并且第二個(gè)株MHOM/IN/KE16/1998是一個(gè)新近臨床分離株，其來(lái)自印度的Muzaffarpur和比哈爾省的10歲齡女性黑熱病患者。這清楚地解釋了基因水平的變化可能引起了在某些地理區(qū)域中降低的敏感性。如果該驅(qū)動(dòng)蛋白基因沒(méi)有從印度分離株中被表征，把這一基因水平的變化信息將永遠(yuǎn)不會(huì)被科學(xué)界所知曉。從ELISA的結(jié)果來(lái)看這是很清楚的，來(lái)自MHOM/IN/DD8抗原的平均滴度要明顯低于來(lái)自MHOM/IN/KE16/1998和恰氏利什曼原蟲(chóng)中任一個(gè)的rK 39。
申請(qǐng)人用不同的關(guān)鍵詞對(duì)專利數(shù)據(jù)庫(kù)做了大量檢索以研究先前對(duì)K39免疫顯性重復(fù)抗原(immunodominant repeat antigen)和230kD抗原的工作。下面對(duì)幾個(gè)Reed的美國(guó)專利就其相關(guān)主題與申請(qǐng)人的抗原的獨(dú)特性進(jìn)行討論。
Reed在1995年5月2日的美國(guó)專利no.5,411,865中教導(dǎo)一種測(cè)定抗-利什曼原蟲(chóng)寄生物抗體的方法。所公開(kāi)的化合物被用于一種用來(lái)檢測(cè)抗-利什曼原蟲(chóng)寄生物抗體，其靶向一個(gè)存在于恰氏利什曼原蟲(chóng)和杜氏利什曼原蟲(chóng)中的230kDa的抗原。其包括從個(gè)體獲得樣品，將樣品與包含SEQID NO3中的氨基酸序列的重組體K39重復(fù)區(qū)域抗原(regionantigen)接觸，和檢測(cè)樣品中結(jié)合到重組體K39重復(fù)區(qū)域抗原的抗利什曼原蟲(chóng)寄生物抗體的存在。
Reed在1998年2月17日的美國(guó)專利no.5,719,263中教導(dǎo)了一種存在于利什曼原蟲(chóng)物種中的抗原。所公開(kāi)的化合物是一種分離的230Kd的抗原，其存在于恰氏利什曼原蟲(chóng)和杜氏利什曼原蟲(chóng)中，并且還公開(kāi)了含有一個(gè)或者多個(gè)K39重復(fù)抗原的分離的多肽。該發(fā)明還公開(kāi)了編碼該230Kd抗原和K39重復(fù)抗原的DNA，以及包含該抗原的疫苗組合物。
上面公開(kāi)的230KDa抗原和含有K39重復(fù)的分離的多肽據(jù)報(bào)道在某些VL高度地方性流行的地區(qū)并不是很靈敏并且是由杜氏利什曼原蟲(chóng)引起的。但是，應(yīng)該注意的是，K39重復(fù)只已經(jīng)從恰氏利什曼原蟲(chóng)而沒(méi)有從杜氏利什曼原蟲(chóng)表征。整個(gè)世界的利什曼病的主要問(wèn)題是由杜氏利什曼原蟲(chóng)引起的。從報(bào)道看，很清楚兩個(gè)物種是遺傳上不同的。因此，本申請(qǐng)人克隆并表征了來(lái)自杜氏利什曼原蟲(chóng)的印度分離株的K39重復(fù)免疫顯性區(qū)域，這對(duì)于全球的VL問(wèn)題作出了很大的貢獻(xiàn)。
申請(qǐng)者的發(fā)明公開(kāi)了存在于利什曼原蟲(chóng)物種中的29kDa和26kDa重復(fù)抗原。公開(kāi)的化合物是分離的29kDa和26kDa抗原，其表征自杜氏利什曼原蟲(chóng)的印度分離株。所報(bào)道的抗原與恰氏利什曼原蟲(chóng)的230kDa抗原完全不同?？乖兓@著，超過(guò)60％的預(yù)計(jì)氨基酸序列與來(lái)自恰氏利什曼原蟲(chóng)的K39重復(fù)抗原不同。還公開(kāi)了編碼該29kD抗原和26kD抗原的DNA，以及包含該抗原的治療和疫苗組合物。
Reed等在1999年6月15日的美國(guó)專利no.5,912,166中教導(dǎo)了用于診斷利什曼病感染的化合物和方法。所提供的化合物包括含有至少一種恰氏利什曼原蟲(chóng)酸性核糖體抗原LcPO或其變體的表位。這種化合物在用于檢測(cè)利什曼病感染和用于鑒定具有無(wú)癥狀感染、可能會(huì)發(fā)展成為急性內(nèi)臟利什曼病的個(gè)體的多種免疫檢測(cè)中有用。所述的多肽化合物還在用于預(yù)防利什曼病的疫苗和藥用組合物中有用。
但是，申請(qǐng)人的發(fā)明不涉及酸性核糖體抗原LcPO。
Reed等在2003年10月28日的美國(guó)專利No.6,638,517“用于利什曼病治療和診斷的利什曼原蟲(chóng)抗原”中教導(dǎo)了用于預(yù)防，治療和檢測(cè)利什曼病并在患者中刺激免疫應(yīng)答的組合物和方法。所提供的化合物包含含有一個(gè)或者多個(gè)利什曼原蟲(chóng)抗原或其變體的免疫原性部分的多肽。該專利還公開(kāi)了含有該多肽的疫苗和藥用組合物，或者編碼該多肽的多核苷酸也被提供并且可能被用于例如預(yù)防和治療利什曼病，以及檢測(cè)利什曼原蟲(chóng)感染。
上面專利中提供的化合物利用L.major源的序列和來(lái)自復(fù)合利什曼原蟲(chóng)抗原的融合構(gòu)建體。這些化合物與申請(qǐng)者的抗原根本不相似。
Burns等， 已經(jīng)從一個(gè)南美內(nèi)臟物種的恰氏利什曼原蟲(chóng)中克隆并表征了驅(qū)動(dòng)蛋白相關(guān)抗原基因，這導(dǎo)致了rK39抗原的發(fā)展，其是一個(gè)具有39個(gè)氨基酸串聯(lián)重復(fù)的重組體蛋白。據(jù)報(bào)道該來(lái)自新大陸的內(nèi)臟物種恰氏利什曼原蟲(chóng)的抗原在一些高VL地方流行性區(qū)域蘇丹和歐洲南部不象其它一些地理區(qū)域印度、孟加拉國(guó)、尼泊爾等那樣敏感[Sundar et al.，2002]。在世界利什曼病問(wèn)題上，印度具有VL人群的多數(shù)。因此，具有準(zhǔn)確和良好表征化的工具對(duì)于診斷和其它控制方法是重要的。申請(qǐng)者已經(jīng)在序列水平表征了驅(qū)動(dòng)蛋白相關(guān)抗原以研究是否該序列與恰氏利什曼原蟲(chóng)的序列相似以排除一些VL和PKDL病例象在蘇丹所報(bào)道的那樣未被檢查出來(lái)的可能性，所述的恰氏利什曼原蟲(chóng)序列已經(jīng)被很好表征。該研究還將探究種族群體中不同應(yīng)答的原因，這些群體在Burns等， 報(bào)道的rK39抗原中包含該疾病。在本發(fā)明中，我們發(fā)現(xiàn)我們的驅(qū)動(dòng)蛋白抗原的序列與公開(kāi)報(bào)道的、Burns等的衍生rK39的恰氏利什曼原蟲(chóng)的序列顯著不同。本發(fā)明還提供了一種使用衍生自杜氏利什曼原蟲(chóng)的印度分離株的抗原用于檢測(cè)抗利什曼原蟲(chóng)抗體的方法。
本研究對(duì)于分析在印度的各種種族群體中對(duì)所述抗原的應(yīng)答是重要的。印度患者中的抗體水平可能由于株的不同或者也可能不同的種族群體以不同的方式應(yīng)答于利什曼原蟲(chóng)抗原。
發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是分離、表征和使用來(lái)自杜氏利什曼原蟲(chóng)株MHOM/IN/DD8的印度分離株的驅(qū)動(dòng)蛋白相關(guān)抗原基因的免疫顯性區(qū)域。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是分離、表征和使用來(lái)自杜氏利什曼原蟲(chóng)株MHOM/IN/KE16/1998的印度分離株的驅(qū)動(dòng)蛋白相關(guān)抗原基因的免疫顯性區(qū)域。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是在核酸和氨基酸水平上鑒定印度分離株和在核酸和氨基酸水平上比較序列分析印度分離株和恰氏利什曼原蟲(chóng)驅(qū)動(dòng)蛋白免疫顯性區(qū)域。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是與其它報(bào)道的序列作比較，鑒定分離自印度株的驅(qū)動(dòng)蛋白基因的39個(gè)氨基酸的免疫顯性重復(fù)區(qū)域的變化。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是從印度株中生產(chǎn)含有一個(gè)或者多個(gè)39氨基重復(fù)區(qū)域的多肽。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是從印度株中生產(chǎn)含有一個(gè)或者多個(gè)39氨基酸重復(fù)區(qū)域的重組體多肽。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種使用上述的多肽從利什曼原蟲(chóng)感染的患者中檢測(cè)抗利什曼原蟲(chóng)抗體的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種試劑盒來(lái)在VL和PKDL患者中檢測(cè)抗利什曼原蟲(chóng)抗體，該試劑盒含有來(lái)自杜氏利什曼原蟲(chóng)的印度分離株的多肽。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是生產(chǎn)針對(duì)SEQ ID NO5或者SEQ ID NO6中所示多肽的抗體。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供使用上述抗體來(lái)檢測(cè)利什曼原蟲(chóng)抗原的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供用于診斷利什曼原蟲(chóng)抗原的診斷試劑盒，該試劑盒由針對(duì)SEQ ID NO5或者SEQ ID NO6中所示多肽產(chǎn)生的抗體組成。
發(fā)明簡(jiǎn)述相應(yīng)地，本發(fā)明提供了被鑒定為SEQ ID NO5和SEQ ID NO6的多肽，其分離自杜氏利什曼原蟲(chóng)印度株，用于從收集自動(dòng)物或者人類的感染樣品中檢測(cè)抗利什曼原蟲(chóng)抗體。本發(fā)明還提供了用來(lái)檢測(cè)上述由利什曼原蟲(chóng)屬的原生動(dòng)物寄生物引起的感染的ELISA方法。本發(fā)明還提供了用于在血液樣品中檢測(cè)利什曼病(VL和PKDL)的診斷試劑盒。本發(fā)明還提供了用于診斷利什曼原蟲(chóng)抗原的診斷試劑盒，該試劑盒由針對(duì)SEQ ID NO5或者SEQ ID NO6中所示多肽產(chǎn)生的抗體組成。
附圖簡(jiǎn)述

圖1克隆自株MHOM/IN/DD8的pGEMTE載體(Promega)中的563bp PCR產(chǎn)物。泳道11kb的分子量標(biāo)記(MBI Fermentas)，泳道2Eco RI消化的帶有釋放的563bp插入物的質(zhì)粒，泳道3未消化的帶有插入物的pGEMTE，泳道4Eco RI消化的帶有釋放的563bp插入物的質(zhì)粒，泳道5未消化的帶有插入物的pGEMTE。
圖2克隆自株MHOM/IN/KE16/1998的pGEMTE載體(Promega)中的466bp PCR產(chǎn)物。泳道11kb的分子量標(biāo)記(MBI Fermentas)，泳道2Eco RI消化的帶有釋放的466bp插入物的質(zhì)粒，泳道3未消化的帶有插入物的pGEMTE，泳道4Eco RI消化的帶有釋放的466bp插入物的質(zhì)粒，泳道5未消化的帶有插入物的pGEMTE。。
圖3使用基因庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)的專利部對(duì)預(yù)測(cè)的杜氏利什曼原蟲(chóng)株MHOM/IN/DD8(SEQ ID NO5)的蛋白序列進(jìn)行BLAST搜索。圖3A-3F，對(duì)專利數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST結(jié)果。查詢來(lái)自杜氏利什曼原蟲(chóng)株MHOM/IN/DD8(SEQ ID NO5)的多肽，主題來(lái)自美國(guó)專利號(hào)5411865，5719263，5912166的專利保護(hù)的序列圖3A-C顯示了SEQ ID NO5和來(lái)自US專利5411865的SEQ IDNO1之間的同源性，其與US專利5719263的SEQ ID NO2相同。
圖3D-F顯示了SEQ ID NO5和來(lái)自US專利5912166的SEQ ID NO3之間的同源性。
圖4在核苷酸水平對(duì)序列SEQ ID NO3和SEQ ID NO4與恰氏利什曼原蟲(chóng)免疫顯性重復(fù)區(qū)域的那些進(jìn)行免疫顯性重復(fù)區(qū)域的Clustal W多序列比對(duì)。
LCIMM恰氏利什曼原蟲(chóng)種類的免疫顯性重復(fù)區(qū)域(基因庫(kù)入藏登記號(hào)L07879)；DDIMM(SEQ ID NO3)是印度株MHOM/IN/DD8的杜氏利什曼原蟲(chóng)種類免疫顯性重復(fù)區(qū)域；KEIMM(SEQ ID NO4)印度株MHOM/IN/KE16/1998的免疫顯性重復(fù)區(qū)域；[---代表缺口，相同的序列用黑色陰影表示]。
圖5在氨基酸水平對(duì)序列SEQ ID NO5和SEQ ID NO6與恰氏利什曼原蟲(chóng)免疫顯性重復(fù)區(qū)域的那些進(jìn)行免疫顯性重復(fù)區(qū)域的Clustal W多序列比對(duì)。
LCIMM恰氏利什曼原蟲(chóng)種類的免疫顯性重復(fù)區(qū)域(基因庫(kù)入藏登記號(hào)L07879)；序列DDIMM(SEQ ID NO5)是印度株MHOM/IN/DD8的杜氏利什曼原蟲(chóng)種類免疫顯性重復(fù)區(qū)域；KEIMM(SEQ ID NO6)印度株MHOM/IN/KE16/1998的免疫顯性重復(fù)區(qū)域；[---代表缺口，相同的序列用黑色陰影表示并且類似的區(qū)域用灰色陰影表示]。
圖6在氨基酸水平對(duì)SEQ ID NO5(DDIMM)與恰氏利什曼原蟲(chóng)免疫顯性重復(fù)區(qū)域的序列進(jìn)行免疫顯性重復(fù)區(qū)域的Clustal W多序列比對(duì)。LCIMM代表恰氏利什曼原蟲(chóng)種類的免疫顯性重復(fù)區(qū)域(基因庫(kù)入藏登記號(hào)L07879)。[---代表缺口，相同的序列用黑色陰影表示并且類似的區(qū)域用灰色陰影表示]。
圖7在氨基酸水平對(duì)SEQ ID NO5(DDIMM)與SEQ ID NO6(KEIMM)進(jìn)行免疫顯性重復(fù)區(qū)域的Clustal W多序列比對(duì)。[---代表缺口，相同的序列用黑色陰影表示并且類似的區(qū)域用灰色陰影表示]。
圖8如SEQ ID NO5所示，帶有杜氏利什曼原蟲(chóng)印度分離株的MHOM/IN/DD8株的內(nèi)重復(fù)變體的免疫顯性39氨基酸重復(fù)單元。呈現(xiàn)了第一個(gè)39氨基酸重復(fù)單元并且顯示了在重復(fù)之間的不同氨基酸位置的簡(jiǎn)并性。
圖9如SEQ ID NO6所示，帶有杜氏利什曼原蟲(chóng)印度分離株的MHOM/IN/KE16/1998的株內(nèi)重復(fù)變體的免疫顯性39氨基酸重復(fù)單元。呈現(xiàn)了第一個(gè)39氨基酸重復(fù)單元并且顯示了在重復(fù)之間的不同氨基酸位置的簡(jiǎn)并性。
圖10a)將Ni-NTA瓊脂糖純化的6X-His標(biāo)記的重組體蛋白在12％SDS-PAGE上分解并用考馬斯亮蘭染色。泳道1預(yù)染的分子量標(biāo)記(MBIFermentas，USA)；泳道2從MHOM/IN/DD8(～29kDA)純化的蛋白；泳道3從MHOM/IN/KE16/1998(～26kDa)純化的蛋白。
b)對(duì)純化的蛋白用五抗-His-HRP綴合物進(jìn)行蛋白印跡。泳道1預(yù)染的分子量標(biāo)記(MBI Fermentas，USA)；泳道2從MHOM/IN/DD8(～29kDA)純化的蛋白；泳道3從MHOM/IN/KE16/1998(～26kDa)純化的蛋白。
的來(lái)自新大陸的內(nèi)臟物種恰氏利什曼原蟲(chóng)的抗原在一些高VL地方流行性區(qū)域蘇丹和歐洲南部[Zijlstra，E.E.，2001；Jelinek T.，1999]不象其它一些地理區(qū)域印度、孟加拉國(guó)、尼泊爾等那樣敏感。在世界利什曼病問(wèn)題上，印度具有VL人群的多數(shù)。因此，具有準(zhǔn)確和良好表征的工具對(duì)于在印度診斷和其它的控制方法是重要的。申請(qǐng)者已經(jīng)在序列水平表征了來(lái)自兩種株的驅(qū)動(dòng)蛋白相關(guān)抗原以研究是否該序列與恰氏利什曼原蟲(chóng)的序列相似并排除在印度是否有一些病例象在蘇丹那樣未被檢查出來(lái)的疑慮，所述的兩個(gè)株也就是a)最初獲得自印度比哈爾省黑熱病患者的WHO參考株MHOM/IN/DD8，b)獲得自印度的Musafarpur和比哈爾省的10歲齡女性黑熱病患者的株MHOM/IN/KE16/1998。同樣，了解是否不同的種族群體對(duì)rK39抗原應(yīng)答不同或者是否在免疫顯性區(qū)域的序列差異引起了敏感性的不同變得非常重要。在本發(fā)明中，我們發(fā)現(xiàn)驅(qū)動(dòng)蛋白抗原/多肽的序列與所公開(kāi)的衍生出rK39的恰氏利什曼原蟲(chóng)的序列顯著不同。
在本發(fā)明中，我們還已經(jīng)產(chǎn)生了針對(duì)所述驅(qū)動(dòng)蛋白抗原/多肽的抗體，并利用它來(lái)檢測(cè)利什曼原蟲(chóng)抗原。
從黑熱病患者的臨床樣品中在NNN培養(yǎng)基中將寄生物首先分離為前鞭毛體，隨后在含有10％熱失活FCS的199培養(yǎng)基中在25℃下適應(yīng)生長(zhǎng)。作為常規(guī)的維持，將含有寄生物的接種物樣品無(wú)菌引入到補(bǔ)充了10％FCS的4ml 199培養(yǎng)基的培養(yǎng)管中。在25℃，將管置于冷卻的孵箱中，并且用顯微鏡以規(guī)律的間隔監(jiān)測(cè)其生長(zhǎng)。對(duì)于寄生物的大量培養(yǎng)，將含有寄生物的接種物樣品無(wú)菌引入到500ml的組織培養(yǎng)瓶中的200ml含有10％FCS的M199中，并在25℃的冷卻的孵箱中孵育直到中間對(duì)數(shù)期(7-10天)。隨后收集寄生物并用于核DNA分離。
通過(guò)在冷凍離心機(jī)中以5000rpm離心來(lái)收獲中對(duì)數(shù)期的寄生物。除了少許修改外，按照標(biāo)準(zhǔn)方法[Lu H.G.等，1994]分離寄生物的核DNA。在60℃下在10體積的裂解緩沖液(NaCl，100mM，Tris-HCl，10mM(pH 8.0)，EDTA 10mM，蛋白酶K/ml 100μg，Sarcosyl 1.5％)中裂解大約1-5×109的前鞭毛體3小時(shí)。通過(guò)在27,000Xg下離心1小時(shí)沉淀動(dòng)基體DNA網(wǎng)絡(luò)，并在TE緩沖液(Tris-HCl(pH 8.0)10mM，EDTA(pH 8.0)1mM)中重懸。在沉淀動(dòng)基體DNA后，從剩余的上清液中分離核DNA。將這些上清液溫育過(guò)夜以在65℃進(jìn)一步消化蛋白。通過(guò)加入等體積的酚/氯仿混合物，徹底混合并隨后通過(guò)在5000rmp沉淀離心15分鐘來(lái)使核DNA經(jīng)歷幾個(gè)循環(huán)的酚/氯仿抽提。通過(guò)加入良好混合的1/10體積的3M-醋酸鈉和2體積的100％乙醇并在-20℃孵育1小時(shí)來(lái)沉淀核DNA。將混合物在4℃以5000rpm離心30分鐘來(lái)沉淀混合物。用70％乙醇清洗沉淀，干燥，并將其重懸于TE緩沖液。通過(guò)測(cè)定260/280nmOD值來(lái)測(cè)定DNA的濃度和純度。將DNA儲(chǔ)存在-70℃直到使用。
使用50ng分離的核DNA并且使用各種下面引物的組合來(lái)進(jìn)行驅(qū)動(dòng)蛋白相關(guān)抗原的PCR擴(kuò)增，以擴(kuò)增驅(qū)動(dòng)蛋白基因的重疊部分。所述的引物基于基因庫(kù)中驅(qū)動(dòng)蛋白基因的序列資料(入藏登記號(hào)L07879)進(jìn)行設(shè)計(jì)?？捎玫膩?lái)自恰氏利什曼原蟲(chóng)的驅(qū)動(dòng)蛋白基因序列長(zhǎng)度為3319bp并且具有的ORF從454位置的推定ATG起始密碼子到3319位置的最后一個(gè)堿基。該基因具有起始自位置2563的起始密碼子的5’非重復(fù)區(qū)域，和一個(gè)從堿基2564直到3’末端的保守的免疫顯性重復(fù)結(jié)構(gòu)域。所述的39氨基酸重復(fù)表位是驅(qū)動(dòng)蛋白基因的一部分，在堿基位置2564-3319的3’末端。該重復(fù)表位在報(bào)道的6.5拷貝處具有117bp串聯(lián)重復(fù)并且在3’末端延伸到3-4kb。在不同位置的高度保守的序列的短延伸被考慮用來(lái)設(shè)計(jì)引物?？紤]恰氏利什曼原蟲(chóng)的全部3.33kb的基因，并且我們?cè)噲D擴(kuò)增從位置454到3319bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)。主要的焦點(diǎn)是117bp大小的免疫顯性串聯(lián)重復(fù)；但是，我們?cè)噲D擴(kuò)增和表征盡可能多重復(fù)的全部ORF。設(shè)計(jì)三個(gè)正向和兩個(gè)反向引物來(lái)擴(kuò)增該基因，細(xì)節(jié)如下引物L(fēng)KF93(SEQ ID NO7)在455bp處預(yù)測(cè)起始密碼子的上游，并且其覆蓋5’到ORF起始的362bp。引物L(fēng)KF 1527(SEQ ID NO9)是另一個(gè)正向引物，其起始于從堿基1開(kāi)始的堿基1527位置，即，其覆蓋從ORF開(kāi)始的1073個(gè)堿基。第三個(gè)正向引物是LKF 2564(SEQ ID NO10)，其意在與反向引物L(fēng)KR3266(SEQ IDNO11)相結(jié)合擴(kuò)增免疫顯性串聯(lián)重復(fù)。第一個(gè)反向引物是LKR 1803(SEQID NO8)，其包含與帶有另一個(gè)反向引物L(fēng)KR3266(SEQ ID NO11)的第二引物組的276bp的重疊區(qū)域。引物序列在SEQ ID NO7到SEQ ID NO11中給出。第一PCR引物組LKF 93(SEQID NO7)和LKR 1803(SEQ IDNO8)擴(kuò)增一個(gè)從驅(qū)動(dòng)蛋白基因5’末端的93堿基位置到3’位置中的位置1803bp的1.71kb片段。第二PCR引物組LKF 1527(SEQ ID NO9)和LKR3266(SEQID NO11)擴(kuò)增具有一個(gè)117bp串聯(lián)重復(fù)的1.15kb片段。該P(yáng)CR擴(kuò)增子在5’末端與擴(kuò)增的第一PCR產(chǎn)物具有276bp的重疊核苷酸。第三PCR引物組LKF 2564(SEQ ID NO10)和LKR 3266(SEQID NO11)擴(kuò)增免疫顯性117串聯(lián)重復(fù)區(qū)域。該第三引物組擴(kuò)增一個(gè)對(duì)應(yīng)于MHOM/IN/KE16/1998的第四個(gè)117bp串聯(lián)重復(fù)的大小為大約470bp的片段，和對(duì)應(yīng)于MHOM/IN/DD8的第五個(gè)串聯(lián)重復(fù)的大小為大約590bp的片段。所有的PCR產(chǎn)物如下所述的那樣被純化并且被克隆在pGEMTE克隆載體中，并在自動(dòng)DNA測(cè)序儀中測(cè)序。
通過(guò)使用不含氣溶膠(aerosol)的吸頭(pipette tips)并將前和后PCR產(chǎn)物分別保持，避免了擴(kuò)增子攜帶的污染。所有的PCR反應(yīng)都使用標(biāo)準(zhǔn)的方法操作(Sambrook等，1989)，并提供一組陰性對(duì)照。
10XTaq緩沖液 5.00μl10mM dNTPs 1.00μl正向引物(25μM) 1.00μl反向引物(25μM) 1.00μlTaq DNA聚合酶(5U/μl)0.25μl(Promega，USA)模板DNA 2.00μl無(wú)菌水將體積補(bǔ)充到 50.00μl將管保持在熱循環(huán)儀中(MJ Research，USA)并在95℃下溫育5分鐘，隨后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增。
將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中分析。將膠在紫外線投照器(UVP)下顯影并使用Polaroid照相機(jī)照像。
PCR擴(kuò)增后的驅(qū)動(dòng)蛋白基因被如下克隆到TA克隆載體中。將PCR擴(kuò)增的DNA在瓊脂糖凝膠上分解，并且用無(wú)菌解剖刀切下含目的帶的部分。使用膠洗脫試劑盒(Qiagen，德國(guó))，按照生產(chǎn)商的使用說(shuō)明書(shū)將DNA從膠上洗脫。洗脫DNA的濃度通過(guò)分光光度計(jì)中260nm處的吸光度測(cè)量。
將膠純化的PCR目的產(chǎn)物直接連接到pGEMT-Easy載體上。向1.5ml微量離心管中加入下列組分pGEM-T Easy1.00μl10X連接緩沖液 1.00μlDNA(200ng) 5.00μlT4DNA連接酶(2U/μl)1.00μl用水將體積補(bǔ)充到 10.00μl輕柔混合后，將管在4℃下孵育過(guò)夜并在70℃下加熱10分鐘。將樣品在-20℃下儲(chǔ)存直到轉(zhuǎn)化。
隨后用熱激處理轉(zhuǎn)化連接的混合物。通過(guò)使用氯化鈣方法制備感受態(tài)細(xì)胞[Sambrook等，1989]。將單個(gè)集落的大腸桿菌接種到5ml的LB培養(yǎng)基中并在37℃下振蕩(200rpm)培養(yǎng)過(guò)夜。第二天，將1ml的過(guò)夜培養(yǎng)物接種到新鮮原液的100ml LB培養(yǎng)基中，并在37℃下連續(xù)振蕩培養(yǎng)直到OD值達(dá)到600nm下的0.6。將培養(yǎng)物在冰上冷卻30分鐘并且用4000g、4℃下離心10分鐘收集細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀在1/10體積的冰冷的過(guò)濾的無(wú)菌50mM CaCl2中重懸并在冰上保持30分鐘。將細(xì)胞沉淀下來(lái)并最終重懸在1/25體積的冰冷的50mM CaCl2中(具有20％ V/V的高壓消毒的甘油)，并以200μl的等份儲(chǔ)存在-70℃或者立即使用于轉(zhuǎn)化。
將大約5μl的連接混合物輕柔地與感受態(tài)細(xì)胞(200μl)混合，并在冰上培養(yǎng)30分鐘。培養(yǎng)后，將細(xì)胞置于42℃的水浴中90秒(熱激)并立即轉(zhuǎn)移到冰上。將800μl的LB培養(yǎng)基加到細(xì)胞中并在37℃下振蕩(150rpm)保持90分鐘。將細(xì)胞與16μl的X-gal和10μl的1M的IPTG在含有50μl/ml氨卞青霉素的LB瓊脂平板上鋪板。將板在37℃下培育12-16小時(shí)。選擇白色的集落并檢查插入物。為了篩選，將質(zhì)粒用快速沸騰法分離[Holmes和Quigley，1981]。用無(wú)菌的牙簽挑選集落并接種在5ml的新鮮培養(yǎng)基中。沉淀生長(zhǎng)過(guò)夜的培養(yǎng)物并且將細(xì)胞重懸于500μl的STET緩沖液(蔗糖8％(w/v)，Tris-HCl，(pH 8.0)，50mM，EDTA Na2，(pH 8.0)50mM，Triton-X 100 5％(w/v)中，隨后用40μl的溶菌酶裂解。將混合物充分混懸并在沸騰的水浴中培育90秒鐘。通過(guò)在12000g離心10分鐘來(lái)移除細(xì)菌碎片和染色體DNA。將上清液與400μl的異丙醇和200μl的7.5M醋酸銨混合。離心沉淀質(zhì)粒DNA。將干燥的沉淀重懸于100μl無(wú)菌水中，與50μl7.5M的醋酸銨混合，并在冰上培育30分鐘。將樣品在4℃下離心10分鐘并且用乙醇沉淀質(zhì)粒DNA。離心后得到的純DNA沉淀被70％的乙醇清洗兩遍，干燥，并溶解在50μl的無(wú)菌水中。
使用載體多個(gè)克隆位點(diǎn)兩側(cè)的合適的限制性酶位點(diǎn)對(duì)重組體質(zhì)粒進(jìn)行限制性酶切分析。反應(yīng)設(shè)置如下質(zhì)粒DNA 8.00μl(2μg)10X反應(yīng)緩沖液2.00μlRNA酶A(10mg/ml) 5.00μl限制性酶 5單位無(wú)菌水補(bǔ)充體積到20.00μl將反應(yīng)在37℃下培育6-8小時(shí)并在1.5％的瓊脂糖凝膠上與標(biāo)準(zhǔn)的分子量標(biāo)記一起對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析。限制性消化檢測(cè)到的含有插入物的陽(yáng)性克隆被用于測(cè)序并保存為甘油貯存液。
在ABI Prism7.0版的自動(dòng)DNA測(cè)序儀中，通過(guò)鏈終止法[Sanger等，1977]進(jìn)行所有的測(cè)序。使用不同的軟件如DNASIS，Lasergeneedit；Megalign等(DNA star Inc.)，Clustal W(各種序列文件的多比對(duì))對(duì)序列進(jìn)行分析。使用Seqman II(Lasergene包)將所有得到的序列進(jìn)行比對(duì)以形成連續(xù)的伸展。同時(shí)，使用來(lái)自不同網(wǎng)站BLAST[Altschul等，1997]選項(xiàng)查詢序列的同源性。
在序列組裝后，所得到全長(zhǎng)驅(qū)動(dòng)蛋白序列被呈現(xiàn)在株MHOM/IN/DD8的SEQ ID NO1中，發(fā)現(xiàn)其長(zhǎng)度為3016bp并具有2670bp的開(kāi)放閱讀框。發(fā)現(xiàn)株MHOM/IN/KE16/1998的長(zhǎng)度為2937bp并具有2577bp的長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框(SEQ ID NO2)。對(duì)于株MHOM/IN/DD8(圖1)，序列分析揭示擴(kuò)增免疫顯性區(qū)域的PCR產(chǎn)物的大小為563bp，相應(yīng)于4.8個(gè)117bp的串聯(lián)重復(fù)(相應(yīng)于4.8單位的39氨基酸重復(fù))；對(duì)于株MHOM/IN/KE16/1998(圖2)，其大小為466bp，相應(yīng)于4個(gè)117bp的串聯(lián)重復(fù)(相應(yīng)于4單位的39氨基酸重復(fù))。
另外，序列分析顯示了在DNA水平以及預(yù)測(cè)氨基酸序列與恰氏利什曼原蟲(chóng)序列的顯著不同。株MHOM/IN/DD8顯示了與恰氏利什曼原蟲(chóng)序列以及株MHOM/IN/KE16/1998的明顯不同。使用基因庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)的非-多余(non-redundant)和專利部Blast搜索株MHOM/IN/DD8(SEQ ID NO5)的預(yù)測(cè)蛋白序列，結(jié)果揭示其分別只有與公布的恰氏利什曼原蟲(chóng)序列和美國(guó)專利號(hào)i)US5411865和ii)US 5912166序列的38％的同一性(圖3)。
在核苷酸水平上對(duì)杜氏利什曼原蟲(chóng)株MHOM/IN/DD8和MHOM/IN/KE16/1998(SEQ ID NO3和SEQ ID NO4)與恰氏利什曼原蟲(chóng)之間的免疫顯性重復(fù)區(qū)域進(jìn)行了Clustal W多重序列比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)圖4。相同部分為暗陰影。杜氏利什曼原蟲(chóng)(SEQID NO5和SEQ ID NO6)和恰氏利什曼原蟲(chóng)的免疫顯性重復(fù)區(qū)域的氨基酸水平多重序列比對(duì)見(jiàn)圖5。杜氏利什曼原蟲(chóng)株MHOM/IN/DD8(SEQID NO5)和恰氏利什曼原蟲(chóng)的免疫顯性重復(fù)區(qū)域的氨基酸水平多重序列比對(duì)見(jiàn)圖6。兩個(gè)杜氏利什曼原蟲(chóng)株MHOM/IN/DD8和MHOM/IN/KE16/1998(SEQID NO5和SEQ ID NO6)的免疫顯性重復(fù)區(qū)域的氨基酸水平多重序列比對(duì)見(jiàn)圖7。杜氏利什曼原蟲(chóng)，株MHOM/IN/DD8和MHOM/IN/KE16/1998(SEQ ID NO5和SEQ ID NO6)的印度分離株的具有內(nèi)重復(fù)變化的免疫顯性39氨基酸重復(fù)單元見(jiàn)圖8和圖9。序列分析顯示氨基酸變化很大，在報(bào)道的恰氏利什曼原蟲(chóng)的39氨基酸序列的許多位置具有許多保守的和變化的取代。至少杜氏利什曼原蟲(chóng)的5個(gè)氨基酸與恰氏利什曼原蟲(chóng)的不同，不同的位置在18，27，29，32和38，在下面的表1中用“*”表示。
在分析序列insilico后，我們發(fā)現(xiàn)在株MHOM/IN/DD8的免疫顯性區(qū)域與恰氏利什曼原蟲(chóng)的區(qū)域的氨基酸序列有一個(gè)明顯變化。而后，為了確認(rèn)是否該序列變化引起了對(duì)抗原檢測(cè)抗利什曼原蟲(chóng)抗體性能的任何影響，我們將來(lái)自大腸桿菌表達(dá)載體pRSET(Invitrogen)中的兩個(gè)印度杜氏利什曼原蟲(chóng)分離株的免疫顯性區(qū)域表達(dá)為6X-His標(biāo)記的蛋白。我們已經(jīng)表達(dá)了各種免疫顯性重復(fù)組合象1，2，3，4，4.8個(gè)單位和上游于免疫顯性結(jié)構(gòu)域的889個(gè)核苷酸的一個(gè)重復(fù)。我們發(fā)現(xiàn)具有4和4.8重復(fù)單元的重組多肽具有較高的靈敏性和特異性。因此，我們的工作集中在含有39氨基酸的4.0和4.8重復(fù)單元的多肽上。
大腸桿菌表達(dá)載體pRSET C(Invitrogen，荷蘭)被PstI和NcoI限制性酶在37℃下過(guò)夜消化完全。將被消化的質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠上分解以移除填充片段。將質(zhì)粒帶切下來(lái)并用Qiagen膠洗脫系統(tǒng)清洗，并在-20℃儲(chǔ)存直到使用。
通過(guò)將其用PstI和NcoI消化，將插入物從攜帶免疫顯性串聯(lián)重復(fù)的重組體pGEM-TE質(zhì)粒(pGEM-TEasy/DD8/LKF2564和pGEM-TEasy/KE16/LKF2564)中釋放。將插入物從膠切割下來(lái)，用Qiagen膠洗脫系統(tǒng)洗脫并在PstI和NcoI消化的pRSET C載體內(nèi)框(in-frame)中連接，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的方法[Sambrook等，1989]將其轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞。在氨芐青霉素板上選擇克隆，分離質(zhì)粒DNA，并用PstI和NcoI消化來(lái)檢查插入物。這些釋放插入物克隆被選擇用于蛋白誘導(dǎo)。
表1

而后，將含有插入物的單個(gè)重組體大腸桿菌(BL21)集落接種到2ml的含有氨芐青霉素(50μg/ml)的SOB中并在37℃振蕩(225rpm)培育過(guò)夜。第二天，將25ml的SOB接種到過(guò)夜的培養(yǎng)物中并使其在37℃的振蕩條件下生長(zhǎng)直到0.6的OD600。移除1ml等份的細(xì)胞，離心并在-20℃冷凍。將IPTG加入到培養(yǎng)物中使終濃度為1mM并在37℃振蕩培育。通過(guò)在IPTG誘導(dǎo)后1，2，3，4和5小時(shí)取得等份的細(xì)胞、SDS-PAGE分析和蛋白印跡來(lái)表達(dá)一個(gè)時(shí)間段以確定最大程度蛋白表達(dá)的最佳誘導(dǎo)時(shí)間。另外，為了確定蛋白的可溶性，將含有插入物的單個(gè)重組體大腸桿菌(BL21)集落接種到含有氨芐青霉素(50μg/ml)的2ml SOB中并在37℃振蕩(225rpm)培育過(guò)夜。第二天，將25ml的SOB接種到過(guò)夜的培養(yǎng)物中并使其在37℃的振蕩條件下生長(zhǎng)直到0.6的OD600。移除1ml等份的細(xì)胞，離心并在-20℃冷凍。向培養(yǎng)物中加入IPTG至1mM的終濃度并在37℃振蕩培養(yǎng)另外的4小時(shí)。通過(guò)在4000×g下離心20分鐘來(lái)收集細(xì)胞，將沉淀重懸在裂解緩沖液中于天然條件下純化(Qiagen，德國(guó))，并且用超聲處理裂解(在200-300W下的6×10s，具有10s的間歇)。將裂解物在10,000×g下的冷凍離心機(jī)中離心10分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到新的管中并且將沉淀重懸在裂解液中并保存在冰上。將沉淀和上清液分別用2×SDS-PAGE樣品緩沖液混合，并使用12％的SDS-PAGE和蛋白印跡分析。結(jié)果顯示該蛋白在可溶的部分中是檢測(cè)得到的并且因此可以在天然條件下純化。
將最大的產(chǎn)生蛋白的克隆接種到20ml含有100μg/ml氨芐青霉素的SOB中并在37℃劇烈振蕩生長(zhǎng)過(guò)夜。第二天，向1升SOB接種1∶50的非誘導(dǎo)的過(guò)夜培養(yǎng)物，并使其在37℃的振蕩條件下生長(zhǎng)直到0.6的OD600。誘導(dǎo)前立刻取5ml等份的培養(yǎng)物。通過(guò)加入IPTG至1mM終濃度并在37℃繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞。通過(guò)在4000×g下離心20分鐘來(lái)收集細(xì)胞，并在-20℃存儲(chǔ)直到純化。
使用Ni-NTA瓊脂糖柱(Qiagen，德國(guó))在天然條件下按照生產(chǎn)商的說(shuō)明對(duì)重組體蛋白進(jìn)行純化。將細(xì)胞沉淀在冰上融化15分鐘并以5ml每克濕重重懸在裂解緩沖液中。加入1mg/ml的溶菌酶并在冰上培育30分鐘，并在冰上使用6個(gè)200-300W的10s的脈沖超聲處理，每個(gè)脈沖間有10s的冷卻期。將裂解物在10,000xg下4℃下離心30分鐘以沉淀細(xì)胞碎片。保存上清液。取50μl等份的上清液并儲(chǔ)存在-20℃用于以后分析。將1ml的50％Ni-NTA混懸液加入到4ml澄清的裂解液中并通過(guò)在4℃振蕩(200rpm在旋轉(zhuǎn)振動(dòng)器上)60分鐘輕柔混合。將裂解物-Ni-NTA混合物上載到底部出口加帽的柱上。在移去底部的帽后，收集流過(guò)物，并用4ml的清洗緩沖液將柱子清洗兩次，收集餾分用于SDS-PAGE分析。用0.5ml的洗脫緩沖液將蛋白洗脫4次，將洗脫物收集在4個(gè)管中并用SDS-PAGE分析。發(fā)現(xiàn)純化后的蛋白表達(dá)為4mg/L。
為了分析表達(dá)的蛋白，使用迷你膠電泳單元(Bangalore Genei，印度)。依照確定的方案進(jìn)行SDS-PAGE[Laemmeli，1970]。通過(guò)混合下列的組分制備10％的分離膠2.66ml的水，1.562ml 30％的丙烯酰胺，1.250ml 1.5M的Tris-HCl，50μl 10％的APS，10％的TEMED。膠頂有～400μl的水飽和的丁醇并允許聚合。聚合以后，將丁醇引流出并用蒸餾水清洗。而后，將2ml的積層膠混合物(1.25ml水，250μl 30％的丙烯酰胺，500μl 0.5M的Tris-HCl，30μl 10％的APS和5μl TEMED)仔細(xì)地倒出，避免分離膠頂端產(chǎn)生任何氣泡。將梳子插入到積層膠部分并使其聚合。聚合后，用過(guò)量的水清洗孔。將樣品應(yīng)用到積層膠的確定的孔中，以恒定的電壓(60V對(duì)積層膠并且100V對(duì)分離膠)進(jìn)行電泳。標(biāo)準(zhǔn)分子蛋白標(biāo)記(MBI)和對(duì)照(載體蛋白)與樣品并排跑膠。隨后將完成的膠用考馬斯亮蘭進(jìn)行染色，去染，和白光下顯影。
來(lái)自株MHOM/IN/DD8的純化的蛋白以29kDa的大小對(duì)應(yīng)于預(yù)測(cè)分子量進(jìn)行遷移，株MHOM/IN/KE16/1998的預(yù)測(cè)分子量是26kDa，但是來(lái)自該株的純化的蛋白具有異常的PAGE遷移性并且以更高的大約為32kDa的分子量遷移(圖10a)。報(bào)道的抗原與恰氏利什曼原蟲(chóng)的230kDa抗原全然不同?？乖兓@著，超過(guò)60％的預(yù)測(cè)氨基酸序列與來(lái)自恰氏利什曼原蟲(chóng)的K39重復(fù)抗原的序列有差別。同樣公開(kāi)的是編碼29kD和26kD抗原的DNA，以及包含該抗原的治療組合物和疫苗組合物。
株MHOM/IN/DD8和MHOM/IN/KE16/1998的純化的重組體多肽被用來(lái)在兔中免疫。用等體積的弗氏完全佐劑(Sigma，USA)乳化100毫克的每種多肽。在多個(gè)位點(diǎn)將混合物皮內(nèi)注射。以30天的間隔給予三個(gè)加強(qiáng)劑量的相同量的被弗氏不完全佐劑乳化的抗原。第一次免疫前，收集免疫前血清并在蛋白印跡上測(cè)試。最后一次加強(qiáng)免疫后，從免疫的動(dòng)物無(wú)菌收集血液，分離血清并在-70℃下儲(chǔ)存直到使用。
將大腸桿菌表達(dá)的蛋白在12％的SDS-PAGE上分解，隨后電轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上[Towbin等，1976]。在Bio-Rad半干轉(zhuǎn)移單位中，使用轉(zhuǎn)移緩沖液(Tris堿3.08g，甘氨酸14.66g，甲醇200ml，加水到1000ml的終體積)執(zhí)行轉(zhuǎn)移。對(duì)于轉(zhuǎn)移，應(yīng)用15V并使其在室溫下跑45分鐘。轉(zhuǎn)移后，將膜放入含有2.5％BSA的磷酸鹽緩沖液(PBS，NaCl 8.00g，KCl0.20g，NaH2PO41.44g，KH2PO40.24g，pH 7.4)的封閉液中。用含有0.02％吐溫-20(PBS-T)的PBS清洗封閉的膜3次。將膜與黑熱病患者的血清(在PBS中1∶200稀釋)在25℃培育1小時(shí)。此外，在PBS-T中將其清洗4次并且在1∶4000稀釋的抗人IgG抗體中培育，與堿性磷酸酶室溫下綴合45分鐘。用PBS清洗幾次后，通過(guò)加入BCIP-NBT(Amresco，USA)對(duì)膜進(jìn)行顯影。
將純化的抗原首先在SDS-PAGE上跑膠并隨后用五-抗-his HRP綴合抗體進(jìn)行免疫印跡(圖10a和10b)。為了研究純化蛋白的抗原性，SDS-PAGE后用黑熱病患者的血清(圖11a和11b)和PKDL患者的血清(圖12a和12b)進(jìn)行免疫印跡，隨后用合并的(n＝5)健康個(gè)體血清作為對(duì)照進(jìn)行蛋白印跡并示于圖13a和13b。同樣，如圖14a和14b進(jìn)行只有AP標(biāo)記的抗人第二抗體的免疫印跡。免疫印跡和序列分析的結(jié)果揭示盡管具有不同的表位，杜氏利什曼原蟲(chóng)的重組體抗原氏特異的。
在用BCA方法(Sigma)進(jìn)行蛋白評(píng)價(jià)后，取純化的抗原用于ELISA評(píng)價(jià)。用適當(dāng)?shù)难搴驮噭?duì)照將ELISA最初以不同的參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化。最佳選擇50ng/孔和1∶100血清稀釋的ELISA并且相同的條件被用于2個(gè)來(lái)自杜氏利什曼原蟲(chóng)即MHOM/IN/DD8和MHOM/IN/KE16/1998的抗原進(jìn)行ELISA。每個(gè)板中包括一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照(寄生蟲(chóng)學(xué)和血清學(xué)上rK39陽(yáng)性)和一個(gè)來(lái)自非地方流行性地區(qū)的陰性對(duì)照，和另一個(gè)試劑對(duì)照。板被如下包被；按照僅被少許改動(dòng)的標(biāo)準(zhǔn)方法[Singh S等，1995]，通過(guò)將50ng的純化的驅(qū)動(dòng)蛋白加入200μl 0.1M的重碳酸鹽緩沖液(pH 9.2)，用抗原包被具有96個(gè)平底孔的聚苯乙烯微滴度板。蓋上該板并于4℃過(guò)夜溫育。隨后移除抗原溶液并且用PBST(帶有0.05％吐溫20的PBS)清洗板3次。隨后用200μl的1％的BSA封閉孔1小時(shí)，用PBST清洗3次。將板在室溫下干燥，密封，并在4℃下儲(chǔ)存直到使用。將敏化的板用50μl的從1∶100到終點(diǎn)稀釋于PBST中的患者血清培育2小時(shí)。再次用PBST清洗孔并與50μl綴合了堿性磷酸酶的山羊抗人IgG以其10-3稀釋度培育另外的2小時(shí)，隨后用PBST清洗3次。在37℃與50μl二乙基胺緩沖液中的p-硝基苯基磷酸鹽(酯)中培育30分鐘后，用50μl的3N NaOH終止反應(yīng)。在Tritrius板讀數(shù)儀中在450nm處測(cè)量每個(gè)孔的光密度。對(duì)于同組的樣品，對(duì)來(lái)自MHOM/IN/DD8(SEQID NO5)的重組蛋白的抗體滴度要遠(yuǎn)小于MHOM/IN/KE16/1998(SEQ ID NO6)。用72個(gè)地方流行性的和非地方流行性的健康對(duì)照，92個(gè)結(jié)核桿菌陽(yáng)性，32個(gè)HIV陽(yáng)性，31個(gè)HCV陽(yáng)性和27個(gè)HbsAg陽(yáng)性血清的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示沒(méi)有交叉反應(yīng)性。但是以前確定的10個(gè)VL病例和10個(gè)PKDL病例的血清的rK39陽(yáng)性顯示兩種抗原在50ng/孔濃度均有高的抗體滴度。該數(shù)據(jù)顯示，這兩個(gè)良好表征的來(lái)自印度株的抗原將對(duì)印度黑熱病的診斷非常有益。
圖15描述了不同樣品經(jīng)過(guò)使用純化的MHOM/IN/DD8源抗原的ELISA的平均滴度值。圖16顯示了不同組樣品對(duì)純化的MHOM/IN/KE16/1998源抗原的平均滴度值。
使用抗體檢測(cè)利什曼原蟲(chóng)抗原從株SEQID NO5和SEQ ID NO6純化的重組體多肽被用于兔中的免疫。用等體積的弗氏完全佐劑(Sigma，USA)乳化100毫克的每種多肽。在多個(gè)位點(diǎn)將混合物皮內(nèi)注射。以30天的間隔給予三個(gè)加強(qiáng)劑量的相同量的被弗氏不完全佐劑乳化的抗原。第一次免疫前，收集免疫前血清并在蛋白印跡上測(cè)試。最后一次加強(qiáng)免疫后12天，從免疫的動(dòng)物無(wú)菌收集血液，分離血清并且血清中的抗體被親和純化并在4℃儲(chǔ)存直到使用。
具有96個(gè)孔的聚苯乙烯微量滴度板被如下包被在包被緩沖液(pH 9.2)[1.59g碳酸鈉(Na2CO3)，2.93g重碳酸鈉(NaHCO3)，0.20g疊氮化鈉(NaN3)，溶解在900ml H2O中，用HCl調(diào)節(jié)pH到9.6，并補(bǔ)充到1L]中稀釋儲(chǔ)存在4℃的抗體，并且在微量滴度板的每個(gè)孔中加入200μl。將板在37℃下培育4小時(shí)并用PBST清洗3次。通過(guò)在綿紙上上下輕扣使板干燥。隨后將包被到固體支持物上的抗體用來(lái)檢測(cè)利什曼原蟲(chóng)抗原，該方法稱為雙抗體或者夾心ELISA，并且如下進(jìn)行操作。向每個(gè)孔中加入200μl等份的測(cè)試樣品并且在37℃下培育4小時(shí)，將板用PBST清洗三次，并隨后與抗體綴合物一起培育，在37℃下培育2小時(shí)，用PBST清洗3次，向每個(gè)孔加入200μl等份的底物，在室溫下培育60分鐘。在405nm下在Tritrius板讀數(shù)儀中測(cè)量每個(gè)孔的光密度。夾心ELISA測(cè)量?jī)蓪涌贵w之間的抗原的量。要測(cè)定的利什曼原蟲(chóng)抗原含有至少兩個(gè)抗原位點(diǎn)，其能夠與抗體結(jié)合，這是由于至少兩個(gè)抗體在該夾心中發(fā)揮作用。這樣的夾心測(cè)試限制于多價(jià)抗原如蛋白質(zhì)或者多糖的定量。用于抗原定量的夾心ELISA在抗原濃度低和/或抗原被包含在高污染濃度的蛋白中的時(shí)候特別有用。
以下實(shí)施例描述了本發(fā)明，其不能解釋為限制了本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1該實(shí)施例闡述了從杜氏利什曼原蟲(chóng)的印度分離株克隆驅(qū)動(dòng)蛋白免疫顯性重復(fù)區(qū)域。PCR克隆策略如下使用引物組LKF 2564和LKR 3266(分別為SEQ ID NO10和SEQ ID NO11)擴(kuò)增免疫顯性117串聯(lián)重復(fù)區(qū)域。該引物組擴(kuò)增了一個(gè)大小約為470bp的片段和一個(gè)大小約為590bp的產(chǎn)物，前者相應(yīng)于杜氏利什曼原蟲(chóng)株MHOM/IN/KE16/1998的4個(gè)117bp串聯(lián)重復(fù)，后者相應(yīng)于來(lái)自杜氏利什曼原蟲(chóng)株MHOM/IN/DD8的5個(gè)免疫顯性串聯(lián)重復(fù)。將PCR擴(kuò)增后的驅(qū)動(dòng)蛋白基因如下克隆到TA克隆載體中。將PCR擴(kuò)增的DNA在瓊脂糖膠上分離，用無(wú)菌解剖刀將含有目的帶的部分切下。用膠洗脫試劑盒(Qiagen，德國(guó))按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)將DNA從膠中洗脫。在分光光度計(jì)中的260nm吸光度處測(cè)定洗脫DNA的濃度。
將膠純化的PCR目的產(chǎn)物直接連接到pGEMT-Easy載體(Promega，USA)上。向1.5ml微量離心管中加入下列組分pGEM-T Easy(100ng/μl) 1.00μl10X連接緩沖液 1.00μlDNA(200ng) 5.00μlT4DNA連接酶(2U/μl) 1.00μl用水將體積補(bǔ)充到10.00μl
輕柔混合后，將管在4℃下孵育過(guò)夜并在70℃下加熱10分鐘。將樣品在-20℃下儲(chǔ)存直到轉(zhuǎn)化。
隨后用熱激處理轉(zhuǎn)化連接的混合物。通過(guò)使用氯化鈣方法制備感受態(tài)細(xì)胞[Sambrook等，1989]。將單個(gè)集落的大腸桿菌接種到5ml的LB培養(yǎng)基中并在37℃下振蕩(200rpm)培養(yǎng)過(guò)夜。第二天，將1ml的過(guò)夜培養(yǎng)物接種到新鮮原液的100mlLB培養(yǎng)基中，并在37℃下連續(xù)振蕩培養(yǎng)直到OD值達(dá)到600nm下的0.6。將培養(yǎng)物在冰上冷卻30分鐘并且用4000g、4℃下離心10分鐘收集細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀重懸在1/10體積的冰冷的過(guò)濾的無(wú)菌50mM CaCl2中并在冰上保持30分鐘。將細(xì)胞沉淀下來(lái)并最終重懸在1/25體積的冰冷的50mM CaCl2中(具有20％ V/V的高壓消毒的甘油)，并以200μl的等份儲(chǔ)存在-70℃或者立即使用于轉(zhuǎn)化。
將大約5μl的連接混合物輕柔地與感受態(tài)細(xì)胞(200μl)混合，并在冰上培養(yǎng)30分鐘。培養(yǎng)后，將細(xì)胞置于42℃的水浴中90秒(熱激)并立即轉(zhuǎn)移到冰上。將800μl的LB培養(yǎng)基加到細(xì)胞中并在37℃下振蕩(150rpm)保持90分鐘。將細(xì)胞與16μl的X-gal和10μl的1M的IPTG在含有50μl/ml氨卞青霉素的LB瓊脂平板上鋪板。將板在37℃下培育12-16小時(shí)。選擇白色的集落并檢查插入物。通過(guò)限制性圖譜和測(cè)序來(lái)進(jìn)一步表征重組體克隆。所有的測(cè)序是通過(guò)鏈終止法在ABI Prism7.0版的自動(dòng)DNA測(cè)序儀中完成的[Sanger等，1997]。使用不同的軟件如DNASIS，Lasergeneedit；Megalign等(DNA star Inc.)，Clustal W(各種序列文件的多重比對(duì))對(duì)序列進(jìn)行分析。使用Seqman II(Lasergene包)將所有得到的序列進(jìn)行比對(duì)以形成連續(xù)的伸展。
同時(shí)，使用來(lái)自不同網(wǎng)站BLAST[Altschul等，1997]選項(xiàng)查詢序列的同源性。
在序列組裝后，所得到全長(zhǎng)驅(qū)動(dòng)蛋白序列被呈現(xiàn)在株MHOM/IN/DD8的SEQ ID NO1中，發(fā)現(xiàn)其長(zhǎng)度為3016bp并具有2670bp的開(kāi)放閱讀框。發(fā)現(xiàn)株MHOM/IN/KE16/1998的序列長(zhǎng)度為2937bp并具有2577bp的長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框(SEQ ID NO2)。對(duì)于株MHOM/IN/DD8(圖1)，序列分析揭示擴(kuò)增免疫顯性區(qū)域的PCR產(chǎn)物的大小為563bp，相應(yīng)于4.8個(gè)117bp的串聯(lián)重復(fù)；對(duì)于株MHOM/IN/KE16/1998(圖2)，其大小為466bp，相應(yīng)于4個(gè)117bp的串聯(lián)重復(fù)。
另外，序列分析顯示了在DNA水平以及預(yù)測(cè)氨基酸序列與報(bào)道的恰氏利什曼原蟲(chóng)序列(基因庫(kù)，入藏登記號(hào)L07879)的顯著不同。株MHOM/IN/DD8顯示了與恰氏利什曼原蟲(chóng)序列以及株MHOM/IN/KE16/1998的明顯不同。使用基因庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)的非-多余和專利部Blast搜索株MHOM/IN/DD8的預(yù)測(cè)蛋白序列(SEQ ID NO5)，結(jié)果揭示其分別只有與公布的恰氏利什曼原蟲(chóng)序列和美國(guó)專利號(hào)i)US5411865和ii)US 5912166序列的38％的同一性(圖3)。
對(duì)杜氏利什曼原蟲(chóng)株MHOM/IN/DD8和MHOM/IN/KE16/1998(SEQID NO3和SEQ ID NO4)與恰氏利什曼原蟲(chóng)(基因庫(kù)，入藏登記號(hào)L07879)之間的免疫顯性重復(fù)區(qū)域進(jìn)行了Clustal W多重序列比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)圖4。相同部分為暗陰影。杜氏利什曼原蟲(chóng)(SEQID NO5和SEQ ID NO6)和恰氏利什曼原蟲(chóng)的免疫顯性重復(fù)區(qū)域的氨基酸水平多重序列比對(duì)見(jiàn)圖5。杜氏利什曼原蟲(chóng)株MHOM/IN/DD8(SEQID NO5)和恰氏利什曼原蟲(chóng)的免疫顯性重復(fù)區(qū)域的氨基酸水平多重序列比對(duì)見(jiàn)圖6。兩株杜氏利什曼原蟲(chóng)株MHOM/IN/DD8和MHOM/IN/KE16/1998(SEQID NO5和SEQ IDNO6)的免疫顯性重復(fù)區(qū)域的氨基酸水平的序列比對(duì)見(jiàn)圖7。杜氏利什曼原蟲(chóng)的印度分離株，株MHOM/IN/DD8和MHOM/IN/KE16/1998(SEQ IDNO5和SEQ ID NO6)的具有內(nèi)重復(fù)變化的免疫顯性39氨基酸重復(fù)單元見(jiàn)圖8和圖9。序列分析顯示氨基酸變化很大，具有許多取代。在報(bào)道的恰氏利什曼原蟲(chóng)的39氨基酸重復(fù)區(qū)的許多位置具有許多保守的和變化的取代。至少杜氏利什曼原蟲(chóng)的5個(gè)氨基酸與恰氏利什曼原蟲(chóng)的不同，不同的位置在18，27，29，32和38并且在下面的表1中用“*”表示。
實(shí)施例2該實(shí)施例闡述了患者血清對(duì)識(shí)別重組體杜氏利什曼原蟲(chóng)抗原的反應(yīng)性。通過(guò)用PstI和NcoI消化，將插入物從攜帶免疫顯性串聯(lián)重復(fù)的重組體pGEM-TE質(zhì)粒(pGEM-TEasy/DD8/LKF2564和pGEM-TEasy/KE16/LKF2564)中釋放。將插入物從膠切割下來(lái)，用Qiagen膠洗脫系統(tǒng)洗脫并在PstI和NcoI消化的pRSET C載體內(nèi)框中連接，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的方法[Sambrook等，1989]將其轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞。在氨芐青霉素板上選擇克隆，分離質(zhì)粒DNA，并用PstI和NcoI消化來(lái)檢查插入物。這些釋放插入物克隆被選擇用于蛋白表達(dá)。將最大的產(chǎn)生蛋白的克隆接種到20ml的含有100μg/ml氨芐青霉素的SOB培養(yǎng)基中并在37℃劇烈振蕩生長(zhǎng)過(guò)夜。第二天，將1升SOB培養(yǎng)基與1∶50的非誘導(dǎo)的過(guò)夜培養(yǎng)物接種，并使其在37℃的振蕩條件下生長(zhǎng)直到0.6的OD600。誘導(dǎo)前立刻取5ml等份的培養(yǎng)物。通過(guò)加入IPTG至終濃度為1mM并在37℃繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞。通過(guò)在4000×g下離心20分鐘來(lái)收集細(xì)胞，并在-20℃存儲(chǔ)直到純化。在天然條件下按照生產(chǎn)商的使用說(shuō)明用Ni-NTA瓊脂糖柱(Qiagen，德國(guó))純化重組體多肽。來(lái)自株MHOM/IN/DD8的純化的蛋白以29kDa的大小對(duì)應(yīng)于預(yù)測(cè)分子量進(jìn)行遷移(圖10a，泳道2)。將純化的抗原首先在SDS-PAGE上跑(圖10a，11a，12a和13a)并隨后用五-抗-his HRP綴合抗體(圖10b)，黑熱病患者的血清(圖11b)，PKDL患者的血清(圖12b)進(jìn)行免疫印跡，隨后用合并的(n＝5)健康個(gè)體血清進(jìn)行蛋白印跡(圖13b)，進(jìn)行只有AP標(biāo)記的抗人第二抗體的蛋白印跡(圖14b)。免疫印跡和序列分析的結(jié)果揭示盡管具有不同的表位，杜氏利什曼原蟲(chóng)的重組體抗原是特異的。
實(shí)施例3該實(shí)施例闡述了患者血清對(duì)識(shí)別杜氏利什曼原蟲(chóng)抗原的反應(yīng)性。用BCA方法(Sigma)進(jìn)行蛋白評(píng)價(jià)，并且純化的抗原被用于ELISA。用適當(dāng)?shù)难搴驮噭?duì)照將ELISA最初以不同的參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化。最佳選擇50ng/孔和1∶100血清稀釋的ELISA并且相同的條件被用于2個(gè)來(lái)自杜氏利什曼原蟲(chóng)即MHOM/IN/DD8(SEQID NO5)和MHOM/IN/KE16/1998(SEQ IDNO6)的重組多肽進(jìn)行ELISA。每個(gè)板中包括一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照(寄生蟲(chóng)學(xué)和血清學(xué)上rK39陽(yáng)性)和一個(gè)來(lái)自非地方流行性地區(qū)的陰性對(duì)照，和另一個(gè)試劑對(duì)照。板被如下包被布；按照僅被少許改動(dòng)的報(bào)道方法[Singh S等，2002]，通過(guò)將50ng的純化的驅(qū)動(dòng)蛋白抗原加入200μl 0.1M的重碳酸鹽緩沖液(pH 9.2)，用抗原包被具有96個(gè)平底孔的聚苯乙烯微滴度板。板被覆蓋并在4℃下培養(yǎng)過(guò)夜。隨后移除抗原溶液并且用PBST(帶有0.05％吐溫20的PBS)清洗板3次。隨后用200μl的1％的BSA封閉孔1小時(shí)，用PBST清洗3次。將板在室溫下干燥，密封，并在4℃下儲(chǔ)存直到使用。將敏化的板用50μl的從1∶100到終點(diǎn)稀釋在PBST中的患者血清培育2小時(shí)。用PBST清洗孔3次并與50μl綴合了堿性磷酸酶的山羊抗人IgG以其10-3稀釋物培育另外的2小時(shí)，隨后用PBST清洗3次。在37℃與50μl二乙基胺緩沖液中的p-硝基苯基磷酸鹽(酯)中培育30分鐘后，用50μl的3N NaOH終止反應(yīng)。在Tritrius板讀數(shù)儀中在450nm處測(cè)量每個(gè)孔的光密度。對(duì)于同組的樣品，對(duì)來(lái)自MHOM/IN/DD8(SEQID NO5)的重組蛋白的抗體滴度要遠(yuǎn)小于MHOM/IN/KE16/1998(SEQ ID NO6)的抗體滴度。用72個(gè)地方流行性的和80個(gè)非地方流行性的健康對(duì)照，92個(gè)結(jié)核桿菌陽(yáng)性，32個(gè)HIV陽(yáng)性，31個(gè)HCV陽(yáng)性和27個(gè)HBsAg陽(yáng)性個(gè)體血清進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。這些ELISA結(jié)果顯示了100％的特異性而沒(méi)有交叉反應(yīng)性。但是，對(duì)確證的帶有rK39抗原的VL(N＝10)和PKDL(N＝10)患者的血清，所進(jìn)行的ELISA顯示對(duì)50ng/孔濃度的所有3種抗原高的抗體滴度，所述的三種rK39抗原來(lái)自恰氏利什曼原蟲(chóng)(Burns et al.，1993)、杜氏利什曼原蟲(chóng)的株MHOM/IN/DD8(SEQ ID NO5)和MHOM/IN/KE16/1998(SEQ ID NO6)。該數(shù)據(jù)顯示，這兩個(gè)良好表征的來(lái)自印度株的抗原對(duì)印度黑熱病診斷的具有高度的特異性和敏感性。在對(duì)更多樣品進(jìn)行的研究中發(fā)現(xiàn)，用恰氏利什曼原蟲(chóng)的rK39無(wú)法診斷的許多病例被這兩種來(lái)自杜氏利什曼原蟲(chóng)的重組多肽檢測(cè)了出來(lái)。這揭示從杜氏利什曼原蟲(chóng)的印度株中新分離的重組多肽對(duì)診斷印度VL和PKDL更為特異，因此，其可以被用于該疾病的廣泛診斷。
但是，在圖15和16中只提供了關(guān)于10個(gè)陽(yáng)性樣品和其它對(duì)照樣品的數(shù)據(jù)。圖15描述了不同樣品經(jīng)過(guò)使用純化的MHOM/IN/DD8源抗原ELISA的平均滴度值。圖16顯示了不同組樣品對(duì)純化的MHOM/IN/KE16/1998源抗原的平均滴度值。
實(shí)施例4該實(shí)施例教導(dǎo)了從動(dòng)物中獲得針對(duì)多肽SEQ ID NO5或者SEQ IDNO6的抗體，以及其在檢測(cè)利什曼原蟲(chóng)抗體中的應(yīng)用如下。
1.來(lái)自含有SEQ ID NO5和SEQ ID NO6的組中純化的重組體多肽被用于免疫兔。用等體積的弗氏完全佐劑(Sigma，USA)乳化100毫克的多肽。
2.在多個(gè)位點(diǎn)將混合物皮內(nèi)注射。
3.以30天的間隔給予三個(gè)加強(qiáng)劑量的相同量的被弗氏不完全佐劑乳化的抗原。第一次免疫前，收集免疫前血清并在蛋白印跡上測(cè)試。
4.最后一次加強(qiáng)免疫后，從免疫的動(dòng)物無(wú)菌收集血液，分離血清并親和純化血清中存在的抗-抗體，并在4℃下儲(chǔ)存直到使用。
5.將抗體首先用0.1M的重碳酸鹽緩沖液稀釋，pH9.2，并且隨后向每個(gè)微量滴度板的孔中加入200μl。
6.將抗體包被的板用石蠟包埋并在冷室中于含有濕紙巾的潮濕盒子內(nèi)培育過(guò)夜，或者在室溫和濕氣下培育兩個(gè)小時(shí)。
7.將板倒空并且用100μl的封閉緩沖液在室溫下封閉未被占據(jù)的點(diǎn)30分鐘，所述的封閉緩沖液含有100mM磷酸鹽緩沖液，pH7.2，1％BSA，0.5％吐溫-20和0.02％的Thimerosol。
8.將板倒空并且用清洗緩沖液(100mM磷酸鹽緩沖液，150mMNaCl，0.2％ BSA和0.05％吐溫20)清洗3次。
9.首先在抗原緩沖液(100mM磷酸鹽緩沖液，150mM NaCl)中稀釋抗原溶液，隨后向板中的每個(gè)孔加入50μl的體積。將板在室溫下培育45分鐘到1小時(shí)。
10.將板再次倒空并且用清洗緩沖液清洗3次。
11.將酶標(biāo)記的針對(duì)抗原的抗體在0.1M、pH9.2的重碳酸鹽緩沖液中適當(dāng)稀釋，隨后向板中的每個(gè)孔加入50μl的體積并在室溫下培育30分鐘。
12.將板再次倒空并且用清洗緩沖液清洗3次。
13.加入顯色系統(tǒng)并且測(cè)量顏色強(qiáng)度。
優(yōu)點(diǎn)驅(qū)動(dòng)蛋白相關(guān)抗原的表征在序列水平已經(jīng)揭示兩個(gè)物種杜氏利什曼原蟲(chóng)和恰氏利什曼原蟲(chóng)的驅(qū)動(dòng)蛋白抗原的相似和不同。
從本發(fā)明可以清楚地看到，分離自印度株的驅(qū)動(dòng)蛋白相關(guān)的抗原的免疫顯性重復(fù)與早先報(bào)道的其它利什曼原蟲(chóng)物種的序列是不同的。
本研究揭示印度株與早先報(bào)道的株和來(lái)自其它地理區(qū)域的物種是非常不同的。
本研究還揭示印度株之間的重復(fù)單位的氨基酸序列變化比先前報(bào)道的序列高很多。
本發(fā)明還導(dǎo)致多肽的分離，所述的多肽在序列上與早先報(bào)道的多肽序列不同。
本發(fā)明還導(dǎo)致抗利什曼原蟲(chóng)抗體的檢測(cè)方法的形成，所述的方法基于新發(fā)現(xiàn)的來(lái)自杜氏利什曼原蟲(chóng)印度分離株的抗原。
本發(fā)明還導(dǎo)致用于檢測(cè)VL的利什曼病檢測(cè)試劑盒，由于印度的杜氏利什曼原蟲(chóng)物種和其它類似物種可能會(huì)被K39多肽漏檢。
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序列表<110>全印度醫(yī)療科學(xué)學(xué)會(huì)S·辛格<120>用于診斷和治療利什曼病的多肽<130>PCT002SS<160>11<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3016<212>DNA<213>杜氏利氏曼原蟲(chóng)(Leishmania donovani)<400>1cggcgcgtcg gtgtctttga ttccactgat caccgcctcg ccatatgctc atcgtggtcc 60aacgcgaccc ccctccccca aaggcaagcg agacgtatcg accatgccgt ctgcccgcat 120ctgtgcttaa caagcgagcc aggtgtccct tccgcagctc cgaatctttc gcgtggcgcc 180acacactgta tgagcgtcac tacccttgta tacctcagac cacttcccgc cgcccctcta 240cccttctaca cgcctacaca cacatatgta tacatgaaca tctctcagca cacaacgcac 300acatactgtg accggtatta ctgcaccaac gtctacctct tccacgatgc acccttctac 360tgtgcggcgt gaggcggagc gggtgaaggt gtcggtgcgc gtgcgccccc tcaacgaccg 420tgaaaacaat actgccgaag gggcgaaagt caccgtcgcg gcgaaacagg cggcggccgt 480ggtaaccgtc aagttcatgg gaggcaccag caacagctgc cccgccgagt cgggggctgc 540gaggcgggta acgcaggact tccagttcga ccacgtgttc tggtctctgg agacgccgga 600cgcgtgtggc gcgacccctg cgacgcaggc agacgtgttc cggacgatcg ggtacccgct 660ggtgcagcac gcgttcgacg ggttcaactc gtgcctgttt gcgtacgggc agacggggag 720cgggaagacg tacacgatga tgggtgcgga cgtgagcgcg cttagcggtg agggcagcgg 780cgtgacgccg cggatctgcc tggagatctt tgcgcggaag gcgagcgtgg aggcacaggg 840gcactcgcgg tggattgtgg agcccgggta cgtggaggtg tacaacgagc gcgtgtcgga 900
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權(quán)利要求
1.一種如SEQ ID NO5或者SEQ ID NO6所述的分離的多肽，其包含利什曼原蟲(chóng)抗原的免疫原性區(qū)域，其中所述的多肽含有一個(gè)或者多個(gè)39個(gè)氨基酸的重復(fù)區(qū)域。
2.一種如SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所述的分離的DNA序列，其編碼如權(quán)利要求1所述的多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其分離自杜氏利什曼原蟲(chóng)的印度株。
4.一種在樣品中檢測(cè)抗利什曼原蟲(chóng)抗體的方法，所述方法包括a.提供一個(gè)固體的支持物或者載體，其與多肽結(jié)合，所述多肽選自由如權(quán)利要求1所述的SEQ ID NO5和SEQ ID NO6組成的組；b.將來(lái)自所述樣品的抗利什曼原蟲(chóng)抗體與結(jié)合到固體支持物或者載體的多肽結(jié)合；c.將與酶或者標(biāo)記綴合的抗人第二抗體或者蛋白加入到步驟(b)的內(nèi)容物中；和d.在所述的樣品中檢測(cè)抗利什曼原蟲(chóng)抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中的樣品選自由全血、血清、血漿和其它體液組成的組。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中的樣品選自動(dòng)物或者包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述的固體支持物選自由硝化纖維，尼龍，膠乳顆粒，聚丙烯和聚苯乙烯材料組成的組。
8.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述的載體是金粒。
9.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中的抗人第二抗體選自IgG，IgM，IgA，IgE抗體類別及其亞類。
10.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中的蛋白選自由蛋白A和蛋白G組成的組。
11.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中的酶選自由堿性磷酸酶，辣根過(guò)氧化物酶，β-半乳糖苷酶，脲酶，黃嘌呤氧化酶，葡萄糖氧化酶和青霉素酶組成的組。
12.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述的標(biāo)記選自由放射性同位素，生物素，生色團(tuán)，熒光團(tuán)，化學(xué)發(fā)光的部分組成的組。
13.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述的抗利什曼原蟲(chóng)抗體檢測(cè)步驟選自由檢測(cè)熒光，檢測(cè)化學(xué)發(fā)光，檢測(cè)光吸收或者檢測(cè)放射性同位素組成的組。
14.一種用于檢測(cè)抗利什曼原蟲(chóng)抗體的診斷試劑盒，其包含如權(quán)利要求1中要求的多肽，抗人第二抗體或者蛋白，和用于檢測(cè)所述抗體的常規(guī)試劑，其中所述的抗人第二抗體或者蛋白與酶或標(biāo)記綴合。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的試劑盒，其中所述的多肽與固體支持物或者載體結(jié)合。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的試劑盒，其中所述的固體支持物選自由硝化纖維，尼龍，膠乳顆粒，聚丙烯和聚苯乙烯材料組成的組。
17.根據(jù)權(quán)利要求14的試劑盒，其中所述的載體是金粒。
18.根據(jù)權(quán)利要求14的試劑盒，其中的抗人第二抗體選自IgG，IgM，IgA，IgE抗體類別及其亞類。
19.根據(jù)權(quán)利要求14的試劑盒，其中的蛋白選自由蛋白A和蛋白G組成的組。
20.根據(jù)權(quán)利要求14的試劑盒，其中的標(biāo)記選自由酶，放射性同位素，生物素，生色團(tuán)，熒光團(tuán)和化學(xué)發(fā)光部分組成的組。
21.根據(jù)權(quán)利要求14的試劑盒，其中的酶選自由堿性磷酸酶，辣根過(guò)氧化物酶，β-半乳糖苷酶，脲酶，黃嘌呤氧化酶，葡萄糖氧化酶和青霉素酶組成的組。
22.一種獲得權(quán)利要求1所述多肽的抗體的方法，所述的方法包括將多肽注射入動(dòng)物，收集針對(duì)所述多肽產(chǎn)生的抗體和純化所述的抗體。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中的動(dòng)物選自由小鼠，兔，馬，山羊，綿羊，豚鼠，豬，牛，大鼠，雞，和倉(cāng)鼠組成的組。
24.一種使用按照權(quán)利要求22獲得的抗體來(lái)檢測(cè)樣品中利什曼原蟲(chóng)抗原的方法，該方法包括a.將一部分所述抗體與固體支持物或者載體結(jié)合；b.將含有利什曼原蟲(chóng)抗原的樣品加到所述的結(jié)合于固體支持物或者載體的抗體；c.將另一部分與酶或者標(biāo)記綴合的抗體加入到步驟(b)的內(nèi)容物中；和d.在所述的樣品中檢測(cè)利什曼原蟲(chóng)抗原。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中的樣品選自由全血、骨髓、脾抽出物，皮膚活檢，其它組織活檢和切片涂片組成的組。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中的樣品選自動(dòng)物或者包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物。
27.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述的固體支持物選自由硝化纖維，尼龍，膠乳顆粒，聚丙烯，玻璃和聚苯乙烯材料組成的組。
28.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述的載體是金粒。
29.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中的酶選自由堿性磷酸酶，辣根過(guò)氧化物酶，β-半乳糖苷酶，脲酶，黃嘌呤氧化酶，葡萄糖氧化酶和青霉素酶組成的組。
30.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述的標(biāo)記選自由放射性同位素，生物素，生色團(tuán)，熒光團(tuán)，化學(xué)發(fā)光的部分組成的組。
31.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述的利什曼原蟲(chóng)抗原的檢測(cè)步驟選自由檢測(cè)熒光，檢測(cè)化學(xué)發(fā)光，檢測(cè)光吸收或者檢測(cè)放射性同位素組成的組。
32.一種用于檢測(cè)利什曼原蟲(chóng)抗原的診斷試劑盒，其包含結(jié)合到固體支持物或者載體的抗體，與酶或者標(biāo)記綴合的抗體，和用于檢測(cè)利什曼原蟲(chóng)抗原的常規(guī)試劑。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的診斷試劑盒，其中所述的固體支持物選自由硝化纖維，尼龍，膠乳顆粒，聚丙烯，玻璃和聚苯乙烯材料組成的組。
34.根據(jù)權(quán)利要求32的診斷試劑盒，其中所述的載體是金粒。
35.根據(jù)權(quán)利要求32的診斷試劑盒，其中的酶選自由堿性磷酸酶，辣根過(guò)氧化物酶，β-半乳糖苷酶，脲酶，黃嘌呤氧化酶，葡萄糖氧化酶和青霉素酶組成的組。
36.根據(jù)權(quán)利要求32的診斷試劑盒，其中的標(biāo)記選自由放射性同位素，生物素，生色團(tuán)，熒光團(tuán)和化學(xué)發(fā)光部分組成的組。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于在疑似感染了利什曼蟲(chóng)屬原生動(dòng)物寄生物的個(gè)體中檢測(cè)抗利什曼原蟲(chóng)抗體的化合物和方法，其中的感染物為印度株并且與印度利什曼原蟲(chóng)株類似或密切相關(guān)。所提供的化合物包括示于SEQ IDNO5或者SEQ ID NO6的多肽，其被用于在個(gè)體中檢測(cè)利什曼原蟲(chóng)抗體，在所述的個(gè)體中激發(fā)了針對(duì)印度株利什曼原蟲(chóng)物種和與印度利什曼原蟲(chóng)株類似或密切相關(guān)的利什曼原蟲(chóng)物種的免疫應(yīng)答，所述的化合物還被用作疫苗和治療劑以預(yù)防和治療利什曼病。本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)利什曼原蟲(chóng)抗原的診斷試劑盒，其由針對(duì)SEQ ID NO5或者SEQ ID NO6所示多肽的抗體組成。
文檔編號(hào)G01N33/569GK1910197SQ200380111045
公開(kāi)日2007年2月7日 申請(qǐng)日期2003年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月26日
發(fā)明者S·辛格, R·西瓦庫(kù)瑪 申請(qǐng)人:全印度醫(yī)療科學(xué)學(xué)會(huì), 生物技術(shù)部