專利名稱：幽門螺桿菌抗原h(huán)la限制性免疫顯性表位肽及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術領域，涉及篩選和鑒定抗原表位肽的方法，尤其涉及一種幽門螺桿菌抗原HLA限制性免疫顯性表位肽及應用。
背景技術：
幽門螺桿菌(Hp)是澳大利亞學者Warren和Marshall在1982年發(fā)現的。在過去的近30年時間里，研究證實Hp是胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍的主要病因，并與胃癌，胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤(MALT)的發(fā)生密切相關，被世界衛(wèi)生組織列為胃癌的I類致癌因子。并且，Hp的感染率非常高，流行病學調查顯示全世界有50%的人口攜帶該細菌，特別是某些發(fā)展中國家的感染率甚至高達80%。因此，有效的治療Hp感染對人類的健康是非常重要的。目前，臨床上主要采用抗生素多聯療法治療Hp感染。雖然能夠達到85%的根除效率，但是存在以下缺點1、藥物療法毒副作用大；2、復雜的聯合用藥導致病人的依從性差； 3、藥物不能防止Hp的潛在感染；4、抗生素治療易產生賴藥性而導致治療失?。?、對發(fā)展中國家病人而言，藥物療法在經濟上也比較困難。免疫接種是預防和控制感染性疾病最經濟而有效的方法，鑒于Hp感染的高發(fā)病率及其與慢性胃炎、消化性潰瘍以及胃癌、胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤的密切關系，如何通過免疫接種達到防治這些疾病的目的，一直是各國科研人員研究的重點問題。疫苗接種通過有效地調動機體免疫系統(tǒng)，克服細菌對宿主的免疫逃避來達到預防感染和消除已感染的細菌的目的，經濟而簡便，可在人群中大規(guī)模運用， 并且對賴藥細菌仍然有效，因此研究Hp疫苗具有重要意義。動物實驗研究表明，疫苗接種可以減少Hp在胃黏膜的定植，并減輕胃黏膜的炎癥反應，起到預防和治療Hp感染的作用。目前關于Hp的疫苗多是采用全菌疫苗或重組亞單位疫苗及核酸疫苗等，其引發(fā)的免疫應答與Hp感染是的免疫應答相似。Hp感染使機體內產生強烈的細胞與體液免疫應答，但是感染仍慢性持續(xù)化甚至是終身感染，說明機體已經對Hp的存在免疫耐受，自然感染時產生的免疫應答不能起到保護作用，因而通過疫苗接種的方式清除Hp就必須在抗原選擇以及在表位水平對抗原進行改造，激發(fā)更有效的免疫應答。表位疫苗是以抗原表位為基礎制備的疫苗，是目前感染性疾病，惡性腫瘤以及自身免疫性疾病等疫苗設計的新方向。相對傳統(tǒng)疫苗其具有很多的優(yōu)點1.選擇性提高所選擇表位的免疫原性；2.去除表位所在蛋白中不必要甚至有害的部分，降低疫苗使用風險。3.可以對表位進行優(yōu)勢組合，擴大免疫應答的寬度；4.應用廣泛，不僅有預防作用，還可以作為治療性疫苗使用。研制表位疫苗的第一步是表位的篩選和鑒定。Hp是一種胞外感染細菌，研究證實， CD4+T淋巴細胞在抗Hp感染免疫應答中起著非常重要的作用，因此，在Hp表位疫苗的設計中加入CD4+T細胞表位(及輔助T細胞表位)尤為重要。此外，并非所有的表位均能誘導機體產生強烈的免疫應答，只有免疫顯性表位才能引起機體強烈的免疫應答，亞顯性表位引起的免疫應答遠遠弱于顯性表位，因此，免疫顯性CD4+T細胞表位才是Hp表位疫苗所需
3要的。目前，已報道的Hp抗原⑶4+T細胞表位均為小鼠H-2限制性Th表位，由于小鼠和人MHC分子的差別，H-2限制性表位可能不適用于人類疫苗設計，因此需要篩選鑒定HLA限制性表位。此外，現有報道的Hp表位多采用生物信息學軟件預測而來，準確率不高，雖能通過實驗加以驗證，但是仍不能避免表位漏篩現象。此外，軟件預測方法篩選表位難以解決表位的免疫顯性問題，而免疫顯性表位才是Hp表位疫苗最佳的候選表位。因此，建立一種系統(tǒng)的篩選免疫顯性CD4+T細胞表位的方法顯得尤為重要。本發(fā)明利用抗原特異性T細胞及步移重疊合成肽，建立了一種系統(tǒng)篩選Hp抗原HLA限制性免疫顯性輔助T細胞(Th細胞) 表位的方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種幽門螺桿菌抗原HLA限制性免疫顯性表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO :8、22、30和42所示。所述氨基酸序列如SEQ ID NO 42所示的表位多肽具有HLA-DR限制亞性。所述HLA限制性亞型為HLA-DRB 1*0406。本發(fā)明所提供的幽門螺桿菌HpaA抗原的免疫顯性表位肽可在制備用于預防或治療幽門螺桿菌感染的疫苗中應用。本發(fā)明所述幽門螺桿菌HpaA抗原的免疫顯性表位肽的制備方法，包括以下步驟 培養(yǎng)外周血單核細胞；在HpaA抗原條件下，體外擴增外周血單核細胞中的HpaA抗原特異性 CD4+T細胞，并收集所獲得的細胞；在收集的細胞中加入待篩選的多肽刺激這些細胞，并繼續(xù)培養(yǎng)；檢測特異性CD4+T細胞對步驟c的多肽的應答頻率，根據應答頻率的不同篩選出免疫顯性表位肽，以及確定所述免疫顯性表位肽的HLA限制性。上述體外擴增外周血單核細胞中的HpaA抗原特異性CD4+T細胞的步驟包括用 RPMI-1640完全培養(yǎng)基調整所培養(yǎng)的外周血單核細胞的濃度至2. 5 5X 106/ml，加入HpaA 抗原進行刺激，該HpaA抗原的終濃度為0. 05 1 μ M，培養(yǎng)5_8天時加入終濃度為25U/ml 的重組人IL-2，繼續(xù)培養(yǎng)13-16天后收集細胞。上述待篩選的多肽通過以下方法獲得在UniProt蛋白數據庫中檢索幽門螺桿菌 11637來源的HpaA蛋白序列，從第觀號氨基酸開始，每次步移6個氨基酸，合成步移重疊的18個氨基酸多肽；或者在獲得的步移重疊的18個氨基酸多肽中每次步移2個氨基酸合成步移重疊的13個氨基酸多肽。其中所述18個氨基酸多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO 3-39所示；所述13個氨基酸多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :40-44所示。本發(fā)明還提供了鑒定所篩選到的免疫顯性表位肽的HLA限制性的方法，包括以下步驟在特異性⑶4+T細胞的培養(yǎng)液中加入抗HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ分子的單克隆抗體，然后加入目的肽段進行刺激，ICS和流式檢測特異性CD4+T細胞對多肽的應答頻率，被抗HLA-DR分子的單克隆抗體阻斷同時不被抗HLA-DP和HLA-DQ分子的單克隆抗體阻斷的多肽即是HLA-DR限制性免疫顯性表位肽。所述鑒定所篩選到的免疫顯性表位肽的HLA限制性的方法，進一步包括用含有 EBV的B淋巴細胞系作為抗原遞呈細胞負載目的肽段后與該肽段特異性CD4+T細胞進行混合淋巴細胞反應，然后進行ICS和流式檢測多肽對特異性CD4+T細胞對多肽的應答頻率，根據特異性CD4+T細胞的應答頻率檢測所述免疫顯性表位肽的HLA限制性亞型。本發(fā)明所提供的免疫顯性表位多肽具有高免疫原性，可引發(fā)強烈的免疫反應。另外所述免疫顯性表位多肽不含有不必要甚至有害的部分，從而降低由其所制備的疫苗的使用風險。本免疫顯性表位多肽可以與其他疫苗成分進行優(yōu)勢組合，從而擴大免疫應答的寬度。由本免疫顯性多肽制備的疫苗對幽門螺桿菌感染不僅有預防作用，還可以作為治療性疫苗使用。本發(fā)明所提供的篩選和鑒定方法準確率高，可以避免漏篩和誤篩現象，可以區(qū)別抗原表位的免疫顯性和免疫亞顯性，并且所篩選出的抗原表位均能被抗原遞呈細胞自然遞呈，由此使得制備高效、低毒、高安全性的Hp疫苗成為可能。為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例， 并配合附圖，作詳細說明如下。


圖IA表示經ICS方法檢測到的Hp感染陽性者PBMC中抗原特異性⑶4+T細胞頻率，可見DMSO對照組和肽庫刺激組之間沒有顯著差別；圖IB表示經ELISP0T方法檢測到的Hp感染陽性者PBMC中抗原特異性⑶4+T細胞頻率，可見Hp感染陽性者PBMC中HpaA特異性⑶4+T細胞頻率極低；圖2A表示Hp感染者外周血中抗原特異性⑶4+T細胞的體外有效擴增；圖2B表示Hp感染者外周血中抗原特異性CD4+T細胞的體外擴增過程中，最佳抗原刺激濃度為0. 2 μ M ；圖2C表示Hp感染者外周血中抗原特異性CD4+T細胞的體外擴增過程中，最佳的細胞培養(yǎng)時間是13-16天；圖3Α表示利用抗原特異性⑶4+Τ細胞和步移重疊合成肽對18氨基酸(18-mer) 免疫顯性表位進行篩選，其中第28條肽段(P28，H19ch2ci7)為免疫顯性肽段，第6 (P6，H58_75) 和第20(P20，H142_159)條肽段免疫亞顯性肽段；圖;3B表示利用抗原特異性⑶4+T細胞和步移重疊合成肽對13-mer免疫顯性表位進行篩選，其中P^-3(H192_2(i4)為免疫顯性肽段；圖4表示利用HLA-II類分子抗體阻斷實驗初步確定免疫顯性肽Ρ28_3Η192_2(14是 HLA-DR限制性的；圖5表示利用BLCL遞呈實驗確定免疫顯性肽(Η192-204)的HLA限制性是 HLA-DRB1*0406 ；圖6表示應用來源于樣本號為5250的HpaA特異性T淋巴細胞進一步驗證了所篩選到的13-mer短肽為免疫顯性肽段；圖7表示將系統(tǒng)篩選方法與生物信息學軟件預測法所得表位進行比較；
圖8表示在相同HLA限制性的不同幽門螺桿菌感染者中對免疫顯性表位的進一步驗證。
具體實施例方式材料與方法(一)蛋白和肽段
重組幽門螺桿菌粘附素A亞單位(rHpaA)蛋白(不含信號肽部分)為本單位重組構建(洪愉，幽門螺桿菌黏附素HpaA的克隆、表達及生物學活性研究中華微生物學和免疫學雜志2003年11期)；多肽肽段通過化學方法合成(由上海吉爾生化公司合成)，用二甲亞砜(DMSO)溶解至5mM的濃度，在_70°C保存，臨用時用RPMI-1640完全培養(yǎng)基稀釋到ImM 的濃度。( 二)主要溶液及試劑配制1. RPMI-1640不完全培養(yǎng)基分別稱取10. 4g RPMI-1640粉末，2. 4g H印es和2g NaHC03，加入去離子水至 IOOmL,攪勻過濾除菌，分裝凍存。2. RPMI-1640 完全培養(yǎng)基分別量取950mL RPMI-1640不完全培養(yǎng)基和50mL人AB血清，加入20萬單位/mL 的青霉素和鏈霉素雙抗各0. 5mL (終濃度為100U/mL)。3.凍存液將胎牛血清與DMSO按照9 1的比例混合，然后分裝凍存。(三)所使用的主要試劑及其來源
權利要求
1.一種幽門螺桿菌抗原HLA限制性免疫顯性表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO :8、 22、30和42所示。
2.根據權利要求1所述的幽門螺桿菌抗原HLA限制性免疫顯性表位肽，其特征在于 所述氨基酸序列如SEQ ID NO 42所示的表位多肽具有HLA-DR限制亞性。
3.根據權利要求2所述的幽門螺桿菌抗原HLA限制性免疫顯性表位肽，其特征在于 所述HLA限制性亞型為HLA-DRB 1*0406。
4.權利要求1-3任一所述的幽門螺桿菌抗原HLA限制性免疫顯性表位肽在制備用于預防或治療幽門螺桿菌感染的疫苗中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種幽門螺桿菌抗原HLA限制性免疫顯性表位肽及應用。所述幽門螺桿菌HpaA抗原免疫顯性表位多肽具有SEQ ID No8、22、30和42所示的氨基酸序列。本發(fā)明所述多肽具有高免疫原性，可引發(fā)強烈的免疫反應。另外所述免疫顯性表位多肽不含有不必要甚至有害的部分，從而降低由其所制備的疫苗的使用風險。本免疫顯性表位多肽可以與其他疫苗成分進行優(yōu)勢組合，從而擴大免疫應答的寬度。由本免疫顯性多肽制備的疫苗對幽門螺桿菌感染不僅有預防作用，還可以作為治療性疫苗使用。
文檔編號A61P31/04GK102276697SQ20111020752
公開日2011年12月14日 申請日期2011年7月22日 優(yōu)先權日2011年7月22日
發(fā)明者余抒, 吳超, 石云, 羅萍, 趙 卓, 鄒全明, 陳立 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學