長(zhǎng)效促黃體激素(lh)化合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及長(zhǎng)效生物學(xué)活性促黃體激素(LH)化合物，其包含連接至藥學(xué)上可接受的分子的LH激動(dòng)劑，與按同LH化合物相同的方式施用的LH激動(dòng)劑的體內(nèi)血漿半衰期相比，所述藥學(xué)上可接受的分子提供大幅度增加的LH激動(dòng)劑或LH化合物的體內(nèi)血漿半衰期。本發(fā)明涉及用于受控的卵巢刺激的方法，其可以與諸如體外受精、胞質(zhì)內(nèi)精子注射、子宮內(nèi)人工授精和體外成熟的輔助生育技術(shù)聯(lián)合使用。在其它方面，本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)卵泡生成的方法以及對(duì)黃體提供黃體支持的方法。
【專利說明】長(zhǎng)效促黃體激素(LH)化合物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及包含連接至藥學(xué)上可接受的分子的LH激動(dòng)劑的長(zhǎng)效生物學(xué)活性促黃體激素(LH)化合物，以及涉及制備和使用這種LH化合物的方法。這些LH化合物具有延長(zhǎng)的作用特性，并且適用于輔助生育技術(shù)程序，如促進(jìn)生育或治療不育癥，以及用于促性腺激素分泌不足的性腺低能男性和患有隱睪癥的男孩。修飾的LH具有延長(zhǎng)的作用特性，并且適用于與促卵泡激素(FSH)組合，用于誘導(dǎo)無(wú)排卵婦女的卵泡發(fā)育，或者用于在哺乳動(dòng)物雌性受試者的月經(jīng)周期的卵泡階段誘導(dǎo)受控的卵巢刺激。此外，本發(fā)明涉及用于受控的卵巢刺激的方法，其可以與諸如體外受精(IVF)、胞質(zhì)內(nèi)精子注射(ICSI)、子宮內(nèi)人工授精(ΙΠ)、體外成熟(IVM)和誘導(dǎo)排卵的輔助生育技術(shù)聯(lián)合使用。在其它方面，本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)卵泡生成的方法以及對(duì)黃體提供黃體和妊娠支持的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]輔助生育技術(shù)(ART)程序通常需要用外源促性腺激素治療以刺激卵泡的生長(zhǎng)和成熟。當(dāng)使用促性腺激素治療無(wú)排卵女性時(shí)，目標(biāo)是在誘導(dǎo)排卵之前當(dāng)單個(gè)優(yōu)勢(shì)的卵泡成熟時(shí)復(fù)制正常的月經(jīng)周期。相比之下，對(duì)于經(jīng)受體外受精(IVF)的婦女，采用受控的卵巢刺激(COS)來(lái)刺激若干卵泡的生長(zhǎng)和成熟，產(chǎn)生多個(gè)卵母細(xì)胞，然后將其重新取之用于IVF程序。
[0003]與保護(hù)多卵泡發(fā)育的ART、COS有關(guān)的是，有必要獲取最佳可能的機(jī)會(huì)使患者懷孕。為獲得多卵泡生長(zhǎng)，F(xiàn)SH的循環(huán)水平需超過引起響應(yīng)卵泡生長(zhǎng)的時(shí)間長(zhǎng)于自然的三到四天時(shí)間的生理閾值水平。這是通過施用外源性FSH或通過控制垂體腺以分泌增強(qiáng)量的FSH實(shí)現(xiàn)的，并且以正確方式進(jìn)行的COS可很容易地導(dǎo)致收獲過多用于體外受精(IVF)的成熟卵母細(xì)胞。
[0004]除了刺激卵泡生長(zhǎng)外，F(xiàn)SH的一個(gè)重要功能就是刺激顆粒細(xì)胞上的LH-受體的發(fā)育。LH-受體結(jié)構(gòu)性地表達(dá)于直接包圍卵泡的卵泡膜細(xì)胞上，并且保障生產(chǎn)-除其它物質(zhì)外-雄激素(即，雄烯二酮和睪酮)，用于在顆粒細(xì)胞層中轉(zhuǎn)化成雌激素，但LH-受體在卵泡的顆粒細(xì)胞層中也具有重要的功能。目前尚未精確地知道在卵泡發(fā)育的何時(shí)LH-受體在顆粒細(xì)胞上得到表達(dá)。
[0005]在正常的月經(jīng)周期中，LH-受體僅由垂體釋放的LH活性激活，但hCG(本質(zhì)上是一種妊娠相關(guān)蛋白)也可結(jié)合并刺激LH-受體。hCG具有比LH長(zhǎng)的半衰期，并且通常認(rèn)為hCG的累積體內(nèi)活性(來(lái)自安瓿中的等劑量LH和hCG)比LH高6至8倍(Stockman PGff etal.Fertil Sterill993 ；60:175,Giudice E et al.J Clin Res2001 ;4:27)。
[0006]COS的一些制劑僅含有FSH，而其它的含有FSH和LH樣活性的組合(即，單獨(dú)的LH或hCG或者LH和hCG的混合物)。例如，美諾孕含有尿源性FSH和LH樣活性。在這些制劑中，體內(nèi)受體介導(dǎo)的LH樣生物活性的約95%來(lái)源于hCG，這是由于其半衰期較長(zhǎng)(Van denHooven H et al.RBM 0nline2003 ;7:547)。也可以按純形式得到重組LH，如對(duì)于COS所添加的(即，Luveris, Merck-Serono, Darmstadt, Germany)。然而，用于 COS 的 hCG 僅在含有FSH的產(chǎn)品存在時(shí)才可得到，并且不以要與COS相關(guān)使用的小劑量銷售。
[0007]在過去的十年中，使用與COS相關(guān)的LH活性的臨床獲益一直飽受爭(zhēng)議。雖然許多元分析表明，與單獨(dú)的純FSH相比，增加LH樣活性(這在本質(zhì)上是經(jīng)由hCG提供的)顯示出帶寶寶到家比率(baby-take-home rate)增加,這一問題還沒有得到澄清(Al-lnany HG etal., Reprod Biomed Online.2008 ； 16:81-88, Westergaard LW, Cochrane Database SystRev2003 ；1:CD003973.,Al-lnany HG et al., Gynecol Endocrinol.2009 ;25:372-8)。使問題更復(fù)雜的是最頻繁使用的含hCG的FSH(即美諾孕(含尿源性FSH、LH和hCG的高度純化的hMG))與純FSH(即重組FSH、保妊康或果納芬)的FSH亞型分布之間的差異。然而，毫無(wú)疑問的是，LH水平可以降到增加LH樣活性將有益的閾值限度以下，并且還存在閾值上限，高于此閾值上限則對(duì)治療結(jié)果的負(fù)面影響就變得明顯起來(lái)。因此LH樣活性理想地應(yīng)保持于治療上狹窄的窗口中。
[0008]LH和CG是非常同源的。與LH相比，CG具有C-末端糖基化的擴(kuò)展，已證明其對(duì)于CG的較長(zhǎng)半衰期是重要的。人LH和hCG在序列上超過80%是相同的。雖然LH和hCG兩者都結(jié)合并激活LH-受體，但兩激素作為異激素的家族存在，它們的寡糖組成不同。各不同亞型以特定的方式影響受體，并且可引起可變的細(xì)胞響應(yīng)(Burgon PG etal., Endocrinology, 1996 ； 137:4827 ；Stanton PG et al., Mol Cell Endocrinol.1996 ；125:133-141),如不同的FSH亞型也已顯不的那樣(Barrios-de-Tomasi J, et al.Mol CellEndocrinol.2002 ； 186:189-98, Yding Andersen C&Ezcurra D,Reproductive BiologyInsights2011:4, 1_10)。因此LH和hCG的更精微和細(xì)致調(diào)整的效果實(shí)際上可有所不同。在斯德哥爾摩ESHRE會(huì)議上給出的近期研究(2011年七月)表明，LH作用比hCG快得多，但在受體水平上總體效率較低(L.Casarini et al., ESHRE Stockholm2011-P312, Universitadegli Studi di Mode na, Italy)。hCG是繼排卵后大約8天開始胚胎著床而分泌的妊娠相關(guān)蛋白。hCG能夠刺激黃體保持活性并使之繼續(xù)分泌孕酮及其它必要的物質(zhì)，以便能夠發(fā)生懷孕。盡管事實(shí)上在月經(jīng)周期的那時(shí)刻LH水平是以可觀量存在的，但這一水平不足以進(jìn)一步刺激黃體，并且除非發(fā)生懷孕，否則黃體將會(huì)退化，將會(huì)發(fā)生月經(jīng)出血，并且開始新的月經(jīng)周期。雖然LH與hCG之間的這種差異已困擾科學(xué)界有些時(shí)間，但現(xiàn)已證明LH-受體(LH-R)在黃體階段發(fā)生變化。功能性全長(zhǎng)受體在存在hCG時(shí)保持其表達(dá)，而LH無(wú)法做到這點(diǎn)(Dickinson RE et al.，Endocrinologyl50:2873-2881，2009)。這顯不出在黃體階段期間LH和hCG影響的差異，并且這可能表明LH和hCG也在月經(jīng)周期的卵泡階段在受體水平上施加不同的影響。
[0009]現(xiàn)在公認(rèn)的是，在FSH僅以與COS有關(guān)的小允許量存在的情況下，LH-R在人顆粒細(xì)胞上的表達(dá)足以驅(qū)動(dòng)卵泡從大約10-12毫米的直徑發(fā)育并且直到排卵為止(Blockheelet al.,2009 ；Filicori et a.，1999)。因此這種刺激類似于自然月經(jīng)周期的條件，其中FSH的水平在卵泡階段的后半期衰減，而LH的水平保持相當(dāng)?shù)睾愣ǎ⑶乙驯砻髟诖傩韵偌に氐闹衅诩ぴ鲋?，LH對(duì)來(lái)自排卵期前卵泡的顆粒細(xì)胞中的雌二醇生產(chǎn)具有非常強(qiáng)的刺激作用。對(duì)卵泡最終成熟提供更自然的環(huán)境的能力有可能提供能力更好的卵母細(xì)胞以維持受精、胚胎形成和著床，并隨后得到更好的生育結(jié)果。
[0010]COS的最嚴(yán)重的副作用之一是出現(xiàn)卵巢過度刺激綜合征(OHSS)，這是一種潛在的危及生命的病癥。最近的研究已表明，現(xiàn)在通過利用對(duì)最終卵泡成熟的激動(dòng)劑引發(fā)有可能幾乎完全地消除 OHSS(Humaidan P, Kol S，Papanikolaou E ；Copenhagen GnRH激動(dòng)劑 Triggering Workshop Group.GnRH 激動(dòng)劑 for triggering of final oocytematuration:time for a change of practice?Hum Reprod Update.2011 ； 17:510-24.PMID: 21450755)，而且不損害生育結(jié)果。與GnRH拮抗劑下調(diào)的垂體功能相結(jié)合，GnRH激動(dòng)劑的藥團(tuán)能夠取代拮抗劑并引起促性腺激素釋放的加劇，其然后被用作排卵誘導(dǎo)的信號(hào)。然而，繼加劇后激動(dòng)劑引起垂體下調(diào)，這將刺激信號(hào)移至卵巢。這些刺激的移除也減少了 OHSS的危險(xiǎn)。然而，這種下調(diào)對(duì)黃體的功能也有極大的負(fù)面影響，并且生育結(jié)果低得無(wú)法接受。因此為了維持黃體的一定功能，已經(jīng)成功地嘗試在獲取卵母細(xì)胞之時(shí)及后來(lái)的黃體階段中增加hCG的藥團(tuán)(1500IU)。或者每日注射LH可援助黃體階段并提供良好的生育結(jié)果(當(dāng)使用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑代替人絨膜促性腺激素用于排卵引發(fā)時(shí)，以重組促黃體激素補(bǔ)充黃體的新穎方法:概念研究的隨機(jī)化前瞻性證明。Papanikolaou EG, Verpoest ff, Fatemi H, Tarlatzis B,Devroey P,Tournaye H.FertilSteril.201IMarI ；95(3):1174-7.Epub20100ct27.PMID:20979997)。
[0011]盡管近來(lái)在ART中有進(jìn)展，但通過外源性促性腺激素的卵巢刺激并沒有一律地取得成功，這部分是由于個(gè)體對(duì)促性腺激素治療的反應(yīng)不同。這種變化性使患者管理復(fù)雜化，并可導(dǎo)致多胎以及可能危及生命的并發(fā)癥。
[0012]促性腺激素形成結(jié)構(gòu)上相關(guān)的糖蛋白激素家族。典型的成員包括絨膜促性腺激素(CG)、促卵泡激素(FSH ;促卵泡素)、促黃體激素(LH ;促黃體素)和促甲狀腺激素(TSH ;促甲狀腺素)。FSH、LH和 TSH存在于大多數(shù)脊椎動(dòng)物物種中，并且由垂體合成和分泌。迄今僅在包括人在內(nèi)的靈長(zhǎng)類動(dòng)物和馬中發(fā)現(xiàn)CG，并且是由胎盤組織合成的。FSH和LH是對(duì)女性的卵泡成熟和黃體化及男性的睪丸成熟和精子生成必不可少的垂體激素。促性腺激素是在下丘腦的促性腺激素釋放激素(GnRH)控制下由垂體腺分泌的。促卵泡激素(FSH)和促黃體激素(LH)是對(duì)卵泡成熟(卵泡發(fā)育)和黃體化必不可少的垂體激素。在自發(fā)月經(jīng)周期的開始，卵泡募集(即，卵泡的早期生長(zhǎng))需要FSH，并且它也支持中期和晚期的卵泡發(fā)育。
[0013]近些年來(lái)通過采用重組DNA技術(shù)已經(jīng)可以得到促性腺激素的非常純的制劑(參見例如 Boime et al., Seminars in Reproductive EndocrinologylO, 45-50，1992: 〃Expression of recombinant human FSH, LH and CG in mammalian cells")。重組促性腺激素品質(zhì)是穩(wěn)定的，即具有可再現(xiàn)的生物化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)。已經(jīng)為所有的亞基制備了基因組和cDNA克隆，并且它們的一級(jí)結(jié)構(gòu)已得到解析。此外，已經(jīng)用人促性腺激素亞基基因轉(zhuǎn)染了中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，并且這些細(xì)胞顯示出能夠分泌完整的二聚體(例如Keene etal (1989), J.Biol.Chem., 264, 4769-4775 ；Van Wezenbeek et al(1990), in From clone toClinic (eds Crommelin D.J.A.and Schellekens H.)，245-251)。已被證明例如重組 FSH的生物化學(xué)和生物學(xué)特性與天然FSH的幾乎完全相同(Mannaerts et al (1991), Endocrinology, 129，2623-2630)。此外，使用重組FSH在受控的卵巢超數(shù)排卵后實(shí)現(xiàn)了懷孕(Germondet al(1992), Lancet, 339, 1170 ；Devroey et al(1992)，Lancet, 339，1170-1171)。
[0014]也可以由天然來(lái)源分離促性腺激素，例如由人尿分離，或者可以按(生物)合成方式制備促性腺激素，參見通過重組DNA技術(shù)的方式。
[0015]在臨床實(shí)踐中廣泛使用促性腺激素以治療患有WHO II組和WHO I組無(wú)排卵的婦女(World Health Organisation Technical Report514, (1973))。按慣例，通過以75-150IU/天的劑量施用hMG(人絕經(jīng)期促性腺激素)或u_hFSH(人尿促卵泡激素)來(lái)誘導(dǎo)卵泡發(fā)育。幾天(通常五天)后按75IU的布幅將此劑量提高。罕有超過450IU/天的。當(dāng)有至少一個(gè)卵泡具有至少18_的平均直徑且不超過兩個(gè)卵泡具有至少16_的平均直徑時(shí)，施用高劑量(例如5000IU)的hCG(人絨毛膜促性腺激素)以誘導(dǎo)排卵。這種“常規(guī)方案”已成功使用超過20年。然而它也帶有一定的危險(xiǎn)性，主要是對(duì)于患有多囊性卵巢或多囊性卵巢綜合癥(PCOS)的患者。
[0016]這些危險(xiǎn)包括發(fā)生OHSS以及相對(duì)高發(fā)病率的多胎妊娠(Schenker et al, Fertil.Steril.35:105-123 (1981))。雖然大多數(shù)多胎妊娠都是雙胞胎，但在英國(guó)，誘導(dǎo)排卵促成三分之一的高級(jí)別多胎分婉(Levene et al, Br.J Obstet.Gynacol.99:607-613 (1992))。
[0017]通過超聲(US)在治療期間仔細(xì)監(jiān)測(cè)并評(píng)估血清雌二醇(E2)已減少了這些危險(xiǎn)，但尚不能夠在所有患者中防止其發(fā)生。這些問題與獲得單一優(yōu)勢(shì)卵泡的生長(zhǎng)的難度有直接關(guān)系，導(dǎo)致非生理性多卵泡發(fā)育。
[0018]治療性施用FSH以誘導(dǎo)無(wú)排卵婦女和經(jīng)歷COS的婦女中的卵泡發(fā)育。在傳統(tǒng)的排卵刺激方法中，在整個(gè)治療過程中施用FSH，直到在臨取得卵母細(xì)胞前不久。這種通過FSH的持續(xù)刺激通常會(huì)引起多卵泡發(fā)育，并可與hCG外源藥團(tuán)相結(jié)合而誘導(dǎo)排卵，導(dǎo)致有可能致命的病狀0HSS。據(jù)現(xiàn)在的估計(jì)，COS對(duì)原本健康的患者來(lái)說，每100，000個(gè)刺激周期有大約3個(gè)是致命性的。降低FSH的劑量可減少OHSS的危險(xiǎn)，但低FSH劑量產(chǎn)生的卵泡數(shù)量不足，并因此會(huì)降低輔助生育成功的機(jī)會(huì)。
[0019]LH在正常月經(jīng)周期的所有階段均起作用。LH刺激卵泡的泡膜細(xì)胞以產(chǎn)生雄激素底物，后者通過顆粒細(xì)胞中的芳香酶系統(tǒng)被轉(zhuǎn)化成雌激素。在卵泡成熟的晚期期間，排卵前大約5至7天，大卵泡開始表達(dá)顆粒細(xì)胞中的LH受體，這使得那些卵泡響應(yīng)LH以持續(xù)成熟和發(fā)育。Hillier et al., Mol.Cell Endocrinol.100:51(1994), Campbell etal.J.Reprod.Fertil.117:244(1999)。接下來(lái)，LH的中期激增引發(fā)正常月經(jīng)周期中的卵泡成熟和排卵的最后階段。排卵在中期LH激增后24至48小時(shí)之內(nèi)。最后，在月經(jīng)周期的第二部分，即黃體階段，LH在卵巢為著床和妊娠準(zhǔn)備子宮時(shí)刺激雌激素和孕酮在其黃體中的產(chǎn)生。
[0020]在卵巢刺激方案中，hCG可充當(dāng)LH活性的來(lái)源，因?yàn)閔CG和LH通過相同的受體起作用。Filicori et al.Human Reprod.17:2009 (2002a) ；Martin et al., Fertil.Steril.76:0-49 (2002)。相對(duì)于LH來(lái)說，hCG具有較長(zhǎng)的半衰期，并且因此在體內(nèi)比LH更有效，雖然文獻(xiàn)傾向于把hCG和LH作為可互換的處理。事實(shí)上，科學(xué)文獻(xiàn)一般不提及確定天然得到的促性腺激素制劑中的LH活性的來(lái)源。
[0021]文獻(xiàn)公開了在整個(gè)排卵刺激過程中采用LH活性或低劑量hCG與FSH相結(jié)合，但缺少有關(guān)LH活性補(bǔ)充的有效量和時(shí)間安排的指導(dǎo)。例如，Martin et al, Fertil.Steril.76:0-49(2002)的摘要公開了在排卵刺激期間每天施用2.5 μ g重組hCG(將血清hCG水平維持在l-3mIU/mL)。Gordon et al.公開了施用具有O、1、25和75IU LH活性的75IU FSH0 Human Reprod.12(Supp1.1):52(1997a) ；ibid.:53 (1997b)。
[0022]發(fā)表的研究報(bào)告公開了在整個(gè)刺激過程中按FSH與LH的比例為150: O、150:37.5、150:75 和 150:150 施用 LH 活性。Filicori et al.(2002a)。進(jìn)一步地，文獻(xiàn)記載了以 50IUhCG/ 天補(bǔ)充 FSH 刺激(Filicori et al., J.Clin.Endocrinol.&Metabol.84:2659 (1999))，以及施用7天150IU FSH、接著以FSH與hCG的比例為150: 0、50:50、25:100和0:200治療的方案(ibid.87:1156 (2002c)和 US20080108571)。
[0023]在過去的10年中，為了進(jìn)一步減少促性腺激素治療并發(fā)癥的發(fā)病率，已經(jīng)設(shè)計(jì)出新的方案(“長(zhǎng)期低劑量方案”)并進(jìn)行了測(cè)試(Seibel et al, Int.J Ferti1.，29:338-339 (1984) ；Buvat et al, Ferti1.Steri1.，52:553-559 (1989)；HamiIton-Fairley et al,Human Reprod.6:1095-1099(1991) ；Sagle et al,FertilSteril., 55:56-60(1991) ；Shoham et al, Fertil.Steril., 55:1051-1056 (1991)；Me I drum, Fertil Steril.，55:1039-1040 (1991))。這一方案以低劑量的 FSH 或 hMG (75IU/天)開始，并且在七天或優(yōu)選14天的治療前沒有劑量調(diào)整。如果需要進(jìn)行劑量調(diào)整，則通過僅37.5IU的增加步幅進(jìn)行。此外，可僅在以給定的劑量治療七天后實(shí)施每一后續(xù)的增加。這種長(zhǎng)期低劑量方案的概念是要找到促進(jìn)單一卵泡生成(unifolliculogenesis)所必需的FSH的閾值量。迄今已經(jīng)發(fā)表了令人鼓舞的結(jié)果，表明這種方法減少了排卵前卵泡的平均數(shù)，平均排卵前E2水平和中間黃體階段卵巢的尺寸。
[0024]然而，盡管采用了長(zhǎng)期低劑量方案，但由于過度響應(yīng)的原因(例如，在有超過3個(gè)卵泡平均直徑為16mm或更大的情況下)，仍不得不取消一些治療周期。此外，當(dāng)與常規(guī)方案相比時(shí)，雖然多胎妊娠率有明顯改善，但仍高于自發(fā)懷孕周期中的情況，即在誘導(dǎo)的排卵中為5-10%，相比之下在自發(fā)周期中為1.5%。這是由于僅在誘導(dǎo)周期的約三分之二至四分之三中獲得單一排卵前卵泡的發(fā)育，并且當(dāng)在hCG施用當(dāng)天評(píng)估排卵前卵泡數(shù)時(shí)通常不考慮具有 15mm或更小的平均直徑的卵泡(Buvat et al, FertiL Steril., 52:553-559(1989)；Hamilton-Fairley et al, Human Reprod.6:1095-1099 (1991))。然而，并不清楚在 hCG 施用當(dāng)天，平均直徑為14至15mm或甚至更小的卵泡是否將會(huì)排卵并導(dǎo)致釋放健康的可受精卵母細(xì)胞。因此，期望能夠改進(jìn)FSH誘導(dǎo)的卵泡發(fā)育治療，其中能減少多胎妊娠率和周期取消率。
[0025]竇狀卵泡生長(zhǎng)由FSH誘導(dǎo)。一些卵泡進(jìn)入生長(zhǎng)階段，該生長(zhǎng)階段在達(dá)到排卵前狀態(tài)的完全成熟階段之前被退化和閉鎖中斷，這種現(xiàn)象在整個(gè)生命過程中一直持續(xù)著乃至達(dá)到絕經(jīng)期(HiIlier, Hum.Reprod., 9:181-191 (1994))。在生長(zhǎng)階段期間，大多數(shù)卵泡可以自閉鎖狀態(tài)中解救出來(lái)，條件是其暴露于足夠的F S H濃度。防止卵泡閉鎖并促進(jìn)其進(jìn)一步生長(zhǎng)所需的FSH水平被稱為“FSH閾值”水平(Brown, Aus.NZJ Obstet.Gynecol.，18:47-55(1987)。FSH閾值水平隨時(shí)間而變化，并且在給定的時(shí)間點(diǎn)，當(dāng)前處于生長(zhǎng)階段的卵泡具有不同的FSH閾值水平。這就是“長(zhǎng)期低劑量”方案所依據(jù)的基本原理。采用FSH劑量的漸進(jìn)和謹(jǐn)慎的增加來(lái)尋找最少數(shù)量卵泡的閾值水平，并且有希望實(shí)現(xiàn)單排卵。
[0026]已知LH還促成卵泡優(yōu)勢(shì)化和單排卵的現(xiàn)象。實(shí)際上，雖然在卵泡發(fā)育期間一些LH對(duì)于E2合成是必不可少的，但有證據(jù)表明，過度暴露于LH將引發(fā)卵泡閉鎖并抑制顆粒細(xì)胞增殖。因此發(fā)育中的卵 泡看起來(lái)對(duì)通過LH刺激具有限定的要求，超此限度則正常的卵泡發(fā)育就停止。這就是“LH高限”概念(Hillier, Hum.Reprod., 9:181-191 (1994)) ?據(jù)信在給定的時(shí)間點(diǎn)，當(dāng)前處于生長(zhǎng)階段的卵泡具有不同的LH高限水平?？烧J(rèn)為較成熟的卵泡比較少成熟的卵泡對(duì)LH的閉鎖作用更具抵抗力。[0027]已報(bào)道了兩例WHO I組無(wú)排卵，是通過單獨(dú)的FSH或采用遞升方案的hMG治療的(Glasier et al, Journal of Endocrinology, 119A-159 (1988))?！皢为?dú)的 FSH”周期具有比hMG周期數(shù)目多得多的成熟卵泡，這可能支持LH在次級(jí)卵泡的閉鎖中的作用。后來(lái)發(fā)表了兩項(xiàng)比較研究。在10位促性腺激素分泌不足的性腺低能婦女的第一項(xiàng)交叉研究中，就排卵前E2水平記錄到顯著的差異,但沒有報(bào)告卵泡計(jì)數(shù)(Couzinet et al, J.Clin.Endocrinol.Metab.66:552-556 (1988))。9位促性腺激素分泌不足的性腺低能婦女的第二項(xiàng)交叉研究報(bào)告了在hCG施用的當(dāng)天，平均直徑超過16mm的卵泡的平均數(shù)為2.0 (在hMG治療周期中為0.7，在 FSH 治療周期中為 1.2 (Shoham et al, FertiL Steril.，55:1051-1056 (1991))。沒有較小卵泡數(shù)的資料。
[0028]最近以來(lái)，已經(jīng)發(fā)表了對(duì)血清FSH、LH和E2濃度低到不可測(cè)量的單個(gè)患者施用 150IU hFSH(人 FSH)和 75IU r_hLH(重組人 LH)的結(jié)果(Hall et al, TheLancet, 344(8918): 334-335 (1994))。與單獨(dú)施用 hFSH 相比，施用 r_hLH 和 r_hFSH 導(dǎo)致 E2水平升高，并且直徑IOmm或更大的卵泡的總數(shù)減少。然而，大卵泡的數(shù)目還保持著足夠地聞，意味著多胎妊娠率聞得不可接受:。
[0029]進(jìn)一步的研究比較了在宮內(nèi)著床之前用FSH治療以刺激多卵泡發(fā)育后對(duì)正常的排卵婦女施用r-hLH(劑量為300IU/天或750IU/天)和r-hFSH的效果(Sullivan etal, Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 84，228-232，1999))。結(jié)果表明接受了 LH的婦女血清E2水平升高，雖然沒有測(cè)量卵泡數(shù)及卵泡尺寸，并且在接受750IU/天的LH的組中發(fā)生了多胎妊娠。
[0030]文獻(xiàn)記載了同時(shí)含有FSH和LH活性的其它組合物以及FSH與LH活性相結(jié)合的用途。例如，2000年11月16日公布的PCT申請(qǐng)W000/67778涉及使用LH或等量的hCG與FSH相結(jié)合以誘導(dǎo)無(wú)排卵婦女中的卵泡發(fā)育。更具體地，’778申請(qǐng)公開了按每天100至1500IU的劑量(第4頁(yè)，第26-29行)和范圍在1:1.5至1:20的FSH:LH比例(同上，第16-18行)施用LH或“其生物活性類似物”。
[0031]美國(guó)專利5，929，028涉及含有一種或多種天然或重組促性腺激素(包括FSH、LH和hCG)的液體制劑?！?28專利討論天然來(lái)源的人絕經(jīng)期促性腺激素(hMG)的組合物，其FSH和LH活性比為大約1:1，但沒有提到不同于商業(yè)化hMG制劑的1:1比例的FSH與LH活性比。
[0032]此外，還有同時(shí)含F(xiàn)SH和LH的商業(yè)化制劑?？傻玫胶?5IU FSH且具有75IU LH活性(普格納、喜美康、R印ronex和美諾孕)和75IU FSH且具有25或35IU LH活性(Normegon和Pergogreen)的人源性制劑。
[0033]然而，傳統(tǒng)的觀點(diǎn)是，雖然尚不明確，但“過多的” LH水平導(dǎo)致卵泡閉鎖、顆粒細(xì)胞增殖的抑制及過早的黃體化。一般地，參見Filicori, Fertil.Steril.79:253 (2003)。雖然近期的工作表明情況不然，但在該領(lǐng)域中仍然存在著這樣的概念，即LH活性水平必須在一定的范圍內(nèi)，而低于或高于“LH高限”的水平損害正常的卵泡發(fā)育。Shoham，F(xiàn)ertil.Steril.70:1170(2002)。
[0034]總之，發(fā)表的證據(jù)表明，在排卵誘導(dǎo)期間以LH活性補(bǔ)充FSH可減少治療的持續(xù)時(shí)間和用于實(shí)現(xiàn)適當(dāng)卵泡發(fā)育的促性腺激素量。Filicori et al.(1999)，(2002b)。另一方面，仍然存在著這樣的信念，即“高”LH活性水平對(duì)卵泡發(fā)育有負(fù)面影響。[0035]盡管在COS方案中有諸多進(jìn)展，但仍有必要作進(jìn)一步的改進(jìn)并消除OHSS的發(fā)生，提高后續(xù)的著床率并提高經(jīng)受輔助生育治療的女性的方便性以及提高安全性。
[0036]這種信念已指導(dǎo)了常規(guī)的卵巢刺激規(guī)范，其涉及在整個(gè)受控的卵巢刺激過程中施用FSH。在卵泡發(fā)育的早期至中期階段期間，外源性LH活性被認(rèn)為是不必要的，并且甚至是有害的。因此，卵巢刺激的傳統(tǒng)方式需要用單獨(dú)的FSH治療，通常按75-300IU/天。在這種傳統(tǒng)的方案中，僅在卵泡達(dá)到一定的發(fā)育階段后才施用LH活性以誘導(dǎo)排卵。只是近期才已經(jīng)在整個(gè)治療過程中施用LH活性，并且在這方面LH活性的最佳量和時(shí)間安排仍存在爭(zhēng)議。
[0037]為了使男孩發(fā)展正常的生育能力，兩個(gè)睪丸均需位于體外在陰囊中處于較低的溫度。如果一個(gè)或兩個(gè)睪丸長(zhǎng)時(shí)間地保持在體溫下，則生育能力可能會(huì)受到損害，并且在成年生活中產(chǎn)生具備功能的精子細(xì)胞的能力可能受損。為了減少未降到陰囊的睪丸對(duì)生育能力的負(fù)面影響，通常是通過物理操作或者通過用使睪丸移到陰囊的hCG激素治療將其移到陰囊。hCG通過刺激睪丸間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生雄激素來(lái)刺激睪丸類固醇激素的產(chǎn)生。還沒有準(zhǔn)確地了解雄激素水平增加引起睪丸移到陰囊的確切作用機(jī)理。
[0038]在男孩中有至少一個(gè)未降到陰囊的睪丸的頻率對(duì)于足月男嬰為約3%，早產(chǎn)男嬰為30%。然而，在生命的第一年期間，大多數(shù)在體內(nèi)的睪丸會(huì)自己到達(dá)陰囊(大多數(shù)在三個(gè)月內(nèi))，使隱睪的真實(shí)發(fā)病率整體為1%左右。hCG的影響是有充分記載的，但由于患者年齡、治療方案的差異以及可能包括伸縮性睪丸的原因，已報(bào)告的結(jié)果差別非常大，尚不清楚真實(shí)療效。已經(jīng)報(bào)告了許多不同的劑量方案，范圍在一周兩次給3-15劑(經(jīng)5周10次注射是常見的)。最常見的方案之一規(guī)定小嬰兒為250IU/劑，6歲或以下兒童為500IU/劑，而6歲以上個(gè)體為1000 IU/劑。
[0039]促性腺激素分泌不足的性腺低能男人沒有能力進(jìn)行促性腺激素LH和FSH的垂體釋放。各種基因缺陷可引起下丘腦中的缺陷，導(dǎo)致促性腺激素釋放激素(GnRH)的釋放不足，這繼而引起垂體減少FSH和LH的釋放。一種這樣的病狀是所謂的卡爾曼綜合癥，其影響到大約1:10.000的男性和1:50.000的女性。除了影響生育能力外，對(duì)男人和婦女的主要健康問題是骨質(zhì)疏松癥。
[0040]當(dāng)LH的水平低時(shí)，男人的雄激素產(chǎn)生減少，他們往往會(huì)不育，并顯示出男性特征減少。治療集中在恢復(fù)不足的激素。對(duì)男性施用hCG或睪酮。許多不同的睪酮制劑可供使用。較廣泛使用的睪酮制劑僅需以按月的間隔施用。然而，為誘導(dǎo)這些男人的精子產(chǎn)生和生育能力，需要隨著施用hCG，因?yàn)榻?jīng)由循環(huán)到達(dá)睪丸的外源性施用的睪酮很少能達(dá)到足以導(dǎo)致精子產(chǎn)生的睪丸內(nèi)水平。似乎更有效的是使用hCG以刺激足以誘發(fā)精子產(chǎn)生的睪丸雄激素產(chǎn)生，往往與FSH結(jié)合施用。由于從精子發(fā)生階段的精子產(chǎn)生到完全成熟的精蟲需要60至70天，這往往是一個(gè)漫長(zhǎng)的過程，多次注射hCG以引發(fā)精子產(chǎn)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0041]本發(fā)明人已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，激動(dòng)和激活哺乳動(dòng)物中的LH受體并提供如下的哺乳動(dòng)物CG或LH(例如人CG或人LH)的生物體組合物或濃度的修飾的哺乳動(dòng)物CG或LH(例如人CG或人LH)
[0042]a)足以驅(qū)動(dòng)竇狀卵泡從直徑約5-6mm(如從IOmm)直到直徑約30mm，其中成熟中的卵母細(xì)胞可完成成熟，以為減數(shù)分裂的恢復(fù)做好準(zhǔn)備，[0043]b)足以驅(qū)動(dòng)雄性后代出生后約I年的早期少年及青春期雌性和雄性受試者的雄
激素產(chǎn)生，
[0044]c)足以支持促性腺激素分泌不足的性腺低能雌性和雄性受試者的類固醇產(chǎn)生，
[0045]d)足以維持哺乳動(dòng)物受試者圍排卵階段、排卵階段和排卵后階段中的孕酮，目的是調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜和子宮以允許哺乳動(dòng)物胚泡的著床，
[0046]e)足以維持哺乳動(dòng)物受試者圍排卵階段、排卵階段和排卵后階段中的孕酮，目的是為著床準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜和子宮，
[0047]f)足以驅(qū)動(dòng)促性腺激素分泌不足的性腺低能男人中的雄激素產(chǎn)生，目的是誘發(fā)精子產(chǎn)生并增加雄激素產(chǎn)生。
[0048]g) 足以驅(qū)動(dòng)患有隱睪癥的男孩中的雄激素產(chǎn)生，目的是誘發(fā)睪丸對(duì)陰囊的重新定位。
[0049]h)足以驅(qū)動(dòng)復(fù)孕婦女中的孕酮產(chǎn)生，目的是減少流產(chǎn)的危險(xiǎn)。
[0050]對(duì)改進(jìn)ART的目前平臺(tái)是重要的(除了 b)。
[0051]因此，在廣泛的方面，本發(fā)明涉及一種長(zhǎng)效生物學(xué)活性促黃體激素(LH)化合物，其包含連接至藥學(xué)上可接受的分子的LH激動(dòng)劑，與按同LH化合物相同的方式施用的LH激動(dòng)劑的體內(nèi)血漿半衰期相比，所述藥學(xué)上可接受的分子提供大幅度增加的LH激動(dòng)劑或LH化合物的體內(nèi)血漿半衰期。
[0052]在另一方面，本發(fā)明涉及一種長(zhǎng)效生物學(xué)活性促黃體激素(LH)化合物，其包含接至藥學(xué)上可接受的分子的LH激動(dòng)劑，與內(nèi)源性絨膜促性腺激素(CG)的體內(nèi)血漿半衰期相t匕，所述藥學(xué)上可接受的分子提供大幅度增加的LH激動(dòng)劑或LH化合物的體內(nèi)血漿半衰期。
[0053]在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明涉及一種長(zhǎng)效生物學(xué)活性促黃體激素(LH)化合物，其包含連接至藥學(xué)上可接受的分子的哺乳動(dòng)物CG或其類似物或者哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物，所述藥學(xué)上可接受的分子選自結(jié)合至哺乳動(dòng)物新生兒Fe受體的分子、轉(zhuǎn)鐵蛋白和其中η是8至22的CH3 (CH2)nC0-以及聚合物。
[0054]LH激動(dòng)劑可來(lái)源于哺乳動(dòng)物，并且可選自哺乳動(dòng)物CG，如人CG，和馬科動(dòng)物CG，如馬CG ;或哺乳動(dòng)物L(fēng)H，如人LH、母牛LH、豬LH、馬LH、綿羊LH、狗LHjg LH和山羊LH。LH激動(dòng)劑也可以是哺乳動(dòng)物L(fēng)H激動(dòng)劑的類似物，并且通常類似物與LH激動(dòng)劑(如絨膜促性腺激素或促黃體激素)的相應(yīng)哺乳動(dòng)物序列具有至少80%的同一性，如至少85%的同一性、90 %的同一性、95 %的同一性、98 %的同一性或至少99 %的同一性。
[0055]LH激動(dòng)劑也可來(lái)源于非哺乳動(dòng)物，并且可選自有機(jī)小分子、肽、多肽和蛋白質(zhì)。
[0056]LH激動(dòng)劑被連接至另一分子，優(yōu)選藥學(xué)上可接受的分子，并且正是這種修飾的化合物在本文中被稱為L(zhǎng)H化合物。LH激動(dòng)劑可以按多種方式被連接至藥學(xué)上可接受的分子，如現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)中所述，如且不限于通過雙官能連接子的化學(xué)偶聯(lián)、通過將LH激動(dòng)劑(如hCG或hLH)的N-末端或C-末端偶聯(lián)至藥學(xué)上可接受的分子(如白蛋白)的基因技術(shù)。特別地，可將白蛋白(例如人白蛋白)的N-末端偶聯(lián)至hCG或hLH的α-鏈的C-末端或者h(yuǎn)CG或hLH的β-鏈的C-末端，或者可將白蛋白(例如人白蛋白)的C-末端偶聯(lián)至hCG或hLH的α -鏈的N-末端或者h(yuǎn)CG或hLH的β -鏈的N-末端?？蓪⑦B接子序列插在白蛋白與hCG或LH鏈之間。hCG和/或hLH中的兩條鏈(即α和β鏈)可通過連接肽偶聯(lián)在一起，從而產(chǎn)生一個(gè)多肽序列，其繼而可被連接(如通過化學(xué)連接或基因連接)至藥學(xué)上可接受的分子。
[0057]LH激動(dòng)劑可通過穩(wěn)定的連接子或較不穩(wěn)定的連接子連接至藥學(xué)上可接受的分子。若干連接子是本領(lǐng)域中已知的，包括雙官能PEG分子(例如參見Paige et.alPharmaceutical Research, vol.12, n0.12, 1995)、可水解的連接子(Shechter et alBioconjugate Chem.2005,16,913-920 和 International Journal of Peptide Researchand Therapeutics, Vol.13，Nos.1-2, June2007 和 W02009095479)、PDPH 和 EMCH,參見例如W02010092135。在其中LH激動(dòng)劑(如hCG)與藥學(xué)上可接受的分子的化學(xué)綴合(兩個(gè)或更多個(gè)分子的連接)強(qiáng)烈地減少官能LH活性的特例中，可優(yōu)選使用能釋放官能LH激動(dòng)劑的較不穩(wěn)定的連接子。
[0058]LH激動(dòng)劑可以被糖基化，在這種情況下連接至藥學(xué)上可接受的分子可通過這種糖部分進(jìn)行，或者可插入糖部分并用來(lái)建立LH激動(dòng)劑與藥學(xué)上可接受的分子之間的連接。
[0059]LH激動(dòng)劑可以被連接至一種或多種藥學(xué)上可接受的分子，或者一種藥學(xué)上可接受的分子可以被連接至一種或多種LH激動(dòng)劑，通常將LH激動(dòng)劑連接至一種或兩種藥學(xué)上可接受的分子，優(yōu)選一種藥學(xué)上可接受的分子。比如，將一種hCG連接至一種白蛋白，例如人白蛋白或修飾的白蛋白。
[0060]本發(fā)明的LH化合物進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)是，藥學(xué)上可接受的分子提供足以支持形成和維持黃體(Corpus Luteum/corpora lutea, CL)的LH激動(dòng)劑或LH化合物的血清濃度。當(dāng)在與促卵泡激素(FSH)治療有關(guān)(優(yōu)選在開始FSH治療后的5-10天)的月經(jīng)周期的卵泡階段期間給予LH化合物注射時(shí)就獲得這種優(yōu)點(diǎn)。
[0061]本發(fā)明的LH化合物再進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)是，藥學(xué)上可接受的分子提供一定濃度的LH激動(dòng)劑或LH化合物以刺激由CL釋放足夠的孕酮。當(dāng)在與FSH治療有關(guān)(優(yōu)選在開始FSH治療后的5-10天)或與排卵誘導(dǎo)有關(guān)或與胚胎轉(zhuǎn)移有關(guān)的月經(jīng)周期的卵泡階段期間或者有時(shí)在黃體或妊娠階段注射LH化合物后就獲得這種優(yōu)點(diǎn)。
[0062]本發(fā)明進(jìn)一步的方面涉及一種藥物組合物，其包含LH化合物和任選藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這種組合物可包含一種或多種LH化合物。
[0063]本發(fā)明又進(jìn)一步的方面涉及本發(fā)明的LH化合物，其用于哺乳動(dòng)物受試者的不育癥治療，如輔助生育技術(shù)治療，例如IVF或ICSI治療，或睪丸的降下不良，或者用于在促性腺激素分泌不足的性腺低能癥中增加類固醇產(chǎn)生的用途。通常，LH化合物用于促進(jìn)哺乳動(dòng)物受試者的生育能力。
[0064]本發(fā)明還涉及治療哺乳動(dòng)物受試者不育癥的方法，包括對(duì)有需要的哺乳動(dòng)物施用本發(fā)明的LH化合物。
[0065]此外，本發(fā)明涉及促進(jìn)哺乳動(dòng)物受試者生育能力的方法，包括對(duì)有需要的哺乳動(dòng)物施用本發(fā)明的LH化合物。
[0066]此外，本發(fā)明人已經(jīng)意識(shí)到，包含連接至藥學(xué)上可接受的分子的哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物的長(zhǎng)效修飾的LH，例如連接至(例如融合至)白蛋白或者融合至哺乳動(dòng)物抗體的Fe片段或哺乳動(dòng)物抗體的Fe片段的變體或者綴合至?；鶊F(tuán)或PEG的人LH，其激動(dòng)和激活哺乳動(dòng)物中的LH受體，并提供哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物或者修飾的LH的體內(nèi)血漿半衰期，其在哺乳動(dòng)物中為2至48小時(shí),通常為4至28小時(shí),如6-8小時(shí)。據(jù)信在卵泡階段中或作為黃體階段支持給予的修飾的LH改善安全性、治療結(jié)果和患者方便性。本發(fā)明具有指定的體內(nèi)半衰期的這種長(zhǎng)效修飾的哺乳動(dòng)物L(fēng)H特別適用于與FSH相結(jié)合。
[0067]因此，本發(fā)明進(jìn)一步的方面涉及一種藥物組合物，其包含本發(fā)明修飾的LH和FSH或具有FSH活性的分子。藥物組合物可以是一種同時(shí)包含修飾的LH和FSH或具有FSH活性的分子的組合物，或者可以是在分開的組合物中包含修飾的LH和FSH或具有FSH活性的分子的部件的試劑盒，其中可以同時(shí)、按順序或分開施用這種組合物。
[0068]本發(fā)明還涉及一種修飾的LH，其包含連接至藥學(xué)上可接受的分子的哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物，所述藥學(xué)上可接受的分子提供哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物或者修飾的LH的體內(nèi)血漿半衰期，其在哺乳動(dòng)物中為2至48小時(shí)，以與FSH或具有FSH活性的分子結(jié)合使用，用于同時(shí)、按順序或分開使用以在哺乳動(dòng)物雌性受試者的無(wú)排卵治療中誘導(dǎo)卵泡發(fā)育，如少量卵泡生成(paucifolliculogenesis)或單一卵泡生成,或者在哺乳動(dòng)物雌性受試者的月經(jīng)周期的卵泡階段中誘導(dǎo)COS。
[0069]本發(fā)明還涉及在哺乳動(dòng)物雌性受試者的無(wú)排卵治療中誘導(dǎo)卵泡發(fā)育(如少量卵泡生成)或在哺乳動(dòng)物雌性受試者的月經(jīng)周期的卵泡階段中誘導(dǎo)COS的方法，包括對(duì)有需要的哺乳動(dòng)物施用有效量的修飾的LH，其包含連接至藥學(xué)上可接受的分子的哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物，所述藥學(xué)上可接受的分子提供哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物或者修飾的LH的體內(nèi)血漿半衰期，其在哺乳動(dòng)物中為2至48小時(shí)，以同時(shí)、按順序或分開地與FSH或具有FSH活性的分子相結(jié)合。
[0070]在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明涉及在妊娠的前12周期間對(duì)患有反復(fù)性流產(chǎn)的婦女施用LH化合物，以便通過CL提高孕酮輸出和提高兒童的分娩率。
[0071]因此，在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明涉及包含連接至藥學(xué)上可接受的分子的哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物的修飾的LH，所述藥學(xué)上可接受的分子提供哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物或者修飾的LH的體內(nèi)血漿半衰期，其在哺乳動(dòng)物中為2至48小時(shí)，通常為4至28小時(shí)，如6_8小時(shí)。如上所述，這種修飾的LH特別適用于與FSH治療相結(jié)合。
[0072]哺乳動(dòng)物的LH可選自哺乳動(dòng)物L(fēng)H，如靈長(zhǎng)類動(dòng)物L(fēng)H (例如猿或猴L(fēng)H)、人LH和馬LH。LH也可以是哺乳動(dòng)物L(fēng)H的類似物，并且通常類似物與LH的相應(yīng)哺乳動(dòng)物序列具有至少80%的同一性，如至少85%的同一性、90%的同一性、95%的同一性、98%的同一性或至少99%的同一性。
[0073]哺乳動(dòng)物L(fēng)H被連接至另一分子，優(yōu)選藥學(xué)上可接受的分子，并且正是這種修飾的LH在本文中被稱為修飾的LH。哺乳動(dòng)物L(fēng)H可以按多種方式被連接至藥學(xué)上可接受的分子，如現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)中所述，如且不限于通過雙官能連接子的化學(xué)偶聯(lián)、通過將LH(如hLH)的N-末端或C-末端偶聯(lián)至藥學(xué)上可接受的分子(如白蛋白)的基因技術(shù)。特別地，可將白蛋白(例如人白蛋白)的N-末端偶聯(lián)至hLH的α -鏈的N-末端或hLH的β -鏈的C-末端。hLH中的兩條鏈(即α和β鏈)可通過連接肽偶聯(lián)在一起，從而產(chǎn)生一個(gè)多肽序列，繼而可被連接(如通過化學(xué)連接或基因連接)至藥學(xué)上可接受的分子。
[0074]哺乳動(dòng)物L(fēng)H可通過穩(wěn)定的連接子或較不穩(wěn)定的連接子連接至藥學(xué)上可接受的分子。若干連接子是本領(lǐng)域中已知的，包括雙官能PEG分子(例如參見Paige et.alPharmaceutical Research, vol.12, n0.12, 1995)、可水解的連接子(Shechter et alBioconjugate Chem.2005,16,913-920 和 International Journal of Peptide Researchand Therapeutics, Vol.13，Nos.1-2, June2007 和 W02009095479)、PDPH 和 EMCH,參見例如W02010092135。在其中哺乳動(dòng)物L(fēng)H(如hLH)與藥學(xué)上可接受的分子的化學(xué)綴合(兩個(gè)或更多個(gè)分子的連接)強(qiáng)烈地減少官能LH活性的特例中，可優(yōu)選使用能釋放哺乳動(dòng)物L(fēng)H的較不穩(wěn)定的連接子。
[0075]哺乳動(dòng)物L(fēng)H可以被糖基化，在這種情況下連接至藥學(xué)上可接受的分子可通過這種糖部分進(jìn)行，或者可插入糖部分并用來(lái)建立LH激動(dòng)劑與藥學(xué)上可接受的分子之間的連接。
[0076]哺乳動(dòng)物L(fēng)H可以被連接至一種或多種藥學(xué)上可接受的分子，或者一種藥學(xué)上可接受的分子可以被連接至一種或多種哺乳動(dòng)物L(fēng)H，通常將哺乳動(dòng)物L(fēng)H連接至一到五種(如一種或兩種)藥學(xué)上可接受的分子。比如，將一種hLH連接至一種白蛋白，例如人白蛋白或修飾的白蛋白。
[0077]本發(fā)明進(jìn)一步的方面涉及一種藥物組合物，其包含本發(fā)明修飾的LH和任選藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這種組合物可包含一種或多種修飾的LH。
[0078]本發(fā)明又進(jìn)一步的方面提供在女性人類中進(jìn)行輔助生育治療的方法，所述方法包括
[0079]a.在月經(jīng)周期的第1-3周期日通過施用FSH開始刺激，
[0080]b.從刺激的 第4-7天施用GnRH拮抗劑直到排卵引發(fā)，
[0081]c.通過在刺激的第1-9天期間施用至少一個(gè)劑量的LH激動(dòng)劑來(lái)對(duì)所述女性提供LH激動(dòng)劑，所述劑量足以刺激卵泡發(fā)育，直到排卵引發(fā)，
[0082]d.當(dāng)至少一個(gè)卵泡具有12_14mm的直徑時(shí)停止施用FSH，
[0083]e.當(dāng)至少一個(gè)卵泡具有至少15mm的直徑時(shí)用至少一個(gè)劑量的GnRH激動(dòng)劑誘導(dǎo)排卵。
[0084]本發(fā)明的刺激方案試圖通過以下方式改進(jìn)已知的方法，即當(dāng)已經(jīng)募集到合適數(shù)目的卵泡時(shí)停止FSH施用，并且在此時(shí)切換到hCG (或LH)施用，以便確保最大卵泡的成熟，同時(shí)較不成熟的卵泡不進(jìn)一步發(fā)育。本領(lǐng)域中已知在排卵時(shí)高數(shù)目不成熟的卵泡會(huì)增加OHSS的危險(xiǎn)。
[0085]通過以下方式進(jìn)一步減少OHSS的危險(xiǎn)，即通過采用GnRH激動(dòng)劑引發(fā)注射誘導(dǎo)排卵，從而無(wú)須施用高劑量的hCG以誘發(fā)排卵。
[0086]在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，在卵泡刺激期間施用的hCG是長(zhǎng)效hCG或長(zhǎng)效LH。使用長(zhǎng)效hCG或LH有若干優(yōu)點(diǎn)。明顯的是患者配合度提高，因?yàn)樽⑸涞拇螖?shù)減少了。還預(yù)期的是，這樣可以更進(jìn)一步地減少OHSS的危險(xiǎn)，因?yàn)樵诼雅蓦A段期間僅一次或兩次施用蛋白質(zhì)時(shí)，hCG或LH的積累沒有危險(xiǎn)。
[0087]還可以設(shè)想到可以在刺激方案的就頭幾天中的一天期間作為單次劑量施用長(zhǎng)效hCG或LH。當(dāng)進(jìn)行藥物(如重組蛋白)的團(tuán)注時(shí)，幾乎總是有血清水平的初始激增，此后血清水平下降到較低的水平，該水平根據(jù)藥物的血清半衰期情況而平穩(wěn)地減少。在刺激方案的最初幾天期間，hCG或LH的受體還沒有在顆粒細(xì)胞上呈活性，這時(shí)它們被結(jié)構(gòu)性表達(dá)于周圍的泡膜細(xì)胞上。在卵泡發(fā)育的此階段提供的LH活性有可能通過泡膜細(xì)胞增加雄激素輸出。這些雄激素有可能影響顆粒細(xì)胞以增強(qiáng)它們的FSH受體表達(dá)，因此使它們對(duì)外源施用的FSH更敏感，并因此改善卵泡健康(E i I S<|) Nielsen M, Rasmussen IA, Kristensen
SG, Christensen ST, Mcpllgird K, Wreford Andersen E, Byskov AG, Yding AndersenC:Expression of Androgen-receptor mRNA in granulosa cells from human smallantral follicles and the corresponding follicular fluid concentrations ofandrogens are positively correlated to granulosa cell FSH receptor mRNAexpression.Mol.Hum.Reprod.2011; 17:63-70.PMID:20843821)。這意味著由 hCG 團(tuán)注造成的激增可提高顆粒細(xì)胞響應(yīng)性，并且在受體于顆粒細(xì)胞上變得呈活性前被終止。此后，可以獲得更合適和穩(wěn)定的hCG血清水平以使適當(dāng)?shù)穆雅莅l(fā)育和成熟。
[0088]在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，在刺激階段期間施用的長(zhǎng)效hCG或LH僅足以支持卵泡發(fā)育直到排卵。在其它實(shí)施方案中，劑量也足以對(duì)根據(jù)本發(fā)明的黃體階段提供支持。
[0089]在替代方案中，通過施用相對(duì)低劑量的hCG進(jìn)行排卵誘導(dǎo)，劑量為2000IU或更少，如1500IU或更少，例如1000IU或更少，如750IU、500IU或200IU。優(yōu)選地，劑量在1000與2000IU之間。排卵誘導(dǎo)也可以涉及聯(lián)合施用GnRH激動(dòng)劑。這種替代方案固有的OHSS危險(xiǎn)性也低，因?yàn)橛糜谂怕颜T導(dǎo)的hCG的劑量比現(xiàn)有技術(shù)中用于排卵誘導(dǎo)的劑量顯著地低。
[0090]在另一方面，本發(fā)明涉及對(duì)經(jīng)受輔助生育治療的女性提供黃體支持的方法，所述方法包括在黃體階段期間施用LH激動(dòng)劑，至少直到排卵后2周。
[0091]根據(jù)這一方面，從大約排卵或取得卵母細(xì)胞時(shí)施用LH激動(dòng)劑，并且在黃體階段期間繼續(xù)施用。優(yōu)選地，繼續(xù)施用LH激動(dòng)劑，直到排卵后至少28天。
[0092]優(yōu)選地，在黃體階段期間施用的LH激動(dòng)劑是如本文所述的LH或LH類似物或LH變體。
[0093]可以按本申請(qǐng)中所述的劑量和間隔施用Ii^PhCG以及這些激素的長(zhǎng)效形式物。女性可以是根據(jù)本發(fā)明經(jīng)受輔助生育治療的女性。女性也可以是已經(jīng)根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)經(jīng)受受控的卵巢刺激的女性，包括已經(jīng)接受用于引發(fā)排卵的hCG的團(tuán)注的女性。后者的女性將具有足以在排卵引發(fā)后提供大約一周黃體支持的hCG的血清水平。
[0094]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，施用LH激動(dòng)劑直到排卵后至少6周，如7周，例如8周，如9周，例如受精后10周。
[0095]可以在排卵誘導(dǎo)階段和/或黃體階段和/或妊娠階段期間每2天施用長(zhǎng)效hCG或長(zhǎng)效LH,如每3天施用,例如每4天施用，如每5天施用,例如每6天施用，如每7天施用,例如每8天施用，如每9天施用,例如每10天施用。
[0096]也可以在排卵誘導(dǎo)階段和/或隨后的黃體階段和/或隨后的妊娠階段期間每14天施用長(zhǎng)效hCG或長(zhǎng)效LH，如每21天施用，例如每月施用，或者以甚至更小的頻度施用。
[0097]本發(fā)明的受控卵巢刺激方法通常導(dǎo)致涉及以下參數(shù)中的一項(xiàng)或多項(xiàng)的改善:生化妊娠、活胎、著床率提高、留存率提高、流產(chǎn)率降低、宮外孕流產(chǎn)率降低、OHSS發(fā)生的減少以及由于在黃體階段中對(duì)施用孕酮的減少或沒有必要施用孕酮而使方便性得到改善。
[0098]可通過胞質(zhì)內(nèi)精子注射(ICSI)、子宮內(nèi)人工授精(IUI)、體外成熟(IVM)或由其衍生的其它形式(如單獨(dú)的卵巢排卵)將本發(fā)明的卵泡刺激方案與體外受精(IVF)聯(lián)合使用。
[0099]可以將提供黃體支持的方法與上文提到的任何刺激方案聯(lián)合使用或者與其中需要刺激孕酮水平的任何嘗試妊娠或?qū)嶋H妊娠聯(lián)合使用。
[0100]在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)卵泡生成和支持隨后的胚胎著床的方法，包括:[0101]a.在月經(jīng)周期的第1-3周期日通過施用FSH開始刺激，
[0102]b.從刺激的第4-7天施用GnRH拮抗劑直到排卵，
[0103]c.通過在第1-9天期間施用至少一個(gè)劑量的hCG來(lái)施用LH激動(dòng)劑,所述至少一個(gè)劑量的hCG足以刺激卵泡發(fā)育，直到排卵，
[0104]d.當(dāng)至少一個(gè)卵泡具有12_14mm的平均直徑時(shí)停止施用FSH，以及
[0105]e.通過施用足以在排卵后7-10天提供至少20nmol/L血清孕酮濃度的一個(gè)或多個(gè)劑量的LH激動(dòng)劑來(lái)提供黃體支持。
[0106]這種方法可導(dǎo)致單卵泡生成(monofolliculogenesis)或少量卵泡生成。該方法也可用于在無(wú)排卵婦女中刺激卵泡發(fā)育。該方法還可涉及采用hCG引發(fā)注射或GnRH引發(fā)注射的排卵誘導(dǎo)，作為COS方案的一部分。
[0107]本發(fā)明進(jìn)一步的方面是對(duì)這種男孩提供LH化合物，以便提供穩(wěn)定濃度的雄激素并減少對(duì)這些年輕男孩給予注射的次數(shù)。
[0108]本發(fā)明又進(jìn)一步的方面對(duì)促性腺激素分泌不足的性腺低能男人提供LH化合物，以便提供穩(wěn)定濃度的hCG，其可誘發(fā)足以引起精子產(chǎn)生并將雄激素維持在可接受水平的睪丸雄激素產(chǎn)生。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0109]圖1a.現(xiàn)有技術(shù)中已知的具有hCG/GnRHa引發(fā)的典型短期拮抗劑方案的示意圖。圖中示意性地顯示出從月經(jīng)周期的第I天每日施用FSH并且直到排卵引發(fā)。大約在第6天開始施用日劑量的GnRH拮抗劑并且直到排卵引發(fā)。當(dāng)卵泡已達(dá)到直徑16-18mm的尺寸時(shí)通過hCG或GnRH激動(dòng)劑的藥團(tuán)注射引發(fā)排卵。36小時(shí)后收獲卵母細(xì)胞。兩天后，將一個(gè)或多個(gè)受精胚胎轉(zhuǎn)回子宮。為了提供黃體支持，施用孕酮，例如通過陰道或肌內(nèi)施用。
[0110]圖1b.具有hCG/GnRH激動(dòng)劑引發(fā)的替代性短期拮抗劑方案的示意圖。該方案基于在方案的第一天施用長(zhǎng)效FSH(絨促卵泡素(Corifollitropin))。從第6或7天往后施用日劑量的重組或尿FSH以補(bǔ)充絨促卵泡素。GnRH拮抗劑、引發(fā)及黃體支持如圖la。
[0111]圖2a.本發(fā)明的示例性COS方案，其中以長(zhǎng)持續(xù)性FSH(如絨促卵泡素)的一個(gè)團(tuán)注代替FSH的日劑量。通過施用長(zhǎng)效hCG(S-hCG)支持卵泡發(fā)育，其是在大約第6天施用的，這取決于卵泡直徑的情況。從方案的第6天左右施用GnRH拮抗劑，并且以GnRH激動(dòng)劑誘導(dǎo)排卵?？捎稍型蛲ㄟ^采用本發(fā)明的黃體方法提供黃體支持(圖4a或4b)。
[0112]圖2b.根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)示例性受控卵巢刺激(COS)方案的示意圖示。以尿或重組FSH的日劑量施用FSH。從對(duì)應(yīng)于大約12-14mm的卵泡尺寸的第6天左右停止FSH施用。第6天開始以日劑量施用GnRH拮抗劑并且直到排卵引發(fā)。在第6天施用長(zhǎng)效(長(zhǎng)持續(xù)性)hCG或長(zhǎng)效LH的藥團(tuán)注射。通過施用GnRH激動(dòng)劑引發(fā)排卵。黃體支持未顯示，可通過如圖1a那樣施用孕酮或者通過在黃體階段期間施用hCG或長(zhǎng)效hCG或LH或長(zhǎng)效LH的一種或多種皮下注射予以實(shí)現(xiàn)。
[0113]圖2c.本發(fā)明的示例性COS方案，其中通過日劑量的重組或尿FSH支持卵泡募集。從對(duì)應(yīng)于大約12-14mm的卵泡尺寸的約第6天通過日劑量的hCG或LH支持卵泡發(fā)育。第6天開始以日劑量施用GnRH拮抗劑并且直到排卵引發(fā)。通過施用GnRH激動(dòng)劑引發(fā)排卵。黃體支持未顯示，可通過如圖1a那樣施用孕酮或者通過在黃體階段期間施用hCG或長(zhǎng)效hCG或LH或長(zhǎng)效LH的一種或多種皮下注射予以實(shí)現(xiàn)。在懷孕的情況下，黃體支持可繼續(xù)，直到第5_10妊娠周。
[0114]圖3a.本發(fā)明的示例性COS方案。與圖2b中的方案相比，長(zhǎng)效(長(zhǎng)持續(xù)性)hCG或LH的施用繼續(xù)到黃體階段以提供黃體支持。在懷孕的情況下，黃體支持可繼續(xù)，直到第
5-10妊娠周。
[0115]圖3b.本發(fā)明的示例性COS方案。與圖3a中的方案相比，以重組或尿hCG或LH的每日注射施用hCG或LH?？捎猛鹊腖H劑量代替hCG。在懷孕的情況下，黃體支持可繼續(xù)，直到第5-10妊娠周。
[0116]圖3c.本發(fā)明的示例性COS方案。與圖3b中的方案相比，已從月經(jīng)周期的第2天以hCG或LH的每日注射開始hCG/LH施用。作為另外的選擇，可以用同等劑量的一次或多次長(zhǎng)效hCG或長(zhǎng)效LH的注射代替日劑量。在懷孕的情況下，黃體支持可繼續(xù)，直到第5-10妊娠周。
[0117]圖4a:本發(fā)明示出黃體支持的示例性方案。不論刺激方案(未顯示)如何，在排卵后大約第2天開始的黃體階段期間，尿或重組LH或hCG的日劑量提供黃體支持。如果女性懷孕，黃體支持可繼續(xù)，直到第5妊娠周，例如直到第10妊娠周。
[0118]圖4b.本發(fā)明示出黃體支持的示例性方案。不論刺激方案(未顯示)如何，在排卵后大約第2天開始的黃體階段期間，每2至7天施用的一個(gè)或多個(gè)劑量的長(zhǎng)效LH或長(zhǎng)效hCG提供黃體支持。如果女性懷孕,黃體支持可繼續(xù),直到第5妊娠周，例如直到第10妊娠周。
[0119]圖5:來(lái)自不同物種的促性腺激素α鏈的ClustalX2比對(duì)。序列取自Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)。Uniprot ID和登錄號(hào)給出如下:
[0120]人GLHA_HUMAN PO 1215
[0121]小鼠GLHA_M0USE P01216
[0122]大鼠GLHA_RAT Pl 1962
[0123]完全保守的殘基用黑色背景標(biāo)記，且對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基在比對(duì)下面以大寫顯示。半保守的殘基用灰色背景顯示，并且用比對(duì)下面的小寫字型標(biāo)記。
[0124]用ClustalX2 進(jìn)行比對(duì)(Larkin, M.A.，Blackshields, G.，Brown, N.P.，Chenna，R.，McGettigan，P.A.，McWilliam，H.，Valentin,F.，Wallace，1.M.，Wilmj A.，Lopez, R.，Thompson, J.D.，Gibson, T.J.，Higgins, D.G.(2007) Clustal W andClustal X version2.0.Bioinformatics,23:2947-2948.)
[0125]圖6:來(lái)自不同物種的促黃體激素β鏈的ClustalX2比對(duì):
[0126]序列取自Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)。Uniprot ID和登錄號(hào)給出如下
[0127]人:LSHBJUMANPOl 229
小鼠:LSHB-MOUSE009108
大鼠:LSHB-RATP01230
大猩猩:LSHB-GORGOQ2QIP1
黑猩猩:LS 腿 JANTRQ2Q1P2
[0128]圖7:來(lái)自不同物種的促卵泡激素β鏈的ClustalX2比對(duì)。序列取自Uniprot數(shù)
據(jù)庫(kù)。Uniprot ID和登錄號(hào)給出如下: [0129]促卵泡素β亞基
[0130]
[0131]人:PSBB—HUMANP01225
小鼠:FSNB—MOUSEQ60687
大鼠:PSHIRATP18427
大猩猩:FSHB-G0RG0A1BN60
黑猩猩:FSHB—PANTRQ2P 冊(cè) 2
[0132]圖8a:綴合物I的非還原SDS PAGE, rHA和hCG為對(duì)照。
[0133]圖8b:綴合物I的還原SDS PAGE, rHA和不同濃度的hCG為對(duì)照。
[0134]圖8c:純綴合物I的SEC-HPLC分析。
[0135]圖9a:綴合物3的非還原SDS PAGE, rHA和hCG為對(duì)照。
[0136]圖9b:綴合物3的還原SDS PAGE, with rHA和不同濃度的hCG為對(duì)照。
[0137]圖9c:純綴合物3的SEC-HPLC分析。
[0138]圖1Oa:綴合物4的非還原SDS PAGE, rHA和hCG為對(duì)照。
[0139]圖1Ob:綴合物4的還原SDS PAGE, rHA和不同濃度的hCG為對(duì)照。
[0140]圖1Oc:純綴合物4的SEC-HPLC分析。
[0141]圖1la:綴合物3V1的非還原SDS PAGE, K473P_rHA和hCG為對(duì)照。
[0142]圖1lb:綴合物3V1的還原SDS PAGE, K573P_rHA和不同濃度的hCG為對(duì)照。
[0143]圖1c:純綴合物3V1的SEC-HPLC分析。
[0144]圖12a:綴合物4V1的非還原SDS PAGE, K573P_rHA和hCG為對(duì)照。
[0145]圖1lb:綴合物4V1的還原SDS PAGE, K573P_rHA和不同濃度的hCG為對(duì)照。
[0146]圖1lc:純綴合物4V1的SEC-HPLC分析。
[0147]圖13:轉(zhuǎn)染前擴(kuò)增的單基因載體的確認(rèn)。
[0148]圖14:使用抗-HSA (人血清白蛋白)的產(chǎn)品1_10的蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)。
[0149]圖15:使用抗-促性腺激素共同α-亞基的產(chǎn)品1_10的蛋白質(zhì)印跡。
[0150]圖16:使用抗-hCGi3-亞基的產(chǎn)品1-10的蛋白質(zhì)印跡。
[0151]圖17:產(chǎn)品1-10的SDS PAGE(非還原及還原)分析。
[0152]圖18:產(chǎn)品11-12的SDS PAGE(非還原及還原)分析。[0153]圖19a:hCG、綴合物3和綴合物4的體外活性測(cè)量。
[0154]圖19b:hCG、綴合物3vl、綴合物4V1、產(chǎn)品11和產(chǎn)品12的體外活性測(cè)量。
[0155]圖19c:hCG、產(chǎn)品2、產(chǎn)品3、產(chǎn)品4和產(chǎn)品5的體外活性測(cè)量。
[0156]圖19d:hCG、產(chǎn)品7、產(chǎn)品8、產(chǎn)品9和產(chǎn)品10的體外活性測(cè)量。
[0157]圖20a:四個(gè)日劑量后hCG體內(nèi)活性的測(cè)量。
[0158]圖20b:四個(gè)日劑量后hCG和綴合物3的體內(nèi)活性的測(cè)量。
[0159]圖20c:四個(gè)日劑量后hCG和綴合物3的體內(nèi)活性的測(cè)量。
[0160]圖20d:四個(gè)日劑量后hCG、綴合物3和綴合物4的體內(nèi)活性的測(cè)量。
[0161]圖20e:四個(gè)日劑量后hCG、綴合物3V1和綴合物4V1的體內(nèi)活性的測(cè)量。
[0162]圖20f:四個(gè)日劑量后hCG、產(chǎn)品2、產(chǎn)品3和產(chǎn)品8的體內(nèi)活性的測(cè)量。
[0163]圖20g:四個(gè)日劑量后hCG、產(chǎn)品11和產(chǎn)品12的體內(nèi)活性的測(cè)量。
[0164]圖20h:四個(gè)日劑量后hCG、產(chǎn)品4、產(chǎn)品5和產(chǎn)品10的體內(nèi)活性的測(cè)量。
[0165]圖201:四個(gè)日 劑量后hCG和產(chǎn)品7的體內(nèi)活性的測(cè)量。
[0166]圖20j:在第I天單次團(tuán)注后hCG、綴合物3、產(chǎn)品11和產(chǎn)品12的體內(nèi)活性的測(cè)量。
[0167]圖21a:在切除垂體的雄性大鼠中hCG、綴合物3和綴合物3V1的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)(線性標(biāo)度)。
[0168]圖21b:在切除垂體的雄性大鼠中hCG、綴合物3和綴合物3V1的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)(對(duì)數(shù)標(biāo)度)。
[0169]圖21c:hCG、綴合物3和綴合物3V1的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0170]圖21d:在切除垂體的雄性大鼠中hCG、綴合物3和綴合物3V1的終末半衰期的計(jì)
笪
ο
[0171]圖22a:在切除垂體的雄性大鼠中hCG、綴合物4V1、產(chǎn)品11和產(chǎn)品12的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)(線性標(biāo)度)。
[0172]圖22b:在切除垂體的雄性大鼠中hCG、綴合物4V1、產(chǎn)品11和產(chǎn)品12的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)(對(duì)數(shù)標(biāo)度)。
[0173]圖22c:hCG、綴合物4V1、產(chǎn)品11和產(chǎn)品12的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0174]圖22d:在切除垂體的雄性大鼠中hCG、綴合物4V1、產(chǎn)品11和產(chǎn)品12的終末半衰期的計(jì)算。
[0175]圖22e:在切除垂體的雄性大鼠中產(chǎn)品7和產(chǎn)品10的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)(線性標(biāo)度)。
[0176]圖22f:在切除垂體的雄性大鼠中產(chǎn)品7和產(chǎn)品10的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)(對(duì)數(shù)標(biāo)度)。
[0177]圖22g:產(chǎn)品7和產(chǎn)品10的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0178]圖22h:在切除垂體的雄性大鼠中產(chǎn)品7和產(chǎn)品10的終末半衰期的計(jì)算。
[0179]圖23a:在正常成年雄性大鼠中hCG、LH、綴合物3、綴合物3V1、產(chǎn)品2、產(chǎn)品3和產(chǎn)品7的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)(線性標(biāo)度)。
[0180]圖23b:在正常成年雄性大鼠中hCG、LH、綴合物3、綴合物3V1、產(chǎn)品2、產(chǎn)品3和產(chǎn)品7的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)(對(duì)數(shù)標(biāo)度)。
[0181]圖23c:LH和產(chǎn)品7的標(biāo)準(zhǔn)曲線。[0182]圖23d:在正常成年雄性大鼠中hCG、LH、綴合物3、綴合物3V1、產(chǎn)品2、產(chǎn)品3和產(chǎn)品7的終末半衰期的計(jì)算。
[0183]定義
[0184]在本發(fā)明的上下文中，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“ LH激動(dòng)劑”意指哺乳動(dòng)物或非哺乳動(dòng)物來(lái)源的分子，其結(jié)合并激活哺乳動(dòng)物(如人)的促黃體激素受體。LH激動(dòng)劑可以是有機(jī)小分子、肽、多肽、蛋白質(zhì)，并且可以通過合成方法、通過重組手段來(lái)產(chǎn)生，或者由組織或體液獲得。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“LH激動(dòng)劑”還包括其藥學(xué)上可接受的鹽。術(shù)語(yǔ)“LH激動(dòng)劑”包括hLH,hLH類似物和變體以及長(zhǎng)效hLH。該術(shù)語(yǔ)還包括hCG、hCG類似物和變體以及長(zhǎng)效hCG。
[0185]如本文所用，“IU比例”是一個(gè)組分的IU數(shù)與另一組分的IU數(shù)之比。值得注意的是，促性腺激素現(xiàn)在可以被表示成(質(zhì)量/g)而不是生物IU。在這種情況下，必須使用轉(zhuǎn)換因子將新的值轉(zhuǎn)成IU。如本文所用，通過ELISA或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的另外的免疫學(xué)方法測(cè)量哺乳動(dòng)物中的體內(nèi)血漿濃度，并表示成可與IU/L互換使用的每升IU。
[0186]在本發(fā)明的上下文中，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“長(zhǎng)效生物學(xué)活性促黃體激素(LH)化合物”或“LH化合物”(這些術(shù)語(yǔ)在整個(gè)說明書中可互換使用)意指連接至藥學(xué)上可接受的分子的LH激動(dòng)劑，如hCG或hLH，其具有與其結(jié)合的藥學(xué)上可接受的分子，以便修飾所述hCG或hLH的性質(zhì)。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“LH化合物”還包括其藥學(xué)上可接受的鹽。
[0187]在本發(fā)明的上 下文中，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“修飾的促黃體激素”或“修飾的LH”(這些術(shù)語(yǔ)在整個(gè)說明書中可互換使用)意指連接至藥學(xué)上可接受的分子的哺乳動(dòng)物L(fēng)HjnhLH，其具有與其結(jié)合的藥學(xué)上可接受的分子，以便修飾所述hLH的性質(zhì)。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“修飾的LH”還包括其藥學(xué)上可接受的鹽。
[0188]在本發(fā)明的上下文中，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“結(jié)合至哺乳動(dòng)物新生兒Fe受體的分子”意指對(duì)哺乳動(dòng)物新生兒Fe受體(FcRn)具有親和力的任何藥學(xué)上可接受的分子，如具有強(qiáng)親和力、弱親和力或中等親和力。FcRn在成人上皮組織中是活性的，并且表達(dá)在腸的內(nèi)腔、肺氣道、鼻表面、陰道表面、結(jié)腸和直腸表面中(第6，485，726號(hào)美國(guó)專利)。包含F(xiàn)cRn結(jié)合伴侶(例如，IgG、Fc片段)的融合蛋白能通過FcRn有效地穿越上皮屏障，從而提供非侵入性手段以全身性施用所需的治療分子。此外，包含F(xiàn)cRn結(jié)合伴侶的融合蛋白被表達(dá)FcRn的細(xì)胞內(nèi)吞和保護(hù)。這些融合蛋白不是被標(biāo)記為降解，而是被向外再循環(huán)再次進(jìn)入到循環(huán)里，從而增加這些蛋白質(zhì)的體內(nèi)半衰期。提高治療蛋白療效的一種方法是增加其血清持久性，從而允許較高的循環(huán)水平、較低頻度的施用和減少的劑量。白蛋白融合物或綴合物的半衰期或者Fe融合物或綴合物的半衰期在一個(gè)實(shí)例中取決于其與FcRn的pH依賴性結(jié)合。表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞的表面上的FcRn以pH依賴性方式結(jié)合白蛋白和/或Fe，并保護(hù)其防止降解。在pH6.0但不是pH7.4下與FcRn選擇性地結(jié)合強(qiáng)于相應(yīng)的野生型的一些白蛋白變體或Fe片段的變體在多種動(dòng)物模型中顯示出較長(zhǎng)的終末半衰期。對(duì)于含F(xiàn)e的分子，位于CH2與CH3結(jié)構(gòu)域之間界面的若干突變，如T250Q/M428L(Hinton PR.et al., 2004.Engineered human IgG antibodies with longer serum half-lives in primates.JBiol Chem.279(8):6213-6)和 252Y/S254T/T256E+H433K/N434F(Vaccaro C.et al., 2005.Engineering the Fe region of immunoglobulin G to modulate in vivo antibodylevels.Nat Biotechnol.23 (10): 1283-8)，已顯示出在體內(nèi)增加對(duì)FcRn的結(jié)合親和力和含F(xiàn)e-變體的分子的半衰期。然而，增加的FcRn結(jié)合與提高的半衰期之間并不總是有直接關(guān)系(Datta-Mannan A.et al., 2007.Humanized IgGlVariants with Differential BindingProperties to the Neonatal Fe Receptor: Relationship to Pharmacokinetics in Miceand Primates.Drug Metab.Dispos.35:86-94)。人白蛋白的變體以類似的方式已顯示出在體內(nèi)增加對(duì)FcRn的結(jié)合親和力和含白蛋白-變體的分子的半衰期(參見W02010/092135和 W02011/051489)。
[0189]在本發(fā)明的上下文中，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物抗體的Fe片段”意指恒定區(qū)，即哺乳動(dòng)物抗體的Fe片段或其片段，其中這種哺乳動(dòng)物抗體可選自哺乳動(dòng)物(如靈長(zhǎng)類動(dòng)物，例如人、猿或猴；馬科動(dòng)物，例如馬)的IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。哺乳動(dòng)物抗體的典型Fe片段是人抗體的重組Fe片段，如人IgG抗體的重組Fe片段。生成包含連接至所關(guān)注的蛋白質(zhì)或其片段的免疫球蛋白恒定區(qū)的融合蛋白已有描述(參見，例如第5，155，027、5，428，130,5, 480，981和5，808，029號(hào)美國(guó)專利)。這些分子通常兼有與所關(guān)注的連接分子相關(guān)的生物活性以及效應(yīng)子功能，或與免疫球蛋白恒定區(qū)相關(guān)的一些其它所需特性。包含免疫球蛋白的Fe部分的融合蛋白可對(duì)融合蛋白賦予若干可取的性質(zhì)，包括提高的穩(wěn)定性、增加的血清半衰期(參加Capon et al.(1989) Nature337:525)以及對(duì)諸如新生兒Fe受體(FcRn)的Fe受體的結(jié)合(第6，086，875,6, 030，613和6，485，726號(hào)美國(guó)專利)。
[0190]在本發(fā)明的上下文中，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物抗體的Fe片段的變體”或“Fe變體”(在整個(gè)本說明書中可互換使用)意指哺乳動(dòng)物抗體的Fe片段，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基(如Fe片段的1-10氨基酸殘基)已被其它氨基酸殘基取代，和/或其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基(如1-10氨基酸殘基)已被從Fe片段中刪除，和/或其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基(如1-10氨基酸殘基)已被加至Fe片段，和/或其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基(如Fe片段中的1-10氨基酸殘基)已被修飾。這種氨基酸殘基的增加或刪除可發(fā)生在例如Fe片段的N-末端和/或Fe片段的C-末端。Fe變體是指由天然Fe修飾的分子或序列，但仍包含挽救受體，F(xiàn)cRn，的結(jié)合位點(diǎn)(W097/34631)。天然是指未被人修飾的Fe。W096/32478描述了示例性Fe變體以及與挽救受體的相互作用。因此，術(shù)語(yǔ)“Fe變體”在一個(gè)實(shí)施方案中包含由非人類天然Fe人源化的分子或序列。此外，天然Fe包含可除去的位點(diǎn)，因?yàn)樗鼈兲峁┝吮景l(fā)明的融合分子不需要的結(jié)構(gòu)特征或生物活性。因此，F(xiàn)e變體包含缺少一個(gè)或多個(gè)影響或涉及以下方面的天然Fe位點(diǎn)或殘基的分子或序列，(I) 二硫鍵形成，(2)與選定的宿主細(xì)胞不相容，(3)在選定的宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)的N-末端不均一性，(4)糖基化，(5)與補(bǔ)體的相互作用，(6)結(jié)合至挽救受體以外的Fe受體，或(7)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)?？筛鶕?jù)諸如定點(diǎn)誘變等的公認(rèn)程序修飾IgG的Fe區(qū)以產(chǎn)生將被FcRn結(jié)合的修飾的IgG或Fe片段或其部分。這種修飾包括遠(yuǎn)離FcRn接觸位點(diǎn)的修飾以及在保持或甚至增強(qiáng)對(duì)FcRn的結(jié)合的接觸位點(diǎn)內(nèi)的修飾。例如，人IgGlFc(Fcyl)中的以下單氨基酸殘基可被取代而不顯著損失對(duì) FcRn 的 Fe 結(jié)合親和力:P238A、S239A、K246A、K248A、D249A、M252A、T256A、E258A、T260A、D265A、S267A、H268A、E269A、D270A、E272A、L274A、N276A、Y278A、D280A、V282A、E283A、H285A、N286A、T289A、K290A、R292A、E293A、E294A、Q295A、Y296F、N297A、S298A、Y300F、R301A、V303A、V305A、T307A、L309A、Q311A、D312A、N315A、K317A、E318A、K320A、K322A、S324A、K326A、A327Q、P329A、A330Q、A330S、P331A、P331S、E333A、K334A、T335A、S337A、K338A、K340A、Q342A、R344A、E345A、Q347A、R355A、E356A、M358A、T359A、K360A、N361A、Q362A、Y373A、S375A D376A、A378Q、E380A、E382A、S383A、N384A、Q386A、E388A、N389A、N390A、Y391F、K392A、L398A、S400A、D401A、D413A、K414A、R416A、Q418A、Q419A、N421A、V422A、S424A、E430A、N434A、T437A、Q438A、K439A、S440A、S444A 和 K447A，其中例如 P238A代表在238號(hào)位置被丙氨酸取代的野生型脯氨酸。除了丙氨酸外，其它氨基酸可以在上面指定的位置取代野生型氨基酸。可以將突變單獨(dú)引入Fe，產(chǎn)生超過一百種不同于天然Fe的FcRn結(jié)合伴侶。此外，可將這些單個(gè)突變中的兩種、三種或更多種的組合一起引入，產(chǎn)生數(shù)百多種FcRn結(jié)合伴侶。上述突變中的某些可對(duì)FcRn結(jié)合伴侶賦予新功能性。例如，一個(gè)實(shí)施方案采用N297A，除去高度保守的N-糖基化位點(diǎn)。此突變的作用是減少對(duì)免疫效應(yīng)細(xì)胞的結(jié)合并潛在地降低免疫原性，從而提高FcRn結(jié)合伴侶的循環(huán)半衰期，并且使FcRn結(jié)合伴侶不能結(jié)合FcyR1、FcyRIIA、FcyRIIB和FcyRIIIA,而不使對(duì)FcRn的親和力受損(Routledgeet al.(1995)Transplantation60:847 ；Friend et al.(1999)Transplantation68:1632 ；Shields et al.(1995) J.Bio1.Chern.276:6591) ? 此外，至少三種人Fcy 受體似乎可識(shí)別下游鉸鏈區(qū)內(nèi)IgG上的結(jié)合位點(diǎn)，通常為氨基酸234-237。因此，另一例新功能性及潛在降低的免疫原性可由此區(qū)的突變引起，例如通過用來(lái)自lgG2 “PVA”的相應(yīng)序列(刪除一個(gè)氨基酸)替換人IgGl“ELLG”的氨基酸233-236。已經(jīng)顯示當(dāng)已引入這種突變時(shí)，介導(dǎo)各種效應(yīng)子功能的 FcyR1、FcyRII 和 FcyRIII 將不結(jié)合至 IgGl (Ward and Ghetie (1995) TherapeuticImmunology2:77 和 Armour et al.(1999)Eur.J.Tmmunol.29:2613) ? 作為起因于上述突變的新功能性的進(jìn)一步的例子，在一些情況下對(duì)FcRn的親和力可被增加超出野生型的情況。這一增加的親和力可反映增加的“結(jié)合”率(on rate)、減小的“離解”率(off rate)或增加的“結(jié)合”率和減小的“離解”率兩者。據(jù)認(rèn)為對(duì)FcRn賦予增加的親和力的突變包括T256A、T307A、E380A和 N434A (Shields et al.(2001) J.Bio1.Chem.276:6591)。此外，F(xiàn)e 片段的這種變體包括且不 限于描述在例如Atwell et all J.Mol.Biol.(1997)，270，26-35和Ridgway et al Protein Engineering, vol.9，n0.7，pp617_621, 1996 中的“旋鈕-入-洞(knob-1nto-hole) ”或“KnH”技術(shù)。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“旋鈕-入-洞”或“KnH”技術(shù)是指通過將突出(旋鈕)引進(jìn)一個(gè)多肽并且將腔(洞)引進(jìn)另一個(gè)多肽(在它們相互作用的界面)而在體外或體內(nèi)引導(dǎo)兩個(gè)多肽配對(duì)到一起。例如，KnH已被引入在抗體的Fe:Fe結(jié)合界面、CL:CHI 界面或 VH:VL 界面中(例如，US2007/0178552, US12/811, 207、US20100286374、W096/027011、W098/050431 和 Zhu et a!.(1997)Protein Science6:781-788)。這特別適用于在生產(chǎn)多特異性抗體或異二聚Fe-融合分子期間驅(qū)動(dòng)將兩個(gè)不同的重鏈配對(duì)到一起。例如，在其Fe區(qū)具有KnH的多特異性抗體可進(jìn)一步包含連接至每個(gè)Fe區(qū)的單可變結(jié)構(gòu)域，或者進(jìn)一步包含與類似或不同的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域配對(duì)的不同的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。KnH技術(shù)也可用于將兩個(gè)不同的受體胞外結(jié)構(gòu)域配對(duì)到一起或包含不同的靶識(shí)別序列的任何其它多肽序列(例如，包括親和體、肽體及其它Fe融合物)。KnH技術(shù)也可用于將例如促性腺激素分子中的兩個(gè)不同的鏈(如Fe-融合物中的FSH、LH、hCG或TSH)配對(duì)。
[0191]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的鹽”旨在表示對(duì)待治療的哺乳動(dòng)物受試者無(wú)害的鹽。這種鹽包括藥學(xué)上可接受的酸加成鹽、藥學(xué)上可接受的金屬鹽、銨鹽和烷基化銨鹽。酸加成鹽包括無(wú)機(jī)酸以及有機(jī)酸的鹽。合適的無(wú)機(jī)酸的代表性例子包括鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、磷酸、硫酸、硝酸等。合適的有機(jī)酸的代表性例子包括甲酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、丙酸、苯甲酸、肉桂酸、梓檬酸、富馬酸、乙醇酸、乳酸、馬來(lái)酸、蘋果酸、丙二酸、扁桃酸、草酸、苦味酸、丙酮酸、水楊酸、丁二酸、甲磺酸、乙磺酸、酒石酸、抗壞血酸、撲酸、雙亞甲基水楊酸、乙二磺酸、葡糖酸、檸康酸、天冬氨酸、硬脂酸、棕櫚酸、EDTA、乙醇酸、對(duì)氨基苯甲酸、谷氨酸、苯磺酸、對(duì)甲苯磺酸等。藥學(xué)上可接受的無(wú)機(jī)或有機(jī)酸加成鹽的進(jìn)一步例子包括在J.Pharm.Sc1.66，2，(1977)中列出的藥學(xué)上可接受的鹽，該文獻(xiàn)以引用的方式并入本文。金屬鹽的例子包括鋰、鈉、鉀、鎂鹽等。銨和烷基化銨鹽的例子包括銨、甲基銨、二甲基銨、三甲基銨、乙基銨、羥乙基銨、二乙基銨、丁基銨、四甲基銨鹽等。
[0192]在本發(fā)明的上下文中，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“絨膜促性腺激素”意指哺乳動(dòng)物來(lái)源的絨膜促性腺激素，例如靈長(zhǎng)類動(dòng)物(如人)絨膜促性腺激素或馬科動(dòng)物絨膜促性腺激素(如馬絨膜促性腺激素)，和重組絨膜促性腺激素，如重組人絨膜促性腺激素，以及這種絨膜促性腺激素的類似物。如本文所用，“CG”和“絨膜促性腺激素”是可互換的。當(dāng)CG是哺乳動(dòng)物的絨膜促性腺激素(如hCG和重組hCG)的類似物時(shí)，所述類似物被理解為通過用另一種天然或非天然氨基酸取代CG (例如hCG)序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；和/或通過對(duì)CG (例如hCG)序列增加一個(gè)或多個(gè)天然或非天然氨基酸；和/或通過從CG (例如hCG)序列中刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而獲得的化合物，其中可任選在任何這些步驟的隨后進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的進(jìn)一步衍生化。特別地，一個(gè)氨基酸殘基被同組的另一個(gè)氨基酸殘基取代，即被具有類似性質(zhì)的另一個(gè)氨基酸殘基取代，從這個(gè)意義上來(lái)說，這種取代是保守的。根據(jù)其性質(zhì)，可以方便地將氨基酸分成以下組:堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨酸、組氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(如谷氨酰胺、半胱氨酸和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)和小氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)。通常，CG與hCG具有至少80%的同一性，并且通常具有hCG的CG體內(nèi)活性的至少20%。
[0193]在本發(fā)明的上下文中，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“促黃體激素”或“哺乳動(dòng)物促黃體激素”意指哺乳動(dòng)物來(lái)源的促黃體激素，如靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如人)或馬促黃體激素和重組促黃體激素(如重組人、馬、猿或猴促黃體激素)，以及這種促黃體激素的類似物。如本文所用，“LH”和“促黃體激素”是可互換的。當(dāng)LH是哺乳動(dòng)物的促黃體激素(如hLH和重組hLH)的類似物時(shí)，所述類似物被理解為通過用另一種天然或非天然氨基酸取代LH(例如hLH)序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；和/或通過對(duì)LH(例如hLH)序列增加一個(gè)或多個(gè)天然或非天然氨基酸；和/或通過從LH(例如hLH)序列中刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而獲得的化合物，其中可任選在任何這些步驟的隨后進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的進(jìn)一步衍生化。特別地，一個(gè)氨基酸殘基被同組的另一個(gè)氨基酸殘基取代，即被具有類似性質(zhì)的另一個(gè)氨基酸殘基取代，從這個(gè)意義上來(lái)說，這種取代是保守的。根據(jù)其性質(zhì)，可以方便地將氨基酸分成以下組:堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨酸、組氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(如谷氨酰胺、半胱氨酸和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)和小氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)。通常，LH與hLH具有至少80%的同一性，并且通常具有hLH的LH體內(nèi)活性的至少20%。對(duì)于本發(fā)明的目的而言，hLH、hLH類似物和變體以及長(zhǎng)效hLH不包括hCG、hCG類似物和變體以及長(zhǎng)效hCG。
[0194]在本發(fā)明的上下文中，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“卵泡刺激激素”意指哺乳動(dòng)物來(lái)源的卵泡刺激激素，如人、馬科動(dòng)物、?；蜇i卵泡刺激激素，和重組卵泡刺激激素，如重組人、馬科動(dòng)物、?；蜇i卵泡刺激激素，以及這種卵泡刺激激素的類似物。如本文所用,“FSiriP“卵泡刺激激素”是可互換的。對(duì)于卵泡生長(zhǎng)的刺激，F(xiàn)SH可得自外源，或者可在婦女中內(nèi)源性產(chǎn)生，其量高于正常量，f.1.通過提供作為對(duì)垂體的雌二醇拮抗劑的檸檬酸克羅米芬。
[0195]當(dāng)FSH是哺乳動(dòng)物的卵泡刺激激素(如hFSH和重組hFSH)的類似物時(shí)，所述類似物被理解為通過用另一種天然或非天然氨基酸取代FSH(例如hFSH)序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；和/或通過對(duì)FSH (例如hFSH)序列增加一個(gè)或多個(gè)天然或非天然氨基酸；和/或通過從FSH(例如hFSH)序列中刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而獲得的化合物，其中可任選在任何這些步驟的隨后進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的進(jìn)一步衍生化。特別地，一個(gè)氨基酸殘基被同組的另一個(gè)氨基酸殘基取代，即被具有類似性質(zhì)的另一個(gè)氨基酸殘基取代，從這個(gè)意義上來(lái)說，這種取代是保守的。根據(jù)其性質(zhì)，可以方便地將氨基酸分成以下組:堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨酸、組氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(如谷氨酰胺、半胱氨酸和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)和小氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)。重組產(chǎn)生的FSH或FSH的類似物通常得自哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，如人或倉(cāng)鼠細(xì)胞系，例如選自CHO、BHK和HEK的細(xì)胞系。通常，F(xiàn)SH與hFSH具有至少80%的同一性，并且通常具有hFSH的FSH體內(nèi)活性的至少20%。
[0196]如本文所用的術(shù)語(yǔ)“具有FSH活性的分子”意指當(dāng)對(duì)哺乳動(dòng)物施用時(shí)結(jié)合并激活FSH受體的分子，例如這種分子可(不限于)選自任何一種有機(jī)小分子。
[0197]在本發(fā)明的上下文中，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“連接子”意指將LH激動(dòng)劑(例如哺乳動(dòng)物L(fēng)H)和藥學(xué)上可接受的分子分開的價(jià)鍵或多官能部分，如雙官能部分。多官能部分(如雙或三官能的)共價(jià)連接 至一種或多種LH激動(dòng)劑(如一種或多種哺乳動(dòng)物L(fēng)H)，并共價(jià)連接至一種或多種藥學(xué)上可接受的分子，以便產(chǎn)生LH化合物，如修飾的LH。連接子可以是穩(wěn)定的，這意味著在治療的時(shí)間段中，在生理?xiàng)l件(例如攝氏37度的溫度和pH7.4)下不發(fā)生顯著的化學(xué)反應(yīng)，例如水解。這可以通過本領(lǐng)域中已知的穩(wěn)定性研究予以確定。連接子可以是不穩(wěn)定的，這意味著在生理相關(guān)的條件(例如攝氏37度的溫度和pH7.4)下化學(xué)鍵斷裂，通常是通過水解被斷裂。這可以通過本領(lǐng)域中已知的穩(wěn)定性研究予以確定。連接子可以是化學(xué)連接子，這意味著它是在活細(xì)胞以外通過有機(jī)化學(xué)產(chǎn)生的。連接子可以是糖部分，如對(duì)蛋白質(zhì)糖基化，或者可以進(jìn)行化學(xué)制備并用于連接LH激動(dòng)劑(例如哺乳動(dòng)物L(fēng)H)和藥學(xué)上可接受的分子。連接子可以是二硫橋，如各自在LH激動(dòng)劑(例如哺乳動(dòng)物L(fēng)H)與藥學(xué)上可接受的分子中的兩個(gè)半胱氨酸(Cys)氨基酸殘基之間的-S-S-鍵。連接子可以是融合連接子，這意味著LH化合物(例如修飾的LH)可以在活細(xì)胞中被表達(dá)為一種多肽或蛋白質(zhì)。連接子可以是用化學(xué)部分將LH激動(dòng)劑(例如哺乳動(dòng)物L(fēng)H)和藥學(xué)上可接受的分子分開的親水連接子，所述化學(xué)部分包含至少5個(gè)非氫原子，其中的30-50%為N或O。連接子可以是可水解的，如 US6515100、US7122189、US7700551、W02004089280、W02006138572 和W02009095479中所述。在本發(fā)明中適合作為連接子的典型化合物包括選自具有二羧酸、馬來(lái)酰亞胺基酰肼、PDPH、SPDP、LC-SPDP、GMBS、羧酸酰肼和小肽的化合物。根據(jù)本發(fā)明適合作為連接子的化合物的更具體的例子包括:(a) 二羧酸，如丁二酸、戊二酸和己二酸；(b)馬來(lái)酰亞胺基酰肼，如N-[馬來(lái)酰亞胺基己酸]酰肼(EMCH)、N-[馬來(lái)酰亞胺基丙酸丙酸]酰肼(MPH或BMPH)、4_ [N-馬來(lái)酰亞胺基甲基]環(huán)己烷_1_羧基酰肼和N- [k_馬來(lái)酰亞胺基十一烷酸]酰肼(KMUH)、4-(4-N-馬來(lái)酰亞胺基苯基)丁酸酰肼(MPBH) ； (c)NHS-3-馬來(lái)酰亞胺基丙酸酯琥珀酰亞胺酯(MPS-EDA) ;(d)PDPH連接子，如綴合至巰基反應(yīng)蛋白的(3_[2_吡啶基二硫代]丙酰肼)；(e) N-琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(STOP)，(f)琥珀酰亞胺基6-(3-[2_吡啶基二硫代]-丙酰胺基)己酸酯(LC-SPDP)，(g)N_U_馬來(lái)酰亞胺基丁酰氧基)琥珀酰亞胺酯(GMBS)，和(h)選自2-5個(gè)碳原子的羧酸酰肼。其它非肽連接子也是可能的。例如，可以使用烷基連接子，如-NH-(CH2)m-C(0)-，其中m是選自2_20的整數(shù)。這些烷基連接子可以被任何非空間位阻基團(tuán)進(jìn)一步取代，如低級(jí)烷基(例如，Cl至C6)低級(jí)?；?、鹵素(例如，Cl、Br、1、F)、CN、NH2、苯基等。示例性非肽連接子為PEG連接子。根據(jù)本發(fā)明適用的另外的連接子描述在第6，660，843號(hào)美國(guó)專利中。其中藥學(xué)上可接受的分子融合至LH激動(dòng)劑的本發(fā)明的LH化合物可任選包含至少一個(gè)肽連接子。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接子包含通過肽鍵連接在一起的氨基酸，其中氨基酸選自二十種天然存在的氨基酸。在各種實(shí)施方案中，連接子可包含1-5個(gè)氨基酸、I至10個(gè)氨基酸、1-20個(gè)氨基酸、10-50個(gè)氨基酸、50-100個(gè)氨基酸或100-200個(gè)氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，氨基酸選自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和賴氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接子由大多數(shù)無(wú)空間位阻的氨基酸組成，如甘氨酸和丙氨酸。連接子在一個(gè)實(shí)施方案中可包含序列Gn(等效地，-(Gly)n-)。連接子在一個(gè)實(shí)施方案中可包含序列(GGS)n或(GGGGS)n。在每個(gè)例子中，η是整數(shù)，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。連接子的例子包括但不限于GGG、SGGSGGS(SEQ ID NO:58)、GGSGGSGGSGGSGGG(SEQ ID NO:59)、GGSGGSGGSGGSGGSGGS(SEQ IDNO:60)和GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 57)。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接子是8-氨基酸連接子 EFAGAAAV(SEQ ID NO:56)。
[0198]將諸如LH激動(dòng)劑(例如哺乳動(dòng)物L(fēng)H)和藥學(xué)上可接受的分子的兩種或更多種分子連接在一起(并且任選經(jīng)由多官能連接子，如雙官能連接子)的不同技術(shù)是現(xiàn)有技術(shù)中就有的，這里合適的參考文獻(xiàn)是W00158493，包括其中所列舉和引用的所有相關(guān)文件。
[0199]在本發(fā)明的上下文中，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的分子”意指選自有機(jī)小分子、肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)、受體、糖基化、糖、聚合物(例如聚乙二醇，PEG)、核酸(例如DNA和RNA)、激素中的任何一種的分子，當(dāng)其連接至LH激動(dòng)劑(例如哺乳動(dòng)物L(fēng)H)時(shí)增加LH激動(dòng)劑(例如哺乳動(dòng)物L(fēng)H)或LH化合物(例如修飾的LH)的血清半衰期。通常，藥學(xué)上可接受的分子是而不限于白蛋白(如人白蛋白、重組白蛋白)或聚合物(如PEG，例如分子量為至少IOkDajB IOkDa至150kDa的PEG)。此外，藥學(xué)上可接受的分子可選自哺乳動(dòng)物抗體的Fe片段、轉(zhuǎn)鐵蛋白、白蛋白(如人白蛋白、重組白蛋白、白蛋白的變體)、其中η是8至22的CH3(CH2)nC0-或聚合物(如PEG，例如分子量為至少5kDa、如IOkDa至150kDa、通常 10 至 40kDa 的 PEG)。
[0200]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“體內(nèi)血漿半衰期”按其正常的含義使用，即在生物系統(tǒng)中LH激動(dòng)劑(例如哺乳動(dòng)物L(fēng)H)或LH化合物(例如修飾的LH)的量通過生物過程減少到其值的一半所需的時(shí)間。
[0201 ] 可與“血漿半衰期”或“半衰期”互換使用的術(shù)語(yǔ)“血清半衰期”按其正常的含義使用，即在生物系統(tǒng)中LH激動(dòng)劑(例如哺乳動(dòng)物L(fēng)H)或LH化合物(例如修飾的LH)、重組或尿hCG或LH或FSH或者長(zhǎng)效hCG、長(zhǎng)效LH或長(zhǎng)效FSH的量減少到其濃度的一半所需的時(shí)間。因此如本文所用，“血清半衰期”表示體內(nèi)血清半衰期。血清半衰期的測(cè)定通常比功能半衰期的測(cè)定更簡(jiǎn)單，并且血清半衰期的大小通常是功能體內(nèi)半衰期大小的良好指示。優(yōu)選在哺乳動(dòng)物中測(cè)量血清半衰期，更優(yōu)選人科物種，如紅毛猩猩、黑猩猩或大猩猩，更優(yōu)選在人中測(cè)量。本申請(qǐng)中提到的血清半衰期是按在人中測(cè)定的半衰期。也可以在諸如小鼠或大鼠或倉(cāng)鼠的嚙齒類動(dòng)物中獲得半衰期或半衰期的任何變化的指示。此外，可以在體重范圍與人相同或者體重比嚙齒類動(dòng)物更接近人的較大型哺乳動(dòng)物中測(cè)量半衰期:優(yōu)選猴、狗、豬或牛(小牛)。根據(jù)本發(fā)明，半衰期比重組或尿促性腺激素(FSH、LH或hCG)長(zhǎng)的促性腺激素被認(rèn)為是“長(zhǎng)效”的。
[0202]結(jié)合血漿半衰期使用的術(shù)語(yǔ)“增加的”用于表示在可比較的條件下測(cè)定時(shí)，相對(duì)于LH激動(dòng)劑(例如哺乳動(dòng)物L(fēng)H)的情況，LH化合物(例如修飾的LH)的相關(guān)半衰期在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著增加。比如，相關(guān)半衰期可增加至少約25%，如至少約50%，例如至少約100%、150%、200%、250%或500%。可以按文獻(xiàn)中描述的多種方式進(jìn)行體內(nèi)血漿半衰期的測(cè)量。體內(nèi)血漿半衰期的增加可以被量化為清除率的減少或平均停留時(shí)間(MRT)的增加。按合適的測(cè)定方法確定，本發(fā)明的LH化合物(例如修飾的LH)，其清除率被減少到LH激動(dòng)劑(例如哺乳動(dòng)物L(fēng)H)的清除率的不到70%，如不到50%，如不到20%，如不到10%，這被認(rèn)為是具有增加的體內(nèi)血漿半衰期。按合適的測(cè)定方法確定，本發(fā)明的LH化合物(例如修飾的LH)，其MRT增加到LH激動(dòng)劑(例如哺乳動(dòng)物L(fēng)H)的MRT的超過130 %，如超過150 %，如超過200%，如超過500%，這被認(rèn)為是具有增加的體內(nèi)血漿半衰期?？墒褂煤线m的試驗(yàn)動(dòng)物在標(biāo)準(zhǔn)的藥代動(dòng)力學(xué)研究中評(píng)估清除率和平均停留時(shí)間。本領(lǐng)域技術(shù)人員有能力針對(duì)給定的蛋白質(zhì)來(lái)選擇合適的試驗(yàn)動(dòng)物。當(dāng)然人體試驗(yàn)代表最根本的試驗(yàn)。合適的試驗(yàn)動(dòng)物包括正常的Sprague-Dawley雄性大鼠、小鼠和食蟹猴。通常對(duì)小鼠和大鼠注射單次皮下藥團(tuán)，而可以對(duì)猴注射單次皮下藥團(tuán)或注射單次iv劑量。注射量取決于試驗(yàn)動(dòng)物的情況。隨后，視情況經(jīng)一至十天取血樣(取決于測(cè)定的靈敏度情況，這可能要長(zhǎng)達(dá)30天)用于評(píng)估清除率和MRT。通過ELISA技術(shù)或其它免疫學(xué)技術(shù)方便地對(duì)血樣進(jìn)行分析。
[0203]在本發(fā)明的上下文中，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物來(lái)源”意指獲自哺乳動(dòng)物，因此哺乳動(dòng)物來(lái)源的LH激動(dòng)劑可例如是獲自哺乳動(dòng)物組織或血液的人CG或人LH，或者可通過重組方法獲得，如重組蛋白質(zhì)、重組多肽，比如哺乳動(dòng)物來(lái)源的LH激動(dòng)劑可以是重組哺乳動(dòng)物CG或重組哺乳動(dòng)物L(fēng)H，比如重組人CG或LH。
[0204]在本發(fā)明的上下文中，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“非哺乳動(dòng)物來(lái)源”意指獲自不是哺乳動(dòng)物的來(lái)源，如合成肽、寡肽和多肽或有機(jī)小分子，比如非哺乳動(dòng)物來(lái)源的LH激動(dòng)劑可以是結(jié)合并激活LH受體的有機(jī)小分子或5至20個(gè)氨基酸的短肽。
[0205]在本發(fā)明的上下文中，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“血漿濃度”意指在注射LH激動(dòng)劑后的任意給定時(shí)間可在循環(huán)中測(cè)量的濃度。
[0206]在本發(fā)明的上下文中，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“注射”意指通過腸胃外途徑施用，如通過皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)施用或者借助于針筒或其它施用裝置靜脈內(nèi)注射。
[0207]在本發(fā)明的上下文中，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“FSH治療”意指標(biāo)準(zhǔn)的卵泡刺激激素治療。在自發(fā)月經(jīng)周期的開始，卵泡募集(即，卵泡的早期生長(zhǎng))需要FSH，并且它也支持中期和晚期卵泡生成。治療性地施用FSH以在無(wú)排卵婦女和經(jīng)受COS的婦女中誘導(dǎo)卵泡生成。在傳統(tǒng)的排卵刺激方法中，在整個(gè)治療過程中施用FSH，直到獲取卵母細(xì)胞之時(shí)。
[0208] 在本發(fā)明的上下文中，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“類似物”(analog，analogue:在整個(gè)本說明書中可互換使用)意指多肽或蛋白質(zhì)，其中多肽或蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基已被其它氨基酸殘基取代，和/或其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基已被從肽中刪除，和/或其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基已被添加至多肽或蛋白質(zhì)。這種氨基酸殘基的增加或刪除可發(fā)生在例如肽的N-末端和/或肽的C-末端?？捎煤?jiǎn)單的系統(tǒng)來(lái)描述類似物:例如，包含突變R133C的hCG類似物指示其中在hCG的位置133處天然存在的R已被C取代的類似物。另一個(gè)例子，包含突變L121C的hLH類似物指示其中在hLHβ鏈的位置121處天然存在的L已被C取代的類似物，采用根據(jù)IUPAC-1UB用于氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫來(lái)描繪多肽或蛋白質(zhì)類似物的化學(xué)式。
[0209]在本發(fā)明的上下文中，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“同一性”是指兩種或更多種蛋白質(zhì)的序列之間的關(guān)系，是通過比較序列測(cè)定的。在本領(lǐng)域中，“同一性”還意指蛋白質(zhì)之間的序列相關(guān)性程度，按兩種或更多種氨基酸殘基的鏈之間的匹配數(shù)來(lái)測(cè)定?！巴恍浴睖y(cè)量?jī)蓚€(gè)或多個(gè)序列的較小者之間的完全相同匹配的百分比，通過特定的數(shù)學(xué)模型或計(jì)算機(jī)程序(即“算法”)處理空位比對(duì)(如果有的話)。通過已知的方法可以很容易地計(jì)算出相關(guān)蛋白質(zhì)的同一性。這類方法包括但不限于以下文獻(xiàn)中描述的方法:Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press,NewYork, 1988 ；Biocomputing:1nformatics and Genome Projects, Smith, D.ff., ed., AcademicPress, New York, 1993 ；Computer Analysis of Sequence Data, Parti, Griffin, A.M., andGriffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994 ；Sequence Analysis in MolecularBiology, von Heinje, G., Academic Press, 1987 ；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.and Devereux, J., eds., M.Stockton Press, New York, 1991 ；和 Carillo et al., SIAMJ.Applied Math.，48，1073, (1988)。設(shè)計(jì)用于測(cè)定同一11"生的優(yōu)選方法以給出測(cè)試序列之間的最大匹配?？晒姭@得的計(jì)算機(jī)程序中描述了測(cè)定同一性的方法。測(cè)定兩序列之間的同一11"生的優(yōu)選計(jì)算機(jī)程序方法包括:GCG程序包,包括GAP (Devereux et al., Nucl.Acid.Res.,12,387, (1984) ；Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison,Wis.)、BLASTP、BLASTN 和 FASTA(Altschul et al.,J.Mol.Biol.，215，403-410，(1990))。公眾可從國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)及其它來(lái)源(BLAST Manual,Altschul et al.NCB /NLM / NIH Bethesda，Md.20894 ；Altschul et al.，同上)獲得BLASTX程序。也可以使用熟知的Smith Waterman算法來(lái)測(cè)定同一性。例如，使用計(jì)算機(jī)算法GAP (Genetics ComputerGroup, University of Wisconsin, Madison, Wi s.),比對(duì)要測(cè)定序列同一性百分比的兩種蛋白質(zhì)的相應(yīng)氨基酸的最佳匹配(由算法測(cè)定的“匹配跨度(matched span)”)?？瘴婚_放罰分(其計(jì)算為3乘以平均對(duì)角線；“平均對(duì)角線”為所使用的比較矩陣的對(duì)角線的平均值；“對(duì)角線”是由特定的比較矩陣分配給每個(gè)完全氨基酸匹配的分值或數(shù)值)和空位延伸罰分(其通常為{分?jǐn)?shù)(I / 10)}乘以空位開放罰分)以及比較矩陣(如PAM250或BL0SUM62)與算法聯(lián)合使用。算法還使用標(biāo)準(zhǔn)比較矩陣(對(duì)于PAM250比較矩陣，參見Dayhoff et al., Atlas of ProteinSequence and Structure, vol.5, supp.3 (1978);對(duì)于BL0SUM62 比較矩陣，參見 Henikoff et al., Proc.Natl.Acad.Sci USA, 89,10915—10919,(1992))。蛋白質(zhì)序列比較的優(yōu)選參數(shù)包括以下:算法:Needleman et al., J.Mol.Biol,48,443-453，(1970);比較矩陣:BL0SUM62，來(lái)自 Henikoff et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,89,10915-10919, (1992);空位罰分:12，空位長(zhǎng)度罰分:4，相似性閾值:0。采用上述參數(shù)的GAP程序是適用的。前述參數(shù)是使用GAP算法的蛋白質(zhì)比較的缺省參數(shù)(連同末端空位沒有罰分)。使用例如ClustalW程序(1.8版，1999年6月)、使用缺省參數(shù)(Thompson etal.，1994，ClustalW !Improving the sensitivity of progressive multiple sequencealignment through sequence weighting， position-specific gap penalties andweight matrix choice，Nucleic Acids Res..22:4673—4680)由比對(duì)序列方便地測(cè)定氨基酸序列同源性/同一性，并通過使用GENED0C第2.5版進(jìn)行分析(Nicholas et al.，1997GeneDoc:Analysis and Visualization of Genetic Variation, EMBNEW.NEWS4:14 ；Nicholas, Κ.B.and Nicholas Η.B.Jr.1997GeneDoc:Analysis and Visualization ofGenetic Variation)。
[0210]在哺乳動(dòng)物物種的循環(huán)血液中最豐富的蛋白質(zhì)組分是血清白蛋白，其存在的濃度通常是每100毫升全血為大約3至4.5克。血清白蛋白是大約70，000道爾頓(Da)的血液蛋白質(zhì)，其在循環(huán)系統(tǒng)中具有若干重要的功能。其充當(dāng)血液中存在的多種有機(jī)分子的轉(zhuǎn)運(yùn)體、諸如脂肪酸和膽紅素的各種代謝產(chǎn)物通過血液的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體，并且由于其量豐富，充當(dāng)循環(huán)血液的滲透調(diào)節(jié)劑。在本發(fā)明的上下文中，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“白蛋白”意指哺乳動(dòng)物來(lái)源或非哺乳動(dòng)物來(lái)源的白蛋白，如Peters，T.，Jr.(1996)All aboutAlbuminiBiochemistryj Genetics and Medical, Applications pplO，Academic Press, Inc.，Orlando (ISBN0-12-552110-3)中描述的人血清白蛋白，或者重組人白蛋白或修飾的白蛋白，如按W02011051489和W02010092135中所描述的那樣修飾的人白蛋白。
[0211 ] W02011051489，說明書涉及親本白蛋白的變體，與親本白蛋白相比，其血漿半衰期改變了。本發(fā)明還涉及包含所述變體白蛋白的融合多肽和綴合物。 [0212]W02010092135，基于白蛋白的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)明人已設(shè)計(jì)了具有一個(gè)或多個(gè)帶游離巰基的半胱氨酸殘基的變體多肽(突變蛋白)(下文稱“硫代-白蛋白")。變體多肽可通過半胱氨酸殘基的硫原子綴合至綴合伴侶，如生物活性化合物。
[0213]W02005054286，說明書涉及包含白細(xì)胞介素Il(IL-1l)的蛋白質(zhì)(包括但不限于其片段和變體)，其顯示出血小板生成或抗炎性質(zhì)，融合至白蛋白(包括但不限于白蛋白的片段或變體)。
[0214]W02004083245描述了一種藥劑，其在患有NS的患者中的半衰期大于天然產(chǎn)生的白蛋白，該藥劑包含結(jié)合于第二多肽的白蛋白樣第一多肽。
[0215]W003066681描述了一種組合物，其包含通過添加高度純化的重組人血清白蛋白而穩(wěn)定化的非白蛋白蛋白質(zhì)。該非白蛋白蛋白質(zhì)可以是因子VIII。
[0216]如本文所用的術(shù)語(yǔ)“聚合物”意指通過兩種或更多種單體鍵連形成的分子，其中除了聚合物是人白蛋白或別的豐富血漿蛋白質(zhì)的情況外，沒有一種單體是氨基酸殘基。術(shù)語(yǔ)“聚合物”可與術(shù)語(yǔ)“聚合物分子”互換使用。該術(shù)語(yǔ)旨在涵蓋通過體外糖基化附接的碳水化合物分子。通過諸如N-or O-糖基化的體內(nèi)糖基化(下文進(jìn)一步描述)附接的碳水化合物分子在本文中被稱為“寡糖部分”。除了明確指出聚合物分子數(shù)目的情況外，如本發(fā)明中所用，每次提到“聚合物”、“一種聚合物”、“一種聚合物分子”、“所述聚合物”或“所述聚合物分子”應(yīng)指一種或多種聚合物分子。聚合物可以是水溶性或水不溶性聚合物，如PEG部分。PEG部分可具有選自500Da至200.0OODa范圍的平均大小，如500Da至100.0OODa，如2000Da 至 50.0OODa。這種 PEG 分子可取自 1.a.Shearwater Inc。
[0217]在本發(fā)明的上下文中，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“藥物組合物”意指含有本發(fā)明的LH化合物(例如修飾的LH)和/或本發(fā)明的修飾的LH以及FSH和任選一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的組合物，并且可以通過常規(guī)技術(shù)來(lái)制備，例如Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy 1995 (E.W.Martin 編輯)，Mack Publishing Company,第19 版，Easton, Pa中所述。組合物可呈常規(guī)的形式，例如膠囊劑、片劑、氣霧劑、溶液劑、混懸劑或局部施用劑。通常，可以將本發(fā)明的藥物組合物配制成用于腸胃外施用，例如通過1.V.或皮下注射，并且可以呈在安瓿、預(yù)填充針筒、小體積輸注或加有防腐劑的多劑量容器中的單位劑型。組合物可采取諸如在油性或水性媒介物中的混懸液、溶液或乳液的形式，例如聚乙二醇水溶液。油性或非水性載體、稀釋劑、溶劑或媒介物的例子包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如，橄欖油)和可注射的有機(jī)酯(例如，油酸乙酯)，并且可含有配制劑，如防腐劑、潤(rùn)濕劑、乳化或混懸劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘?，活性成分可以為粉末形式，通過消毒固體的無(wú)菌分離或者通過由溶液凍干獲得，用于在使用前用合適的媒介物(例如，無(wú)菌無(wú)熱原水)進(jìn)行組構(gòu)。適用于腸胃外制劑的油包括石油、動(dòng)物油、植物油或合成油。適用于這種制劑的油的具體例子包括花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄欖油、凡士林油和礦物油。用于腸胃外制劑的合適脂肪酸包括油酸、硬脂酸和異硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蘧酸異丙酯是合適的脂肪酸酯的例子。腸胃外制劑在溶液中通常含有約0.0001至約25重量％ (如約0.5至約25%重量)的活性成分?？梢允褂梅栏瘎┖途彌_劑。為了最小化或消除注射部位的刺激，這種組合物可含有一種或多種具有約12至約17的親水-親脂平衡值(HLB)的非離子型表面活性劑。這種制劑中的表面活性劑量通常在約0.000001至約15重量％范圍內(nèi)，如約0.000001至約5重量％或約5至約15重量％。合適的表面活性劑包括聚乙烯失水山梨醇脂肪酸酯(如失水山梨醇單油酸酯)和通過環(huán)氧丙烷與丙二醇縮合形成的環(huán)氧乙烷與疏水堿的高分子量加合物。腸胃外制劑可存在于單位劑量或多劑量密封的容器中，如安瓿和小瓶，并且可以在冷凍干燥(凍干)條件下儲(chǔ)存，在臨使用前，注射僅需添加無(wú)菌液體賦形劑，例如水。
[0218]在本發(fā)明的上下文中，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“輔助生育技術(shù)”意指旨在增加自然懷孕或通過獲取卵母細(xì)胞和精蟲并進(jìn)行體外受精而懷孕的可能性，這可以通過體外受精(IVF)或胞質(zhì)內(nèi)精子注射(ICSI)、子宮內(nèi)人工授精(ΙΠ)、體外成熟(IVM)或由其而來(lái)的其它形式。
[0219]術(shù)語(yǔ)“反復(fù)性流產(chǎn)”或“習(xí)慣性流產(chǎn)”(可互換使用)發(fā)生在約1%的育齡婦女中，她們沒能成功地在三個(gè)或更多個(gè)孕期中懷孕，并且懷孕在妊娠的12周前終止。因?yàn)榕咛ジ街驮谧訉m中的早期著床是受局部激素環(huán)境的精密控制的，所以內(nèi)分泌紊亂經(jīng)常關(guān)聯(lián)到早期妊娠的失敗，雖然諸多的因素可導(dǎo)致類似的臨床現(xiàn)象。通過雌激素和孕酮的刺激，子宮在著床前期間中經(jīng)歷重要的發(fā)育變化。由CL分泌的孕酮對(duì)于成功著床和延續(xù)懷孕是重要的。因此，與CL分泌孕酮不足相關(guān)的條件有可能負(fù)面地影響懷孕的結(jié)果。
[0220]如本文所用的術(shù)語(yǔ)“藥團(tuán)”是化合物的施用，這種給予將其在血液、血清或血漿中的濃度升高到有效水平?？赏ㄟ^任何施用途徑給予這種施用，包括口服、吸入、靜脈內(nèi)施用、通過肌內(nèi)、鞘內(nèi)或皮下注射。
[0221]如本文所用的術(shù)語(yǔ)“促性腺激素”是屬于異二聚糖蛋白一組的天然存在的激素，包括促卵泡激素(FSH)、促黃體激素(LH)和絨膜促性腺激素(CG)，如人絨膜促性腺激素。這些激素調(diào)節(jié)男性和女性的性腺功能。這些天然存在的激素中的每一種由兩個(gè)非共價(jià)連接的亞基組成:α-亞基和β_亞基，前者是FSH、LH和hCG所共有的，后者對(duì)它們中的每一種來(lái)說是獨(dú)特的，并且對(duì)每種激素賦予生物特異性。在所有天然存在的促性腺激素中，每個(gè)亞基具有天冬酰胺-連接(N-連接)的寡糖側(cè)鏈。在人類激素共有的α-亞基中，這些附接在位置52和78 (SEQ ID NO:1)。在人FSH和hCG兩者中，兩個(gè)N-連接的寡糖側(cè)鏈在FSH中的位置7和24附接至β -亞基(SEQ ID NO: 10)。
[0222]本發(fā)明優(yōu)選的促性腺激素的α鏈選自與SEQ ID Ν01、2或3具有至少80%、更優(yōu)選85%、更優(yōu)選90%、更優(yōu)選95%的序列同一性的序列。優(yōu)選地，變體在SEQ ID NOl的位置和間距處包含保守的半胱氨酸殘基。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，促性腺激素包含具有SEQID NOl的人α-亞基。
[0223]如同所有的糖蛋白，寡糖結(jié)構(gòu)的變化發(fā)生在促性腺激素中，產(chǎn)生一系列見于垂體腺內(nèi)和循環(huán)中的亞型。此外，通過唾液酸的末端碳水化合物“封端”的程度有不同。亞型可以根據(jù)其電荷而被分開，這在很大程度上是由唾液酸化N-連接的寡糖的數(shù)目和分布決定的。高度唾液酸化的形式將具有較酸性的ΡΗ，并且被稱為“酸性的”。唾液酸化較低的形式具有相對(duì)較高的PH并被稱為“堿性的”。
[0224]由于其結(jié)構(gòu)差異的原因，促性腺激素亞型在它們結(jié)合靶細(xì)胞受體的能力方面有所不同。唾液酸化的程度影響它們?cè)谘h(huán)中存活的能力。例如，在FSH的情況下，高度酸性/唾液酸化的亞型在動(dòng)物模型中具有顯著較長(zhǎng)的血漿半衰期。
[0225]天數(shù)-本發(fā)明的方案開始于月經(jīng)周期中的某一點(diǎn)。月經(jīng)周期的第I天為月經(jīng)的首日。當(dāng)指刺激方案的天數(shù)時(shí)，第I天是施用第一劑量的FSH的那天。刺激方案的第2天是后面的那天，等等。在黃體階段，天數(shù)是從排卵那天或者從取得卵母細(xì)胞的那天計(jì)算的。
[0226]卵泡尺寸-可通過卵泡體積的婦科超聲檢查測(cè)量卵巢功能。采用超聲檢查例行地測(cè)量卵泡直徑?，F(xiàn)在，也可以快速地測(cè)量卵泡體積，并自動(dòng)地形成三維重建的超聲圖像(Salama S，Arbo E, Lamazou F, Levailllant JM, Frydman R, Fanchin R(2010 年 4 月)。Reproducibility and reliability of automated volumetric measurement of singlepreovulatory follicles using SonoAVC”.Fertil.Steril.93(6):2069—73)。
[0227]尿源或尿的。這兩個(gè)術(shù)語(yǔ)可互換使用。所述術(shù)語(yǔ)是指由尿純化的促性腺激素的來(lái)源。
[0228]在本發(fā)明的上下文中，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“不孕癥治療”意指幫助無(wú)生育能力的夫婦中的婦女或單獨(dú)婦女懷孕的方法。
[0229]在本發(fā)明的上下文中，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“促進(jìn)生育能力”意指提高夫婦、婦女或男人生育能力的方法。
[0230]在本發(fā)明的上下文中，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物受試者”、“哺乳動(dòng)物”或“哺乳動(dòng)物的”(這些術(shù)語(yǔ)在整個(gè)說明書中可互換使用)意指任何哺乳動(dòng)物，如人、母牛、豬、馬、綿羊、狗、貓和山羊。
[0231]在描述本發(fā)明的上下文中使用的術(shù)語(yǔ)“一個(gè)(種)” (a, an)和“該(所述)”以及類似的指代應(yīng)被解釋為涵蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)兩種情況，除非本文指出另外的情況或者與上下文明顯互相矛盾。
[0232]如本文所用的“有效量”的LH化合物意指要施用的LH化合物足以促進(jìn)哺乳動(dòng)物的生育能力或治療有需要的哺乳動(dòng)物的不育癥。足夠做到這一點(diǎn)的量被定義為“有效量”。每一目的的有效量將取決于病癥的嚴(yán)重程度以及受試者的體重和一般狀態(tài)。要理解的是，采用例行的實(shí)驗(yàn)，通過構(gòu)建數(shù)值的矩陣，并測(cè)試矩陣中的不同點(diǎn)，由此可確定適當(dāng)?shù)膭┝?，這都在受過訓(xùn)練的醫(yī)師或獸醫(yī)所掌握的普通技能范圍內(nèi)。hCG施用的典型劑量為每日50-500IU或者是會(huì)提供類似的生物效應(yīng)的LH化合物的劑量。
[0233]如本文所用的“有效量”的修飾的LH意指要施用的修飾的LH的量足以在哺乳動(dòng)物雌性受試者的無(wú)排卵治療中幫助誘導(dǎo)卵泡發(fā)育，如少量卵泡生成或單一卵泡生成，或者在有需要的哺乳動(dòng)物雌性受試者的月經(jīng)周期的卵泡階段中誘導(dǎo)cos。因?yàn)槿绫疚乃?，修飾的LH旨在與FSH結(jié)合使用，所以修飾的LH將與FSH —起“幫助”進(jìn)行這種治療。足夠做到這一點(diǎn)的量被定義為“有效量”。每一目的的有效量將取決于病癥的嚴(yán)重程度以及受試者的體重和一般狀態(tài)。要理解的是，采用例行的實(shí)驗(yàn)，通過構(gòu)建數(shù)值的矩陣，并測(cè)試矩陣中的不同點(diǎn)，由此可確定適當(dāng)?shù)膭┝?，這都在受過訓(xùn)練的醫(yī)師或獸醫(yī)所掌握的普通技能范圍內(nèi)。hFSH施用的典型劑量為每日50-500IU或者是會(huì)提供類似的生物效應(yīng)的具有FSH活性的分子劑量。
[0234]如本文所用的術(shù)語(yǔ)“?；鶊F(tuán)”意指R- (C=O)-基團(tuán)，其中R選自直鏈或支鏈的飽和或不飽和碳鏈，任選包含一個(gè)或多個(gè)O、N、S或P，如直鏈或支鏈烷烴羧酸。合適?；鶊F(tuán)的各種例子描述在 W02006/037810、W000/34331、W02006/097537、W02011/080103 中。在特定的例子中，合適的?；鶊F(tuán)具有結(jié)構(gòu)CH3 (CH2) nCO-，其中η是4至40，例如8至22，如選自以下的?；鶊F(tuán):CH3 (CH2) 8C0-、CH3 (CH2) 9C0-、CH3 (CH2) 10C0-、CH3 (CH2) I ICO-、CH3 (CH2)12C0-、CH3 (CH2)13C0-、CH3 (CH2)14C0-、CH3 (CH2)15C0-、CH3 (CH2)16C0-、CH3 (CH2) 17C0-、CH3 (CH2) 18C0-、CH3 (CH2) 19C0-、CH3 (CH2) 20C0-、CH3 (CH2) 21C0-和CH3 (CH2) 22C0-。合適酰化基團(tuán)的進(jìn)一步的例子具有結(jié)構(gòu)HOOC- (CH2) nCO-，其中η是4至 40，例如 12 至 20，典型的有 HOOC-(CH2) 14C0-、HOOC- (CH2) 15C0-、HOOC- (CH2) 16C0-、 HOOC- (CH2) 17C0-和HOOC-(CH2) 18C0-。關(guān)于?；鶊F(tuán)的進(jìn)一步例子，還參見US5905140。
[0235]如本文涉及修飾的LH所用的術(shù)語(yǔ)“治療"(treatment, treating)意指為了在哺乳動(dòng)物雌性受試者的無(wú)排卵治療中誘導(dǎo)卵泡發(fā)育或者在哺乳動(dòng)物雌性受試者的月經(jīng)周期的卵泡階段中誘導(dǎo)COS的目的而管理和護(hù)理患者。
[0236]如本文涉及LH化合物所用的術(shù)語(yǔ)“治療"(treatment, treating)意指為治療不育癥或促進(jìn)生育能力的目的而管理和護(hù)理患者。要治療的患者優(yōu)選為哺乳動(dòng)物；特別是人，但也可以包括動(dòng)物，如狗、貓、馬、母牛、綿羊和豬。
【具體實(shí)施方式】
[0237]長(zhǎng)效生物學(xué)活性促黃體激素化合物
[0238]本發(fā)明涉及包含連接至藥學(xué)上可接受的分子的LH激動(dòng)劑的長(zhǎng)效生物學(xué)活性LH化合物，其中與ART程序有關(guān)的LH化合物的施用可進(jìn)行一次或兩次，特別是在卵泡階段期間。相較目前的ART程序，這是相當(dāng)具有優(yōu)點(diǎn)的，并且導(dǎo)致不育癥治療的改進(jìn)。
[0239]此外，本發(fā)明涉及包含連接至藥學(xué)上可接受的分子的LH激動(dòng)劑的長(zhǎng)效生物學(xué)活性LH化合物，其中可以按有規(guī)律的間隔進(jìn)行與ART程序有關(guān)的LH化合物的施用，以維持黃體和妊娠階段支持。相較目前的ART程序，這是相當(dāng)具有優(yōu)點(diǎn)的，并且導(dǎo)致不育癥治療的改進(jìn)。[0240]在廣泛的方面中，本發(fā)明涉及連接至藥學(xué)上可接受的分子的LH激動(dòng)劑的長(zhǎng)效生物學(xué)活性LH化合物，與按同LH化合物相同的方式施用的LH激動(dòng)劑的體內(nèi)血漿半衰期相t匕，所述藥學(xué)上可接受的分子提供大幅度增加的LH激動(dòng)劑或LH化合物的體內(nèi)血漿半衰期。
[0241]在另一廣泛的方面中，本發(fā)明涉及包含連接至藥學(xué)上可接受的分子的LH激動(dòng)劑的長(zhǎng)效生物學(xué)活性LH化合物，與內(nèi)源性CG的體內(nèi)血漿半衰期相比，所述藥學(xué)上可接受的分子提供大幅度增加的LH激動(dòng)劑或LH化合物的體內(nèi)血漿半衰期。
[0242]在又進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明涉及長(zhǎng)效生物學(xué)活性促黃體激素(LH)化合物，其包含連接至藥學(xué)上可接受的分子的哺乳動(dòng)物CG或其類似物或者哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物，所述藥學(xué)上可接受的分子選自結(jié)合至哺乳動(dòng)物新生兒Fe受體的分子、轉(zhuǎn)鐵蛋白和其中η是8至22的CH3(CH2)nCO-以及聚合物。
[0243]在一個(gè)實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的分子選自結(jié)合至哺乳動(dòng)物新生兒Fe受體的分子。
[0244]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的分子選自白蛋白，如人白蛋白、重組人白蛋白、對(duì)哺乳動(dòng)物FcRn結(jié)合增加的修飾的人白蛋白、對(duì)哺乳動(dòng)物FcRn結(jié)合增加的修飾的重組白蛋白。通常，藥學(xué)上可接受的分子選自重組人白蛋白(SEQ ID Ν020)。通常，藥學(xué)上可接受的分子選自重組Κ573Ρ人白蛋白(SEQ ID Ν021)。
[0245]在又進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的分子選自哺乳動(dòng)物抗體的Fe片段，如哺乳動(dòng)物抗體的重組Fe片段。通常，藥學(xué)上可接受的分子選自SEQ ID Ν022。
[0246]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的分子選自哺乳動(dòng)物抗體的Fe片段的變體，如哺乳動(dòng)物抗體的Fe片段的重組變體。通常，藥學(xué)上可接受的分子選自與SEQ IDΝ022具有至少80%同一性的序列，如至少90%同一性，如至少95%同一性，不包括SEQ IDN0.22。
[0247]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，LH激動(dòng)劑可選自有機(jī)小分子、肽、多肽、蛋白質(zhì)，并且可通過合成方法、重組手段產(chǎn)生或者由組織或血液獲得。在特定的實(shí)施方案中，LH激動(dòng)劑是非哺乳動(dòng)物來(lái)源的。在另一特定的實(shí)施方案中，LH激動(dòng)劑是哺乳動(dòng)物來(lái)源的，如通過重組手段獲得的蛋白質(zhì)。
[0248]在又進(jìn)一步的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物CG或其類似物或者哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物選自重組哺乳動(dòng)物CG或其類似物或者重組哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物。
[0249]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，LH激動(dòng)劑選自哺乳動(dòng)物CG或哺乳動(dòng)物L(fēng)H。當(dāng)LH激動(dòng)劑是哺乳動(dòng)物CG時(shí)，其通常為靈長(zhǎng)類動(dòng)物CG，例如人CG或猿CG或猴CG，但也可選自其它哺乳動(dòng)物物種，如馬科動(dòng)物CG，例如馬CG。當(dāng)LH激動(dòng)劑是哺乳動(dòng)物L(fēng)H時(shí)，其通常為靈長(zhǎng)類動(dòng)物L(fēng)H，如人LH、猿LH或猴L(fēng)H ;母牛LH的序列；豬LH的序列；馬科動(dòng)物L(fēng)H的序列，如馬LH ；綿羊LH的序列；狗LH的序列；貓LH的序列；和山羊LH的序列。通常，LH激動(dòng)劑是人CG。
[0250]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，LH激動(dòng)劑選自哺乳動(dòng)物CG的類似物或哺乳動(dòng)物L(fēng)H的類似物。當(dāng)LH激動(dòng)劑是哺乳動(dòng)物CG的類似物時(shí)，該類似物與絨膜促性腺激素的相應(yīng)哺乳動(dòng)物序列具有至少80%同一性，如85%同一性、90%同一性、95%同一性、98%同一性。通常，LH激動(dòng)劑是與絨膜促性腺激素的相應(yīng)人序列具有至少80%同一性的人CG的類似物，如85%同一性、90%同一性、95%同一性、98%同一性。當(dāng)LH激動(dòng)劑是哺乳動(dòng)物L(fēng)H的類似物時(shí)，該類似物與促黃體激素的相應(yīng)哺乳動(dòng)物序列具有至少80%同一性，如85%同一性、90%同一性、95%同一性、98%同一性。通常，LH激動(dòng)劑是與促黃體激素的相應(yīng)人序列具有至少80%同一性的人LH的類似物，如85 %同一性、90 %同一性、95 %同一性、98 %同一性。
[0251]當(dāng)LH激動(dòng)劑選自多肽或蛋白質(zhì)時(shí)，如哺乳動(dòng)物CG的類似物或哺乳動(dòng)物L(fēng)H的類似物，它可以被糖基化。通常，LH激動(dòng)劑是被糖基化的hCG。
[0252]也可以是像這樣的LH化合物被糖基化，并且糖基化可以在LH激動(dòng)劑上，或者在藥學(xué)上可接受的分子上(當(dāng)所述分子選自多肽或蛋白質(zhì)，如人白蛋白時(shí))。
[0253]可以按多種方式將LH激動(dòng)劑連接至藥學(xué)上可接受的分子，如直接通過價(jià)鍵，或者間接地通過連接子，該連接子通常為雙官能連接子，雖然它也可以是多官能連接子，在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，連接子選自化學(xué)連接子、糖部分、二硫橋、融合連接子、親水連接子、可水解的連接子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，LH激動(dòng)劑通過肽連接子融合至藥學(xué)上可接受的分子。在又進(jìn)一步的實(shí)施方案中，LH激動(dòng)劑直接融合至藥學(xué)上可接受的分子，以便通過由宿主細(xì)胞(如CHO細(xì)胞或酵母細(xì)胞)表達(dá)LH化合物來(lái)產(chǎn)生一種多肽或蛋白質(zhì)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，LH激動(dòng)劑通過穩(wěn)定的連接子連接至藥學(xué)上可接受的分子。在另一實(shí)施方案中，LH激動(dòng)劑通過不穩(wěn)定的連接子連接至藥學(xué)上可接受的分子。
[0254]因此，可以采用現(xiàn)有技術(shù)中熟知的技術(shù)，按多種方式將LH激動(dòng)劑連接至藥學(xué)上可接受的分子，并且本發(fā)明還包括其中一種或多種LH激動(dòng)劑連接至一種或多種藥學(xué)上可接受的分子的情況，如兩種LH激動(dòng)劑連接至一種藥學(xué)上可接受的分子，或者一種LH激動(dòng)劑連接至兩種藥學(xué)上可接受的分子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，LH激動(dòng)劑連接至一種或兩種藥學(xué)上可接受的分子，優(yōu)選一種藥學(xué)上可接受的分子。
[0255]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物CG或其類似物或者哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物連接至藥學(xué)上可接受的分子，并且其中連接子選自化學(xué)連接子，任選雙官能連接子。通常，化學(xué)連接子選自糖部分、二硫橋、親水連接子、可水解的連接子、二羧酸、羧酸酰肼、馬來(lái)酰亞胺基酰肼、PDPH、SPDP, LC-SPDP, GMBS、烷基連接子和PEG連接子。在又進(jìn)一步的實(shí)施方案中，化學(xué)連接子選自丁二酸、戊二酸、己二酸、N-[馬來(lái)酰亞胺基己酸]酰肼(EMCH)、N-[馬來(lái)酰亞胺基丙酸]酰肼(MPH或BMPH)、4_[N_馬來(lái)酰亞胺基甲基]環(huán)己烷_1_羧基酰肼、N-[k-馬來(lái)酰亞胺基十一烷酸]酰肼(KMUH)、4-(4-N-馬來(lái)酰亞胺基苯基)丁酸酰肼(MPBH)、NHS-3-馬來(lái)酰亞胺基丙酸酯琥珀酰亞胺酯(MPS-EDA)、綴合至巰基反應(yīng)蛋白的(3- [2-吡啶基二硫代]丙酰肼)、N-琥珀酰亞胺基3- (2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(STOP)、琥珀酰亞胺基6-(3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基)己酸酯(LC-SroP)、N-( Y -馬來(lái)酰亞胺基丁酰氧基)琥珀酰亞胺酯(GMBS)、具有2-5個(gè)碳原子的羧酸酰肼、-NH-(CH2) m-C (O)-，其中m是2-20的整數(shù)，它們?nèi)芜x被非空間位阻基團(tuán)取代，如C1-C6烷基、C1-C6?；?、鹵素(例如，(:1、&0、0隊(duì)順2或苯基。
[0256]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物CG或其類似物或者哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物直接化學(xué)連接至藥學(xué)上可接受的分子。
[0257]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的分子連接至哺乳動(dòng)物CG或其類似物或者哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物的α鏈。
[0258]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的分子連接至哺乳動(dòng)物CG或其類似物或者哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物的β鏈。
[0259]在又進(jìn)一步的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物CG或其類似物或者哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物融合至藥學(xué)上可接受的分子，所述藥學(xué)上可接受的分子選自結(jié)合至哺乳動(dòng)物新生兒Fe受體的分子，如白蛋白、哺乳動(dòng)物抗體的Fe片段或哺乳動(dòng)物抗體的Fe片段的變體，任選通過肽連接子。
[0260]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，肽連接子具有至少I個(gè)氨基酸，如1-200個(gè)氨基酸，通常1-50個(gè)氨基酸，其中氨基酸選自二十種天然存在的氨基酸。通常,肽連接子具有1-40個(gè)氨基酸，如1-30、如1-20、如1-10個(gè)氨基酸。
[0261]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，肽連接子選自由選自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和賴氨酸的氨基酸組成的連接子。通常，肽連接子由大多數(shù)無(wú)空間位阻的氨基酸(如甘氨酸和丙氨酸)組成。特別地，肽連接子包含選自-(G)n-、(GGS)η或(GGGGS)η的序列，其中η是1-50的整數(shù)。通常η是選自1-10的整數(shù)，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
[0262]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，肽連接子選自GGG、SGGSGGS (SEQ ID NO: 58)、GGSGGSGGSGGSGGG (SEQ ID NO:59)、GGSGGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO:60),GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:57)和 EFAGAAAV (SEQ ID NO:56)。
[0263]在另一實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物CG或其類似物或者哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物直接融合至藥學(xué)上可接受的分子。
[0264]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的分子融合至哺乳動(dòng)物CG或其類似物的N-末端。
[0265]在又進(jìn)一步的 實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的分子融合至哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物的N-末端。
[0266]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的分子融合至哺乳動(dòng)物CG或其類似物的α鏈的N-末端。
[0267]在又進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的分子融合至哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物的α鏈的N-末端。
[0268]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的分子融合至哺乳動(dòng)物CG或其類似物的β鏈的N-末端。
[0269]在又進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的分子融合至哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物的β鏈的N-末端。
[0270]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的分子融合至哺乳動(dòng)物CG或其類似物的C-末端O
[0271]在又進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的分子融合至哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物的C-末端。
[0272]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的分子融合至哺乳動(dòng)物CG或其類似物的α鏈的C-末端。
[0273]在又進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的分子融合至哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物的α鏈的C-末端。
[0274]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的分子融合至哺乳動(dòng)物CG或其類似物的β鏈的C-末端。
[0275]在又進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的分子融合至哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物的β鏈的C-末端。[0276]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物CG或其類似物或者哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物選自一種哺乳動(dòng)物CG或其類似物。通常是一種hCG。
[0277]在又進(jìn)一步的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物CG或其類似物或者哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物選自一種哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物。通常是一種hLH。
[0278]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物CG或其類似物或者哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物選自兩種哺乳動(dòng)物CG或其類似物。通常是兩種hCG。
[0279]在又進(jìn)一步的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物CG或其類似物或者哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物選自兩種哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物。通常是兩種hLH。
[0280]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的分子選自一種藥學(xué)上可接受的分子。通常是一種白蛋白或一種Fe片段或Fe片段的一種變體。
[0281]在又進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的分子選自兩種藥學(xué)上可接受的分子。通常是兩種白蛋白或兩種Fe片段或Fe片段的兩種變體或它們的組合。
[0282]本發(fā)明優(yōu)選的LH化合物選自綴合物I (hCG-PDPH-rHA綴合物)、綴合物3 (hCG-SPDP-rHA綴合物)、綴合物4 (EDC活化的hCG-PDPH-rHA綴合物)、綴合物3V1 (hCG-SPDP-rHA-K573P 綴合物)和綴合物 4V1 (EDC 活化的 hCG-PDPH-rHA_K573P 綴合物)。
[0283]本發(fā)明其它優(yōu)選的LH化合物選自由SEQ ID N09和SEQ ID N026構(gòu)成的產(chǎn)品2、由SEQ ID NOl和SEQ ID N028構(gòu)成的產(chǎn)品3、由SEQ ID N09和SEQ ID N027構(gòu)成的產(chǎn)品4、由SEQ ID NOl和SEQ ID N029構(gòu)成的產(chǎn)品5、由SEQ ID N04和SEQ ID N026構(gòu)成的產(chǎn)品7、由SEQ ID NOl和SEQ ID N030構(gòu)成的產(chǎn)品8、由SEQ ID N04和SEQ ID N027構(gòu)成的產(chǎn)品9、由SEQ ID NOl和SEQ ID N031構(gòu)成的產(chǎn)品10、由SEQ ID N032和SEQ ID N033構(gòu)成的產(chǎn)品 11、由 SEQ ID N032 和 SEQ ID N034 構(gòu)成的產(chǎn)品 12、由 SEQ ID N032 和 SEQ ID N061 構(gòu)成的產(chǎn)品13以及由SEQ ID N032和SEQ ID N062構(gòu)成的產(chǎn)品14。
[0284]有關(guān)ART程序，為了產(chǎn)生可施用一次或兩次的LH化合物，這種LH化合物在對(duì)哺乳動(dòng)物施用時(shí)應(yīng)導(dǎo)致LH激動(dòng)劑或LH化合物體內(nèi)血漿半衰期增加至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍，如1.5倍至25倍。
[0285]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，LH激動(dòng)劑具有的體內(nèi)血楽;半衰期為至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天,9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天,18天、19天，如2至20天。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中,LH化合物具有的體內(nèi)血楽;半衰期為至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天,9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天,18天、19天，如2至20天。
[0286]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的分子提供LH激動(dòng)劑或LH化合物的生物體組合物或濃度，其足以驅(qū)動(dòng)竇狀卵泡從直徑約IOmm直到排卵前階段(即直徑約15-30_)，在此階段成熟中的卵母細(xì)胞可完成成熟，以為減數(shù)分裂的恢復(fù)做好準(zhǔn)備。
[0287]在又進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的分子提供LH激動(dòng)劑或LH化合物的生物體組合物或濃度，其足以驅(qū)動(dòng)雄性后代出生后約I年的早期少年及青春期雌性和雄性受試者的雄激素產(chǎn)生。
[0288]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的分子提供LH激動(dòng)劑或LH化合物的生物體組合物或濃度，其足以支持促性腺激素分泌不足的性腺低能受試者。[0289]在又進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的分子提供LH激動(dòng)劑或LH化合物的生物體組合物或濃度，其足以維持哺乳動(dòng)物受試者圍排卵階段、排卵階段和排卵后階段中的孕酮，目的是調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜和子宮以允許哺乳動(dòng)物胚泡的著床。
[0290]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的分子提供LH激動(dòng)劑或LH化合物的生物體組合物或濃度，其足以維持哺乳動(dòng)物受試者圍排卵階段、排卵階段和排卵后階段中的孕酮，目的是為著床準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜和子宮。
[0291]在又進(jìn)一步的實(shí)施方案中，當(dāng)在月經(jīng)周期的卵泡階段期間與FSH治療有關(guān)地給予注射時(shí)，優(yōu)選開始FSH治療后5-10天，藥學(xué)上可接受的分子提供LH激動(dòng)劑或LH化合物的血漿濃度以支持CL的形成和維持。
[0292]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在月經(jīng)周期的卵泡階段期間與FSH治療有關(guān)地注射后，優(yōu)選開始FSH治療5-10天后，藥學(xué)上可接受的分子提供LH激動(dòng)劑或LH化合物的濃度以刺激由CL釋放足夠的孕酮。
[0293]在又進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的分子結(jié)合至新生兒Fe受體(FcRn)，如pH依賴性結(jié)合，其允許LH化合物避開溶酶體降解，如Roopenian et.al., "FcRn: theneonatal Fe receptor comes of age〃，Nature reviews, Immunology, vol.7, p.715.725, sept.2007中所述。
[0294]結(jié)合至FcRn的典型藥學(xué)上可接受的分子選自白蛋白，如對(duì)FcRn結(jié)合增加的修飾的白蛋白、人白蛋白或重組人白蛋白。
[0295]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的分子選自有機(jī)小分子、肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)、受體、糖基化、酰化基團(tuán)、糖、聚合物(例如聚乙二醇，PEG)、核酸(例如DNA和RNA)以及激素中的任一種。通常，藥學(xué)上可接受的分子(不限于)選自哺乳動(dòng)物抗體的Fe片段、轉(zhuǎn)鐵蛋白、白蛋白(如人白蛋白)、重組白蛋白、白蛋白的變體；?；鶊F(tuán)，如CH3 (CH2) nC0-，其中η是8至22 ;或聚合物，如PEG，例如分子量為至少5kDa的PEG，如IOkDa至150kDa，通常為10至40kDa。
[0296]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的分子選自聚合物，如PEG。通常，PEG部分可具有選自500Da至200.0OODa范圍的平均大小，如500Da至100.0OODa，如2000Da至50.0OODa0
[0297]本發(fā)明進(jìn)一步的方面涉及包含本發(fā)明的LH化合物和任選藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。通常，藥物組合物用于注射，如皮下注射。
[0298]與ART程序有關(guān)，在不育癥治療中或者在促進(jìn)生育能力中可同時(shí)地或順序地施用不止一種藥劑。因此，在用于不育癥治療的ART程序(如IVF或ICSI)中或者在促進(jìn)生育能力中，使用本發(fā)明的LH化合物與一種或多種通常用于不育癥治療或促進(jìn)生育能力的其它治療活性化合物相結(jié)合，這是在本發(fā)明范圍內(nèi)的。通過類比，在生產(chǎn)用于不育癥治療或促進(jìn)生育能力的藥劑中，使用本發(fā)明的LH化合物與通常用于所述不育癥治療或促進(jìn)生育能力的其它治療活性化合物相結(jié)合，這也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0299]本發(fā)明進(jìn)一步的方面涉及本發(fā)明的LH化合物，用于哺乳動(dòng)物受試者的不育癥治療或促進(jìn)生育能力，如輔助生育技術(shù)治療，例如IVF或ICSI治療或睪丸的降下不良。
[0300]本發(fā)明進(jìn)一步的方面涉及本發(fā)明的LH化合物，用于雌性哺乳動(dòng)物中的輔助生育治療方法，其中在卵泡階段期間按一次、兩次、三次或四次劑量施用LH化合物，該劑量足以支持卵泡發(fā)育?？梢詥未螆F(tuán)注施用LH化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，劑量也足以提供黃體支持。
[0301]本發(fā)明又進(jìn)一步的方面涉及本發(fā)明的LH化合物，用于雌性哺乳動(dòng)物中的輔助生育治療方法，其中在黃體階段期間按一次、兩次、三次或四次劑量施用LH化合物，至少直到排卵后2周?？梢詥未螆F(tuán)注施用LH化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，排卵后首次施用LH化合物。
[0302]本發(fā)明進(jìn)一步的方面涉及本發(fā)明的LH化合物，用于雌性哺乳動(dòng)物中的輔助生育治療方法，其中在妊娠階段期間按一次、兩次、三次或四次劑量施用LH化合物，至少直到排卵后2周。可以單次團(tuán)注施用LH化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，排卵后首次施用LH化合物。
[0303]本發(fā)明又進(jìn)一步的方面涉及本發(fā)明的LH化合物，用于雌性哺乳動(dòng)物中治療反復(fù)性流產(chǎn)的方法，其中在早期妊娠期間按一次、兩次、三次或四次劑量施用LH化合物，直到直到懷孕后12周?？梢詥未螆F(tuán)注施用LH化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，排卵后首次施用LH化合物。
[0304]本發(fā)明進(jìn)一步的方面涉及本發(fā)明的LH化合物，用于增加孕酮產(chǎn)生和優(yōu)化成功懷孕機(jī)會(huì)的方法，其中在妊娠的頭12周期間按一次、兩次、三次或四次劑量施用LH化合物?？梢詥未螆F(tuán)注施用LH化合物 。在一個(gè)實(shí)施方案中，排卵后首次施用LH化合物。
[0305]本發(fā)明進(jìn)一步的方面涉及本發(fā)明的LH化合物，用于雌性哺乳動(dòng)物中的輔助生育治療方法，其中與排卵誘導(dǎo)有關(guān)地按一次或兩次劑量施用LH化合物。可以單次團(tuán)注施用LH化合物。
[0306]與排卵引發(fā)有關(guān)，可以采用各種治療方案。在一個(gè)實(shí)施方案中，將GnRH激動(dòng)劑用于排卵引發(fā)。在另一實(shí)施方案中，將hCG用于排卵引發(fā)。
[0307]本發(fā)明進(jìn)一步的方面涉及本發(fā)明的LH化合物，用于促進(jìn)生育能力或治療促性腺激素分泌不足的性腺低能雄性哺乳動(dòng)物受試者的不育癥。
[0308]本發(fā)明又進(jìn)一步的方面涉及本發(fā)明的LH化合物，用于促進(jìn)生育能力或治療患有隱睪癥的年輕或年少雄性哺乳動(dòng)物受試者的不育癥。
[0309]本發(fā)明又進(jìn)一步的方面涉及哺乳動(dòng)物受試者的不育癥治療方法，包括對(duì)有需要的哺乳動(dòng)物施用有效量的本發(fā)明的LH化合物。
[0310]本發(fā)明進(jìn)一步的方面涉及促進(jìn)哺乳動(dòng)物受試者生育能力的方法，包括對(duì)有需要的哺乳動(dòng)物施用有效量的本發(fā)明的LH化合物。
[0311]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物受試者選自人、母牛、豬，a馬、綿羊、狗、貓和山羊，通常為人受試者。
[0312]在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明涉及制備包含連接至藥學(xué)上可接受的分子的LH激動(dòng)劑的長(zhǎng)效生物學(xué)活性促黃體激素(LH)化合物(如本發(fā)明在本文公開的任一種綴合物)的方法，該方法包括使LH激動(dòng)劑與附接至藥學(xué)上可接受的分子的連接子反應(yīng)，或者使LH激動(dòng)劑與連接子反應(yīng)，并然后將所述連接子附接至藥學(xué)上可接受的分子，或者使連接子與藥學(xué)上可接受的分子反應(yīng)，并然后使LH激動(dòng)劑與附接至藥學(xué)上可接受的分子的連接子反應(yīng)，或者通過由宿主細(xì)胞表達(dá)LH激動(dòng)劑和藥學(xué)上可接受的分子。
[0313]長(zhǎng)效修飾的哺乳動(dòng)物L(fēng)H
[0314]本發(fā)明涉及長(zhǎng)效修飾的哺乳動(dòng)物L(fēng)H，例如連接至(例如融合至)白蛋白或綴合至?；鶊F(tuán)或PEG的人LH，其激動(dòng)和激活哺乳動(dòng)物中的LH受體，并提供哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物或者修飾的LH的體內(nèi)血漿半衰期，其在哺乳動(dòng)物中為2至48小時(shí)。據(jù)信在卵泡階段中或作為黃體階段支持給予的修飾的LH改善患者方便性和治療結(jié)果。
[0315]此外，使用長(zhǎng)效修飾的哺乳動(dòng)物L(fēng)H不會(huì)對(duì)將由著床胚胎分泌的高糖基化hCG施加的特定影響產(chǎn)生干擾，并且使患者有可能通過利用普通的懷孕測(cè)試盡早方便地檢測(cè)到她是否懷孕。
[0316]總的來(lái)說，這些研究結(jié)果表明，在長(zhǎng)效修飾的哺乳動(dòng)物L(fēng)H制劑中，LH的特定效果在受體水平上得到保持，結(jié)合在循環(huán)中的穩(wěn)定存在，這將能夠優(yōu)化月經(jīng)周期的卵泡階段中的C0S，并因此優(yōu)化最終治療結(jié)果。
[0317]在廣泛的方面中，本發(fā)明涉及包含連接至藥學(xué)上可接受的分子的哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物的修飾的LH，所述藥學(xué)上可接受的分子提供哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物或者修飾的LH的體內(nèi)血漿半衰期，其在哺乳動(dòng)物中為2至48小時(shí)。
[0318]本發(fā)明進(jìn)一步的方面涉及包含連接至藥學(xué)上可接受的分子的哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物的長(zhǎng)效生物學(xué)活性促黃體激素(LH)化合物，所述藥學(xué)上可接受的分子選自結(jié)合至哺乳動(dòng)物新生兒Fe受體的分子、轉(zhuǎn)鐵蛋白和其中η是8至22的CH3(CH2)nCO-以及聚合物，與FSH或具有FSH活性的分子結(jié)合使用，用于同時(shí)、按順序或分開使用，以在哺乳動(dòng)物雌性受試者的無(wú)排卵治療中誘導(dǎo)卵泡發(fā)育，如少量卵泡生成或單一卵泡生成，或者在哺乳動(dòng)物雌性受試者的月經(jīng)周期的卵泡階段中誘導(dǎo)COS。
[0319]在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)SH在哺乳動(dòng)物雌性受試者中是外源得到的。在另一實(shí)施方案中，F(xiàn)SH是在哺乳動(dòng)物雌性受試者中內(nèi)源產(chǎn)生的。
[0320]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的分子選自結(jié)合至哺乳動(dòng)物新生兒Fe受體的分子，如白蛋白，例如人白蛋白、重組人白蛋白、對(duì)哺乳動(dòng)物FcRn結(jié)合增加的修飾的人白蛋白、對(duì)哺乳動(dòng)物FcRn結(jié)合增加的修飾的重組白蛋白；哺乳動(dòng)物抗體的Fe片段，如哺乳動(dòng)物抗體的重組Fe片段；和哺乳動(dòng)物抗體的Fe片段的變體。
[0321]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的分子提供哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物或者修飾的LH的體內(nèi)血漿半衰期，其在哺乳動(dòng)物雌性受試者中為2至48小時(shí)。
[0322]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物L(fēng)H具有的體內(nèi)血漿半衰期為至少3小時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)、6小時(shí)、7小時(shí)、8小時(shí)、9小時(shí)、10小時(shí)、11小時(shí)、12小時(shí)、13小時(shí)、14小時(shí)、15小時(shí)、16小時(shí)、17小時(shí)、18小時(shí)、19小時(shí)、20小時(shí)、21小時(shí)、22小時(shí)、23小時(shí)、24小時(shí)，如4至48小時(shí)、5至40小時(shí)、6至36小時(shí)、7至30小時(shí)、8至28小時(shí)、9至26小時(shí)或10至24小時(shí)，通常為6至8小時(shí)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，修飾的LH具有的體內(nèi)血漿半衰期為至少3小時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)、6小時(shí)、7小時(shí)、8小時(shí)、9小時(shí)、10小時(shí)、11小時(shí)、12小時(shí)、13小時(shí)、14小時(shí)、15小時(shí)、16小時(shí)、17小時(shí)、18小時(shí)、19小時(shí)、20小時(shí)、21小時(shí)、22小時(shí)、23小時(shí)、24小時(shí)，如4至48小時(shí)、5至40小時(shí)、6至36小時(shí)、7至30小時(shí)、8至28小時(shí)、9至26小時(shí)或10至24小時(shí),通常為6至8小時(shí)。
[0323]在對(duì)哺乳動(dòng)物施用修飾的LH時(shí)，重要的是達(dá)到足夠的體內(nèi)血漿濃度，并保持提供在哺乳動(dòng)物雌性受試者的無(wú)排卵治療中誘導(dǎo)卵泡發(fā)育或在哺乳動(dòng)物雌性受試者的月經(jīng)周期的卵泡階段中誘導(dǎo)COS效果所需的時(shí)間。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的修飾的LH在哺乳動(dòng)物中提供2至30IU/L范圍內(nèi)的修飾的LH、哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其混合物的體內(nèi)血漿濃度，如 2 至 4IU/L、4 至 8IU/L、8 至 14IU/L、14 至 20IU/L 或 20 至 30IU/L。
[0324]哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物以是重組的或合成的，或者是它們的組合，并且可以通過合成方法制備，如標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)方法，包括通過自動(dòng)化程序合成，或者通過重組手段，或者由尿、組織或血液獲得。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物L(fēng)H是重組LH。在又進(jìn)一步的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物L(fēng)H是重組人LH (rhLH)。
[0325]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物L(fēng)H可選自人LH的序列、母牛LH的序列、豬LH的序列、馬LH的序列、綿羊LH的序列、狗LH的序列、貓LH的序列和山羊LH的序列。
[0326]在又進(jìn)一步的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物L(fēng)H類似物是重組LH?？赏ㄟ^重組手段產(chǎn)生的哺乳動(dòng)物L(fēng)H類似物通常選自這樣的哺乳動(dòng)物L(fēng)H的類似物，其中該類似物與LH的相應(yīng)哺乳動(dòng)物序列具有至少80%同一1丨生，如85%同一1丨生、90%同一1丨生、95%同一1丨生、98%同一1丨生。比如，哺乳動(dòng)物L(fēng)H類似物選自人LH的類似物，其中該類似物與LH的人序列具有至少80%同一性，如85%同一性、90%同一性、95%同一性、98%同一性?；蛘卟溉閯?dòng)物L(fēng)H類似物選自馬LH的類似物，其中該類似物與LH的馬序列具有至少80%同一性，如85%同一性、90%同一,f生、95%同一,丨生、98%同一,f生。
[0327]按本發(fā)明使用的哺乳動(dòng)物L(fēng)H或哺乳動(dòng)物L(fēng)H的類似物可以是糖基化的。通常，哺乳動(dòng)物L(fēng)H或類似物是糖基化的，如被糖基化的hLH。
[0328]也可以是像這樣的修飾的LH被糖基化，并且糖基化可以在哺乳動(dòng)物L(fēng)H上，或者在藥學(xué)上可接受的分子上(當(dāng)所述分子選自多肽或蛋白質(zhì)，如人白蛋白時(shí))?？梢园炊喾N方式將哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似 物連接至藥學(xué)上可接受的分子，如直接通過價(jià)鍵，或者間接地通過連接子，該連接子通常為雙官能連接子，雖然它也可以是多官能連接子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，連接子選自化學(xué)連接子、糖部分、二硫橋、融合連接子、親水連接子、可水解的連接子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物通過肽連接子融合至藥學(xué)上可接受的分子。在又進(jìn)一步的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物直接融合至藥學(xué)上可接受的分子，以便通過由宿主細(xì)胞(如CHO細(xì)胞或酵母細(xì)胞)表達(dá)修飾的LH來(lái)產(chǎn)生一種多肽或蛋白質(zhì)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物通過穩(wěn)定的連接子連接至藥學(xué)上可接受的分子。在另一實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物通過不穩(wěn)定的連接子連接至藥學(xué)上可接受的分子。
[0329]因此，可以采用現(xiàn)有技術(shù)中熟知的技術(shù)，按多種方式將哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物連接至藥學(xué)上可接受的分子，并且本發(fā)明還包括其中一種或多種哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物連接至一種或多種藥學(xué)上可接受的分子的情況，如兩種哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物連接至一種藥學(xué)上可接受的分子，或者一種哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物連接至兩種藥學(xué)上可接受的分子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物連接至一種或兩種藥學(xué)上可接受的分子，如一種藥學(xué)上可接受的分子。
[0330]在又進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的分子結(jié)合至新生兒Fe受體(FcRn)，如pH依賴性結(jié)合，其允許修飾的LH避開溶酶體降解，如Roopenian et.al., "FcRn:theneonatal Fe receptor comes of age〃，Nature reviews, Immunology, vol.7, p.715.725, sept.2007中所述。
[0331]結(jié)合至FcRn的典型藥學(xué)上可接受的分子選自白蛋白，如對(duì)FcRn結(jié)合增加或減少的修飾的白蛋白、人白蛋白或重組人白蛋白。[0332]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的分子選自有機(jī)小分子、肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)、受體、糖基化、?；鶊F(tuán)、糖、聚合物(例如聚乙二醇，PEG)、核酸(例如DNA和RNA)以及激素中的任一種。通常，藥學(xué)上可接受的分子(不限于)選自哺乳動(dòng)物抗體的Fe片段、轉(zhuǎn)鐵蛋白、白蛋白(如人白蛋白)、重組白蛋白、白蛋白的變體；?；鶊F(tuán)，如CH3(CH2)nCO-,其中η是8至22 ;或聚合物，如PEG，例如分子量為至少5kDa的PEG，如IOkDa至150kDa，通常為10至40kDa。
[0333]本發(fā)明進(jìn)一步的方面涉及包含本發(fā)明的修飾的LH和任選藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。
[0334]與ART程序有關(guān)，并且特別是與本文所講解的誘導(dǎo)卵泡發(fā)育或COS有關(guān)，可同時(shí)地或順序地施用不止一種藥劑。因此，在用于不育癥治療的ART程序(如誘導(dǎo)COS)中或者在促進(jìn)生育能力中，使用本發(fā)明的修飾的LH與一種或多種通常用于不育癥治療或促進(jìn)生育能力的其它治療活性化合物相結(jié)合，這是在本發(fā)明范圍內(nèi)的。
[0335]在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明涉及包含連接至藥學(xué)上可接受的分子的哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物的修飾的LH，所述藥學(xué)上可接受的分子提供哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物或者修飾的LH的體內(nèi)血漿半衰期，其在哺乳動(dòng)物中為2至48小時(shí)，以與FSH或具有FSH活性的分子結(jié)合使用，用于同時(shí)、按順序或分開使用以在哺乳動(dòng)物雌性受試者的無(wú)排卵治療中誘導(dǎo)卵泡發(fā)育，或者在哺乳動(dòng)物雌性受試者的月經(jīng)周期的卵泡階段中誘導(dǎo)COS。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)SH選自哺乳動(dòng)物的FSH，如人FSH，特別是重組FSH，例如rhFSH。在特定的實(shí)施方案中，F(xiàn)SH選自保妊康、果納 芬、依諾娃、Fostinorm、Bravelle、美諾孕。
[0336]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的修飾的LH與FSH或具有FSH活性的分子的組合是要在哺乳動(dòng)物雌性受試者的無(wú)排卵治療中誘導(dǎo)卵泡發(fā)育，如少量卵泡生成或單一卵泡生成。在又進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的修飾的LH與FSH或具有FSH活性的分子的組合是要在哺乳動(dòng)物雌性受試者的月經(jīng)周期的卵泡階段中誘導(dǎo)COS。通常，在誘導(dǎo)卵泡發(fā)育或COS中，按20:1至1:20的IU比例范圍(FSH:修飾的LH)施用本發(fā)明的修飾的LH和FSH或具有FSH活性的分子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，按18:1至1:18、15:1至1:15、12:1至1:12、9:1至1:9、5:1至1:5(如4:1至1:4)的IU比例范圍施用FSH:修飾的LH。
[0337]雖然如上所述可以同時(shí)、按順序或分開施用FSH和修飾的LH，但通常是作為成套試劑盒或者作為藥物組合物一起地組合施用，前者包含單獨(dú)劑型的修飾的LH和FSH，這些劑型可以是相同的，例如試劑盒中的兩個(gè)單獨(dú)的注射劑，如皮下注射劑，后者包含本發(fā)明的修飾的LH和FSH或具有FSH活性的分子以及任選藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。優(yōu)選的是，皮下施用修飾的LH和FSH，優(yōu)選進(jìn)入前腹壁。用于胃腸外施用的制劑通常是無(wú)菌的。適于腸胃外施用的藥物制劑包括水和非水無(wú)菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使制劑與擬定哺乳動(dòng)物受試者的血液等滲的溶質(zhì)；可包括混懸劑及增稠劑的水和非水無(wú)菌混懸液也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。制劑可存在于單位劑量或多劑量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以在冷凍干燥(凍干)條件下儲(chǔ)存，在臨使用前，注射僅需添加無(wú)菌液體載體，例如水?？捎蔁o(wú)菌粉末、顆粒和片劑制備臨時(shí)注射溶液和混懸液。可通過預(yù)填充針筒、自動(dòng)注射器或多劑量自動(dòng)注射器施用制劑。通常，提供LH化合物和FSH或具有FSH活性的分子以在藥物組合物中同時(shí)使用。
[0338]本發(fā)明又進(jìn)一步的方面涉及在哺乳動(dòng)物雌性受試者的無(wú)排卵治療中誘導(dǎo)卵泡發(fā)育(如少量卵泡生成或單一卵泡生成)或者在哺乳動(dòng)物雌性受試者的月經(jīng)周期的卵泡階段中誘導(dǎo)COS的方法，包括與FSH或具有FSH活性的分子相結(jié)合而同時(shí)、按順序或分開地對(duì)有需要的哺乳動(dòng)物施用有效量的本發(fā)明的修飾的LH。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，F(xiàn)SH或具有FSH活性的分子選自哺乳動(dòng)物的FSH，如人FSH，特別是重組FSH，例如rhFSH。
[0339]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物受試者選自人、母牛、豬、馬、綿羊、狗、貓和山羊，通常為人受試者。
[0340]在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明涉及制備本發(fā)明的修飾的LH(如本發(fā)明的任一種本文公開的綴合物)的方法，該修飾的LH包含連接至藥學(xué)上可接受的分子的哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物，所述藥學(xué)上可接受的分子提供哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物或者修飾的LH的體內(nèi)血漿半衰期，其在哺乳動(dòng)物中為2至48小時(shí)，該方法包括使哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物與附接至藥學(xué)上可接受的分子的連接子反應(yīng)，或者使哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物與連接子反應(yīng)，并然后將所述連接子附接至藥學(xué)上可接受的分子，或者使連接子與藥學(xué)上可接受的分子反應(yīng)，并然后使哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物與附接至藥學(xué)上可接受的分子的連接子反應(yīng)，或者通過由宿主細(xì)胞表達(dá)哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物和藥學(xué)上可接受的分子。
[0341]本發(fā)明的方法
[0342]圖1a和Ib描述現(xiàn)有技術(shù)中已知的受控卵巢刺激的方案。圖1中的方案開始于在月經(jīng)周期的第1-3天施用重組或尿FSH。按日劑量施用FSH直到排卵誘導(dǎo)。從約第6天施用GnRH拮抗劑以避免排卵誘導(dǎo)之前LH過早激增。通過施用5，000至10，000IU重組hCG的引發(fā)注射來(lái)誘導(dǎo)排卵?？蛇x擇性地通過GnRH激動(dòng)劑引發(fā)來(lái)誘導(dǎo)排卵。這通常是當(dāng)一至三個(gè)卵泡具有17_的尺寸時(shí)進(jìn)行。為了提供黃體支持，在胚胎轉(zhuǎn)移的當(dāng)天開始通過陰道或肌內(nèi)施用孕酮。孕酮施用持續(xù)至少直到刺激方案的第28天。在許多情況下，施用孕酮直到懷孕的第5周或甚至直到懷孕的第10周。
[0343]在圖1b中，在第1-6天將日劑量的FSH替換成一個(gè)劑量的長(zhǎng)效FSH (絨促卵泡素)。在第5-7天左右，絨促卵泡素的血清水平降低，并且給予日劑量的重組或尿FSH直到排卵引發(fā)。使用絨促卵泡素的優(yōu)點(diǎn)在于，女性不需要在第2-5或6天就診和接受FSH注射。
[0344]圖2a是根據(jù)本發(fā)明基于施用長(zhǎng)效促性腺激素刺激方案的一個(gè)實(shí)施方案的示意圖示。在此例中，在月經(jīng)周期的第1-3天施用長(zhǎng)效FSH,如絨促卵泡素α。在絨促卵泡素的例子中，劑量可以是每位女性100和150yg。選擇劑量和血清半衰期以使得在卵泡階段的后期FSH的血清水平減少，從而在卵泡階段的晚期顯著地減少進(jìn)一步的卵泡募集。這是為了減少受刺激發(fā)育的卵泡數(shù)，從而減少OHSS的危險(xiǎn)。
[0345]如在已知方案中的那樣，在刺激方案的第4-7天開始施用GnRH拮抗劑。通過在刺激方案的第6天或更早施用一個(gè)劑量的長(zhǎng)效hCG來(lái)刺激卵泡發(fā)育。也可以使用長(zhǎng)效LH。長(zhǎng)效hCG或LH的劑量足以刺激卵泡發(fā)育，并且足夠低以減少OHSS的危險(xiǎn)。按給出的生物響應(yīng)類似于以4-15IU/升血清水平所獲得的響應(yīng)的劑量施用長(zhǎng)效hCG或LH。為進(jìn)一步減少OHSS的危險(xiǎn)，當(dāng)至少一個(gè)卵泡具有至少15mm的直徑時(shí)、優(yōu)選當(dāng)3個(gè)卵泡具有17mm的直徑時(shí)采用GnRH激動(dòng)劑引發(fā)注射以誘導(dǎo)排卵。當(dāng)皮下施用或鼻內(nèi)施用時(shí)，合適的劑量范圍在0.1與Img之間?？梢酝ㄟ^如已知方案(在圖2a中示出)中的那樣施用孕酮或者通過如本文所描述和示出(圖4a和4b)的那樣施用LH激動(dòng)劑來(lái)提供黃體階段支持。
[0346]圖2b示出本發(fā)明的一項(xiàng)方案，其中通過從第I天施用重組或尿源FSH作為每日注射劑來(lái)刺激卵泡生成，直到大約第6天。FSH的優(yōu)選日劑量為每天150-225IU。通過UV掃描和測(cè)量卵泡直徑來(lái)確定停止FSH施用的確切日子。當(dāng)至少一個(gè)卵泡已達(dá)到12-14mm直徑時(shí)停止FSH施用，并施用單劑量的長(zhǎng)效hCG或LH以刺激卵泡發(fā)育，如上文所述。卵母細(xì)胞誘導(dǎo)和黃體支持如圖2a中所描述。在圖2b的方案中，如對(duì)于圖2a所描述的那樣施用GnRH拮抗劑和激動(dòng)劑。
[0347]圖2c示出本發(fā)明的一項(xiàng)方案，其中通過從大約第6天開始施用日劑量的FSH(如圖2b中的那樣)和日劑量的hCG或LH來(lái)刺激卵泡生成和卵泡發(fā)育。在卵泡階段期間hCG的合適劑量包括每天25-400IU，如每天50-300IU，更優(yōu)選每天100-300IU，如每天150-250IU，例如每天175—225IU。在圖2c的方案中，如對(duì)于圖2a所描述的那樣施用GnRH拮抗劑和激動(dòng)劑。這里沒有示出黃體支持，但可以通過施用孕酮或施用LH/hCG提供，如圖4a或4b中所描述的那樣。
[0348]在基于圖3a示出的施用長(zhǎng)效(長(zhǎng)持續(xù)性)hCG或LH的可供選擇的方案中，如對(duì)于圖2b中的方案所描述的那樣施用FSH、GnRH拮抗劑和GnRH激動(dòng)劑。通過例如從卵泡階段中的約第6天開始，以2-7天的間隔(以5天示出)施用長(zhǎng)效hCG或LH，并持續(xù)至少直到懷孕測(cè)試，由此提供卵泡發(fā)育和黃體支持。在懷孕的情況下，可繼續(xù)施用長(zhǎng)效LH或hCG，直到懷孕的第5周，例如直到懷孕的第10周。在卵泡階段期間長(zhǎng)效hCG或LH的合適劑量是給出的生物響應(yīng)類似于以4-15IU/升的血清水平獲得的響應(yīng)的劑量。
[0349]在可供選擇的方案中，在卵泡階段期間并貫穿黃體階段以日劑量施用重組或尿hCG或LH (圖3b和3c)。圖中示出了 hCG施用，但同樣可設(shè)想到施用LH。hCG的施用可開始于刺激的第6天，但同樣可更早地開始，如在刺激的第2天。在卵泡階段期間尿或重組hCG的合適劑量包括每天25-400 IU，如每天50-300IU，更優(yōu)選每天100-300IU，如每天150-250IU，例如每天175— 225IU。在黃體階段中，優(yōu)選使用LH或LH類似物或變體，因?yàn)槭┯弥亟M或尿hCG可能會(huì)導(dǎo)致生化懷孕誤檢測(cè)。大多數(shù)橫向流裝置懷孕測(cè)試依賴于尿hCG的檢測(cè)。在黃體階段中重組或尿hCG的合適劑量包括每天25-400IU hCG，優(yōu)選每天50-200IU hCG，例如 75-200IU/ 天，如 100-150 或 120-170IU/ 天。
[0350]圖3c中的方案示出本發(fā)明的另一種方案，其中已從刺激方案的第2天施用hCG (或LH)。其它方面該方案與圖3b的方案完全相同。也可以用長(zhǎng)效hCG或長(zhǎng)效LH實(shí)施圖3b和3c中的方案的卵泡刺激，它們是在刺激方案第1、2或3天以單劑量施用的。
[0351]圖4a和4b示出根據(jù)本發(fā)明的黃體支持方案。根據(jù)示出的實(shí)施方案(圖4a)，通過從大約卵母細(xì)胞收獲之時(shí)施用日劑量的LH (或hCG)，并持續(xù)直到方案的第28天，由此提供黃體支持。用于黃體支持的重組或尿LH的優(yōu)選劑量范圍包括每天100-600IU LH的日劑量，優(yōu)選每天150-450IU LH，如每天200-400IU LH，例如250-350IU/天。重組或尿hCG的優(yōu)選劑量范圍包括每天25-400IU hCG，優(yōu)選每天50-200IU hCG，例如75-200IU/天，如100-150或 120-170IU/天。
[0352]黃體支持持續(xù)直到排卵后至少2周，但可持續(xù)直到第5或10妊娠周。
[0353]通過在黃體階段期間以一定的劑量一次或多次施用長(zhǎng)效LH或長(zhǎng)效hCG(圖4b)可以得到類似的結(jié)果，所述劑量給出的生物響應(yīng)類似于通過施用LH的優(yōu)選劑量的日劑量所獲得的響應(yīng)?？膳c任何類型的ART聯(lián)合使用黃體支持方案。
[0354]可以按多種方式組合本發(fā)明的不同方案，只要它們不背離如獨(dú)立權(quán)利要求中所確定的本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思即可。
[0355]FSH
[0356]促卵泡激素(FSH)調(diào)節(jié)人體的發(fā)育、生長(zhǎng)、青春期成熟和生育過程。在男性和女性中，F(xiàn)SH刺激生殖細(xì)胞的成熟。在男性中，F(xiàn)SH誘導(dǎo)睪丸支持細(xì)胞分泌抑制素并刺激支持細(xì)胞-支持細(xì)胞緊密連接(閉鎖小帶)的形成。在女性中，F(xiàn)SH刺激未成熟卵泡在卵巢中的生長(zhǎng)和募集。在早期(小)竇狀卵泡中，F(xiàn)SH是挽救卵泡凋亡(卵泡和卵母細(xì)胞的體細(xì)胞的程序性死亡)的主要存活因子。在黃體-卵泡階段過渡期，孕酮和雌激素(主要是雌二醇)的血清水平下降，并且不再抑制FSH的釋放，因此FSH在約第三天達(dá)到峰值(第一天為月經(jīng)周期的首日)。
[0357]FSH是異二聚糖蛋白。每個(gè)單體單元是一個(gè)或多個(gè)寡糖鏈共價(jià)連接至氨基酸側(cè)鏈的蛋白質(zhì)分子；這些單體單元中的兩個(gè)構(gòu)成完整的功能性蛋白。蛋白二聚體含有2個(gè)多肽單元，以α和β亞基標(biāo)記。LH、FSH、TSH和hCG的α亞基是完全相同的，并且含有92個(gè)氨基酸(參見圖5)。FSH具有118個(gè)氨基酸的β亞基(FSHB)，這些氨基酸賦予其特定的生物學(xué)作用，并負(fù)責(zé)與FSH-受體的相互作用。激素的糖部分由巖藻糖、半乳糖、甘露糖、半乳糖胺、葡糖胺和唾液酸組成，后者對(duì)于其生物半衰期是關(guān)鍵的。FSH的半衰期是3-4小時(shí)。
[0358]α亞基的基因位于染色體6ρ21.1_23上。其表達(dá)于不同的細(xì)胞類型中。FSH^亞基的基因位于染色體11Ρ13上，并且表達(dá)于垂體細(xì)胞的促性腺物質(zhì)中，被GnRH控制，受抑制素的抑制，并且通過激活素增強(qiáng)。
[0359]本發(fā)明優(yōu)選的FSH的β-鏈選自與SEQ ID Ν010、11、12、13或15具有至少80%、更優(yōu)選85%、更優(yōu)選90%、更優(yōu)選95%的序列同一性的序列。優(yōu)選地，變體在SEQ ID NOlO的位置和間距處包含保守的半胱氨酸殘基。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)SH包含具有SEQID NOlO的人α -亞基。
[0360]本領(lǐng)域技術(shù)人員要理解的是，F(xiàn)SH可被生物學(xué)活性類似物或者被刺激內(nèi)源性FSH分泌的化合物替代。在這后一類中包括有芳香酶抑制劑和抗雌激素，如它莫昔芬和克羅米酚檸檬酸鹽(CC)。這些化合物通過除去雌激素施加于下丘腦上的負(fù)反饋(通過拮抗雌激素受體，如CC和它莫昔芬的情況，或者通過大幅度減少雌激素濃度，如芳香酶抑制劑的情況)而刺激內(nèi)源性FSH分泌。其它類型的FSH類似物包括例如單鏈FSH類似物，其中[β ]-亞基融合至hCG的CTP，其繼而融合至FSH[ α ]-亞基，如W096/05224中所述(單鏈FSH-CTP)。
[0361]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，F(xiàn)SH選自哺乳動(dòng)物FSH的類似物或哺乳動(dòng)物FSH的類似物。當(dāng)FSH是哺乳動(dòng)物FSH的類似物時(shí)，該類似物與FSH的相應(yīng)哺乳動(dòng)物序列具有至少80 %同一1丨生，如85%同一1丨生、90%同一1丨生、95%同一1丨生、98%同一1丨生。序列同一1丨生適用于FSH的α和β鏈兩者。
[0362]所使用的兩種最常見的形式是尿人絕經(jīng)期促性腺激素(含F(xiàn)SH和LH活性)和重組FSH (含F(xiàn)SH而沒有任何LH活性)。由于所有目前使用的FSH制劑的半衰期相對(duì)較短，在刺激IVF的婦女中誘導(dǎo)多卵泡發(fā)育的臨床方案需要每日注射。可采用使用顯示出半衰期延長(zhǎng)的FSH的長(zhǎng)效形式物代替FSH的每日注射。
[0363]通常按藥典以IU給出FSH活性?，F(xiàn)在也可以生產(chǎn)出FSH的純制劑，并且活性以質(zhì)量給出(例如yg每小瓶)。在本發(fā)明中要理解的是，以IU給出的活性同以其它單位給出的FSH活性有關(guān)聯(lián)。[0364]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)SH是長(zhǎng)效FSH。說到長(zhǎng)效旨在表示其血清半衰期為重組或尿FSH的血清半衰期的至少1.5倍的蛋白質(zhì)，更優(yōu)選至少2倍、更優(yōu)選至少3倍、更優(yōu)選至少4倍、更優(yōu)選至少5倍、更優(yōu)選至少7倍、更優(yōu)選至少10倍,如至少15倍,例如至少20倍，如至少25倍，例如至少30倍、40倍或50倍或更多。
[0365]優(yōu)選長(zhǎng)效FSH的半衰期不長(zhǎng)于72小時(shí)，如48小時(shí)。這使得在卵泡生成的后期更容易控制FSH施用。
[0366]長(zhǎng)效FSH可例如是FSH-CTP，其描述于W093/06844中，并具有野生型FSH[ α ]-亞基以及[β]_亞基，其包括在其羧基末端融合至hCG的[β]_亞基(天然hCG[i3]序列SEQID N09的位置145的殘基118)的羧基末端肽(CTP)的野生型人FSH[ β ]-亞基(SEQ IDΝ010)。所得到的β-亞基具有SEQ ID Ν015的序列。
[0367]絨促卵泡素α是在CHO細(xì)胞中通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的糖蛋白。絨促卵泡素α被設(shè)計(jì)為持續(xù)的卵泡刺激物，具有與(rec)FSH相同的藥效學(xué)特點(diǎn)(pharmacodynamicprofile)，但FSH活性的持續(xù)時(shí)間顯著延長(zhǎng)。由于其能夠引發(fā)和維持多卵泡生長(zhǎng)長(zhǎng)達(dá)一周，因而在COS治療周期中單次皮下注射推薦劑量的絨促卵泡素(Elonva? )可代替任何每日(rec) FSH制劑的頭七次注射中的一些或全部。通過對(duì)人FSH(SEQ ID NO I O)的β -鏈增加人絨膜促性腺激素(hCG)的β_亞基的羧基末端肽實(shí)現(xiàn)FSH活性的長(zhǎng)持續(xù)時(shí)間。絨促卵泡素α不顯示有任何內(nèi)在的LH/hCG活性。絨促卵泡素α具有69小時(shí)(59_79小時(shí))的平均消除半衰期。
[0368]優(yōu)選可按每一雌性哺乳動(dòng)物一次團(tuán)注40-240 μ g來(lái)施用絨促卵泡素，例如像每一雌性哺乳動(dòng)物60-220 μ g、例如像每一雌性哺乳動(dòng)物80-200 μ g、例如像每一雌性哺乳動(dòng)物100-180 μ g或例如像每一雌性100-150 μ g。在另一實(shí)施方案中可按每一雌性哺乳動(dòng)物一次團(tuán)注40-120 μ g施用絨促卵泡素，例如像每一雌性哺乳動(dòng)物60-100 μ g或例如像每一雌性哺乳動(dòng)物70-90 μ g。在再一實(shí)施方案中，按每一雌性哺乳動(dòng)物一次團(tuán)注120-240 μ g施用絨促卵泡素，例如像每一雌性哺乳動(dòng)物140-220 μ g、例如像每一雌性哺乳動(dòng)物160-200 μ g或例如像每一雌性哺乳動(dòng)物170-190 μ g。絨促卵泡素的批準(zhǔn)劑量是60kg以下的女性為100 μ g, 60kg以上的女性為150 μ go
[0369]按一次團(tuán)注施用絨促卵泡素優(yōu)選在月經(jīng)周期的第1-3天，例如像在月經(jīng)周期的第I天、第2天或第3天。
[0370]因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)SH是長(zhǎng)效FSH，如絨促卵泡素，優(yōu)選在月經(jīng)周期的第1-3天按每一雌性哺乳動(dòng)物一次團(tuán)注40-240 μ g施用。
[0371]在其中FSH(或類似物)與COS技術(shù)或方案聯(lián)合使用的方面中，適當(dāng)劑量和施用方案對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說是顯而易見的，并且可使用任何適當(dāng)?shù)膭┝亢褪┯梅桨浮?br> [0372]例如，可以按在卵泡階段期間給出每升1-50IU FSH的血清水平的劑量施用FSH，例如像每升2-40IU FSH、例如像每升3-35IU FSH，例如每升4-30IU FSH，例如像每升5-25IUFSH，例如每升7-20IU FSH，例如像每升10-15IU FSH0
[0373]優(yōu)選按在卵泡階段期間給出每升5-25IU FSH、優(yōu)選每升10-15IU的血清水平的劑量施用FSH。
[0374]在一個(gè)實(shí)施方案中可按每天50-600IU FSH、優(yōu)選每天100-300IU FSH的日劑量施用FSHjn 150-225IU/天。在顯示出對(duì)FSH響應(yīng)減少的一些患者中，可取的是使用高達(dá)每天600IU FSH的劑量。典型的方案如下:患者開始于每天150IU FSH0如果卵泡發(fā)育充分，則可維持150IU FSH/天的劑量。如果卵泡發(fā)育不充分，則可將劑量增至225、300、375、450、525或600IU FSH/天。理想地，F(xiàn)SH的累積劑量不應(yīng)超過6000IU/周期。
[0375]在本發(fā)明方法中使用的FSH可以有任何來(lái)源。這些來(lái)源是排卵誘導(dǎo)和COS程序領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的?？墒褂肍SH的尿制劑，例如按1:1比例含有FSH和LH活性的hMG。
[0376]因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)SH是按每天50-600IU FSH的日劑量施用的重組或尿源FSH，優(yōu)選每天100-300IU FSHjB 150-225IU/天。
[0377]可以在月經(jīng)周期的第1-3周期日開始施用FSH，例如像在月經(jīng)周期的第I周期日、例如在月經(jīng)周期的第2周期日或例如在月經(jīng)周期的第3周期日。
[0378]當(dāng)至少一個(gè)卵泡具有12_14mm、例如像12_13mm或例如13_14mm的直徑時(shí)停止施用FSH0例如可在月經(jīng)周期的第4、5、7或8周期日停止施用FSH。在本發(fā)明的典型例子中，在月經(jīng)周期的第6周期日停止施用FSH。停止FSH施用的目的是阻止進(jìn)一步的卵泡生成，并允許最大的卵泡成熟。本領(lǐng)域中已知的是，卵泡數(shù)目與OHSS危險(xiǎn)之間有關(guān)聯(lián)。
[0379]當(dāng)施用的FSH是重組或尿源FSH時(shí)，停止FSH施用僅需不進(jìn)一步施用FSH。然后FSH的血清水平將在未來(lái)的幾天中下降到不會(huì)再刺激卵泡生成的水平。當(dāng)施用長(zhǎng)效FSH(例如絨促卵泡素α)時(shí)，停止FSH施用意指應(yīng)停止施用，使得在第一個(gè)卵泡已經(jīng)達(dá)到如上所述的直徑后一或兩天，血清FSH活性的水平不再刺激卵泡生成。在施用例如絨促卵泡素α的情況下，優(yōu)選在刺激方案的第一天只施用一個(gè)劑量的絨促卵泡素α。如果需要進(jìn)一步的卵泡生成，可以稍后在刺激周期但在卵泡達(dá)到12-14mm尺寸前施用重組或尿源FSH。按這種方式可以更容易地控制FS H的血清水平。
[0380]一般來(lái)說，血清FSH活性的水平(以IU或μ g每升為單位)應(yīng)下降到在刺激方案的頭1-6天期間低于血清水平的50%的水平。更優(yōu)選低于25%，如低于10%。
[0381]促黃體激素(LH)
[0382]LH是由垂體前葉腺產(chǎn)生的激素，并且對(duì)于男性和女性的生育是必不可少的。在女性中，在月經(jīng)來(lái)潮之時(shí)，F(xiàn)SH引發(fā)卵泡生長(zhǎng)，特別是影響顆粒細(xì)胞。隨著雌激素的升高，LH受體也表達(dá)于成熟中的卵泡上,成熟中的卵泡產(chǎn)生增加量的雌二醇。最終在卵泡成熟之時(shí),雌激素升高經(jīng)由下丘腦界面導(dǎo)致“正反饋”效果，經(jīng)24到48小時(shí)時(shí)間釋放LH。這種“LH激增”引發(fā)排卵，從而不僅釋放卵子，而且還引發(fā)將殘余卵泡轉(zhuǎn)化為黃體，這繼而產(chǎn)生孕酮，以為可能的著床準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜。LH對(duì)于頭兩周維持黃體功能是必要的。在懷孕的情況下，黃體功能將由來(lái)自剛剛確實(shí)的妊娠的hCG(非常類似于LH的激素)的作用進(jìn)一步得以維持。LH在巢卵中支持泡膜細(xì)胞，其為雌二醇產(chǎn)生提供雄激素和激素前體。LH是異二聚糖蛋白。每個(gè)單體單元是一個(gè)或多個(gè)寡糖鏈共價(jià)連接至氨基酸側(cè)鏈的蛋白質(zhì)分子；這些單體單元中的兩個(gè)構(gòu)成完整的功能性蛋白。蛋白~聚體含有2個(gè)多妝單兀，以α和β亞基標(biāo)記。LH、FSH、TSH和hCG的α亞基是完全相同的，并且含有92個(gè)氨基酸。LH具有141個(gè)氨基酸的β亞基(LHB)，這些氨基酸賦予其特定的生物學(xué)作用，并負(fù)責(zé)與LH-受體的相互作用。此β亞基含有顯示出與hCG的β亞基的序列有同源性并且均刺激相同受體的氨基酸序列。然而，hCGi3亞基含有另外24種氨基酸，并且兩種激素的糖部分的組成不同。
[0383]本發(fā)明的LH的β鏈選自與SEQ ID Ν04、5、6、7和8具有至少80%、更優(yōu)選85%、更優(yōu)選90%、更優(yōu)選95%的序列同一性的序列。優(yōu)選地，變體在SEQ ID Ν04的位置和間距處包含保守的半胱氨酸殘基。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，LH包含具有SEQ ID N04的人α-亞基。
[0384]這些寡糖的不同組成影響生物活性以及降解和消除速度。LH的生物學(xué)半衰期為20分鐘，這比FSH (3-4小時(shí))和hCG (24-30小時(shí))的要短得多。
[0385]本領(lǐng)域技術(shù)人員要理解的是，LH可被生物學(xué)活性類似物或者被刺激內(nèi)源性LH分泌的化合物替代。LH的類似物包括施加與LH相同的生理、生化或生物效果和/或結(jié)合至與LH相同的受體的所有分子。LH的一些類似物還可包括單鏈LH。已知hCG與LH分擔(dān)一些生理作用。LH的類似物的一些例子在以下文獻(xiàn)中有公開:例如歐洲專利EP0322226 (AppliedResearch Systems) > W092/22568 (University of Medicine&Dentistry of New Jersey) >W096/05224(Washington University)、W090/09800 (Washington University)、W093/06844 (Washington University)、W098/43999 (Washington University)、W099/25849(Washington University) > W000/61586 (Akzo Nobel)。
[0386]LH及其類似物或LH激動(dòng)劑可選自有機(jī)小分子、肽、多肽、蛋白質(zhì)，并且可以通過合成方法、通過重組手段來(lái)產(chǎn)生，或者由其天然來(lái)源獲得，例如由尿、組織或血液獲得。
[0387]在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，LH激動(dòng)劑是重組或尿源LH。在另一實(shí)施方案中，LH激動(dòng)劑是非哺乳動(dòng)物來(lái)源的。在另一特定的實(shí)施方案中，LH激動(dòng)劑是哺乳動(dòng)物來(lái)源的，如通過重組手段獲得的蛋白質(zhì)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，LH激動(dòng)劑選自哺乳動(dòng)物絨膜促性腺激素(CG)或哺乳動(dòng)物L(fēng)H。當(dāng)LH激動(dòng)劑是哺乳動(dòng)物CG時(shí)，其通常為靈長(zhǎng)類動(dòng)物CG，例如人CG，但也可選自其它 哺乳動(dòng)物物種，如馬CG。
[0388]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，LH激動(dòng)劑選自哺乳動(dòng)物L(fēng)H的類似物或者哺乳動(dòng)物L(fēng)H的類似物。當(dāng)LH激動(dòng)劑是哺乳動(dòng)物L(fēng)H的類似物時(shí)，該類似物優(yōu)選與促黃體激素的相應(yīng)哺乳動(dòng)物序列具有至少80%同一1丨生，如85%同一1丨生、90%同一1丨生、95%同一1丨生、98%同一1丨生。序列變化可以在α鏈中、β鏈中或在這兩者中。LH激動(dòng)劑可以是人CG的類似物，其與絨膜促性腺激素的相應(yīng)人序列具有至少80 %同一性，如85 %同一性、90 %同一性、95 %同一性、98%同一性。當(dāng)LH激動(dòng)劑是哺乳動(dòng)物L(fēng)H的類似物時(shí)，該類似物與促黃體激素的相應(yīng)哺乳動(dòng)物序列具有至少80%同一1丨生，如85%同一1丨生、90%同一1丨生、95%同一1丨生、98%同一1丨生。通常，LH激動(dòng)劑是人LH的類似物，其與促黃體激素的相應(yīng)人序列具有至少80%同一性，如85%同一性、90%同一性、95%同一性、98%同一性。
[0389]當(dāng)LH激動(dòng)劑選自多肽或蛋白質(zhì)時(shí)，如哺乳動(dòng)物CG的類似物或哺乳動(dòng)物L(fēng)H的類似物，其可以被糖基化。通常，LH激動(dòng)劑是被糖基化的hCG。也可以是像這樣的LH化合物被糖基化，并且糖基化可以在LH激動(dòng)劑上，或者在藥學(xué)上可接受的分子上(當(dāng)所述分子選自多肽或蛋白質(zhì)，如人白蛋白時(shí))?？梢园炊喾N方式將LH激動(dòng)劑連接至藥學(xué)上可接受的分子，如直接通過價(jià)鍵，或者間接地通過連接子，該連接子通常為雙官能連接子，雖然它也可以是多官能連接子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，連接子選自化學(xué)連接子、糖部分、二硫橋、融合連接子、親水連接子、可水解的連接子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，LH激動(dòng)劑通過肽連接子融合至藥學(xué)上可接受的分子。在又進(jìn)一步的實(shí)施方案中，LH激動(dòng)劑直接融合至藥學(xué)上可接受的分子，以便通過由宿主細(xì)胞(如CHO細(xì)胞或酵母細(xì)胞)表達(dá)LH化合物來(lái)產(chǎn)生一種多肽或蛋白質(zhì)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，LH激動(dòng)劑通過穩(wěn)定的連接子連接至藥學(xué)上可接受的分子。在另一實(shí)施方案中，LH激動(dòng)劑通過不穩(wěn)定的連接子連接至藥學(xué)上可接受的分子。因此，可以采用現(xiàn)有技術(shù)中熟知的技術(shù)，按多種方式將LH激動(dòng)劑連接至藥學(xué)上可接受的分子，并且本發(fā)明還包括其中一種或多種LH激動(dòng)劑連接至一種或多種藥學(xué)上可接受的分子的情況，如兩種LH激動(dòng)劑連接至一種藥學(xué)上可接受的分子，或者一種LH激動(dòng)劑連接至兩種藥學(xué)上可接受的分子。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，LH激動(dòng)劑連接至一種或兩種藥學(xué)上可接受的分子，優(yōu)選一種藥學(xué)上可接受的分子。
[0390]當(dāng)LH激動(dòng)劑是哺乳動(dòng)物L(fēng)H時(shí)，其通常為人LH，但也可選自其它哺乳動(dòng)物物種，如母牛LH、豬LH、馬LH、綿羊LH、狗LH、貓LH和山羊LH。通常，LH激動(dòng)劑是人LH或人hCG。通常情況下，IVF涉及在胚胎轉(zhuǎn)移后的頭2周期間采用孕酮的每日黃體階段支持治療。如果確認(rèn)在周期的第28天妊娠，則可以將采用孕酮的每日黃體階段支持治療再延長(zhǎng)5-10周。然而在本發(fā)明中，LH的施用可以代替這種采用孕酮的每日治療。通過施用一個(gè)或多個(gè)劑量的LH激動(dòng)劑提供黃體和妊娠階段支持可導(dǎo)致卵母細(xì)胞更好地發(fā)育，卵母細(xì)胞更健康，增加胚胎著床和保留，降低生化懷孕危險(xiǎn)，并且可減少OHSS的危險(xiǎn)。
[0391 ] 在一個(gè)實(shí)施方案中，單獨(dú)用于黃體支持的LH激動(dòng)劑是LH類似物而不是hCG或hCG類似物。這首先是因?yàn)樵邳S體階段中施用hCG可能會(huì)干擾通常涉及檢測(cè)由黃體分泌的尿hCG的生化懷孕測(cè)試。此外，預(yù)期在黃體階段中施用LH而不是hCG可減少發(fā)生OHSS的危險(xiǎn)，這是由于這兩種蛋白質(zhì)的受體親和力不同。
[0392]在另一實(shí)施方案中，單獨(dú)用于妊娠支持的LH激動(dòng)劑是LH類似物而不是hCG或hCG類似物。這首先是因?yàn)樵谌焉镫A段中施用hCG可能會(huì)干擾通常涉及檢測(cè)由黃體分泌的尿hCG的生化懷孕測(cè)試。此外，預(yù)期在妊娠階段中施用LH而不是hCG可減少發(fā)生OHSS的危險(xiǎn)，這是由于這兩種蛋白質(zhì)的受體親和力不同。
[0393]雖然LH和hCG兩者都結(jié)合并激活LH-受體，但這兩種激素作為一個(gè)家族的異激素存在，它們的寡糖組成不同。每種不同的亞型以特定的方式影響受體，并且可引起可變的細(xì)胞響應(yīng)(Burgon PG et al., Endocrinology, 1996 ； 137:4827 ；Stanton PG etal.,Mol Cell Endocrinol.1996 ;125:133-14L )，如也已對(duì)不同的 FSH 亞型顯示的那樣(Barrios-de-TomasiJ, et al.Mol Cell Endocrinol.2002 ；186:189-98, Yding AndersenC&Ezcurra D, Reproductive Biology Insights2011:4, 1-10)。因此LH和hCG的更精細(xì)和微調(diào)的效果可能實(shí)際上不同。在斯德哥爾摩的ESHRE會(huì)議(2011年7月)上介紹的近期研究實(shí)際上表明LH的作用比hCG快得多，但在受體水平上效率較低(L.Casarini et al.，ESHREStockholm2011-P312, Universita degli Studi di Modena, Italy)。Peter Humaindan 教授的展示(ESHRE Stockholm2011)進(jìn)一步表明，與補(bǔ)充的等效劑量的hCG相比，在COS期間對(duì)重組FSH補(bǔ)充重組LH顯著提高了卵母細(xì)胞產(chǎn)量，在受體水平上顯示出特定的LH效果。hCG是在懷孕后大約8天繼胚胎著床而分泌的妊娠相關(guān)蛋白。hCG能夠刺激黃體保持活性并使之繼續(xù)分泌孕酮及其它必要的物質(zhì)，以便能夠發(fā)生懷孕。當(dāng)開始由著床的胚胎分泌hCG時(shí)，LH以可觀的量存在，但這些水平不足以進(jìn)一步刺激黃體，并且除非婦女發(fā)生懷孕，否則黃體將會(huì)退化，將會(huì)發(fā)生月經(jīng)出血，并且開始新的月經(jīng)周期。因此在此階段hCG優(yōu)先刺激黃體。雖然LH與hCG之間的這種差異已經(jīng)困擾了科學(xué)界有些時(shí)間，但現(xiàn)已證實(shí)在黃體階段期間LH-受體(LH-R)發(fā)生變化。當(dāng)存在hCG時(shí)，功能性全長(zhǎng)受體保持其表達(dá)，而LH無(wú)法做到這點(diǎn)(Dickinson RE et al.，Endocrinologyl50:2873-2881，2009)。這顯不了在黃體階段期間LH和hCG效果的差異。[0394]本文描述的雌性哺乳動(dòng)物中的輔助生育治療方法可在一個(gè)實(shí)施方案中進(jìn)一步包括通過施用一個(gè)或多個(gè)劑量的LH激動(dòng)劑代替目前的孕酮黃體階段支持來(lái)提供黃體階段支持。
[0395]通常按藥典以IU給出LH活性。現(xiàn)在也可以生產(chǎn)出LH的純制劑，并且活性以質(zhì)量給出(例如yg每小瓶)。在本發(fā)明中要理解的是，以IU給出的活性同以其它單位(如摩爾單位)給出的LH活性有關(guān)聯(lián)。
[0396]在卵泡階段期間可以按給出的響應(yīng)等同于由本文所述的尿和重組hCG的劑量提供的生物響應(yīng)的劑量施用尿或重組或長(zhǎng)效LH代替hCG (尿或重組或長(zhǎng)效的)。
[0397]一個(gè)或多個(gè)劑量的LH激動(dòng)劑應(yīng)足以提供至少5nmol/L、如至少10nmol/L、如至少15nmol/L或如至少20nmol/L的血清孕酮濃度,至少直到排卵或取得卵母細(xì)胞后5天、至少直到取得卵母細(xì)胞后10天，優(yōu)選至少直到排卵或取得卵母細(xì)胞后14天，更優(yōu)選至少直到排卵或取得卵母細(xì)胞后21天，更優(yōu)選至少直到排卵或取得卵母細(xì)胞后28天。優(yōu)選地，LH激動(dòng)劑的施用可持續(xù)到超過排卵或取得卵母細(xì)胞后28天，如長(zhǎng)達(dá)5周、如長(zhǎng)達(dá)6周，例如長(zhǎng)達(dá)7周，如長(zhǎng)達(dá)8周，例如長(zhǎng)達(dá)9周，如長(zhǎng)達(dá)10周或更長(zhǎng)時(shí)間。
[0398]在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，輔助生育治療方法進(jìn)一步包括通過施用足以在取得卵母細(xì)胞后第7天提供至少20nmol/L的血清孕酮濃度的一個(gè)或多個(gè)劑量的LH激動(dòng)劑來(lái)提供黃體支持。
[0399]優(yōu)選的是，黃體階段中的所述一個(gè)或多個(gè)劑量足以維持至少在20nmol/L的血清孕酮水平，至少直到取得卵母細(xì)胞后10天、優(yōu)選至少直到取得卵母細(xì)胞后14天、更優(yōu)選至少直到取得卵母細(xì)胞后21天、更優(yōu)選至少直到取得卵母細(xì)胞后28天。
[0400]優(yōu)選的是，所施用的LH激動(dòng)劑足以提供類似于在黃體階段期間由每升4-12IU重組或尿LH的血清濃度、更優(yōu)選4-12IU/L (如8-12IU/L)的血清濃度所提供的響應(yīng)的生物響應(yīng)。
[0401]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在黃體階段中按每天100-600IU LH的日劑量施用重組或尿源 LH，優(yōu)選每天 150-450IU LH，如每天 200-400IU LH，例如 250-350IU/ 天。
[0402]LH激動(dòng)劑可在一個(gè)實(shí)施方案中為顯示出延長(zhǎng)的血清半衰期的長(zhǎng)效LH。該長(zhǎng)效LH可包含連接至諸如藥學(xué)上可接受的分子的化學(xué)部分的LH或LH激動(dòng)劑，當(dāng)與按同LH化合物相同的方式施用的LH激動(dòng)劑的血清半衰期相比時(shí)，或者當(dāng)與內(nèi)源性絨膜促性腺激素(CG)的體內(nèi)血漿半衰期相比時(shí)，所述藥學(xué)上可接受的分子提供大幅度增加的LH激動(dòng)劑或LH化合物的血清半衰期。當(dāng)與常規(guī)的孕酮施用相比時(shí)，據(jù)信在卵泡階段中或作為黃體階段支持給予的修飾的LH改善患者方便性和治療結(jié)果。
[0403]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，LH激動(dòng)劑是包含連接至化學(xué)部分的促黃體激素的長(zhǎng)效LH。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，LH激動(dòng)劑是包含連接至化學(xué)部分的人絨膜促性腺激素的長(zhǎng)效 hCG。
[0404]為了產(chǎn)生可在與輔助生育技術(shù)(ART)程序有關(guān)的黃體階段期間一次或兩次施用的長(zhǎng)期LH化合物，這種長(zhǎng)期LH化合物在對(duì)哺乳動(dòng)物施用時(shí)應(yīng)導(dǎo)致LH激動(dòng)劑或LH化合物具有的血清半衰期為L(zhǎng)H的半衰期的至少1.5倍，如至少2倍、至少3倍、至少4倍，優(yōu)選至少5倍、更優(yōu)選至少6倍，如為L(zhǎng)H的半衰期的1.5倍至25倍。
[0405]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，LH激動(dòng)劑是包含連接至化學(xué)部分的促黃體激素的長(zhǎng)效LH，其中長(zhǎng)效LH具有的血清半衰期為L(zhǎng)H的半衰期的至少6倍。
[0406]當(dāng)長(zhǎng)效LH包含連接至化學(xué)部分的人絨膜促性腺激素時(shí)，長(zhǎng)期LH的血清半衰期可以例如為hCG的半衰期的至少1.2倍，如hCG的半衰期的至少1.3倍、hCG的半衰期的至少1.5倍、hCG的半衰期的至少2倍，或者如hCG的半衰期的至少3倍。
[0407]LH激動(dòng)劑可在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中為包含連接至化學(xué)部分的人絨膜促性腺激素的長(zhǎng)效hCG，其中長(zhǎng)效hCG具有的血清半衰期為hCG的半衰期的至少1.5倍。
[0408]在檢測(cè)到生化懷孕之前對(duì)婦女給予黃體支持，胚胎著床和懷孕可能是不確定的，并且女性可能在給定的周期中不會(huì)懷孕。因此，雌性哺乳動(dòng)物可能必須要經(jīng)歷另外的刺激或排卵周期，并且優(yōu)選的是，在黃體階段期間施用的LH激動(dòng)劑的半衰期不超過10天，優(yōu)選不超過5天，以使得所述水平可降到某一水平以下，在雌性哺乳動(dòng)物必須要在下一周期中得到新的治療的情況下，該某一水平能干擾隨后的排卵或刺激周期。
[0409]長(zhǎng)效LH和hCG的例子見于所附的實(shí)施例。
[0410]人絨膜促性腺激素(hCG)
[0411]人絨膜促性腺激素(hCG)是在懷孕期間產(chǎn)生的糖蛋白激素，其是由在懷孕后的發(fā)育胚胎以及后來(lái)由合體滋養(yǎng)細(xì)胞(胎盤的一部分)生成。其作用是防止卵巢的黃體解體，并從而維持在人懷孕期間至關(guān)重要的孕酮產(chǎn)生。hCG可具有另外的功能:比如，據(jù)認(rèn)為hCG影響懷孕的免疫耐 受性。早孕測(cè)試一般來(lái)說是基于hCG的檢測(cè)或測(cè)量。
[0412]人絨膜促性腺激素與LHCG受體相互作用，并且在懷孕開始期間促進(jìn)黃體的維持，使之分泌激素孕酮。孕酮使子宮富有血管和毛細(xì)血管厚內(nèi)層，使得其可支撐生長(zhǎng)的胎兒。由于其高度的負(fù)電荷性，hCG可排斥母親的免疫細(xì)胞，在第一孕期保護(hù)胎兒。還推測(cè)hCG可能是產(chǎn)生局部母體免疫耐受性的胎盤紐帶(link)。例如，經(jīng)hCG處理的子宮內(nèi)膜細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡(T-細(xì)胞溶解)的增加。這些結(jié)果表明，hCG可能是滋養(yǎng)層周圍免疫耐受性產(chǎn)生的紐帶，并且可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞侵入，已知這能加速子宮內(nèi)膜中的胎兒發(fā)育。還已經(jīng)提出，hCG水平與孕婦晨吐的嚴(yán)重性有關(guān)聯(lián)。
[0413]人絨膜促性腺激素是由244個(gè)氨基酸組成的糖蛋白，分子質(zhì)量為36.7kDa。它是異二聚的，α-亞基與促黃體激素(LH)、卵泡-刺激激素(FSH)、甲狀腺刺激激素(TSH)的完全相同，而β-亞基是hCG(SEQ ID NO: 9)獨(dú)特的。
[0414]α -亞基為92個(gè)氨基酸長(zhǎng)。hCG的β -亞基含有由六個(gè)高度同源的基因編碼的145個(gè)氨基酸，這些基因串聯(lián)布置并且倒轉(zhuǎn)對(duì)在染色體19ql3.3-CGB(l，2，3，5，7，8)上。兩個(gè)亞基產(chǎn)生被球的2.8倍的高的表面積與體積比所包圍的小疏水核心。外層氨基酸中的絕大多數(shù)是親水的。
[0415]本發(fā)明的優(yōu)選hCG的β鏈選自與SEQ ID Ν09具有至少80 %、更優(yōu)選85 %、更優(yōu)選90%、更優(yōu)選95%的序列同一性的序列。優(yōu)選地，變體在SEQ ID Ν09的位置和間距處包含保守的半胱氨酸殘基。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，hCG包含具有SEQ ID N09的人α-亞基。
[0416]hCG與LH的區(qū)別可在于β -亞基中存在由SEQ ID Ν09的氨基酸112-145構(gòu)成的C末端肽，CTP?？砂疵庖邔W(xué)方法并通過測(cè)序進(jìn)行區(qū)分。
[0417]所使用的hCG可來(lái)自任何來(lái)源，前提條件是其不被任何物質(zhì)(特別是其它促性腺激素)污染，這些物質(zhì)將顯著地影響其作用?？梢允褂媚騢CG，雖然優(yōu)選的是使用重組hCG(rhCG)，因?yàn)槠浼兌雀?。類似的條件適用于在本發(fā)明中使用的hCG的來(lái)源。
[0418]通常按藥典以IU給出hCG活性?，F(xiàn)在也可以生產(chǎn)出hCG的純制劑，并且活性以質(zhì)量給出(例如yg每小瓶)。在本發(fā)明中要理解的是，以IU給出的活性同以其它單位(如摩爾單位)給出的hCG活性有關(guān)聯(lián)。
[0419]hCG的類似物包括施加與hCG相同的生理、生化或生物效果和/或結(jié)合至與hCG相同的受體的所有分子。已知促黃體激素(LH)與hCG分擔(dān)一些生理作用。hCG的一些類似物包括單鏈hCG，其中[β]_亞基的C-末端融合至[α]-亞基的N-末端(Sugahara et al.，PNAS，92，1995，2041-2045)。類似物的其它例子在以下文獻(xiàn)中有公開:例如歐洲專利 EP0322226 (Applied Research Systems)、W092/22568 (Universityof Medicine&Dentistry of New Jersey) > W096/05224 (Washington University) >W090/09800 (Washington University) >W093/06844 (Washington University)>W098/43999(Washington University) > W099/25849 (Washington University)。
[0420]有關(guān)生育能力治療，以腸胃外的方式廣泛使用人絨膜促性腺激素作為排卵誘導(dǎo)物代替促黃體激素。在一個(gè)或多個(gè)成熟卵泡的存在下，可通過施用hCG引發(fā)排卵。由于排卵將發(fā)生在注射hCG后24-36小時(shí)，因此可安排好程序以利用這一時(shí)序。因此，經(jīng)歷IVF的患者在一般情況下接受hCG以引發(fā)排卵過程，但要在注射后約36小時(shí)取出她們的卵子，這是在卵子實(shí)際上將從卵巢中釋放出來(lái)之前的幾個(gè)小時(shí)。
[0421]在本發(fā)明的方法中，在刺激或月經(jīng)周期的第1-9天施用至少一個(gè)劑量的hCG，該劑量足以刺激卵泡發(fā)育直到排卵引發(fā)。優(yōu)選的是施用的hCG足以提供類似于在黃體階段期間由每升4-15IU LH的血清濃度、更優(yōu)選4-12或5-12IU/L(如5-8IU/L)的血清濃度所提供的響應(yīng)的生物響應(yīng)。
[0422]如上所述，hCG可以是重組的或尿源的。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，按重組或尿源hCG的日劑量施用hCG?？衫邕M(jìn)行hCG的每日施用，直到引發(fā)卵泡成熟，或者以hCG的常規(guī)藥團(tuán)誘導(dǎo)/引發(fā)排卵。
[0423]對(duì)于卵泡階段期間hCG的每日施用，劑量范圍應(yīng)該在25-4000IU hCG/天，優(yōu)選25-1000IU hCG/天，更優(yōu)選 30-1000 或 30-500IU hCG/天，最優(yōu)選每天 25-400IU，如每天50-300IU，更優(yōu)選每天100-300IU，如每天150-250IU，例如每天175— 225IU。也可以按更低的頻度施用hCG，例如每?jī)商?、三天或四天施用，?yōu)選每?jī)商焓┯?，直到排卵被引發(fā)。在這種方案中，可使用如上面概述的劑量，雖然50-400IU hCG的劑量是優(yōu)選的。
[0424]因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)在黃體階段中施用時(shí)的日劑量是每天25-400IU hCG，優(yōu)選每天 50-200IU hCG，例如 75-200IU/天，如 100-150 或 120-170IU/天。
[0425]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，hCG是顯示出延長(zhǎng)的血清半衰期的長(zhǎng)效hCG。長(zhǎng)效hCG可包含連接至諸如藥學(xué)上可接受的分子的化學(xué)部分的hCG，與按同長(zhǎng)效hCG相同的方式施用的hCG的血清半衰期相比，所述藥學(xué)上可接受的分子提供大幅度增加的hCG化合物的血清半衰期。
[0426]長(zhǎng)效hCG的半衰期可例如為hCG的半衰期的至少1.2倍，如hCG的半衰期的至少1.3倍、hCG的半衰期的至少1.5倍、hCG的半衰期的至少2倍，或者如hCG的半衰期的至少3倍。
[0427]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，hCG是血清半衰期為hCG的半衰期的至少1.5倍的長(zhǎng)效 hCG。
[0428]在一個(gè)實(shí)施方案中，在排卵誘導(dǎo)階段和/或隨后的黃體和/或妊娠階段期間，每2天施用長(zhǎng)效hCG,如每3天施用，例如每4天施用，如每5天施用，例如每6天施用，如每7天施用，例如每8天施用，如每9天施用,例如每10天施用。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在排卵誘導(dǎo)階段和/或隨后的黃體階段和/或隨后的妊娠階段期間也可以每14天施用長(zhǎng)效hCG，如每21天施用，例如每月施用，或者以甚至更小的頻度施用。如上面所提到的那樣，優(yōu)選的是在黃體階段中從hCG施用轉(zhuǎn)換成LH施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，在卵泡階段期間按單次團(tuán)注施用長(zhǎng)效hCG，該劑量足以支持卵泡發(fā)育，并且優(yōu)選也足以提供黃體支持。
[0429]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)至少一個(gè)卵泡具有至少8_的直徑時(shí)按單次團(tuán)注施用長(zhǎng)效hCG,如至少9mm、至少IOmm,例如像至少Ilmm,如至少13mm、至少14mm,或者例如像至少15mm。
[0430]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)至少一個(gè)卵泡具有至少12mm的直徑時(shí)按單次團(tuán)注施用長(zhǎng)效hCG。
[0431]在一個(gè)實(shí)施方案中，在FSH施用期間按單次團(tuán)注施用長(zhǎng)效hCG。
[0432]優(yōu)選的是，卵泡階段中的hCG劑量足以提供類似于在卵泡階段期間由每升1-12IUhCG的血清濃度所提供的響應(yīng)的生物響應(yīng)。
[0433]進(jìn)一步優(yōu)選的是按每天25-300IU hCG的日劑量施用其中是重組或尿源hCG的hCG,優(yōu)選 50-200IU/ 天，如 125-200IU/ 天，例如 150-200IU/ 天。
[0434]優(yōu)選地，從卵泡階段的第5天施用hCG，并且直到排卵引發(fā)。
[0435]可以從卵泡階段的第2天進(jìn)一步施用hCG，使得從卵泡階段的第2天施用hCG直到排卵。
[0436]排卵引發(fā)
[0437]通過卵泡直徑的UV測(cè)量來(lái)確定排卵引發(fā)的確切施用時(shí)間。通常當(dāng)至少一個(gè)卵泡具有至少15mm的平均直徑時(shí)進(jìn)行引發(fā)治療。優(yōu)選當(dāng)至少一個(gè)卵泡具有16_、更優(yōu)選17_的直徑時(shí)進(jìn)行引發(fā)治療。在許多情況下，當(dāng)至少2個(gè)卵泡已經(jīng)達(dá)到指定尺寸時(shí)、更優(yōu)選當(dāng)至少3個(gè)卵泡已經(jīng)達(dá)到指定尺寸時(shí)進(jìn)行引發(fā)治療。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)三個(gè)或更多個(gè)卵泡具有17mm的直徑時(shí)誘導(dǎo)排卵引發(fā)。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，通過施用治療有效劑量的如本文所述的GnRH激動(dòng)劑引發(fā)排卵。在本發(fā)明的另一方面中，通過相對(duì)低劑量的hCG或hCG類似物或變體或長(zhǎng)效hCG引發(fā)排卵。當(dāng)使用重組或尿hCG時(shí)，引發(fā)劑量為2000IU或更少，如1500IU或更少，例如1000IU或更少。可用GnRH激動(dòng)劑的劑量補(bǔ)充hCG或類似物/變體/長(zhǎng)效hCG的低劑量。
[0438]促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑
[0439]促性腺激素-釋放激素激動(dòng)劑(GnRH激動(dòng)劑，GnRH-A)是模仿下丘腦神經(jīng)激素GnRH的合成肽，后者與促性腺激素-釋放激素受體相互作用以引發(fā)生物響應(yīng)、垂體激素FSH和LH的釋放。激動(dòng)劑不會(huì)迅速與GnRH受體解離。其結(jié)果是當(dāng)起初施用GnRH激動(dòng)劑時(shí)，F(xiàn)SH和LH分泌(所謂的“突發(fā)效應(yīng)”)有增加。然而在約十天后，經(jīng)由通過受體內(nèi)化的受體下調(diào)獲得了深度的性腺低能效果(即，F(xiàn)SH和LH減少)。一般來(lái)說這一誘導(dǎo)的且可逆性的性腺低能就是治療的目標(biāo)。
[0440]在本發(fā)明的一個(gè)方面中，施用GnRH激動(dòng)劑以便引發(fā)排卵。[0441]批準(zhǔn)的GnRH激動(dòng)劑的例子包括:亮丙瑞林(Lupron，Eligard);布舍瑞林(Suprefact, Suprecor)；那法瑞林(Synarel);組氨瑞林(Supprelin);戈舍瑞林(Zoladex);地洛瑞林(Suprelorin, Ovuplant);曲普瑞林。
[0442]適當(dāng)劑量和施用方案對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說是顯而易見的，并且可使用任何適當(dāng)?shù)膭┝亢褪┯梅桨浮＜?dòng)劑可皮下施用或通過鼻內(nèi)噴霧施用。
[0443]要舉例的話，布舍瑞林的常用和治療有效的劑量為0.5mg(皮下)或0.2mg(鼻內(nèi))。曲普瑞林可以按0.2mg劑量皮下施用，亮丙瑞林可以按1.0mg劑量皮下施用。
[0444]促性腺激素釋放激素拮抗劑
[0445]促性腺激素-釋放激素(GnRH)拮抗劑(受體阻滯劑)是一類在結(jié)構(gòu)上類似于天然GnRH(由下丘腦中的神經(jīng)元所產(chǎn)生的激素)的化合物，但具有拮抗效應(yīng)。GnRH拮抗劑是由多種通常是合成產(chǎn)生的氨基酸組成的肽分子。GnRH拮抗劑與天然GnRH競(jìng)爭(zhēng)對(duì)GnRH受體的結(jié)合，因此在體內(nèi)減少或阻滯GnRH作用。
[0446]GnRH拮抗劑競(jìng)爭(zhēng)性地并且可逆性地結(jié)合至垂體腺中的GnRH受體，阻滯促黃體激素(LH)和卵泡-刺激激素(FSH)從垂體中的釋放。在婦女中，LH的減少隨后導(dǎo)致雌激素從卵巢中釋放的抑制。
[0447]與引起下丘腦-垂體-性腺軸(HPGA)的初始刺激而導(dǎo)致雌激素水平激增的GnRH激動(dòng)劑不同，GnRH拮抗劑有立竿見影的作用，迅速減少性激素水平而沒有初始的激增。
[0448]目前批準(zhǔn)的適合用于本發(fā)明方法的GnRH拮抗劑包括以下:西曲瑞克；加尼瑞克；阿巴瑞克；地加瑞克。適當(dāng)劑量和施用方案對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說是顯而易見的，并且可使用任何適當(dāng)?shù)膭┝亢褪┯梅桨浮?br> [0449]以上實(shí)施方案以及下文要描述的實(shí)施方案應(yīng)被視為指的是本文描述的任一方面以及本文描述的任一項(xiàng)實(shí)施方案，除非指定一項(xiàng)實(shí)施方案涉及本發(fā)明的某一方面或某些方面。
[0450]本文中引述的所有參考文獻(xiàn)，包括出版物、專利申請(qǐng)和專利以引用的方式并入，其程度如同單獨(dú)和明確地指出將每一參考文獻(xiàn)以引用的方式并入并且全文給出在本文中。
[0451]本文中所用的所有標(biāo)題和小標(biāo)題僅為方便，不應(yīng)被解釋為以任何方式限制本發(fā)明。
[0452]本發(fā)明涵蓋上述要素以其所有可能的變化形式的任意組合，除非本文指出另外的情況，或者另外上下文明顯矛盾。
[0453]除本文中另指出外，本文中數(shù)值范圍的敘述僅旨在作為單獨(dú)提到屬于所述范圍內(nèi)的每個(gè)單獨(dú)值的簡(jiǎn)便方法，并且將每個(gè)單獨(dú)值并入說明書中，如同其在本文中被單獨(dú)引述。除另有說明外，本文中提供的所有精確值代表相應(yīng)的近似值(例如，有關(guān)特定的因素或測(cè)量提供的所有精確的示例性值可以被認(rèn)為也提供了相應(yīng)的近似測(cè)量值，在適當(dāng)?shù)那闆r下被“約”修飾)。
[0454]可按任意合適的順序?qū)嵤┍疚拿枋龅乃蟹椒ǎ潜疚闹赋隽硗獾那闆r，或者另外上下文明顯矛盾。
[0455]除另指出外，使用本文中提供的任何及所有的實(shí)施例或示例性語(yǔ)言(例如，“如”)僅旨在更好地闡述本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。說明書中的語(yǔ)言都不應(yīng)被解釋為表示任何要素對(duì)于本發(fā)明的實(shí)踐是必不可少的，除非有盡可能多的明確說明。[0456]本文中專利文件的引述和并入僅是為了方便起見而進(jìn)行的，并不反映這些專利文件的有效性、可專利性和/或可執(zhí)行性的任何觀點(diǎn)。
[0457]本文中關(guān)于一個(gè)要素或多個(gè)要素使用諸如“包含”、“具有”、“包括”或“含有”的措辭對(duì)任何方面或?qū)嵤┓桨高M(jìn)行的描述旨在對(duì)本發(fā)明的“由該特定的一個(gè)(多個(gè))要素組成”、“基本上由該特定的一個(gè)(多個(gè))要素組成”或“基本上包括該特定的一個(gè)(多個(gè))要素”的類似方面或?qū)嵤┓桨柑峁┲С?，除非另有說明，或者上下文明顯矛盾(例如，本文描述的包含特定要素的組合物應(yīng)被理解為還描述了由該要素組成的組合物，除非另有說明，或者上下文明顯矛盾)。
[0458]本發(fā)明在適用法律允許的最大程度上包括本文中提出的各方面或權(quán)利要求中敘述的主題的所有修改形式和等效形式。
[0459]通過以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，然而這些實(shí)施例不應(yīng)被解釋為限制保護(hù)范圍。在前文描述和以下實(shí)施例中公開的特征可以(單獨(dú)地以及以其任意組合的形式)是用于以其不同形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的內(nèi)容。
[0460]實(shí)施方案一覽
[0461]1.一種長(zhǎng)效生物學(xué)活性促黃體激素(LH)化合物，其包含連接至藥學(xué)上可接受的分子的LH激動(dòng)劑，與按同LH化合物相同的方式施用的LH激動(dòng)劑的體內(nèi)血漿半衰期相比，所述藥學(xué)上可接受的分子提供大幅度增加的LH激動(dòng)劑或LH化合物的體內(nèi)血漿半壽期。
[0462]2.實(shí)施方案I的LH化合物，其中LH激動(dòng)劑選自哺乳動(dòng)物CG或其類似物或者哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物，如重組hLH或hGH。
[0463]3.前述前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的LH化合物，其中LH激動(dòng)劑任選通過雙官能連接子化學(xué)連接至藥學(xué)上可接受的分子。
[0464]4.前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的LH化合物，其中藥學(xué)上可接受的分子提供足以驅(qū)動(dòng)竇狀卵泡從直徑約IOmm直到直徑約15-30mm的排卵前階段的LH激動(dòng)劑或LH化合物的生物體組合物或濃度，在排卵前階段中成熟中的卵母細(xì)胞可完成成熟，以為減數(shù)分裂的恢復(fù)做好準(zhǔn)備。
[0465]5.前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的LH化合物，其中藥學(xué)上可接受的分子提供足以支持促性腺激素分泌不足的性腺低能受試者的LH激動(dòng)劑或LH化合物的生物體組合物或濃度。
[0466]6.前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的LH化合物，其中藥學(xué)上可接受的分子提供足以維持哺乳動(dòng)物受試者圍排卵階段、排卵階段和排卵后階段中的孕酮的LH激動(dòng)劑或LH化合物的生物體組合物或濃度，目的是調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜和子宮以允許哺乳動(dòng)物胚泡的著床。
[0467]7.前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的LH化合物，其中當(dāng)在月經(jīng)周期的卵泡階段期間與促卵泡激素(FSH)治療有關(guān)地給予注射時(shí)，優(yōu)選在開始進(jìn)行FSH治療后5-10天，藥學(xué)上可接受的分子提供LH激動(dòng)劑或LH化合物的血衆(zhòng)濃度以支持黃體(Corpus Luteum/corporalutea, CL)的形成和維持。
[0468]8.前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的LH化合物，其中LH激動(dòng)劑選自人CG或人LH的序列、母牛CG或母牛LH的序列、豬CG或豬LH的序列、馬CG或馬LH的序列、綿羊CG或綿羊LH的序列、狗CG或狗LH的序列、貓CG或貓LH的序列和山羊CG或山羊LH的序列。
[0469] 9.前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的LH化合物，其中類似物與絨膜促性腺激素或促黃體激素的相應(yīng)哺乳動(dòng)物序列具有至少80 %同一性，如85 %同一性、90 %同一性、95 %同一性、98%同一性。
[0470]10.前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的LH化合物，其中LH激動(dòng)劑或LH化合物體內(nèi)血漿半衰期增加至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍，如1.5倍至25倍。
[0471]11.前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的LH化合物，其中LH激動(dòng)劑或LH化合物是糖基化的。
[0472]12.前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的LH化合物，其中藥學(xué)上可接受的分子選自白蛋白或聚合物，如與FcRn結(jié)合增加的修飾的白蛋白、人白蛋白、重組人白蛋白或PEG。
[0473]13.一種藥物組合物，其包含前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的LH化合物。
[0474]14.前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)的LH化合物，用于促進(jìn)哺乳動(dòng)物受試者的生育能力，如輔助生育技術(shù)治療。
[0475]15.一種修飾的促黃體激素，包含連接至藥學(xué)上可接受的分子的哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物，所述藥學(xué)上可接受的分子提供哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物或者修飾的LH的體內(nèi)血漿半衰期，其在哺乳動(dòng)物中為2至48小時(shí)。
[0476]16.實(shí)施方案15的修飾的LH，用于提供范圍在2至30IU/L的修飾的LH、哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其混合物在哺乳動(dòng)物中的體內(nèi)血漿濃度。
[0477]17.前述實(shí)施 方案15-16中任一項(xiàng)的修飾的LH，其中哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物是重組LH，例如rhLH。
[0478]18.前述實(shí)施方案15-17中任一項(xiàng)的修飾的LH，其中修飾的LH包含哺乳動(dòng)物L(fēng)H的類似物，其中類似物與LH的相應(yīng)哺乳動(dòng)物序列具有至少80%同一性。
[0479]19.前述實(shí)施方案15-18中任一項(xiàng)的修飾的LH，其中哺乳動(dòng)物L(fēng)H選自人LH的序列和馬LH的序列。
[0480]20.前述實(shí)施方案15-19中任一項(xiàng)的修飾的LH，其中藥學(xué)上可接受的分子選自有機(jī)小分子、肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)、受體、糖基化、?；鶊F(tuán)、糖、聚合物(例如聚乙二醇，PEG)、核酸(例如DNA和RNA)中的任一種，通常藥學(xué)上可接受的分子是且不限于白蛋白(如人白蛋白)、重組白蛋白、白蛋白的變體、其中η是4至40的CH3 (CH2)nC0-或聚合物，如PEG，例如分子量為至少5kDa的PEG，如IOkDa至150kDa，通常為10至40kDa。
[0481]21.前述實(shí)施方案15-20中任一項(xiàng)的修飾的LH，其中哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物任選通過雙官能連接子化學(xué)連接至藥學(xué)上可接受的分子，或者任選通過肽連接子融合至藥學(xué)上可接受的分子。
[0482]22.前述實(shí)施方案15-21中任一項(xiàng)的修飾的LH，其中哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物或者修飾的LH是糖基化的。
[0483]23.前述實(shí)施方案15-22中任一項(xiàng)的修飾的LH，其中哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物連接至一種或兩種藥學(xué)上可接受的分子，優(yōu)選一種藥學(xué)上可接受的分子。
[0484]24.一種藥物組合物，其包含前述實(shí)施方案15-23中任一項(xiàng)的修飾的LH。
[0485]25.一種藥物組合物，其包含前述實(shí)施方案15-23中任一項(xiàng)的修飾的LH和FSH或具有FSH活性的分子。
[0486]26.前述實(shí)施方案15-23中任一項(xiàng)的修飾的LH，以與FSH或具有FSH活性的分子結(jié)合使用，用于同時(shí)、按順序或分開使用以在哺乳動(dòng)物雌性受試者的無(wú)排卵治療中誘導(dǎo)卵泡發(fā)育，如少量卵泡生成或單一卵泡生成，或者在哺乳動(dòng)物雌性受試者的月經(jīng)周期的卵泡階段中誘導(dǎo)cos。[0487]27.實(shí)施方案26的修飾的LH，其中施用FSH:LH的IU比例范圍在20:1至1:20。
[0488]28.實(shí)施方案25-27中任一項(xiàng)的修飾的LH，其中FSH選自哺乳動(dòng)物的FSH，如人FSH,特別是重組FSH，例如rhFSH。
[0489]實(shí)施例
[0490]實(shí)施例1
[0491]產(chǎn)生長(zhǎng)效hCG的方法
[0492]長(zhǎng)效hCG是通過將hCG化學(xué)綴合至人血清白蛋白或人血清白蛋白的變體產(chǎn)生的，具有選定的對(duì)新生兒Fe受體增加或減少的親和力。
[0493]可使用本領(lǐng)域中已知的多種不同的化學(xué)物質(zhì)和連接子進(jìn)行化學(xué)綴合，包括具有高共價(jià)穩(wěn)定性的連接子和具有較低共價(jià)穩(wěn)定性的連接子，后者具有從白蛋白分子中釋放活性組分的潛力，通常是通過不穩(wěn)定化學(xué)鍵的水解。
[0494]從下面的表中可顯見白蛋白分子上的合適的附接基團(tuán)。
[0495]
【權(quán)利要求】
1.一種長(zhǎng)效生物學(xué)活性促黃體激素(LH)化合物，其包含連接至藥學(xué)上可接受的分子的哺乳動(dòng)物CG或其類似物或者哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物，所述藥學(xué)上可接受的分子選自結(jié)合至哺乳動(dòng)物新生兒Fe受體的分子、轉(zhuǎn)鐵蛋白和其中η是8至22的CH3 (CH2) nCO-以及聚合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的LH化合物，其中所述藥學(xué)上可接受的分子選自結(jié)合至哺乳動(dòng)物新生兒Fe受體的分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的LH化合物，其中所述藥學(xué)上可接受的分子選自白蛋白、哺乳動(dòng)物抗體的Fe片段和哺乳動(dòng)物抗體的Fe片段的變體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的LH化合物，其中所述藥學(xué)上可接受的分子選自白蛋白，如人白蛋白、重組人白蛋白、對(duì)哺乳動(dòng)物FcRn結(jié)合增加的修飾的人白蛋白、對(duì)哺乳動(dòng)物FcRn結(jié)合增加的修飾的重組白蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的LH化合物，其中所述藥學(xué)上可接受的分子選自哺乳動(dòng)物抗體的Fe片段，如哺乳動(dòng)物抗體的重組Fe片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的LH化合物，其中所述藥學(xué)上可接受的分子選自哺乳動(dòng)物抗體的Fe片段的變體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的LH化合物，其中所述白蛋白選自重組人白蛋白(SEQ ID N020)和 K573P 人白蛋白(SEQ ID N021)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6中 任一項(xiàng)所述的LH化合物，其中所述Fe片段選自SEQID N022。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的LH化合物，其中所述Fe片段的變體選自與SEQID N022具有至少80%同一性的序列，不包括SEQ ID N0.22。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的LH化合物，其中所述哺乳動(dòng)物CG或其類似物或者哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物選自重組哺乳動(dòng)物CG或其類似物。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的LH化合物，其中所述哺乳動(dòng)物CG或其類似物或者哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物選自重組哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的LH化合物，其中所述重組哺乳動(dòng)物CG或其類似物選自諸如人CG、猿CG或猴CG的靈長(zhǎng)類動(dòng)物CG的序列；和諸如馬CG的馬科動(dòng)物CG的序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的LH化合物，其中所述重組哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物選自諸如人LH、猿LH或猴L(fēng)H的靈長(zhǎng)類動(dòng)物L(fēng)H的序列；母牛LH的序列；豬LH的序列；諸如馬LH的馬科動(dòng)物L(fēng)H的序列；綿羊LH的序列；狗LH的序列；貓LH的序列；和山羊LH的順序。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的LH化合物，其中所述哺乳動(dòng)物CG或其類似物或者哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物選自分別與絨膜促性腺激素或促黃體激素的相應(yīng)哺乳動(dòng)物序列具有至少80%同一性的類似物，如具有85%同一性、90 %同一性、95 %同一性、98%同一性。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的LH化合物，其中所述藥學(xué)上可接受的分子選自PEG，例如分子量為至少5kDa的PEG，如從IOkDa至150kDa，通常為10至40kDa。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的LH化合物，其中所述哺乳動(dòng)物CG或其類似物或者哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物連接至所述藥學(xué)上可接受的分子，并且其中所述連接子選自化學(xué)連接子，任選雙官能連接子。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的LH化合物，其中所述化學(xué)連接子選自糖部分、二硫橋、親水連接子、可水解的連接子、二羧酸、羧酸酰肼、馬來(lái)酰亞胺基酰肼、PDPH、SPDP, LC-SPDP,GMBS、烷基連接子和PEG連接子。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的LH化合物，其中所述化學(xué)連接子選自丁二酸、戊二酸、己二酸、N-[馬來(lái)酰亞胺基己酸]酰肼(EMCH)、N-[馬來(lái)酰亞胺基丙酸]酰肼(MPH或BMPH)、4-[N-馬來(lái)酰亞胺基甲基]環(huán)己-1-羧酰肼、N-[k-馬來(lái)酰亞胺基十一烷酸]酰肼(KMUH)、4-(4-N-馬來(lái)酰亞胺基苯基)丁酸酰肼(MPBH)、NHS-3-馬來(lái)酰亞胺基丙酸琥珀酰亞胺酯(MPS-EDA)、綴合至巰基反應(yīng)蛋白的(3-[2_吡啶基二硫代]丙酰肼)、N-琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶基二硫代)_丙酸酯(STOP)、琥珀酰亞胺基6-(3-[2-吡啶基二硫代]_丙酰胺基)己酸酯(LC-SPDP)、N-( Y-馬來(lái)酰亞胺基丁酰氧基)琥珀酰亞胺酯(GMBS)、具有2-5個(gè)碳原子的羧酸酰肼、-NH- (CH2)m-C (O)-，其中m是2_20的整數(shù)，任選經(jīng)任何非空間位阻基團(tuán)取代，如C1-C6烷基、C1-C6酰基、鹵素(例如，Cl、Br)、CN、NH2或苯基。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的LH化合物，其中所述哺乳動(dòng)物CG或其類似物或者哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物直接地化學(xué)連接至所述藥學(xué)上可接受的分子。
20.根據(jù)權(quán)利要求16-19中任一項(xiàng)所述的LH化合物，其中所述藥學(xué)上可接受的分子連接至所述哺乳動(dòng)物CG或其類似物或者所述哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物的α鏈。
21.根據(jù)權(quán)利要求16-19中任一項(xiàng)所述的LH化合物，其中所述藥學(xué)上可接受的分子連接至所述哺乳動(dòng)物CG或其類似物或者所述哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物的β鏈。
22.根據(jù)前述權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的LH化合物，其中所述哺乳動(dòng)物CG或其類似物或者哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物融合至所述藥學(xué)上可接受的分子，所述藥學(xué)上可接受的分子選自結(jié)合至哺乳動(dòng)物新生兒Fe受體的分子，如白蛋白、哺乳動(dòng)物抗體的Fe片段或哺乳動(dòng)物抗體的Fe片段的變體，任選通過肽連接子。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的LH化合物，其中所述肽連接子具有至少I個(gè)氨基酸，如1-200個(gè)氨基酸，通常1-50個(gè)氨基酸，其中所述氨基酸選自二十種天然存在的氨基酸。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的LH化合物，其中所述肽連接子選自:由選自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和賴氨酸的氨基酸組成的連接子；由大多數(shù)無(wú)空間位阻的氨基酸，如甘氨酸和丙氨酸，組成的連接子；包含序列_(G)n-、(GGS)n(GGGGS)η的連接子，其中 n 是 1-50 的整數(shù)，如 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的LH化合物，其中所述肽連接子選自GGG、SGGSGGS(SEQID NO: 58)、GGSGGSGGSGGSGGG (SEQ ID NO: 59)、GGSGGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 60)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:57)和 EFAGAAAV(SEQ ID NO:56)。
26.根據(jù)權(quán)利要求22所述的LH化合物，其中所述哺乳動(dòng)物CG或其類似物或者哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物直接融合至所述藥學(xué)上可接受的分子。
27.根據(jù)權(quán)利要求22-26中任一項(xiàng)所述的LH化合物，其中所述藥學(xué)上可接受的分子融合至所述哺乳動(dòng)物CG或其類似物的N-末端或者所述哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物的N-末端。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的LH化合物，其中所述藥學(xué)上可接受的分子融合至所述哺乳動(dòng)物CG或其類似物的α鏈的N-末端或者所述哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物的α鏈的N-末端。
29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的LH化合物，其中所述藥學(xué)上可接受的分子融合至所述哺乳動(dòng)物CG或其類似物的β鏈的N-末端或者所述哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物的β鏈的N-末端。
30.根據(jù)權(quán)利要求22-26中任一項(xiàng)所述的LH化合物，其中所述藥學(xué)上可接受的分子融合至所述哺乳動(dòng)物CG或其類似物的C-末端或者哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物的C-末端。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的LH化合物，其中所述藥學(xué)上可接受的分子融合至所述哺乳動(dòng)物CG或其類似物的α鏈的C-末端或者所述哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物的α鏈的C-末端。
32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的LH化合物，其中所述藥學(xué)上可接受的分子融合至所述哺乳動(dòng)物CG或其類似物的β鏈的C-末端或者所述哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物的β鏈的C-末端。
33.根據(jù)前 述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的LH化合物，其中所述哺乳動(dòng)物CG或其類似物或者所述哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物是糖基化的。
34.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的LH化合物，其中哺乳動(dòng)物CG或其類似物或者哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物選自一種哺乳動(dòng)物CG或其類似物或者一種哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物。
35.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的LH化合物，其中哺乳動(dòng)物CG或其類似物或者哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物選自兩種哺乳動(dòng)物CG或其類似物或者兩種哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物。
36.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的LH化合物，其中所述藥學(xué)上可接受的分子選自一種藥學(xué)上可接受的分子。
37.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的LH化合物，其中所述藥學(xué)上可接受的分子選自兩種藥學(xué)上可接受的分子。
38.根據(jù)權(quán)利要求1所述的LH化合物，選自綴合物I(hCG-PDPH-rHA綴合物)、綴合物3 (hCG-SPDP-rHA綴合物)、綴合物4 (EDC活化的hCG-PDPH-rHA綴合物)、綴合物3V1 (hCG-SPDP-rHA-K573P 綴合物)、綴合物 4V1 (EDC 活化的 hCG-PDPH-rHA_K573P 綴合物)、由SEQ ID N09和SEQ ID N026構(gòu)成的產(chǎn)品2、由SEQ ID NOl和SEQ ID N028構(gòu)成的產(chǎn)品3、由SEQ ID N09和SEQ ID N027構(gòu)成的產(chǎn)品4、由SEQ ID NOl和SEQ ID N029構(gòu)成的產(chǎn)品5、由SEQ ID N04和SEQ ID N026構(gòu)成的產(chǎn)品7、由SEQ ID NOl和SEQ ID N030構(gòu)成的產(chǎn)品8、由SEQ ID N04和SEQ ID N027構(gòu)成的產(chǎn)品9、由SEQ ID NOl和SEQ ID N031構(gòu)成的產(chǎn)品 10、由 SEQ ID N032 和 SEQ ID N033 構(gòu)成的產(chǎn)品 11、由 SEQ ID N032 和 SEQ ID N034構(gòu)成的產(chǎn)品12、由SEQ ID N032和SEQ ID N061構(gòu)成的產(chǎn)品13、由SEQ ID N032和SEQ IDN062構(gòu)成的產(chǎn)品14。
39.一種藥物組合物，包含前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的LH化合物。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的藥物組合物，用于注射，如皮下注射。
41.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的LH化合物，用于促進(jìn)哺乳動(dòng)物受試者的生育能力，如輔助生育技術(shù)治療。
42.根據(jù)前述權(quán)利要求1-40中任一項(xiàng)所述的LH化合物，用于雌性哺乳動(dòng)物中的輔助生育治療方法，其中在卵泡階段期間按一次、兩次、三次或四次劑量施用所述LH化合物，優(yōu)選以單次團(tuán)注施用，所述劑量足以支持卵泡發(fā)育。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的LH化合物，其中所述劑量也足以提供黃體支持。
44.根據(jù)前述權(quán)利要求1-40中任一項(xiàng)所述的LH化合物，用于雌性哺乳動(dòng)物中的輔助生育治療方法，其中在黃體階段期間按一次、兩次、三次或四次劑量施用所述LH化合物，至少直到排卵后2周。
45.根據(jù)前述權(quán)利要求1-40中任一項(xiàng)所述的LH化合物，用于雌性哺乳動(dòng)物中的輔助生育治療方法，其中在妊娠階段期間按一次、兩次、三次或四次劑量施用所述LH化合物，優(yōu)選以單次團(tuán)注施用，至少直到排卵后2周。
46.根據(jù)前述權(quán)利要求1-40中任一項(xiàng)所述的LH化合物，用于在雌性哺乳動(dòng)物中治療反復(fù)性流產(chǎn)的方法，其中在早期妊娠期間按一次、兩次、三次或四次或者更多次劑量施用所述LH化合物，優(yōu)選以單次團(tuán)注施用，直到受孕后12周。
47.根據(jù)前述權(quán)利要求1-40中任一項(xiàng)所述的LH化合物，用于增加孕酮產(chǎn)生和優(yōu)化成功懷孕機(jī)會(huì)的方法，其中在妊娠的前12周期間按一次、兩次、三次或四次或者更多次劑量施用所述LH化合物，優(yōu)選以單次團(tuán)注施用。
48.根據(jù)權(quán)利要求44-47中任一項(xiàng)所述的LH化合物，其中在排卵后首次施用所述LH化合物。
49.根據(jù)前述權(quán)利要求1-40中任一項(xiàng)所述的LH化合物，用于雌性哺乳動(dòng)物中的輔助生育治療方法，其中就排卵誘導(dǎo)按一次或兩次劑量施用所述LH化合物，優(yōu)選以單次團(tuán)注施用。
50.根據(jù)權(quán)利要求42-49中任一項(xiàng)所述的LH化合物，其中將GnRH激動(dòng)劑用于排卵引發(fā)。
51.根據(jù)權(quán)利要求42-49中任一項(xiàng)所述的LH化合物，其中將hCG用于排卵引發(fā)。
52.根據(jù)前述權(quán)利要求1-40中任一項(xiàng)所述的LH化合物，用于促進(jìn)生育能力或治療促性腺激素分泌不足的性腺低能雄性哺乳動(dòng)物受試者的不育癥。
53.根據(jù)前述權(quán)利要求1-40中任一項(xiàng)所述的LH化合物，用于促進(jìn)生育能力或治療患有隱睪癥的年輕或年少雄性哺乳動(dòng)物受試者的不育癥。
54.一種長(zhǎng)效生物學(xué)活性促黃體激素(LH)化合物，其包含連接至藥學(xué)上可接受的分子的哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物，所述藥學(xué)上可接受的分子選自結(jié)合至哺乳動(dòng)物新生兒Fe受體的分子、轉(zhuǎn)鐵蛋白和其中η是8至22的CH3 (CH2) nCO-以及聚合物，其用于與FSH或具有FSH活性的分子結(jié)合使用，用于同時(shí)、按順序或分開使用，以在哺乳動(dòng)物雌性受試者的無(wú)排卵治療中誘導(dǎo)卵泡發(fā)育，如少量卵泡生成或單一卵泡生成，或者在哺乳動(dòng)物雌性受試者的月經(jīng)周期的卵泡階段中誘導(dǎo)COS。
55.根據(jù)權(quán)利要求54所述的LH化合物，其中所述FSH是外源性得到的或在所述哺乳動(dòng)物雌性受試者中內(nèi)源性產(chǎn)生的。
56.根據(jù)權(quán)利要求54所述的LH化合物，其中所述藥學(xué)上可接受的分子選自結(jié)合至哺乳動(dòng)物新生兒Fe受體的分子，如白蛋白，例如人白蛋白、重組人白蛋白、與哺乳動(dòng)物FcRn結(jié)合增強(qiáng)的修飾的人白蛋白、與哺乳動(dòng)物FcRn結(jié)合增強(qiáng)的修飾的重組白蛋白；哺乳動(dòng)物抗體的Fe片段，如哺乳動(dòng)物抗體的重組Fe片段；和哺乳動(dòng)物抗體的Fe片段的變體。
57.根據(jù)權(quán)利要求54-56中任一項(xiàng)所述的LH化合物，其提供所述哺乳動(dòng)物L(fēng)H或其類似物或者所述修飾的LH的體內(nèi)血漿半衰期，其在所述哺乳動(dòng)物雌性受試者中為2至48小時(shí)。
58.根據(jù)權(quán)利要求54-57中任一項(xiàng)所述的LH化合物，其中提供所述LH化合物和所述FSH或所述具有FSH活性的分子用于在藥物組合物中同時(shí)使用。
59.根據(jù)權(quán)利要求54-58中任一項(xiàng)所述的LH化合物，其中所述FSH或所述具有FSH活性的分子選自哺乳動(dòng)物FSH，如人FSH，特別是重組FSH，例如rhFSH。
60.根據(jù)權(quán)利要求54-59中任一項(xiàng)所述的LH化合物，其中按FSH或具有FSH活性的分子與LH的IU比例為20:1至1:20施用所述FSH或所述具有FSH活性的分子。
61.一種在女性人類中進(jìn)行輔助生育治療的方法，所述方法包括 a.在月經(jīng)周期的第1-3周期日通過施用FSH開始刺激， b.從刺激的第4-7天施用GnRH拮抗劑直到排卵引發(fā)， c.通過在刺激的第1-9天期間施用至少一個(gè)劑量的LH激動(dòng)劑來(lái)提供LH激動(dòng)劑，所述劑量足以刺激卵泡發(fā)育，直到排卵引發(fā)， d.當(dāng)至少一個(gè)卵泡具有12-14_的直徑時(shí)停止施用FSH， e.當(dāng)至少一個(gè)卵泡具有至少15mm的直徑時(shí)用至少一個(gè)劑量的GnRH激動(dòng)劑誘導(dǎo)排卵。
62.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中所述LH激動(dòng)劑是血清半衰期為hCG的半衰期的至少1.5倍的長(zhǎng)效1^6。
63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中在排卵誘導(dǎo)階段期間每2天施用所述長(zhǎng)效hCG，如每3天施用，例如每4天施用，如每5天施用，例如每6天施用，如每7天施用,例如每8天施用，如每9天施用,例如每10天施用。
64.根據(jù)權(quán)利要求62-63中任一項(xiàng)所述的方法，其中在隨后的黃體階段期間每2天施用所述長(zhǎng)效hCG,如每3天施用,例如每4天施用，如每5天施用,例如每6天施用，如每7天施用，例如每8天施用，如每9天施用,例如每10天施用。
65.根據(jù)權(quán)利要求62-64中任一項(xiàng)所述的方法，其中在隨后的妊娠階段期間每2天施用所述長(zhǎng)效hCG,如每3天施用,例如每4天施用，如每5天施用,例如每6天施用，如每7天施用，例如每8天施用，如每9天施用,例如每10天施用。
66.根據(jù)權(quán)利要求62-65中任一項(xiàng)所述的方法，其中在排卵誘導(dǎo)階段和/或隨后的黃體階段和/或隨后的妊娠階段期間每14天施用所述長(zhǎng)效hCG，如每21天施用，例如每月施用，或者以甚至更小的頻度施用。
67.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中在卵泡階段期間以單次團(tuán)注施用所述長(zhǎng)效hCG，所述劑量足以支持卵泡發(fā)育，并且優(yōu)選也足以提供黃體支持。
68.根據(jù)權(quán)利要求62-66中任一項(xiàng)所述的方法，其中在卵泡階段期間以單次團(tuán)注施用所述長(zhǎng)效hCG，所述劑量足以支持卵泡發(fā)育，并且優(yōu)選也足以提供妊娠支持。
69.根據(jù)權(quán)利要求62-68中任一項(xiàng)所述的方法，其中當(dāng)至少一個(gè)卵泡具有至少12mm的直徑時(shí)以單次團(tuán)注施用所述長(zhǎng)效hCG。
70.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中在FSH施用期間以單次團(tuán)注施用所述長(zhǎng)效hCG。
71.根據(jù)前述權(quán)利要求61-70中任一項(xiàng)所述的方法，其中在卵泡階段中的LH激動(dòng)劑劑量足以提供與在卵泡階段期間由每升1-12IU hCG的血清濃度提供的響應(yīng)類似的生物響應(yīng)。
72.根據(jù)前述權(quán)利要求61-71中任一項(xiàng)所述的方法，其中在卵泡階段中的hCG是重組或尿源性hCG，以每天25-400IU的劑量施用，如每天50-300IU，更優(yōu)選每天100-300IU，如150-250IU，例如 175— 225IU。
73.根據(jù)權(quán)利要求72所述的方法，其中從卵泡階段的第5天每日施用所述hCG并且直至謂_引發(fā)。
74.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中從卵泡階段的第2天進(jìn)一步施用所述hCG。
75.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中所述LH激動(dòng)劑選自LH和長(zhǎng)效LH，優(yōu)選長(zhǎng)效LH。
76.根據(jù)前述權(quán)利要求61-75中任一項(xiàng)所述的方法，其中在卵泡階段期間以給出每升5-25IU FSH、優(yōu)選每升10-15IU的血清水平的劑量施用所述FSH。
77.根據(jù)前述權(quán)利要求61-76中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述FSH是重組或尿源性FSH,以每天50-600IU FSH的日劑量施用，優(yōu)選每天100-300IU FSHjn 150-225IU/天。
78.根據(jù)前述權(quán)利要求61-77中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述FSH是長(zhǎng)效FSH，如絨促卵泡素，優(yōu)選在月經(jīng)周期的第1-3天以每一雌性哺乳動(dòng)物一次團(tuán)注施用。
79.根據(jù)前述權(quán)利要求61-78中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述GnRH拮抗劑選自:西曲瑞克、加尼瑞克、阿巴瑞克和地加瑞克。
80.根據(jù)前述權(quán)利要求61-79中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述GnRH激動(dòng)劑選自:亮丙瑞林、布舍瑞林、那法瑞林、組氨瑞林、戈舍瑞林、地洛瑞林和曲普瑞林。
81.根據(jù)前述權(quán)利要求61-80中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過施用足以在取得卵母細(xì)胞后第7天提供至少20nmol/L的血清孕酮濃度的一個(gè)或多個(gè)劑量的LH激動(dòng)劑來(lái)提供隨后的黃體支持。
82.根據(jù)權(quán)利要求81所述的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)劑量足以將血清孕酮水平維持至少在20nmol/L，至少直到取得卵母細(xì)胞后10天，優(yōu)選至少直到取得卵母細(xì)胞后14天，更優(yōu)選至少直到取得卵母細(xì)胞后21天，更優(yōu)選至少直到取得卵母細(xì)胞后28天。
83.根據(jù)權(quán)利要求81所述的方法，其中所述LH激動(dòng)劑是重組或尿源LH。
84.根據(jù)權(quán)利要求81至83中任一項(xiàng)所述的方法，其中所施用的LH足以提供類似于在黃體階段期間由每升2-12IU LH的血清濃度、更優(yōu)選4-12IU/L (如6-12IU/L)的血清濃度所提供的響應(yīng)的生物響應(yīng)。
85.根據(jù)權(quán)利要求81至84中任一項(xiàng)所述的方法，其中以每天100-600IULH的日劑量施用所述LH，優(yōu)選每天150-450IU LH，如每天200-400IU LH，例如250-350IU/天。
86.根據(jù)權(quán)利要求81所述的方法，其中所述LH激動(dòng)劑是包含連接至化學(xué)部分的促黃體激素的長(zhǎng)效LH，其中所述長(zhǎng)效LH具有的血清半衰期是LH的半衰期的至少6倍。
87.根據(jù)權(quán)利要求81所述的方法，其中所述LH激動(dòng)劑是重組或尿源hCG。
88.根據(jù)權(quán)利要求81所述的方法，其中所述LH激動(dòng)劑是包含連接至化學(xué)部分的人絨膜促性腺激素的長(zhǎng)效hCG，其中所述長(zhǎng)效hCG具有的血清半衰期是hCG的半衰期的至少1.5倍。
89.根據(jù)權(quán)利要求87或88所述的方法，其中所施用的hCG足以提供類似于在黃體階段期間由每升5-15IU LH的血清濃度、更優(yōu)選4-12IU/L(如每天5-12IU，例如每天5-8IU)的血清濃度所提供的響應(yīng)的生物響應(yīng)。
90.根據(jù)權(quán)利要求87所述的方法，其中以重組或尿源hCG的日劑量施用hCG。
91.根據(jù)權(quán)利要求90所述的方法，其中hCG的日劑量是每天25-400IUhCG，優(yōu)選每天50-200IU hCG,例如 75-200IU/ 天，如 100-150 或 120-170IU/ 天。
92.根據(jù)前述權(quán)利要求61-91中任一項(xiàng)所述的方法，其中當(dāng)至少一個(gè)卵泡具有至少16mm、更優(yōu)選17mm的直徑時(shí)、更優(yōu)選當(dāng)至少2或3個(gè)卵泡具有17mm的直徑時(shí)引發(fā)排卵。
93.根據(jù)前述權(quán)利要求61-92中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述輔助生育技術(shù)導(dǎo)致受控的卵巢刺激或過度刺激。
94.根據(jù)前述權(quán)利要求61-93中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述輔助生育技術(shù)與體外受精、胞質(zhì)內(nèi)精子注射、體外成熟和子宮內(nèi)人工授精聯(lián)合使用。
95.一種對(duì)經(jīng)受輔助生育治療的女性提供黃體支持的方法，所述方法包括在黃體階段期間施用LH激動(dòng)劑，至少直到排卵后2周。
96.根據(jù)權(quán)利要求95所述的方法，其中施用所述LH激動(dòng)劑，直到排卵后至少3周，如排卵后4周，例如排卵后5周，如排卵后6周，如排卵后7周，例如排卵后8周，如排卵后9周，例如排卵后10周。
97.根據(jù)權(quán)利要求95至96中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述LH激動(dòng)劑足以提供至少20nmol/L孕酮的血清水平。
98.根據(jù)權(quán)利要求95至97中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述LH激動(dòng)劑選自LH、LH的序列變體和長(zhǎng)效LH。
99.根據(jù)權(quán)利要求98所述的方法，其中所述LH激動(dòng)劑是重組或尿源LH。
100.根據(jù)權(quán)利要求99所述的方法，其中所施用的LH足以提供類似于在黃體階段期間由每升4-12IU LH的血清濃度、更優(yōu)選4-12IU/L(如8-12IU/L)的血清濃度所提供的響應(yīng)的生物響應(yīng)。
101.根據(jù)權(quán)利要求99所述的方法，其中以每天100-600IULH的日劑量施用所述LH，優(yōu)選每天 150-450IU LH，如每天 200-400IU LH，例如 250-350IU/天。
102.根據(jù)權(quán)利要求98所述的方法，其中所述LH激動(dòng)劑是包含連接至化學(xué)部分的促黃體激素的長(zhǎng)效LH，其中所述長(zhǎng)效LH具有的血清半衰期為L(zhǎng)H的半衰期的至少6倍。
103.根據(jù)權(quán)利要求102所述的方法，其中在黃體階段期間每2天施用所述長(zhǎng)效LHjn每3天施用,例如每4天施用，如每5天施用，例如每6天施用，如每7天施用,例如每8天施用，如每9天施用，例如每10天施用。
104.根據(jù)權(quán)利要求98所述的方法，其中在妊娠階段期間每2天施用所述長(zhǎng)效LH，如每3天施用,例如每4天施用，如每5天施用，例如每6天施用，如每7天施用，例如每8天施用，如每9天施用，例如每10天施用。
105.根據(jù)權(quán)利要求103或104所述的方法，其中在黃體和妊娠階段期間每14天施用所述長(zhǎng)效LH，如每21天施用，例如每月或者以甚至更小的頻度施用。
106.根據(jù)權(quán)利要求95至97中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述LH激動(dòng)劑選自hCG、hCG的序列變體和長(zhǎng)效hCG。
107.根據(jù)權(quán)利要求106所述的方法，其中所述LH激動(dòng)劑是包含連接至化學(xué)部分的人絨膜促性腺激素的長(zhǎng)效hCG，其中所述長(zhǎng)效hCG具有的血清半衰期為hCG的半衰期的至少1.5倍。
108.根據(jù)權(quán)利要求106所述的方法，其中所施用的hCG足以提供類似于在黃體階段期間由每升2-12IU LH的血清濃度、更優(yōu)選4-12IU/L的血清濃度所提供的響應(yīng)的生物響應(yīng)。
109.根據(jù)權(quán)利要求106至108中任一項(xiàng)所述的方法，其中以重組或尿源hCG的日劑量施用hCG。
110.根據(jù)權(quán)利要求109所述的方法，其中hCG的日劑量是每天25-400IUhCG，優(yōu)選每天 50-200IU hCG,例如 75-200IU/ 天，如 100-150 或 120-170IU/ 天。
111.根據(jù)權(quán)利要求106至108中任一項(xiàng)所述的方法，其中hCG是長(zhǎng)效hCG，其血清半衰期為hCG的半衰期的少1.5倍。
112.根據(jù)權(quán)利要求106至111中任一項(xiàng)所述的方法，其中在黃體階段期間每2天施用所述長(zhǎng)效hCG,如每3天施用,例如每4天施用，如每5天施用,例如每6天施用，如每7天施用，例如每8天施用，如每9天施用,例如每10天施用。
113.根據(jù)權(quán)利要求106至111中任一項(xiàng)所述的方法，其中在妊娠階段期間每2天施用所述長(zhǎng)效hCG,如每3天施用,例如每4天施用，如每5天施用,例如每6天施用，如每7天施用，例如每8天施用，如每9天施用,例如每10天施用。
114.根據(jù)權(quán)利要求112至113中任一項(xiàng)所述的方法，其中在黃體和妊娠階段期間每14天施用所述長(zhǎng)效hCG，如每21天施用，例如每月或者以甚至更小的頻度施用。
115.根據(jù)權(quán)利要求106至112中任一項(xiàng)所述的方法，其中在卵泡階段期間以單次團(tuán)注施用所述長(zhǎng)效hCG，所述劑量足以提供黃體支持。
116.根據(jù)權(quán)利要求115所述的方法，其中在卵泡階段中的hCG劑量足以提供類似于在卵泡階段期間由每升1-12IU hCG的血清濃度所提供的響應(yīng)的生物響應(yīng)。
117.根據(jù)權(quán)利要求95至116中任一項(xiàng)所述的方法，其中已經(jīng)通過權(quán)利要求61至94中任一項(xiàng)所述的方法誘導(dǎo)輔助生育技術(shù)。
118.根據(jù)權(quán)利要求95至116中 任一項(xiàng)所述的方法，其中已經(jīng)通過hCG、長(zhǎng)效hCG、GnRh激動(dòng)劑或激動(dòng)劑和hCG的組合的引發(fā)注射而引發(fā)排卵。
119.一種在女性人類中誘導(dǎo)卵泡生成并支持隨后的胚胎著床的方法，包括: a.在月經(jīng)周期的第1-3周期日通過施用FSH開始刺激， b.從刺激的第4-7天施用GnRH拮抗劑直到排卵， c.通過在第1-9天期間施用至少一個(gè)劑量的hCG來(lái)施用LH激動(dòng)劑，所述至少一個(gè)劑量的hCH足以刺激卵泡發(fā)育直到排卵， d.當(dāng)至少一個(gè)卵泡具有12-14mm的平均直徑時(shí)停止施用FSH，以及 e.通過施用在排卵后7-10天足以提供至少20nmol/L的血清孕酮濃度的一個(gè)或多個(gè)劑量的LH激動(dòng)劑來(lái)提供黃體支持。
120.根據(jù)權(quán)利要求119所述的方法，其中所述方法導(dǎo)致單卵泡生成或少量卵泡生成。
121.根據(jù)權(quán)利要求119所述的方法，其中所述方法是受控卵巢刺激的方法，其涉及當(dāng)至少一個(gè)卵泡具有至少15_、更優(yōu)選至少16_的直徑時(shí)(例如當(dāng)至少3個(gè)卵泡具有17_的直徑時(shí))通過施用hCG或GnRH激動(dòng)劑的引發(fā)注射來(lái)進(jìn)行排卵誘導(dǎo)。
122.根據(jù)權(quán)利要求120或121所述的方法，其中通過權(quán)利要求91至110中任一項(xiàng)所述的方法進(jìn)一步提供黃體支持。
123.—種在女性人類中進(jìn)行輔助生育治療的方法，所述方法包括 a.在月經(jīng)周期的第1-3周期日通過施用FSH開始刺激， b.從刺激的第4-7天施用GnRH拮抗劑直到排卵引發(fā)， c.通過在刺激的第1-9天期間施用至少一個(gè)劑量的LH激動(dòng)劑來(lái)對(duì)所述女性提供LH激動(dòng)劑，所述劑量足以刺激卵泡發(fā)育，直到排卵引發(fā)， d.當(dāng)至少一個(gè)卵泡具有12-14_的直徑時(shí)停止施用FSH， e.當(dāng)至少一個(gè)卵泡具有至少15mm的直徑時(shí)用至少一個(gè)2000IU的hCG或更小的劑量誘導(dǎo)排卵。
124.根據(jù)權(quán)利要求123所述的方法，其中排卵誘導(dǎo)另外涉及施用GnRH激動(dòng)劑。
125.根據(jù)權(quán)利要求123或124所述的方法，包括權(quán)利要求72至85任一項(xiàng)中所指出的一項(xiàng)或多項(xiàng)特征。
126.用于權(quán)利要求61至94的任一項(xiàng)方法的FSH、LH激動(dòng)劑、GnRH拮抗劑和GnRH激動(dòng)劑。
127.用于根據(jù)權(quán)利要求95至118中任一項(xiàng)提供黃體支持的LH激動(dòng)劑。
128.用于權(quán)利 要求121的方法的FSH、LH激動(dòng)劑、GnRH拮抗劑和LH激動(dòng)劑。
【文檔編號(hào)】A61K47/48GK103930134SQ201280045264
【公開日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2012年7月9日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月18日
【發(fā)明者】彼得·諾德基爾德, 斯文德·林登伯格, 克勞斯·伊丁·安德森, 金姆·維爾博爾·安德森 申請(qǐng)人:阿茨生物股份有限公司