T細胞活化的抑制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種雙特異性生物制品，包含對CTLA-4特異性的配體和對pMHC復(fù)合物特異性的配體。
【專利說明】T細胞活化的抑制劑
[0001]對相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本申請要求下述美國臨時申請的權(quán)益:2011年6月30日提交的61/503，282號，其全部內(nèi)容通過援引并入本申請。
[0003]發(fā)明背景
[0004]使用新鮮分離的、離體擴增的或體外誘導(dǎo)的Treg的細胞療法在自身免疫性疾病或器官移植的模型中已經(jīng)顯示Treg的過繼性轉(zhuǎn)移能夠恢復(fù)Treg相對效應(yīng)T細胞的平衡，從而控制與這些疾病相關(guān)的自身免疫力(Allan et al., (2008)Immunol.Rev.223:391-421;.Tiang et al., (2006)Expert review of clinicalimmunology2:387-392;Riley et al., (2009)Immunity30:656-665;Tang et al., (2012)Journal of molecular cell biology4:11-21)。然而，使用過繼性轉(zhuǎn)移作為治療策略在臨床轉(zhuǎn)化上面臨若干挑戰(zhàn)。從人類受試者外周血中能夠分離的自身Treg的數(shù)目有限，并且對Treg的高度離體擴增可能改變它們的功能性和/或純度。由于分離的Treg是多克隆的，它們可能對非目標的效應(yīng)T細胞產(chǎn)生泛免疫抑制功能。重要的是，Treg 的可塑性(plasticity)是一個嚴重的挑戰(zhàn)(Bluestone et al., (2009)Nat Rev TmmunoI 9:811-816;Zhou et al., (2009a)Curr Opin Tmmunol21:281-285),因為過繼轉(zhuǎn)移的Treg可能喪失Foxp3表達并重新分化成Thl7細胞(Koenen etal.，(2008) Bloodl 12:2340-2352.)或致病性記憶 T 細胞(Zhou et al.，(2009b) NatImmunollO: 1000-1007)，從而提高了加重自身免疫或炎癥的風險。
[0005]可以以抗原特異性方式原位誘導(dǎo)Treg生成的治療劑相比于過繼Treg細胞療法可能有優(yōu)勢。細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原-4(CTLA-4;CD152)是一種公認的T細胞應(yīng)答負調(diào)節(jié)物，對T細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和自身耐受的維持有重要作用。CTLA-4與共刺激分子CD28同源，并擁有相同的配體:⑶80(B7.1)和⑶86(B7.2)，這些配體在抗原呈遞細胞(APC)的表面上表達。然而，APC上的⑶80/⑶86對效應(yīng)T細胞上⑶28和CTLA-4的不同的結(jié)合導(dǎo)致相反的后果:⑶28觸發(fā)T細胞活化，而CTLA-4導(dǎo)致T細胞抑制。
[0006]由于⑶28在T細胞上組成型表達，而CTLA-4僅在T細胞活化之后才被誘導(dǎo)，并在 2-3 日之后達到峰值(Jago et al., (2004)Clinical&ExperimentalImmunology, 136:463-471)，因此在CTLA-4接合之前可能已經(jīng)發(fā)生了大范圍的T細胞活化。因此，CTLA-4的主要作用是充當防止過度T細胞應(yīng)答的防衛(wèi)，而非抑制T細胞活化。然而，如果CTLA-4過早被其配體接合，然后與T細胞受體(TCR)交聯(lián)，可能提前減弱TCR信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致T細胞抑制和應(yīng)答過低，或無應(yīng)答(anergy)。該觀點已經(jīng)通過多種方法得到了實驗 驗證，包括下述:(i)通過在珠子上共固定(co-1mmobilization)或介由第二種抗體來用激動性抗CTLA-4抗體交聯(lián)T細胞活化性抗體(抗-CD3/抗-CD28)(Blair et al., (1998)J.1mmunol.160:12-15;Krummel and Allison, (1996)J Exp Medl83:2533-2540;Walunas et al.，(1996)J.Exp.Med.183:2541-2550);
(ii)在APC上用分子手段構(gòu)建針對CTLA-4的表面連接的激動性scFv(Fife etal.，(2006) J.Clin.1nvest.116 (8): 2252-61; Griff in et al.，(2001) J.1mmunol.Methods.248(1-2): 77-90; Griff in et al.，(2000) J.1mmunol.164(9):4433-42);和(iii)將特異性識別APC上的抗原的抗體與激動性抗CTLA-4抗體化學交聯(lián)(Li et al.，(2007).J.1mmunol.179(8):5191-203;Rao et al., (2001)Clin.1mmunol.101(2):136-45;Vasu etal.，(2004) J.1mmunol.173(4):2866-76)。
[0007]恢復(fù)Treg對效應(yīng)T細胞的平衡是治療自身免疫性疾病的一種有前景的手段。然而，涉及Treg轉(zhuǎn)移的細胞療法有某些不足之處。因此，急切需要能夠以抗原特異性方式誘導(dǎo)Treg產(chǎn)生的治療手段(例如CTLA-4)用于自身免疫性疾病的治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明涉及配體,所述配體在T細胞活化的早期將配體接合的(ligand-engaged)細胞毒性T淋巴細胞抗體-4 (CTLA-4)與T細胞受體(TCR)交聯(lián)，從而弱化TCR信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致T細胞抑制。為了開發(fā)能抑制T細胞活化的作用劑，制作了一種雙特異性融合蛋白，其包含多個部分，這些部分可選擇性結(jié)合并活化CTLA-4并將其共連接(co-ligate)于TCR。與現(xiàn)有技術(shù)的手段不同，該雙特異性融合蛋白被工程構(gòu)建為使MHC與CTLA-4交聯(lián)，然后二者都被拉向(drawn to) TCR，從在免疫突觸內(nèi)CTLA-4/MHCII/TCR三分子復(fù)合物。
[0009]在同種異體MLR中將配體接合的細胞毒性T淋巴細胞抗原-4(CTLA_4)與一種包含突變的小鼠CD80和淋巴細胞活化抗原-3的雙特異性融合蛋白(BsB)交聯(lián)弱化了 TCR信號傳導(dǎo)和T細胞向FoXp3+調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)的直接分化。如本文中描述的，抗原特異性Treg也可以在抗原特異性環(huán)境下被誘導(dǎo)。用BsB短期處理非肥胖糖尿病(NOD)小鼠少許延遲了自身免疫性I型糖尿病(TlD)的發(fā)病，同時在血液中Treg短暫增加。然而，用BsB更長期地處理NOD動物顯著延遲了疾病發(fā)病，而且還減少了表現(xiàn)糖尿病的動物的發(fā)生率。對于保持無糖尿病的BsB處理小鼠的胰臟進行的組織病理學分析揭示在胰島周圍有與其他⑶3+T細胞及非T細胞白細胞混在的Treg存在。該胰島周圍炎(per1-1nsulitis)伴隨的侵襲性胰島炎極少，而且沒有對·產(chǎn)生胰島素的(6-細胞的破壞。因此，能夠接合CTLA-4和MHCII，并間接地將其與TCR共連接的雙功能蛋白可能在體內(nèi)誘導(dǎo)抗原特異性Treg以保護小鼠免遭TlD或其他自身免疫性疾病。
[0010]具體地，本發(fā)明描述了雙特異性融合蛋白，它們將CTLA-4交聯(lián)到pMHCII復(fù)合物。例如，描述了一種包含突變的小鼠⑶80 (⑶80w88a)和淋巴細胞活化抗原_3 (LAG-3)的雙特異性融合蛋白，其被工程構(gòu)建為同時接合CTLA-4并將其藉由pMHCII交聯(lián)于TCR。因此，在第一個方面，提供一種雙特異性生物制品，其包含對CTLA-4特異性的配體和對pMHC復(fù)合物特異性的配體。
[0011]在一個方面，本發(fā)明提供一種雙特異性生物制品，其包含對CTLA-4特異性的配體和對pMHC復(fù)合物特異性的配體。根據(jù)本發(fā)明的雙特異性生物制品能夠?qū)細胞上存在的CTLA-4與抗原呈遞細胞(APC)上的肽MHC(pMHC)復(fù)合物交聯(lián)。肽MHC復(fù)合物被T細胞上的相關(guān)的T細胞受體(TCR)結(jié)合，意味著依照本發(fā)明的雙特異性生物制品可產(chǎn)生CTLA-4/MHC/TCR三元復(fù)合物。
[0012]在本文中描述的各方面的多個實施方案中，對CTLA-4特異性的配體選自:對CTLA-4特異性的抗體、以及⑶80(B7-1)或⑶86 (B7-2)。在一個具體的實施方案中，對CTLA-4特異性的抗體、以及⑶80 (B7-1)或⑶86 (B7-2)是激動性抗體。對CTLA-4特異性的抗體可以是工程構(gòu)建的，而⑶80和⑶86都是CTLA-4的天然配體。在一個方面中，使用⑶80或其突變體，這是因為⑶80優(yōu)先于⑶28與CTLA-4結(jié)合，因此促進T細胞失活而非活化。
[0013]在本文中描述的各方面的多個實施方案中，對pMHC復(fù)合物特異性的配體可以選自:抗MHC抗體，以及LAG-3。LAG-3多肽是MHCII蛋白的一種天然配體。在一個實施方案中，MHC是MHC II (其與CD4+T細胞相互作用)。在另一個實施方案中，MHC是MHC-1，其與⑶8+T相互作用。
[0014]在依照本發(fā)明的雙特異性生物制品中，對CTLA-4特異性的配體和對pMHC復(fù)合物特異性的配體優(yōu)選被接頭分隔開來。接頭的形式可以是下述中的一種或多種:聚氨基酸序列，以及抗體Fe域。一種合適的聚氨基酸序列是G9 (Gly-9)。
[0015]在本文中描述的各方面的多個實施方案中，對CTLA-4特異性的配體是CD80，或者是它的突變體，該突變體被突變以提高其對CTLA-4相比于CD28的特異性。在一個實施方案中，突變的CD80包含選自下組的一個或多個突變，使用小鼠CD80前體中的序列編號:W88A, K75G.K75V, S112G, R126S, R126D, G127L, S193A,和 S204A,或它們的人CD80 對應(yīng)物(W84A, K71G, K71V, S109G, R123S, R123D, G124L, S190A,和 S201A);以及還有R63A, M81A, N97A, E196A。
[0016]在一個實施方案中，所述雙特異性生物制品包含⑶80，后者包含突變W84A(人)或W88A (小鼠)。
[0017]在一個具體的實施方案中，對MHCII復(fù)合物特異性的配體是LAG-3。有利的是，LAG-3被突變以增加對pMHCII的特異性。例如，LAG-3包含選自下組的一個或多個突變:R73E, R75A, R7 5E 和 R76E (Huard et al., (1997) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.94(11):5744-5749)。在一個實施方案中，LGA-3 包含突變 R75E。
[0018]所述雙特異性融合蛋白對CTLA-4相比于對⑶2的優(yōu)先結(jié)合是利用突變體⑶80(⑶80w88a)作為配體實現(xiàn)的，后者在氨基酸88 (在小鼠⑶80中編號)處含有丙氨酸而不是色氨酸。CD80w88a結(jié)合CTLA-4，但對CD28顯示的親和力最小(Wu et al.，(1997), J.Exp.Med.185:1327-1335)。
[0019]選擇了淋巴細胞活化基因-3 (LAG-3)，MHCII的一種天然配體，來作為所述雙特異性融合蛋白的另一個結(jié)合組分(Baixeras et al.，(1992) J.Exp.Med.176:327-337; Triebel et al.，(1990) J.Exp.Med.171:1393-1405)。我們顯示，具有這樣的雙重功能性的融合蛋白可有效地抑制T細胞活化并刺激抗炎細胞因子IL-10和TGF-P產(chǎn)生。更重要的是，該雙特異性融合蛋白還指導(dǎo)T細胞分化為高度抑制性的Foxp3+Treg。這在改為使用常規(guī)的共刺激抑制劑CTLA_4Ig (Bluestone et al., (2006)Immunity24:233-238;Linsley and Nadler (2009) Immunol.Rev.229:307-321)時沒有發(fā)生。由此可見，CTLA-4的早期接合以及在T細胞活化過程中CTLA-4與TCR的交聯(lián)可積極地影響T細胞分化。因此這樣的雙特異性融合蛋白可能代表了一類能夠用來在自身免疫性疾病中控制過度的T細胞應(yīng)答的新的生物制品。
[0020]在本發(fā)明的第二個方面，提供了依照本發(fā)明第一個方面的包含對CTLA-4特異性的配體以及對pMHC復(fù)合物特異性的配體的雙特異性生物制品用于耐受化(tolerisation)T細胞的用途，所述耐受化是通過使所述T細胞與呈遞有與MHC分子復(fù)合的衍生自所述抗原的肽的抗原呈遞細胞及所述雙特異性生物制品接觸來實施的。
[0021]在第三個方面，提供依照本發(fā)明第一個方面的包含對CTLA-4特異性的配體以及對pMHC復(fù)合物特異性的配體的雙特異性生物制品在治療選自自身免疫性疾病和移植排斥的疾病中的用途。
[0022]例如，所述自身免疫性疾病是I型糖尿病(TlD)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和炎性腸病(IBD)(包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD))、多發(fā)性硬化(MS)、硬皮病、以及其他疾病和病癥，如PV(尋常型天皰瘡)、銀屑病、特應(yīng)性皮炎、乳糜瀉、慢性阻塞性肺病、橋本氏甲狀腺炎、格雷夫斯病(甲狀腺)、舍格倫綜合征、格林-巴利綜合征、古德帕斯徹綜合征、阿狄森氏病、韋格納肉芽腫、原發(fā)性膽汁性硬化(primary biliarysclerosis)、硬化性膽管炎、自身免疫性肝炎、風濕性多肌痛。雷諾氏現(xiàn)象，顳動脈炎、巨細胞動脈炎、自身免疫性溶血性貧血、惡性貧血、結(jié)節(jié)性多動脈炎。貝切特氏病、原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary bilary cirrhosis)、葡萄膜炎、心肌炎、風濕熱、強直性脊柱炎、腎小球性腎炎(glomerulenephritis)、結(jié)節(jié)病、皮肌炎、重癥肌無力、多肌炎、斑秀、和白癜風。
[0023]在第四個方面，提供一種使T細胞對抗原耐受化的方法，包括使所述T細胞與抗原呈遞細胞及依照本發(fā)明第一方面的雙特異性生物制品接觸，所述抗原呈遞細胞呈遞有與MHC分子復(fù)合的衍生自所述抗原的肽。
[0024]在第五個方面，提供一種治療患有選自自身免疫性疾病和移植排斥的病況的受試者的方法，包括向有此需要的受試者施用依照本發(fā)明第一方面的包含對CTLA-4特異性的配體以及對PMHC復(fù)合物特異性的配體的雙特異性生物制品。
[0025]例如，所述自身免疫性疾病是I型糖尿病(TlD)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1.BsB與BsBA的設(shè)計。(A) BsB (雙特異性生物制品)和BsBA融合蛋白的示意圖。(B) pMHCI1、TCR和共刺激分子在免疫突觸中的示意圖，以及CTLA-4在BsB介導(dǎo)下藉由CTLA-4/MHC11/TCR三分子復(fù)合物與TCR交聯(lián)的供討論方案。在免疫突觸中該融合蛋白接合CTLA-4并通過結(jié)合間接地將TCR與MHCII連接。三角形的兩條實線邊表示MHCI I與CTLA-4的交聯(lián)以及MHCI I與TCR的交聯(lián)；虛線邊表示CTLA-4與TCR的連接。點線表示被BsB接合的CTLA-4對TCR信號傳導(dǎo)的抑制。示意圖顯示BsB A的作用與BsB相似，只是它不能連接TCR。
[0027]圖2.BsB在混合淋巴細胞反應(yīng)中對同種異體T細胞活化的抑制。將來自C57BL/6小鼠的幼稚T細胞與經(jīng)LPS處理并經(jīng)輻射的BALB/c APC與測試構(gòu)建物混合2日。然后收獲培養(yǎng)基，測定IL-2。只有BsB和CTLA-4Ig抑制了 T細胞活化，表現(xiàn)為培養(yǎng)基中IL-2的量減少。該圖代表了多于5次獨立但相似的研究。
[0028]圖3』88誘導(dǎo)？(《?3+1'代8以及IL-10和TGF-@產(chǎn)生.(A)如圖2圖例中所述建立同種異體混合淋巴細胞反應(yīng)，使用在測試構(gòu)建體的存在下從Foxp3-EGFP敲入小鼠分離而來的幼稚⑶4+⑶62LhkD25-GFP”細胞?；罨?日，通過流式細胞術(shù)分析⑶4+T細胞的GFP表達。Treg作為GFP+與⑶25+ 細胞設(shè)門。僅有BsB處理導(dǎo)致了 GFP表達，表明Foxp3+Treg的誘導(dǎo)(中左小圖)。收集培養(yǎng)基進行細胞因子分析(右邊小圖)，發(fā)現(xiàn)在BsB存在下IL-10和TGF-P水平上升。該數(shù)據(jù)代表了若干次獨立但類似的研究。(B)在TGF-P封閉抗體的存在下Treg誘導(dǎo)完全被阻斷，而對照抗體未顯著影響Treg誘導(dǎo)，表明Treg誘導(dǎo)需要自分泌的TGF-3。
[0029]圖4.體外BsB介導(dǎo)的抗原特異性Treg的誘導(dǎo)。⑷0va233_339_特異性Treg的體外誘導(dǎo)。在0.5 ii g/ml 0va233_239肽的存在下將幼稚OT-1I T細胞與LPS活化并經(jīng)輻射的同基因APC混合。然后如標示的那樣加入對照mIgG2a、BsB、及BsB加抗TGF- ^抗體(a TGF- ^ )并測試(左邊小圖)。將細胞培養(yǎng)5日，然后用抗⑶25和抗Foxp3抗體標記，再用流式細胞術(shù)分析。通過ELISA測定培養(yǎng)基中的IL-2，IL-10和TGF-P水平(右邊小圖)。(B)對誘導(dǎo)出的Treg的增殖的監(jiān)測。如A —樣進行實驗，只是幼稚OT-1I T細胞在與APC混合之前用CFSE預(yù)先標記。在Foxp3和CFSE熒光頻道上對細胞設(shè)門。 [0030]圖5.BsB誘導(dǎo)的Treg的抑制性功能。(A)將BsB誘導(dǎo)或TGF-@誘導(dǎo)的Treg用流式細胞術(shù)純化，并與自C57BL/6小鼠制備的CFSE標記的幼稚應(yīng)答T細胞按標示的比例在transwell (實心柱形)或普通培養(yǎng)孔(陰影線柱形)中混合。加入LPS處理過的同種異體BALB/c APC以刺激T細胞活化。結(jié)果(均值+標準偏差)顯示了增殖的應(yīng)答T細胞(Tresp)的百分比，以沒有Treg的CFSE稀釋物(Tresp+僅APC)作為100%。(B)向普通培養(yǎng)孔中的Tresp = Treg比例為1:1的細胞加入抗IL-10和抗TGF-P以確定這些細胞因子對T細胞增殖的貢獻?？筎GF-P抗體部分抑制了 TGF-P誘導(dǎo)的Treg的抑制性功能，但未影響B(tài)sB誘導(dǎo)的Treg(右邊小圖)。該圖代表了多于三次獨立但相似的研究。
[0031]圖6.BsB對AKT和mTOR磷酸化的下調(diào)。在用抗-⑶3，抗-⑶28以及BsB，小鼠IgG(mlgG)或小鼠H)-L1 (mPD-Ll)共包被的圓底96孔平板中培養(yǎng)幼稚T細胞18h。將認為未活化的細胞在僅用IgG包被的孔中培養(yǎng)。然后用針對磷酸化AKT和mTOR的熒光標記抗體染色，再通過流式細胞術(shù)監(jiān)測AKT和mTOR的磷酸化狀態(tài)。MFI表示平均熒光強度。該圖代表了三次獨立實驗中的一次。
[0032]圖7.Foxp3在Treg中響應(yīng)于BsB連續(xù)刺激的持續(xù)表達。用抗-⑶3、抗-⑶28和BsB或小鼠IgG共包被圓底96孔平板。將來自Foxp3-EGFP敲入小鼠的幼稚T細胞培養(yǎng)5日以誘導(dǎo)Treg (左邊小圖)，然后將它們從BsB處理的細胞中純化出來(紅色方塊)，并在另一輪如上所述的共包被孔中的培養(yǎng)中再刺激5日，然后通過流式細胞術(shù)分析GFP+細胞。將純化Treg與小鼠IgG對照再培養(yǎng)5日導(dǎo)致~60%的細胞中Foxp3+表達喪失(右上小圖的右上象限)。而與BsB再次培養(yǎng)的Treg中有~7%喪失了 Foxp3+表達(右下小圖的右上象限)。該圖代表3個獨立實驗之一。
[0033]圖8.BsB的體內(nèi)藥動學和生化分析。(A)BsB在小鼠中的藥動學規(guī)律。正常C57BL/6小鼠(n=5)腹膜內(nèi)給藥20mg/kg的BsB。在標示的不同時間點收集血液樣品并利用ELISA測定BsB水平。(B) BsB和小鼠IgG2a對FcRn的結(jié)合的比較。FcRn固定化于Biacore芯片。將不同濃度的BsB或?qū)φ招∈驣gG2a加載到該芯片上，然后記錄信號。
[0034]圖9.對BsB上天冬酰胺連接的糖基化的分析。將BsB的氨基酸序列提交到NetNGlycl.0服務(wù)器以預(yù)測Asn連接的糖基化位點。預(yù)測出總共10個Asn連接的糖基化位點(標記為N);其他的氨基酸以點表示。還進行了 BsB的單糖組成分析(monosaccharidecomposition)以確定聚糖的組成巖藻糖(Fuc)、N_乙酰葡糖胺(GlcNAc),半乳糖(Gal),甘露糖(Man)，唾液酸(N-乙酰神經(jīng)氨酸)。唾液酸:半乳糖比例0.68表明有大約三分之一的半乳糖殘基可用來結(jié)合無唾液酸糖蛋白受體。[0035]圖10.按照晚期預(yù)防處理范式(late prevention treatment paradigm)用 BsB處理非糖尿病(NOD)小鼠延遲了 I型糖尿病(TlD)的發(fā)病。(A)BsB處理的NOD小鼠(實心圓，n=15)和鹽水處理的對照NOD小鼠(實心三角形，n=14)的血液中Foxp3+Treg的水平。與對照動物中所見相比，BsB處理的動物中Treg的數(shù)目發(fā)生了有限(moderate)但顯著的增加。(B)用BsB (實心圓)或鹽水(實心三角形)處理的NOD動物中顯性糖尿病的累計發(fā)生率。
[0036]圖11.按照早期預(yù)防處理范式(early prevention treatment paradigm)用 BsB處理NOD小鼠延遲了 TlD發(fā)病。(A)用BsB(實心圓，n=10)、鹽水(實心三角形，n=10)、CTLA-4Ig(實心方塊，n=10)和小鼠IgG2a (空心方塊，n=10)處理的小鼠的血液中Foxp3+Treg的水平。與鹽水或mlgG2a處理的對照相比，用BsB處理2周之后未檢測到Foxp3+Treg數(shù)目的增加。然而,用CTLA_4Ig處理導(dǎo)致血液中Foxp3+Treg的數(shù)目統(tǒng)計學顯著地減少。(B)在用BsB或?qū)φ仗幚淼膭游镏酗@性糖尿病的累積發(fā)生率。在24周齡之前，與鹽水或小鼠IgG2a處理的對照組相比，BsB處理導(dǎo)致TlD發(fā)病顯著延遲(p=0.04)。然而，在研究結(jié)束時，各組之間未見顯著差異。數(shù)據(jù)代表了結(jié)果相似的兩次不同研究，每組中共有26只NOD小鼠。
[0037]圖12.用BsB更長期地處理NOD小鼠顯著延遲了 NOD小鼠中TlD的發(fā)病。(A)在BsB處理(n=16)和未處理(n=16)的小鼠中顯性糖尿病的累積發(fā)生率。與鹽水處理的小鼠相比，BsB處理顯著降低了 TlD的發(fā)生率(p〈0.01)。(B)對來自BsB或鹽水處理的動物的胰臟組織的組織病理學分析。小圖a-c呈現(xiàn)對來自鹽水處理的、保持無糖尿病的小鼠的切片用H&E、抗胰島素抗體、或抗-CD3和叉頭框蛋白P3(FoxP3)分別處理的結(jié)果。對BsB處理的、保持無病的NOD小鼠觀察到了類似的結(jié)果。在所有這些切片中均未發(fā)現(xiàn)浸潤或胰島炎的證據(jù)；可能存在少數(shù)Foxp3+Treg(小圖c中的箭頭)。小圖d_f呈現(xiàn)了來自糖尿病NOD動物的胰臟切片。明顯可見侵襲性胰島炎，且產(chǎn)胰島素的(6-細胞全部被破壞(e)。還觀察到某些CD3+T細胞浸潤，以及極少Treg和許多有藍色細胞核的非T細胞白細胞(f)。小圖g_i顯示了 BsB處理后保持無糖尿病的動物的胰島,其顯示典型的胰島周圍炎(per1-1nsulitis)。觀察到了白細胞浸潤，但局限于胰島周圍。此外，產(chǎn)胰島素的(6-細胞沒有明顯的破壞。周圍的白細胞大多是非T細胞(藍色細胞核)。放大的胰島(小圖j，在i中呈現(xiàn)紅色方塊)表明在胰島周圍FoXp3+Treg (黃色箭頭)與其他CD3+T細胞和非T細胞白細胞(藍色細胞核)混雜在一起。用40x物鏡獲取圖像；用60x物鏡捕獲胰島圖像，然后再數(shù)字放大3x。
[0038]發(fā)明詳細說明
[0039]除非另有說明，本文中使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語的意思與本發(fā)明相關(guān)【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員所通常理解的意思相同。與本申請中描述的方法和材料具有類似或等同的功能的任何方法和材料都可以用于實施或測試本發(fā)明。下面描述適合此類應(yīng)用的方法、裝置和材料。本文通過援引并入本文中引用的所有出版物的全部內(nèi)容，用于描述和公開這些出版物中報道的可能用于本發(fā)明的方法學、試劑或工具之目的。
[0040]除非另有說明，本申請的方法和技術(shù)一般是根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)方法，并按照本申請通篇各處中引用并討論的各種一般性或者更專門的參考文獻中描述的那樣實施的。這樣的技術(shù)在文獻中有充分的解釋。參見例如Gennaro，A.R.,ed.(1990)Remington’ s Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack PublishingC0.;Hardman, J.G., Limbird, L.E., and Gilman, A.G., eds.(2001) The PharmacologicalBasis of Therapeutics, IOth ed., McGraw-Hill C0.;Colowick, S.et al., eds., MethodsIn Enzymology, Academic Press, Inc.;ffeir, D.M., and Blackwell, C.C., eds.(1986)Handbook of Experimental Immunology,Vols.1-1V,Blackwell ScientificPublications;Maniatis,T.et al.,eds.(1989)Molecular Cloning:A LaboratoryManual, 2nd edition, Vols.1_III，Cold Spring Harbor Laboratory Press;Ausubel, F.M.et al.,eds.(1999)Short Protocols in Molecular Biology,4th edition, Johnffiley&Sons;Ream et al., eds.(1998)Molecular Biology Techniques:An IntensiveLaboratory Course, Academic Press;Newton, C.R., and Graham, A., eds.(1997)PCR(Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed.，Springer-Verlag。
[0041]術(shù)語“抗體”，除非另有說明，用來指完整抗體，也指這樣的抗體的抗原結(jié)合部分。例如，該術(shù)語涵蓋四鏈IgG分子，以及抗體片段。
[0042]如本文中所使用的，術(shù)語“抗體片段”指完整全長抗體的部分，例如完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2，和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體(例如scFv);多特異性抗體片段諸如雙特異性、三特異性和多特異性抗體(例如雙抗體、三抗體、四抗體)；結(jié)合域免疫球蛋白融合蛋白；駱駝化抗體；迷你抗體；螯合性重組抗體；三抗體或雙抗體；胞內(nèi)抗體(intrabodies);納米抗體(nanobodies);小型模塊性免疫藥(smull modular immunopharmaceuticals, SMIP),含Vhh的抗體；和任何其他從抗體片段形成的多肽，例如如下文中詳述的。 [0043]抗體可以屬于任何類別，如IgG，IgA或IgM ;和任何亞類，諸如IgGl或IgG4。不同的免疫球蛋白類型和亞類有不同的性質(zhì)，這些可能在不同的應(yīng)用中是有利的。
[0044]在本發(fā)明的語境中，特異性需要要求保護的抗體能夠選擇性地結(jié)合其確定的關(guān)聯(lián)抗原，即CTLA-4或pMHC復(fù)合物。
[0045]天然存在的免疫球蛋白具有共同的核心結(jié)構(gòu)，其中兩條相同的輕鏈(大約24kD)和兩條相同的重鏈(大約55或70kD)形成四聚體。每條鏈的氨基末端部分稱作可變(V)區(qū)，可以與每條鏈上其余部分的更保守的恒定(C)區(qū)區(qū)分開來。在輕鏈可變區(qū)(又稱'域)的內(nèi)部有一 C末端部分，稱為J區(qū)。在重鏈可變區(qū)(又稱乂11域)內(nèi)部除了 J區(qū)之外還有一D區(qū)。免疫球蛋白的大部分氨基酸序列變異都局限在V區(qū)中的三個不同的位置，稱為高變區(qū)或互補決定區(qū)(CDR)，它們直接參與抗原結(jié)合。從氨基末端開始，這些區(qū)域分別命名為⑶R1、⑶R2和⑶R3。⑶R被更保守的框架區(qū)(FR)保持定位，從氨基末端開始，這些區(qū)域分別命名為 FRU FR2、FR3 和 FR4。Kabat 等人(Kabat, E.A.，et al.，(1991) Sequences ofProteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S.Department of Health andHuman Services, U.S.Government Printing Office 已經(jīng)定義了 CDR和FR區(qū)域的位置以及一套編號系統(tǒng)，可以在網(wǎng)上找到它們的更新。
[0046]本申請中提及的人源化單克隆抗體是由其中移植了來自非人抗體的CDR的人抗體框架構(gòu)成。設(shè)計和生產(chǎn)人源化抗體的程序是本領(lǐng)域公知的，例如在下述文獻中有記載:Cabilly et al.,美國專利 N0.4，816，567;Cabilly et al.,歐洲專利申請 0125023;Bosset al.,美國專利 N0.4，816，397;Boss et al.,歐洲專利申請 0120694;Neuberger, M.S.et al., W086/01533; Neuberger, M.S.etal.,歐洲專利申請 0194276B1; Winter,美國專利 N0.5，225，539;Winter,歐洲專利申請 0239400;Padlan, E.A.et al.,歐洲專利申請0519596。關(guān)于抗體、人源化抗體、人工程化抗體和它們的制備方法可見Kontermann, R.and Diibel, S.eds.(2001, 2010) Antibody Engineering, 2nd ed., Springer-Verlag, NewYork, NY, 2001。
[0047]恒定區(qū)可衍生自任何人抗體恒定區(qū)。典型地，將可變區(qū)基因克隆到表達載體中使之與恒定區(qū)合框，以表達免疫球蛋白重鏈和輕鏈。可以將這樣的表達載體克隆到產(chǎn)生抗體的宿主細胞中以合成抗體。
[0048]所需的抗體可變和恒定區(qū)可或其序列數(shù)據(jù)庫。例如，免疫球蛋白序列可從IMGT/LIGM 數(shù)據(jù)庫(Giudicelli et al., (2006)Nucleic Acids Res.34: (suppl.1):D781_D784)或 VBase (vbase.mrccpe.cam.ac.uk)獲得。
[0049]本文中提到的“核酸”通常包括編碼本發(fā)明的抗體的DNA分子。優(yōu)選的是表達載體，其適于在宿主細胞中表達抗體基因。用于抗體基因表達的表達載體和宿主細胞是本領(lǐng)域已知的，參見例如 Morrow, K.J.(2008) Genetic Engineer ing&Biotechno logyNews.(June15，2008) 28 (12)，and Backliwal, G., et al.(2008)Nucleic AcidsRes.36(15):e96_e96。
[0050]“⑶80”，如本申請中所用的，是指哺乳動物⑶80抗原，及其具有增加的對CTLA-4的結(jié)合親合力或特異性的突變體。參見Linsley et al., (1994) Immunityl: 793-801,和Wuet al., (1997) J.Exp.Med.185(7): 1327-1335，茲通過提述并入本申請。哺乳動物CD80可以選自嚙齒動物，如小鼠，或人CD80。
[0051]“⑶86”，如本申請中所用的，是指哺乳動物⑶86抗原，及其具有增加的對CTLA-4的結(jié)合親合力或特異性的突變體。參見Linsley et al., (1994) Immunityl: 793-801,茲通過提述并入本申請。哺乳動物CD86可以選自嚙齒動物，如小鼠，或人CD86。
[0052]CTLA-4”，如本文中使用的，是指哺乳動物細胞毒T細胞相關(guān)抗原_4 (CTLA-4)。人CTLA-4的序列可見于GenBank,登錄號AAH74893.1, G1: 49904741。哺乳動物CTLA-4可以選自嚙齒動物，如小鼠，或人CTLA-4。
[0053]“LAG-3”，如本文中使用的，是指哺乳動物淋巴細胞活化抗原3 (LAG-3)。人LAG-3的序列可見于 Huard et al., (1997) Proc.Natl.Acad.Sci, USA94:5744-5749,茲通過提述并入本申請。哺乳動物LAG-3可以選自嚙齒動物，如小鼠，或人LAG-3。
[0054]“MHC”是參與抗原呈遞細胞對抗原衍生肽的呈遞的復(fù)合物，其被TCR所識別。在特定的方面，所述MHC是MHC II，其將抗原呈遞給⑶4+輔助T細胞。參見例如，Wucherpfenniget al., CSH Perspect.Biol.2 (4):a005140, epub2010Marl7。
[0055]雙特異性生物制品，又可稱為雙特異性配體，是能夠在同時期(contemporaneously)結(jié)合兩個祀物,或被兩個祀物所結(jié)合的配體。雙特異性抗體是本領(lǐng)域已知的，并在下文中有進一步描述。在本發(fā)明的語境中，兩個靶物是T細胞上的CTLA-4分子和APC上的MHC肽復(fù)合物。依照本發(fā)明的雙特異性生物制品可借助在免疫突觸中pMHC結(jié)合TCR來交聯(lián)該兩個靶物，因此它將CTLA-4分子與TCR交聯(lián)。“生物制品”，一般而言，是生物治療劑或作用劑，其可以用于治療、診斷和/或研究目的，等等。
[0056]接頭是任何連接并分隔蛋白質(zhì)中的兩個多肽域的氨基酸序列。在本發(fā)明的雙特異性配體的語境中，接頭是將CTLA-4配體與MHC配體連接的序列。示例的接頭有某種氨基酸的序列，例如多聚甘氨酸，如Gly-9。一種備選的接頭是抗體Fe區(qū)。這樣的接頭將兩個配體域分開大約120 A。
[0057]依照本發(fā)明的配體可包含任何組合的抗體與非抗體配體。例如，CTLA-4配體可以是抗CTLA-4抗體，而MHC配體可以是LAG-3。或者，可以用⑶80作為CTLA-4配體，與LAG-3或抗MHC抗體組合。兩個配體可以都是抗體，或者可以都是自然配體，CD80和LAG-3。
[0058]細胞毒性淋巴細胞相關(guān)抗原-4 (CTLA-4)
[0059]細胞毒性淋巴細胞相關(guān)抗原-4(CTLA_4)，又稱⑶152，是一種T細胞應(yīng)答負調(diào)控子，在T細胞穩(wěn)態(tài)的維持和自身耐受的誘導(dǎo)中起著重要作用(Karandikar et al.，(1996)J Exp Medl84:783-788;Krummel and Allison, (1995)J Exp Medl82:459-465;Linsleyand Golstein, (1996)Curr Biol6:398-400;Walunas and Bluestone, (1998)J Immunol160:3855-3860;Walunas et al., (1994)J Immunol 160:3855-3860) ? Micedeficient in CTLA_4develop mult1-organ autoimmune disease and typically succumbto the ailment by4weeks of age(Tivol et al., (1995)Immunity3:541-547;Waterhouseet al.，(1995) Science270:985-988)。CTLA-4調(diào)控T細胞活性的分子機制是多方面的，人們認為這些機制內(nèi)在地在常規(guī)T細胞上發(fā)生或者通過調(diào)節(jié)性T細胞(Treg) (Iseet al., (2010)Nat Immunolll: 129-135; Jain et al., (2010)Proc Natl Acad Sci U SA107:1524-1528;Paterson and Sharpe, (2010)Nat Immunolll:109-111)。
[0060]這些機制包括與CD28競爭配體結(jié)合(Linsley et al.，(1994)Immunityl: 793-801)，包括在APC中誘導(dǎo)致耐受酶吲哚胺2，3-雙加氧酶的產(chǎn)生(Grohmann et al., (2002)Nat Immunol3:1097-1101;Onodera et al., (2009)JImmunoll83:5608-56`14),和從免疫突觸中置換 CD28 (Pentcheva-Hoang et al., (2004)Immunity21:401-413)。CTLA-4與共刺激分子CD28同源，并享有相同的配體，CD80 (B7.1)和⑶86(B7.2)，它們在抗原呈遞細胞(APC)的表面上表達。然而，APC上的⑶80/⑶86對效應(yīng)T細胞上的⑶28和CTLA-4的結(jié)合的差異導(dǎo)致相反的結(jié)果，⑶28觸發(fā)T細胞活化，CTLA-4導(dǎo)致T細胞抑制。APC上的CTLA-4配體(CD80/86)接合CTLA-4也刺激磷酸酶SHP-1(Guntermann and Alexander, (2002)J Immunol168:4420-4429)和 PP2A(Barojaet al., (2002) JImmunol168:5070-5078;Chuang et al., (2000)Immunityl3:313-322)募集到經(jīng)歷活化的T細胞的TCR附近。接下來對TCR相關(guān)的關(guān)鍵信號分子的去磷酸化導(dǎo)致 T 細胞活化終止(Griffin et al., (2000) J Immunol 164:4433-4442)。此外，促進CTLA-4早期與其配體接合并交聯(lián)于TCR的干預(yù)導(dǎo)致關(guān)鍵的信號簽名(signalingsignatures)的提前衰減，由此T細胞活化被抑制，導(dǎo)致T細胞低應(yīng)答或無應(yīng)答(Blair etal., (1998)Tmmunol160:12-15;Griffin et al., (2000)JImmunol164:4433-4442;Krummeland Allison, (1996) J Exp Medl82:459-465;Walunas et al., (1996)J ExpMedl83:2541-2550)。
[0061]為了促進CTLA-4在T細胞活化的早期與TCR交聯(lián)，生成了一種雙特異性融合蛋白(命名為“BsB”)，其包含突變體⑶80(⑶80w88a)和淋巴細胞活化基因_3 (LAG-3)。BsB被設(shè)計為在免疫突觸中同時接合CTLA-4和MHCII，由此通過MHCII與TCR的關(guān)聯(lián)性配對來間接地將其與 TCR 交聯(lián)(Karman et al., (2012) J Biol Chem 印ub2012Febl5)。在一個同種異體MLR中，顯示BsB可有效抑制T細胞活化。令人驚奇的是，BsB還誘導(dǎo)了 IL-1O和TGF-P產(chǎn)生，并促進了正經(jīng)歷活化的T細胞分化成Treg。IL-1O通過其控制巨噬細胞和樹突細胞，以及自調(diào)控Thl細胞的能力能夠廣泛地發(fā)揮免疫抑制性質(zhì)(Ohataet al., (2007)Arthritis Rheum56:2947-2956)。TGF-^ 可充當 T 細胞分化(Kehrlet al., (1986) J Exp Medl63:1037-1050)，巨噬細胞活化(Tsunawaki et al., (1988)Nature334:260-262;Wahl et al., (1990)Ann N Y Acad Sci593:188-196)、和樹突細胞成熟(Steinman et al., (2003)Annu Rev Tmmunol 21:685-711)的抑制物。除了它們的抗炎功能，據(jù)稱IL-10和TGF-P還能夠影響Treg功能。例如，已經(jīng)顯示IL-10能夠誘導(dǎo)產(chǎn) IL-10 的 Trl 細胞(Roncarolo et al., (2006) Immunol Rev212:28-50)，并能夠作用于Foxp3+Treg以維持Foxp3的表達，從而擴大它們的抑制功能(Murai et al., (2009)Nat ImmunollO: 1178-1184)。類似地，已經(jīng)有報道稱 TGF-0 對 Treg 的誘導(dǎo)(Chen etal., (2003)J Exp Medl98:1875-1886;Zhenget al., (2002)J Immunoll69:4183_4189)，以及維持通過促進Fox3表達以維持它們的抑制功能(Marie et al.，(2005) J ExpMed201:1061-1067)是必要的。
[0062]調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)
[0063]Treg是功能上獨特的T細胞亞群，能夠控制針對非自身抗原的免疫應(yīng)答。Treg的缺乏導(dǎo)致免疫應(yīng)答升高和自身免疫性疾病的呈現(xiàn)(Sakaguchi et al., (1995) JImmunol 155:1151-1164)。大量的研究已經(jīng)證明了這些特化的T細胞在控制免疫應(yīng)答的所有方面中，尤其是在引起自身耐受中的作用。不拘于某一特定理論，這些發(fā)現(xiàn)表明能夠增強Treg的原位產(chǎn)生、或者Treg的過繼轉(zhuǎn)移的作用劑可以用來治療自身免疫性疾病。實際上，已經(jīng)證明利用新鮮分離的或離體擴增的Treg進行的基于Treg細胞的療法可有效地治療I型糖尿病(TlD) (Tang et al., (2004) J Exp Medl99:1455-1465; Tarbell et al., (2007)J Exp Med204:191-201)和抑制物抗宿主病(Anderson et al., (2004) ;Taylor etal., (2002)Blood99:3493-3499;Zhao et al.，(2008)Bloodll2:2129_2138)的動物模型。作為從外周血或淋巴結(jié)分離和擴增FoXp3+CD4+CD25+Treg (常稱為天然Treg或nTreg)的替代，可以在TCR活化的背景下，在TGF- P的同時存在下從幼稚的⑶4+⑶25_T細胞誘導(dǎo)Treg。這些Treg常被稱為過繼性Treg (aTreg)或誘導(dǎo)Treg (iTreg)。它們也是Foxp3+,并且據(jù)稱可展不與nTreg 同樣強的抑制功能(Chen et al., (2003) J Exp Medl98:1875-1886; Yamagiwaet al., (2001)JImmunol166:7282-7289;Zheng et al., (2002)J Immunol169:4183-4189)。已經(jīng)顯示在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的動物模型中aTreg或iTreg的過繼性轉(zhuǎn)移可有效地賦予對抗自身免疫性疾病的保護作用(Gonzalez-Rey et al., (2006) ArthritisRheum54:864-876)。然而,越來越明顯的是,抗原特異性Treg提供的治療商(therapeuticquotient)顯著高于具有泛-TCR 庫的多克隆 Treg (Masteller et al., (2005) JImmunol175:3053-3059;Tang et al., (2004) J Exp Medl99:1455-1465;Tarbell etal., (2007) J Exp Med204:191-201)，而且對泛免疫抑制的潛在副作用更少。由于該原因，我們試圖評價BsB在體外抗原特異性T細胞活化環(huán)境中在產(chǎn)生抗原特異性Treg方面的相對優(yōu)劣性。此外，我們在非肥胖糖尿病(NOD)小鼠中測試了它治療自身免疫性糖尿病的潛力。
[0064]I型糖尿病
[0065]I型糖尿病(TlD)是一種由于產(chǎn)胰島素的胰腺P細胞的組織特異性破壞所致，因而發(fā)生高血糖的自身免疫性疾病。非肥胖糖尿病(NOD)小鼠(尤其是雌性小鼠)自發(fā)產(chǎn)生針對胰島特異性自身抗原(例如胰島素和谷氨酸脫羧酶65)的自身反應(yīng)性T細胞。與其他的淋巴細胞相呼應(yīng)，這些自身免疫性T細胞在3周到4周齡時啟動胰島周圍炎(per1-1nsulitis),然后在第9周時發(fā)生侵襲性胰島炎,第12-35周發(fā)生自發(fā)的顯性糖尿病(Anderson and Bluestone, (2005)Annu Rev Immuno123:447-485)。NOD 小鼠與人受試者的疾病有許多相似之處，例如胰腺特異性自身抗體的產(chǎn)生和自身反應(yīng)性CD4+和⑶8+T細胞的活化。和人類中一樣，這些小鼠對自身免疫的易感性受到主要組織相容性復(fù)合物(MHC)、CTLA-4、和LAG-3的基因的影響。NOD小鼠攜帶一種獨特的主要組織相容性復(fù)合物(MHC)單體型(H-2g7)，據(jù)稱這種單體型賦予最高的疾病易感性風險(McDevitt etal., (1996)Hormone and metabolic research28:287-288;Wicker et al., (1995)AnnuRev Immunoll3:179-200)。還在 NOD 小鼠(Ueda et al., (2003) Nature423:506-511)和人(Qu et al., (2009) Genes and immunitylOSuppl1: S27-32)中發(fā)現(xiàn)了 CTLA-4 多態(tài)性,且NOD背景下的LAG-3缺陷可加速TlD發(fā)病，外顯率達100%(Bettini et al., (2011) JImmunol 187:3493-3498)。由于BsB接合所有這些靶物，在這種TlD小鼠模型中測試了 BsB的治療價值。
[0066]抗體
[0067]本發(fā)明涵蓋權(quán)利要求書中所述的抗體的抗原結(jié)合片段。如本文中使用的，術(shù)語“片段”指完整的全長抗體的部分，如抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子如上所述。
[0068]本文中使用的術(shù)語“片段”是指能夠結(jié)合特定的靶物，CTLA-4分子或pMHC復(fù)合物，的片段。這些片段可能缺少完整抗體的Fe片段，從循環(huán)中清除更迅速，而且可能有相比于完整抗體更少的非特異性組織結(jié)合。這些片段可以使用公知的方法從完整抗體制備，例如通過用木瓜蛋白酶(用來產(chǎn)生Fab片段)或胃蛋白酶(用來產(chǎn)生F(ab’)2片段)等酶來蛋白水解切割，或者通過用重組技術(shù)表達這樣的片段。
[0069]所述抗體和片段也涵蓋結(jié)合CTLA-4分子或pMHC復(fù)合物的單鏈抗體片段(scFv)。scFv包含一條抗體重鏈可變區(qū)(Vh)及與之可操作連接的抗體輕鏈可變區(qū)(VJ，其中所述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)一起或個別地形成結(jié)合CTLA-4分子或pMHC復(fù)合物的結(jié)合位點。scFv可包含位于氨基末端的Vh區(qū)和位于羧基末端的\區(qū)?；蛘撸瑂cFv可包含位于氨基末端的\區(qū)和位于羧基末端的Vh區(qū)。此外，雖然Fv片段的兩個域\和Vh是由不同的基因編碼的，但通過重組方法可以用合成接頭將它們連接起來，使得它們能夠作為單一蛋白鏈制備，其中\(zhòng)和Vh區(qū)配對而形成單價分子(稱為單鏈Fv (scFv))。scFv可任選地還包含位于重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間的多肽接頭。
[0070]所述抗體和片段還涵蓋如Ward, E.S.et al.(1989) Nature341:544-546中描述的域抗體(dAb)片段，其由Vh域組成。
[0071]所述抗體和片段還涵蓋重鏈抗體(HCAb)。這些抗體表觀上可以僅使用重鏈可變區(qū)形成抗原結(jié)合區(qū)，因為這些功能性抗體僅是重鏈的二聚體(稱為“重鏈抗體”或“HCAb” )。相應(yīng)地，抗體和片段可以是特異性結(jié)合CTLA-4或pMHC靶物的重鏈抗體(HCAb)。
[0072]所述抗體和片段還涵蓋對CTLA-4或pMHC靶物特異性的、屬于SMIP或結(jié)合域免疫球蛋白融合蛋白(binding domain immunoglobulin fusion proteins)的抗體。這些構(gòu)建體是單鏈多肽，包含與執(zhí)行抗體效應(yīng)器功能所必須的免疫球蛋白域融合的抗原結(jié)合域(見W02005/017148)。
[0073]所述抗體和片段還包含雙抗體。它們是二價抗體，其中Vh和\域表達在單一多肽鏈上，但使用的接頭短到不容許同一鏈上的兩個域配對。這強迫這些域與另一條鏈上的互補域配對，從而形成兩個抗原結(jié)合位點(參見，例如W093/11161)。雙抗體可以是雙特異性的或者是單特異性的。
[0074]根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗體片段不與除預(yù)期的CTLA-4或pMHC靶物之外的任何靶物交叉反應(yīng)。
[0075]所述抗體或其片段可能本身是雙特異性的。例如，雙特異性抗體可能與單一抗體(或抗體片段)相似，但具有兩個不同的抗原結(jié)合位點(可變區(qū))。雙特異性抗體可以用不同的方法制備-諸如化學技術(shù)，“多形瘤”(polydoma)技術(shù)或重組DNA技術(shù)。雙特異性抗體可能具有對至少兩個不同表位的結(jié)合特異性，例如CTLA-4和pMHC靶物上各一個表位。 [0076]包含Vh和'區(qū)的互補配對的雙特異性抗體是本領(lǐng)域已知的。這些雙特異性抗體包含兩對Vh和\，每對Vh和\結(jié)合單一抗原或表位。這樣的雙特異抗體包括雜交瘤(Milstein, C.and Cuello, A.C.，(1983) Nature305 (5934):537-40),迷你抗體(Hu et al., (1996)Cancer Res.56: ? 3055-3061)，雙抗體(Holliger et al., (1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448; W094/13804),螯合性重組抗體(CRAbs) (Neriet al.，(1995) J.Mol.Biol.246，367-373) ,biscFv (例如 Atwell et al., (1996)Mol.1mmunol.33:1301-1312), “孔中節(jié)”(“knobs inholes”)穩(wěn)定化抗體(Carter etal., (1997) Protein Sc1.6:781-788)。在所有情況下，每個抗體種類均包含兩個抗原結(jié)合位點，每個位點都是由一對互補的Vh和\形成。因此，每個抗體都能夠同時結(jié)合兩個不同的抗原或表位，其中對每個抗原或表位的結(jié)合由Vh及其互補的'域所介導(dǎo)。
[0077]已經(jīng)有人描述了多反應(yīng)性(polyreactive)的天然自身抗體(Casali andNotkins (1989) Ann.Rev.1mmunol.7:515-531),其與至少兩個(通常更多)在結(jié)構(gòu)上不相關(guān)的不同抗原或表位反應(yīng)。已經(jīng)顯示利用噬菌體展示技術(shù)針對某一單克隆抗體選擇隨機肽庫將會鑒定出一系列與抗原結(jié)合位點相適合的肽序列。這些序列中的一些是高度近緣的，符合某一共有序列，而其它的序列則是差異甚大，已有人稱其為模擬位(mimotopes) (Laneand Stephen(1993)Current Opinion in Immunology5:268-271)。由此可見，抗體的結(jié)合位點，包含結(jié)合并互補的Vh和 '域，具有結(jié)合來自海量已知抗原的多種不同抗原的潛力。
[0078]W003/002609 (Domantis)描述了雙重特異性抗體的生產(chǎn)，其中每個VhVl對都具有雙重特異性，即能夠結(jié)合相同或不同抗原上的兩個表位。構(gòu)象可以是開放的或是封閉的；在開放構(gòu)象中，兩個表位可以同時被結(jié)合，但在封閉構(gòu)象中，對第一個表位的結(jié)合會防止或阻礙對第二個表位的結(jié)合。
[0079]自然界中具有多種結(jié)合特異性的非免疫球蛋白蛋白是已知的，例如，多種轉(zhuǎn)錄因子既結(jié)合DNA也結(jié)合其他蛋白分子。然而，現(xiàn)有技術(shù)中選擇結(jié)合肽的方法僅選擇具有一種，而非兩種或多種特異性的肽。不同的研究團隊已經(jīng)將具有半胱氨酸的多肽與合成分子結(jié)構(gòu)扣鎖起來(Kemp, D.S.and McNamara, P.E., (1985) J.0rg.Chem.Timmerman, P.etal., (2005) ChemBioChem.6 (5): 821-4)。Meloen及其同事使用三(漠甲基)苯和相關(guān)分子將多個肽環(huán)快速且定量地環(huán)化到合成的支架上，以模擬蛋白質(zhì)表面的結(jié)構(gòu)(Timmerman, P.etal., (2005)同上)。W02004/077062和W02006/078161公開了生成候選藥物化合物的方法，其中所述化合物是通過將含有半胱氨酸的多肽與分子支架，例如三(溴甲基)苯連接而生成的。W02009/098450描述了利用展示技術(shù)選擇此類分子的方法。在W02010/089117中進一步描述了雙重特異性的實施方案。
[0080]配體，諸如抗體或其片段，可以加以修飾以增加其血清半壽期，例如，通過添加分子，如PEG或其他水溶性聚合物，包括多糖聚合物，來增加半壽期。在一個實施方案中，可以將抗體Fe區(qū)添加到根據(jù)本發(fā)明的雙特異性接頭，以增加循環(huán)半壽期。
[0081]抗體生產(chǎn)
[0082]抗體生產(chǎn)可以利用任何本領(lǐng)域已知的技術(shù)進行，包括在轉(zhuǎn)基因生物如山羊(參見 Pollock et al.(1999)J.1mmunol.Methods231:147-157),雞(參見Morrow, KJJ (2000) Genet.Eng.News20:1-55),小鼠(參見 Pollock et al.同上)或植物中(參見 Doran PM(2000)Curr.0pinion Biotechnol.11:199-204;Ma, JK-C(1998)Nat.Med.4:601-606;Baez, J.et al.(2000)BioPharm.13:50-54;Stoger, E.et al.(2000)PlantMol.Biol.42:583-590)。抗體還可以通過化學合成制備；但優(yōu)選的是在宿主細胞中表達編碼抗體的基因。
[0083]編碼抗體的多核苷酸被分離并插入可復(fù)制構(gòu)建體或載體例如質(zhì)粒中，用于在宿主細胞中進一步增殖或表達。適合于表達根據(jù)本發(fā)明的人源化免疫球蛋白的構(gòu)建體或載體(例如表達載體)在現(xiàn)有技術(shù)中是可得的。有多種載體可用，包括在宿主細胞中以單拷貝或多拷貝維持的載體，或整合到宿主細胞的染色體的載體。可以將構(gòu)建體或載體導(dǎo)入合適的宿主細胞，由此可以產(chǎn)生表達人源化免疫球蛋白的細胞并在培養(yǎng)中維持。人源化免疫球蛋白的表達可以使用單一載體或多個載體。
[0084]使用常規(guī)程序容易地分離和測序編碼抗體的多核苷酸(例如，寡核苷酸探針)。可以使用的載體包括質(zhì)粒、病毒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、微染色體，其中質(zhì)粒是典型的實施方式。一般地，這些載體還包括與輕鏈和/或重鏈多核苷酸可操作連接的信號序列、復(fù)制起點、一個或多個標記基因、增強子元件、啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列以便于表達。編碼輕鏈和重鏈的多核苷酸可以插入獨立的載體中，并同時地或次序地導(dǎo)入(例如，通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電穿孔或轉(zhuǎn)導(dǎo))相同的宿主細胞，或者，如果希望，可以將重鏈和輕鏈插入相同的載體，然后進行這種導(dǎo)入。
[0085]可提供啟動子以供在合適的宿主細胞中表達。啟動子可以是組成型或誘導(dǎo)型的。例如，啟動子可以與編碼人源化免疫球蛋白或免疫球蛋白鏈的核酸可操作連接，使其指導(dǎo)被編碼的多肽的表達。有多種用于原核和真核宿主的合適啟動子可供使用。原核啟動子包括用于大腸桿菌的lac、tac、T3、Τ7啟動子，3_磷酸甘油酸激酶或其他解糖酶例如烯醇化酶、甘油醛3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖6磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶和葡糖激酶。真核啟動子包括可誘導(dǎo)的酵母啟動子，如乙醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、金屬硫蛋白和對氮代謝或麥芽糖/半乳糖利用負責的酶；RNA聚合酶II啟動子，包括病毒啟動子例如多形瘤、禽痘和腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽類肉瘤病毒、巨細胞病毒(特別是即時早期啟動子)、逆轉(zhuǎn)錄病毒、B型肝炎病毒、肌動蛋白、勞氏肉瘤 病毒(RSV)啟動子和早期或晚期猿猴病毒40和非病毒啟動子,例如EF-1alpha (Mizushima and Nagata Nucleic Acids Resl99018 (17):5322)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠選擇合適啟動子用于表達本發(fā)明的人源化抗體或其部分。[0086]當適合時，例如，用于在高等真核生物中表達時，可以包括其他增強子元件，來代替或附加于發(fā)現(xiàn)位于如上所述的啟動子中的那些。適合的哺乳動物增強子序列包括來自球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、胎蛋白、金屬硫蛋白和胰島素的增強子元件。做為選擇，人們可以使用來自真核細胞病毒的增強子元件，例如SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、多形瘤增強子、桿狀病毒增強子或鼠IgG2a基因座(參見W004/009823)。雖然這些增強子一般位于載體上啟動子上游的位置，它們也可以位于其它地方，例如在非翻譯區(qū)域內(nèi)，或多聚腺苷酸信號的下游。增強子的選擇和位置可以基于與用于表達的宿主細胞的兼容性。
[0087]另外，載體(例如表達載體)通常包含可選擇標志，用于選出攜帶載體的宿主細胞，并且在可復(fù)制表達載體的情況下，選出攜帶復(fù)制起點的宿主細胞。賦予抗生素或藥物抗性的基因編碼產(chǎn)物是常見的可選擇標志，并且可以在原核(例如內(nèi)酰胺酶基因(氨芐青霉素抗性)、Tet基因(四環(huán)素抗性))和真核細胞(例如新霉素(G418或遺傳霉素)、gpt (霉酚酸)、氨芐青霉素或潮霉素抗性基因)中使用。二氫葉酸還原酶標志基因允許在多種宿主中用甲氨蝶呤選擇。編碼宿主的營養(yǎng)缺陷型標志的基因產(chǎn)物(例如LEU2，URA3，HIS3)的基因經(jīng)常被用作酵母中的可選擇標志。還涵蓋使用病毒(例如桿狀病毒)或噬菌體載體，以及能夠整合到宿主細胞的基因組中的載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
[0088]在真核系統(tǒng)中，多腺苷酸化和終止信號被可操作連接到編碼本發(fā)明的抗體的多核苷酸上。這種信號一般位于開放閱讀框的3’。在哺乳動物系統(tǒng)中，多腺苷酸化/終止信號的非限制性實例包括來自生長激素、延伸因子-1a和病毒(例如，SV40)基因或逆轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復(fù)者。在酵母系統(tǒng)中，多聚腺苷酸化/終止信號的非限制性實例包括來自磷酸甘油酸激酶(PGK)和乙醇脫氫酶I(ADH)基因者。在原核系統(tǒng)中，一般不需要多腺苷酸化信號，而是通常是采用較短的和更為確定的終止子序列。多聚腺苷酸化/終止序列的選擇可以基于與用于表達的宿主細胞的兼容性。除了以上的之外，可以采用其他特征來增加產(chǎn)量，包括染色質(zhì)重塑元件，內(nèi)含子和宿主細胞特`異性的密碼子修飾?？梢詫Ρ景l(fā)明的抗體的密碼子利用率加以修飾使之適應(yīng)宿主細胞的密碼子偏好，以增加轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和/或產(chǎn)物產(chǎn)率(eg Hoekema A et al (1987)Mol Cell Biol7 (8): 2914-24)。密碼子的選擇可以基于與用于表達的宿主細胞的兼容性。
[0089]因此，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明的人源化免疫球蛋白或其重鏈或輕鏈的分離的核酸分子。本發(fā)明還涉及編碼所述免疫球蛋白及其鏈的抗原結(jié)合部分的分離的核酸分子。
[0090]根據(jù)本發(fā)明的抗體可以通過，例如，在合適的宿主細胞中表達一種或多種編碼所述抗體的重組核酸來制備。宿主細胞可使用任何合適的方法來產(chǎn)生。例如，可以將本文中描述的表達載體(例如一種或多種載體，例如哺乳動物細胞表達載體)導(dǎo)入合適的宿主細胞，然后可以將所得的細胞維持(例如，在培養(yǎng)物中，在動物中，在植物中)在適合于構(gòu)建體或載體表達的條件下。合適的宿主細胞可以是原核的，包括細菌細胞如大腸桿菌(例如菌株 DH5a?(Invitrogen, Carlsbad, CA), PerC6 細胞(CrucelI, Leiden, NL)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和/或其它合適的細菌；真核細胞，如真菌或酵母細胞(例如巴斯德畢赤酵母、曲霉屬(Aspergillus)菌種、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、粗糖脈抱菌(Neurospora crassa)),或其它低等真核生物的細胞，以及高等真核生物的細胞如那些來自于昆蟲(例如DrosophilaSchnieder S2 細胞、Sf9 昆蟲細胞(W094/26087 (O，Connor)), TN5B1-4 (HIGH FIVE?)昆蟲細胞(Invitrogen)，哺乳動物(例如COS細胞，如C0S-1 (ATCC登錄號CRL-1650)和COS-7 (ATCC 登錄號 CRL-1651)、CHO (例如 ATCC 登錄號 CRL-9096)，CHO DG44 (UrIaub,G.和 Chasin, LA.,Pr。C.Natl.Acad.Sc1.USA, 77 (7): 4216-4220 (1980)))、293 (ATCC 登錄號 CRL-1573)、HeLa(ATCC 登錄號 CCL-2)、CVl (ATCC 登錄號 CCL-70)、WOP (Dailey, L.等，J.Virol.,54:739-749(1985) ,3T3.293T(Pear, ff.S.等，Pr。 C.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.,90:8392-8396(1993))，NSO細胞、SP2/0細胞、HuT78細胞等，或植物(例如煙草、浮萍(水萍)、和藻類)的細胞。參見例如 Ausubel,F.M.等編.Current Prot0 Cols in MolecularBiology, Greene Publishing Ass。Ciates and John ffiley&Sons Inc.(1993)。在一些實施方案中，宿主細胞不是多細胞生物(例如植物或動物)的一部分，例如，它是分離的宿主細胞或者是細胞培養(yǎng)物的一部分。
[0091]宿主細胞可以培養(yǎng)在旋轉(zhuǎn)燒瓶、搖瓶、滾瓶、波式生物反應(yīng)器(wavebioreactors)(例如來自wavebiotech.com的SystemlOOO)或空心纖維系統(tǒng)中，但是對于大規(guī)模生產(chǎn)而言，優(yōu)選使用攪拌罐生物反應(yīng)器或袋式生物反應(yīng)器(例如，Wave Biotech, Somerset, NewJersey USA)，特別是用于懸浮培養(yǎng)。典型地，攪拌罐生物反應(yīng)器適合于曝氣，例如利用起泡器、擋板或低剪切轉(zhuǎn)子的曝氣。對于泡柱和氣升生物反應(yīng)器，可以用空氣或氧氣泡直接曝氣。當宿主細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，可以給培養(yǎng)基補充細胞保護劑，例如pluronic F-68，以幫助防止曝氣過程所致的細胞損傷。取決于宿主細胞的特性，可以微載體用作錨基依賴性細胞系(anchorage dependent cell lines)的生長基質(zhì)，或者可以使細胞適應(yīng)于懸浮培養(yǎng)。宿主細胞，特別是脊椎動物宿主細胞的培養(yǎng)可以利用多種操作模式，例如分批、補料分批、重復(fù)的分批過程(參見Drapeau et al (1994)Cytotechnologyl5:103-109)、長期分批過程(extended batch process)或灌流培養(yǎng)(perfusion culture)。雖然重組轉(zhuǎn)化的哺乳動物宿主細胞可以在含有血清的培養(yǎng)基中，例如包含胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，但優(yōu)選的是將這樣的宿主細胞在無血清培養(yǎng)基中，如Keen et al (1995) Cytotechnologyl7:153-163中所公開的無血清培養(yǎng)基,或在可商購的培養(yǎng)基如ProCHO-CDM或UltraCHOTM(Cambrex NJ, USA)中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中必要時補充能量來源例如葡萄糖和合成的`生長因子例如重組胰島素。宿主細胞的的無血清培養(yǎng)可能需要適應(yīng)于在無血清條件中生長的那些細胞。一種導(dǎo)致適應(yīng)的方法是在含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)這種宿主細胞，并重復(fù)地將80 %的培養(yǎng)基交換為無血清培養(yǎng)基，使得宿主細胞學會適應(yīng)無血清條件(參見例如，Scharfenberg K.etal (1995) in Animal Cell TechnologyDevelopments Towards the21st Century(Beuvery E.C.et al eds),pp619-623, KluwerAcademic publishers)。
[0092]根據(jù)本發(fā)明的抗體可以被分泌到培養(yǎng)基中，并利用多種技術(shù)從培養(yǎng)基中回收和純化，以提供適于預(yù)定用途的純化程度。例如，與包含治療性抗體的培養(yǎng)基相比，用于治療人類患者的本發(fā)明的治療抗體的使用一般需要如還原SDS-PAGE所測定的至少95%的純度，更典型地98%或99%純度。在第一種情況下，來自培養(yǎng)基的細胞碎片一般使用離心、隨后通過利用例如微量過濾、超濾和/或深度過濾的上清液澄清步驟來除去。做為選擇，抗體可以不預(yù)先離心而通過微量過濾、超濾或深度過濾來收獲。有各種其他技術(shù)可用，例如透析和凝膠電泳和層析技術(shù)例如羥基磷灰石(HA)、親和層析(任選地包括親和標簽系統(tǒng)，例如聚組氨酸)和/或疏水性相互作用層析(HIC)(參見US5，429，746)。在一個實施方式中，在各種澄清步驟之后使用蛋白A或G親和層析來捕獲本發(fā)明的抗體，隨后是進一步的層析步驟，例如離子交換和/或HA層析、陰離子或陽離子交換、大小排阻層析和硫酸銨沉淀。一般地，還采用各種病毒去除步驟(例如納濾，例如使用DV-20過濾器的納濾)。在這些不同步驟之后，提供了包含至少10mg/ml或更高、例如100mg/ml或更高的本發(fā)明的抗體的純化的制備物，因而該制品構(gòu)成本發(fā)明的實施方式。100mg/ml或更高的濃度可以通過超離心來產(chǎn)生。這樣的制備物基本上不含聚集形式的本發(fā)明的抗體。
[0093]細菌系統(tǒng)特別適合于抗體片段的表達。這樣的片段定位在細胞內(nèi)或周質(zhì)中。對于不溶的周質(zhì)蛋白，可以提取并根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法重折疊形成活性蛋白質(zhì)，參見 Sanchez et al.(1999) J.Biotechnol.72:13-20; Cupit, PM et al.(1999) Lett.Appl.Microbiol.29:273-277。
[0094]本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的核酸，例如載體(如表達載體)的細胞。例如,編碼依照本發(fā)明的人源化免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的核酸(即一個或多個核酸)，或包含這樣的核酸的構(gòu)建體(即一個或多個構(gòu)建體，例如一個或多個載體)，可以通過對所選的宿主細胞適宜的方法(例如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電穿孔、感染)導(dǎo)入合適的宿主細胞，該核酸與或?qū)⒁c一個或多個表達控制元件(例如在載體中，在通過細胞內(nèi)的過程創(chuàng)建的構(gòu)建體中，整合到宿主細胞基因組中)可操作連接。宿主細胞可以維持在適合于表達的條件下(例如在誘導(dǎo)物、補充有適宜鹽、生長因子、抗生素、營養(yǎng)補充劑等的合適培養(yǎng)基的存在下)，使得被編碼的多肽得以產(chǎn)生。如果期望，可以將編碼的人源化抗體分離，例如從宿主細胞、培養(yǎng)基、或乳汁分離。該過程包括了在轉(zhuǎn)基因動物或植物(例如煙草)的宿主細胞(例如乳腺細胞)中表達(參見例如 W092/03918)。
[0095]CD80 配體
[0096]⑶80配體的設(shè)計和構(gòu)建的意圖是使配體對CTLA-4的特異性相比于對⑶28的特異性最大化。⑶80的序列是本領(lǐng)域已知的，例如在Wu et al.，1997中有引證。⑶80包含一個細胞外的類Ig-V可變域，和一個細胞內(nèi)的類IgC恒定域。在一個優(yōu)選的實施方案中，使用CD80的細胞外域作為配體。例如，見SEQ ID NO: 15，尤其是殘基1-241。
[0097]可以在人⑶80中制造突變以改善結(jié)合親和力、以及改善相比于⑶28對CTLA-4的選擇性。參見，例如，Wu et al., 19970
[0098]可以制造W84A 之外的突變，包括 K71G, K71V, S109G, R123S, R123D, G124L, S190A,S201A, R63A, Μ81Α, Ν97Α, Ε196Α0 見 Peach et al.，JBC1995.270 (6): 21181-21187。突變體對CTLA-4和CD28的結(jié)合親和力的評估可以通過如下實現(xiàn):進行定點誘變，然后表達突變多肽，再利用CTLA-4和⑶28Biocore芯片通過表面等離子共振來測定Kd。參見例如Guo etal.，(1995) J.Exp.Med.181:1345-55。
[0099]可以選擇具有有利的結(jié)合和選擇性規(guī)律的突變體，然后在基于細胞的測定法中進一步評估。例如，可以利用流式細胞術(shù)來測定轉(zhuǎn)染到細胞中的野生型或突變體CD80的作用。
[0100]LAG-3 配體
[0101]LAG-3在現(xiàn)有技術(shù)中已有描述，而且對MHC蛋白的結(jié)合位點已得到表征。參見Huard et al., (1997)Proc.N atl.Acad.Sc1.USA94(11):5744-90 LAG-3 具有四個細胞外 Ig樣域，可以向這些域中導(dǎo)入突變來最優(yōu)化對MHCII的結(jié)合。[0102]突變的有效性可以如上文就⑶80配體所述的那樣進行分析。
[0103]在一個實施方案中，LAG=3的四個Ig樣域中只有域I和域2 (Dl和D2)被用于依照本發(fā)明的配體中。據(jù)信這些域負責與MHCII蛋白的相互作用。
[0104]雙特異性配體構(gòu)建體
[0105]雙特異性配體的構(gòu)建依照通式“配體一接頭一配體”來進行。雙特異性抗體是本領(lǐng)域已知的，在上文中已有描述。
[0106]雙特異性配體的構(gòu)建優(yōu)選涉及構(gòu)建和表達編碼期望多肽的合適基因。其他構(gòu)建方法包括在允許共價、離子或疏水鍵合的條件下混合兩個多肽。在優(yōu)選的實施方案中，其包括共價鍵合這些多肽。當構(gòu)建包含三個組分的雙特異性分子，例如CTLA-4配體、接頭和MHC配體時，可以將三者中的兩者混合、結(jié)合到一起，然后將第三個多肽添加到該融合產(chǎn)物并結(jié)合，從而產(chǎn)生包含所有三個多肽的融合產(chǎn)物。
[0107]依照本發(fā)明的多肽可以通過任何期望的技術(shù)，包括化學合成、從生物樣品分離、或者表達編碼此類多肽的核酸，來加以制備。而核酸可以合成或者從生物來源分離，而且如果期望可以通過定點誘變來修飾。
[0108]因此，本發(fā)明涉及編碼依照本發(fā)明的雙特異性配體、或其片段的載體。所述載體可為，例如，噬菌體、質(zhì)粒、病毒、或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
[0109]依照本發(fā)明的核酸可以是含有用于在宿主中擴增的選擇標志的載體的一部分。通常而言，質(zhì)粒載體以沉淀物，例如磷酸鈣沉淀物，或者與帶電脂質(zhì)的復(fù)合物的形式被導(dǎo)入。
[0110]如果載體是 病毒，它可以在體外用合適的包裝細胞系加以包裝，然后轉(zhuǎn)導(dǎo)到宿主細胞中。
[0111]核酸插入物與合適的啟動子可操作連接，所述載體例如λ噬菌體PL啟動子、大腸桿菌lac，trp, phoA和tac啟動子，SV40早期和晚期啟動子，以及逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR的啟動子。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道其他的合適啟動子。所述表達構(gòu)建體還包含用于轉(zhuǎn)錄起始、終止的位點，以及，在被轉(zhuǎn)錄的區(qū)域中，包含用于翻譯的核糖體結(jié)合位點。這些構(gòu)建體所表達的轉(zhuǎn)錄物的編碼部分優(yōu)選包含位于要翻譯的多肽的起始位置的起始密碼子，和位于要翻譯的多肽的末尾合適位置處的終止密碼子(UAA、UGA或UAG)。
[0112]如已指出的，表達載體可能優(yōu)選地包含至少一個選擇標志。這樣的選擇標志包括四氫葉酸還原酶、G418或新霉素抗性，用于真核細胞培養(yǎng)；和四環(huán)素、卡那霉素或氨芐青霉素抗性基因，用于培養(yǎng)大腸桿菌和其他細菌。合適的宿主的代表性例子包括，但不限于，細菌細胞，諸如大腸桿菌，鏈霉屬(Streptomyces)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)細胞；真菌細胞；諸如酵母細胞(例如釀酒酵母或巴斯德畢赤酵母)；昆蟲細胞諸如果蠅(Drosophila) S2和夜蛾(Spodoptera) Sf9細胞；動物細胞如CH0、C0S、HEK293、和Bowes黑素瘤細胞；以及植物細胞。
[0113]用于上述宿主細胞的合適的培養(yǎng)基和條件是本領(lǐng)域已知的，并且可以通過商購獲得。
[0114]優(yōu)選用于細菌的載體包括pQE70，pQE60和pQE_9，可獲自QIAGEN，Inc.；pBluescript 載體，Phagescript 載體，pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A,可獲自 StratageneCloning Systems, Inc.;和 ptrc99a, pKK2233, pKK233_3, pDR540, pRIT5,可獲自 PharmaciaBiotech, Inc。優(yōu)選的真核載體包括 pffLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI 和 pSG,，可獲自Stratagene;和pSVK3, pBPV, pMSG和pSVL,,可獲自Pharmacia。優(yōu)選用于哺乳動物細胞表達的載體包括 PSG5 載體，pCMV.SP0RT6, pcDNA, pCEP4, pREP4, pCI, pSI 和 pBICEP-CMV。優(yōu)選用于酵母系統(tǒng)中的表達載體包括，但不限于PYES2，pYDI, pTEFI/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalph, pPIC9, pPIC3.5，pHILD2, pHIL-SI, pPIC3.5K, pPIC9K,和 PA0815(都可獲自Invitrogen, Carlsbad, CA)。
[0115]將構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細胞中可以通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，電穿孔，轉(zhuǎn)導(dǎo)，感染，或其他方法來實現(xiàn)。這樣的方法在許多常規(guī)實驗室手冊中，例如上文援引的Sambrook et al.中有描述。可以通過公知的方法，包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽提、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和幾丁質(zhì)層析來從重組細胞培養(yǎng)物中回收并純化根據(jù)本發(fā)明的多肽。更優(yōu)選的是，使用高效液相層析(“HPLC”)進行純化。
[0116]還可以從生物來源，包括體液、組織和細胞，尤其是來自受試者的腫瘤組織或疑似腫瘤組織的細胞，回收依照本發(fā)明的多肽。
[0117]此外，可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)(例如參見Creighton, 1983，Proteins:Structures and Molecular Principles, ff.H.Freeman&C0., N.Y., and Hunkapiller etal., (1984)Nature, 310:105-111)來化學合成依照本發(fā)明的多肽。例如，通過利用肽合成儀，可以合成包含依照本發(fā)明的雙特異性配體的全部或一部分的多肽。 [0118]依照本發(fā)明的雙特異性配體在本文隨附的SEQ ID NO中有詳細說明。SEQ ID NO:1和2提供了如下所述的雙特異性配體的小鼠替身DNA(surrogate DNA)和蛋白序列,所述雙特異性配體中CTLA-4配體和⑶80w88a與MHC配體LAG-3配對，并且被IGg2a Fe區(qū)和一個Gly-9 (G9)序列所分隔。在C末端提供末端His標簽(H6)序列。SEQ ID N0:3和4提供了這樣的構(gòu)建體的小鼠替身DNA和蛋白序列:該構(gòu)建體與SEQ ID NO:1和2相同，只是IgG2aFc區(qū)被置于LAG-3多肽之C末端側(cè)，從而⑶80和LAG-3肽僅被G9隔開。這兩種布置，其中Fe區(qū)位于配體之間或配體C端側(cè)，分別命名為基因I構(gòu)建體和基因2構(gòu)建體。SEQ ID NO: 5和6提供了其中保守了野生型序列的人DNA和蛋白序列。沒有進行突變，無論是對CD80還是對LAG-3。在SEQ ID NO: 7和8中，對人CD80進行了 W84A突變(等同于小鼠中的W88A)，且對LAG-3進行了 R75E突變。其他SEQ ID N0(N07-14)描述了 CD80和LAG-3序列中的其他突變。
[0119]治療應(yīng)用
[0120]在許多有必要免疫抑制的情況下，和/或在發(fā)生了自身免疫狀況的情況下，抑制T細胞活性是期望的。相應(yīng)地，在涉及不適宜或不期望的免疫應(yīng)答的疾病如炎癥、自身免疫，以及涉及這些機制的狀況的治療中，有必要靶向CTLA-4/MHC相互作用。在一個實施方案中，這樣的疾病或病癥是自身免疫和/或炎癥疾病。此類自身免疫和/或炎癥疾病的例子如上所述。
[0121]在一個實施方案中，這樣的疾病或病癥是I型糖尿病(TlD)。
[0122]在另一個實施方案中，應(yīng)用依照本發(fā)明的配體，通過免疫抑制受試者來幫助移植。此類應(yīng)用可緩解移植物抗宿主病?，F(xiàn)有的移植物抗宿主病的治療的描述可見Svennilson, (2005)Bone Marrow Transplantation35:S65 - S67,以及其中引證的參考文獻。有利的是，可以將本發(fā)明的抗體與其他可用的療法組合使用。[0123]關(guān)于自身免疫性疾病的治療，組合療法可包括將本發(fā)明的配體與藥物一起施用，所述藥物與該配體一同構(gòu)成預(yù)防或治療此類自身免疫性疾病的有效量。當所述自身免疫病是I型糖尿病時，組合療法可包含一種或多種可促進胰腺β細胞生長或增強β細胞抑制的作用劑，例如β細胞生長或存活因子或免疫調(diào)節(jié)抗體。當所述自身免疫病是類風濕性關(guān)節(jié)炎時，所述組合療法可包含下述的一種或多種:甲氨蝶呤，抗TNF-α抗體，TNF-α受體-1g融合蛋白，抗-1L-6、或抗-1L17或抗-1L-15或抗-1L-21抗體，非留體抗炎藥(NSAID)，或緩解疾病的抗風濕藥(DMARD)。例如，額外的作用劑可為生物作用劑，諸如抗-TNF劑(例如Enbrel ,⑧，英夫利昔單抗(Remicade 和阿達木單抗(Humira ? )或利妥
昔單抗(Rituxan⑩:)。當所述自身免疫性疾病是造血移植排斥時，可以施用造血生長因子(如紅細胞生成素，G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-11，血小板生成素，等等)或抗微生物劑(如抗生素、抗病毒藥、抗真菌藥)。當所述自身免疫性疾病是銀屑病時，額外的作用劑可以是下述的一種或多種:阿片樹膠(tar)或其衍生物、光療、皮質(zhì)類固醇、環(huán)胞素A、維生素D類似物、甲氨喋呤、P38絲裂原活化的蛋白激酶(MAPK)抑制劑，以及生物作用劑諸如抗-TNF-α劑和Rituxan f^當所述自身免疫性疾病是炎性腸病(IBD)諸如克羅恩氏病或潰瘍性結(jié)腸炎時，額外的作用劑可以是下述的一種或多種:氨基水楊酸鹽、皮質(zhì)類固醇、免疫調(diào)節(jié)劑、抗生素、或生物制劑如Remicade (R,和Humira氣
[0124]組合治療可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員視為必要或方便的任何方式來實施，而且為本說明書的目的，不考慮任何關(guān)于組合中要使用的化合物的次序、量、重復(fù)次數(shù)或相對量的限制。因此，用于治療的依照本發(fā)明的抗體可以配制為藥物組合物。本發(fā)明也涉及包含依照本發(fā)明的肽的藥物組合物。
[0125]藥物組合物
[0126]在一個優(yōu)選的實施方案中，提供藥物組合物，其包含依照本發(fā)明的雙特異性配體，或者一種或多種能夠通過本發(fā)明的前述方面中定義的測定法鑒定的配體。配體可以是如本文所討論的免疫球蛋白、肽、核酸或小分子。在下面的討論中將它們稱為“化合物”。
[0127]依照本發(fā)明的藥物組合物是這樣的物質(zhì)組合，其包含一種或多種能夠調(diào)節(jié)T細胞活性的化合物作為有效成分。典型`地，所述化合物的形式是任何藥學上可接受的鹽，或者，例如，當適宜時，是它的類似物、游離堿形式、互變異構(gòu)體、對映異構(gòu)體、外消旋化合物、或其組合。預(yù)期包含依照本發(fā)明的有效成分的藥物組合物的有效成分當以根據(jù)具體情況而定的量施用時，可發(fā)揮優(yōu)秀的治療活性(例如在移植物抗宿主病中)。
[0128]在另一個實施方案中，一種或多種本發(fā)明的化合物可以與本領(lǐng)域公知的適于在任何前述狀況的治療中治療特定適應(yīng)證的化合物組合使用。因此，可以將一種或多種本發(fā)明的化合物與一種或多種本領(lǐng)域公知的、已知適于治療前述適應(yīng)證的化合物組合，從而可以向受試者施用簡便的單一組合物?？梢哉{(diào)整給藥方案以提供最優(yōu)的治療應(yīng)答。
[0129]例如，可以每日施用數(shù)個分割的劑量，或者可以視治療狀況的緊急程度按比例地減少劑量。
[0130]活性成分可以按照方便的方式施用，例如通過口服、靜脈內(nèi)(當其為水溶性時)、肌肉內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、皮內(nèi)或栓劑途徑，或植入(例如利用緩釋分子)。
[0131]取決于施用途徑，活性成分可能需要包被到某種材料中以保護所述成分免受酶、酸、和其他可能使所述成分失活的天然條件的作用。
[0132]為了通過非胃腸施用之外的途徑施用有效成分，可以將有效成分用防止其失活的材料包被或者與防止其失活的材料一起施用。例如，可以將有效成分在佐劑中施用、與酶抑制劑共同施用、或在脂質(zhì)體中施用?！白魟币云渥顚挿旱囊饬x使用，包括任何免疫刺激性化合物，諸如干擾素。本文考慮的佐劑包括間苯二酚類(resorcinols)、非離子型表面活性劑諸如聚氧乙烯油基醚，以及正十六烷基聚乙烯醚。酶抑制劑包括胰蛋白酶抑制劑(pancreatic trypsin)。
[0133]脂質(zhì)體包括水包油包水(water-1n-oi 1-1n-water) CGF乳液，以及常規(guī)的脂質(zhì)體。
[0134]活性成分還可以通過非胃腸道或腹膜內(nèi)施用。
[0135]懸液還可以在甘油、液體聚乙二醇、及其混合物中制備，以及在油中制備。在通常的貯存和使用條件下，這些制備物包含防腐劑以防止微生物生長。
[0136]適于可注射用途的藥物形式包括無菌水性溶液(當可溶于水時)或分散液，和用于臨時配制無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。在所有情況下，所述形式必須是無菌的，而且以容易通針為限，必須是液體，其在制造條件下必須是穩(wěn)定的，并且必須在防止細菌和真菌等微生物的污染作用的條件下保存。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，例如含有水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液體聚乙二醇等等)、它們的合適的混合物、以及植物油的溶劑或分散介質(zhì)。合適的流動性可以通過例如下述方式來維持:使用包衣，如卵磷脂；在分散劑的場合，通過維持必要的顆粒大??；以及通過使用表面活性劑。
[0137]防止微生物作用可以由各種抗細菌劑和抗真菌劑，例如對羥苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等等來實現(xiàn)。在特定情況下，理想的是包含等張劑，例如糖或氯化鈉。在可注射組合物中使用可延遲吸收的作用劑，如單硬脂酸鋁和明膠，能夠延長可注射組合物的吸收。
`[0138]無菌可注射溶液通過將要求量的活性成分、以及上文列舉的各種其他成分(視需要)納入合適的溶劑中，然后進行過濾除菌來制備。一般而言，分散液是通過將經(jīng)滅菌的活性成分納入含有基本分散介質(zhì)和所述的其他成分(選自上述列舉的那些)的無菌媒介(vehicle)來制備的。在無菌粉末的情況下，為了制備無菌可注射溶液，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，這些技術(shù)從包含活性成分加上任何其他期望的組分的預(yù)先經(jīng)無菌過濾的溶液中產(chǎn)生活性成分加上任何其他期望的組分。
[0139]如本文中使用的，“藥學可接受的載體和/或稀釋劑”包括任何溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細菌和抗真菌劑、等張和吸收延遲劑等等。為藥學活性物質(zhì)使用此類介質(zhì)和作用劑是本領(lǐng)域公知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)或作用劑與活性成分不兼容，否則考慮任何常規(guī)介質(zhì)或作用劑在治療組合物中的使用。組合物中還可以納入補充的活性成分。特別有利的是，將非胃腸組合物配制成劑量單位的形式，以方便施用和使劑量均一。如本文中所使用的，劑量單位形式是指物理上離散的單位，這些單位被調(diào)整為供要治療的受試者使用的單元(unitary)劑量；每個單位含有據(jù)計算可以產(chǎn)生期望的治療效果的預(yù)定量的活性材料，以及與之一起的所需的藥物載體。新的劑量單位形式的規(guī)格可取決于并依賴于(a)活性材料的獨特特征以及希望獲得特定治療效果，和(b)現(xiàn)有技術(shù)中對于為了治療具有損害身體健康的疾病狀態(tài)的活體受試者的疾病而配合這樣的活性材料的內(nèi)在限制。
[0140]將主要的活性成分與合適的藥學可接受載體配合成單位劑型，以便方便、有效地以有效量進行施用。在含有補充活性成分的組合物的情況下，通過參考所述成分的通常劑量和施用方式來確定劑量。
[0141]為了幫助肽化合物(包括抗體)對細胞的投遞，可以對肽加以修飾以改善它們跨越細胞膜的能力。例如，US5，149，782公開了使用致融合肽、形成離子通道的肽、膜肽、長鏈脂肪酸和其他膜摻混劑(membrane blending agents)來增加蛋白質(zhì)的跨細胞膜轉(zhuǎn)運。這些方法以及其他方法在W097/37016和US5，108, 921 (通過援引并入本文)中也有描述。
[0142]在另一個方面，提供了如上文定義的本發(fā)明的活性成分用于單獨治療疾病或與現(xiàn)有技術(shù)中已知適于治療特定適應(yīng)證的公知化合物聯(lián)合治療疾病。因此，提供了本發(fā)明的活性成分用于制造用于治療與異常免疫應(yīng)答相關(guān)的疾病的藥物的用途。
[0143]此外，提供一種治療與異常免疫應(yīng)答相關(guān)的狀況的方法，包括對受試者施用治療有效量的可通過如上所述的測定方法鑒定的配體。
[0144]僅出于示例說明的目的，在下面的實施例中進一步說明本發(fā)明。
實施例
[0145]實施例1
[0146]設(shè)計可接合CTLA-4并將其藉由MHCll與TCR交聯(lián)的雙特異性融合蛋白
[0147]為了生成可選擇性和激動性地接合CTLA-4并同時將其與TCR連接的雙特異性融合蛋白，將可結(jié)合CTLA-4但對⑶28的親和力最小的突變型⑶80(⑶80w88a，后文中稱為CD80wa) (ffu et al.，1997)與 LAG-3 融合，LAG-3 是 MHCII 的一種天然配體(Baixeras etal., 1992; Triebel et al.，1990)。使用一個由9個甘氨酸組成的接頭將CD80wa與LAG-3連接起來，而LAG-3則與小鼠IgG2a的Fe部分搭接，據(jù)信這樣可增加其循環(huán)半壽期(圖1A)。響應(yīng)于具有此種構(gòu)型的配體，預(yù)期會通過在早期T細胞活化的過程中在免疫突觸中形成三分子復(fù)合物(CTLA-4/MHCII/TTCR)而間接發(fā)生CTLA-4接合和對TCR的連接(圖1B)。從概念上說，在免疫突觸的語境之外，雙特異性融合蛋白對單獨CTLA-4或MHCI1、或CTLA-4或MHCII 二者的結(jié)合應(yīng)該不會導(dǎo)致T細胞活性的抑制。CD80wa對CTLA-4的接合被設(shè)計為藉由募集磷酸酶到CTLA-4的胞質(zhì)尾巴而觸發(fā)CTLA-4信號傳導(dǎo)。同時，意圖通過LAG-3對MHCII的結(jié)合將CTLA-4帶入到關(guān)聯(lián)TCR的附近，關(guān)聯(lián)TCR在免疫突觸中結(jié)合pMHCII復(fù)合物(圖1B)。預(yù)期這兩個結(jié)合事件的組合會將抑制信號輸送給TCR。還構(gòu)建了包含⑶80wa和IgG2a Fe的對照融合蛋白(圖1A)，其應(yīng)該不能將CTLA-4與TCR交聯(lián)(圖1C)，因為它缺少LAG-3。
[0148]將測試融合蛋白和對照融合蛋白在中華倉鼠卵巢細胞中表達，然后用蛋白G柱通過親和色譜加以純化。利用大小排阻色譜去除聚集體。將測試雙特異性融合蛋白(CD80wa-LAG-3-Fc)稱為BsB(核苷酸序列:SEQ ID N0.3 ;氨基酸序列:SEQ IDNO: 4),對照構(gòu)建體(CD80wa-Fc)稱為BsB Λ (核苷酸序列:SEQ ID N0.16;氨基酸序列:SEQ ID NO: 17)。如預(yù)期的，兩種融合蛋白在非還原性SDS-PAGE凝膠上都表現(xiàn)為二聚體(BsB，200kDa; BsB Δ 140kDa)，而在還原性SDS-PAGE凝膠上都表現(xiàn)為單體(BsB, IOOkDa; BsB Δ 70kDa)。使用針對LAG-3和CD80的抗體進行Western印跡進一步確認了它們的身份。
[0149]實施例2[0150]BsB在同種異體混合淋巴細胞反應(yīng)中抑制T細胞活化。
[0151]在一個同種異體淋巴細胞混合反應(yīng)中通過測量IL-2產(chǎn)生評估了 BsB和BsBA抑制T細胞活化的相對能力。在有或無BsB或BsB Δ存在的條件下，將從BALB/c小鼠純化的幼稚^4^)25工0621^^44<￡1'細胞與從0578176小鼠分離的APC混合。納入小鼠IgG2a和CTLA-4Ig( —種共刺激抑制物，結(jié)合⑶80/86并阻斷它們對⑶28的結(jié)合)，分別作為陰性和陽性對照。在混合淋巴細胞反應(yīng)中納入BsB而非BsB Λ抑制了 IL-2產(chǎn)生，盡管抑制的程度不及CTLA-4Ig(圖2)。這種差異可能是BsB介導(dǎo)的T細胞抑制晚于CTLA_4Ig-介導(dǎo)的抑制發(fā)生的結(jié)果。更具體地說，對于BsB而言，抑制僅在T細胞活化、繼而CTLA-4上調(diào)之后才發(fā)生。BsBA無法減少IL-2產(chǎn)生強烈暗示僅有CTLA-4接合不足以阻止T細胞活化，因為還需要同時交聯(lián)TCR。為了排除BsB的LAG-3部分在T細胞抑制中起作用的可能性，在本測定法中測試了 LAG-3Ig，并確認了其不抑制T細胞活化。
[0152]實施例3
[0153]BsB指導(dǎo)T細胞向Treg分化。
[0154]已經(jīng)顯示，由于抗原刺激停止而導(dǎo)致的TCR信號傳導(dǎo)過早終止、mTOR信號傳導(dǎo)的抑制、由于抗原親和力低而未達到最優(yōu)的TCR刺激，或者T細胞活化過程中共刺激弱等原因可誘導(dǎo)Foxp3+表達，并使T細胞分化偏向Treg表型(Delgoffe et al., (2009)Immunity30:832-844;Haxhinasto et al., (2008) J.Exp.Med.205:565-574;Sauer etal.，(2008) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA105:7797-7802)。鑒于 BsB 可強迫活化誘導(dǎo)的CTLA-4 (activation-1nduced)提前接合TCR,繼而導(dǎo)致TCR信號傳導(dǎo)弱化，還評估了BsB 產(chǎn)生 Foxp3+Treg 的能力。將從 Foxp3_EGFP 敲入小鼠(Haribhai et al., (2007)J.1mmunol 178:2961-2972)制備的幼稚CD4+CD62L高GFP，，T細胞在BsB或BsB Λ的存在下與經(jīng)LPS處理的同種異體APC混合。培養(yǎng)5日后對細胞的流式細胞術(shù)分析揭示在BsB處理的細胞中有大量的⑶4+⑶25+GFP+T細胞(圖3Α，左邊中間小圖)，但在小鼠IgG2a處理的細胞中(圖3A，左邊上部小圖)或BsB Λ對照處理的細胞中(圖3Α，左邊底下小圖)都沒有，提示這些⑶4+⑶25+GFP+T細胞是FoXp3+Treg。為了驗證該發(fā)現(xiàn)，收集細胞培養(yǎng)基并測定特征Treg細胞因子:IL-10 和 TGF-β (Cools et al., (2008) J.Cell Mo/.Med.12:690-700) ? 在 BsB處理的細胞的培養(yǎng)基中檢出了大量的IL-10和TFG-β (圖3Α，左邊的各小圖)但在BsB Λ或mIgG2a處理的細胞的培養(yǎng)基中則沒有。令人驚奇的是，CTLA_4Ig沒有誘導(dǎo)GFP+Treg的生成，也沒有誘導(dǎo)IL-10與TGF-β產(chǎn)生。不拘于任何具體理論，CTLA-41g降低T細胞應(yīng)答的機理與BsB不同。LAG-3Ig單獨或與BsBA組合也未能誘導(dǎo)GFP+Treg的生成，提示BsB介導(dǎo)的CTLA-4與TCR的交聯(lián)是Treg誘導(dǎo)所必需的。
[0155]實施例4
[0156]BsB誘導(dǎo)Treg需要自刺激的TGF-β
[0157]在BsB處理后同時檢測到IL-10和TGF-β的升高水平提示了這樣的可能性，即這些細胞因子，尤其是TGF-β，在幫助Treg生成中發(fā)揮作用(圖3Α)。為考察這一點，在5天時間內(nèi)收集培養(yǎng)基，分析細胞因子和F0Xp3+Treg含量。早在處理后第2天就檢測到了升高的IL-10和TGF-β水平,而Foxp3+Treg在第3天之后檢出。不拘于具體理論,推定的由BsB刺激的內(nèi)源TGF-β產(chǎn)生與Treg分化有牽連。向Treg誘導(dǎo)測定系統(tǒng)中添加抗TGF-β抗體(克隆1D11)完全阻斷了 FoXp3+Treg的出現(xiàn)，但同種型對照IgG(克隆13C4)則不然(圖3B)。不拘于具體理論，BsB導(dǎo)致的CTLA-4提前接合以及隨后CTLA-4與TCR的交聯(lián)刺激了內(nèi)源TGF-β產(chǎn)生，而內(nèi)源TGF-β產(chǎn)生則促進Treg分化。先前已有報道稱CTLA-4與TCR 的交聯(lián)可誘導(dǎo) TGF-β 產(chǎn)生(Chen et al.，(1998) J.Exp.Med.188:1849-1857)，雖然在本研究中未評估Treg分化。
[0158]Treg在數(shù)種自身免疫病的動物模型中在調(diào)節(jié)疾病表現(xiàn)方面已顯示出相當大的治療潛力。但是，迄今為止被強調(diào)的是誘導(dǎo)出的Treg針對相關(guān)抗原的特異性的重要性。不會在自身抗原特異性反應(yīng)性T細胞(autoantigen-specific reactive T cells)的背景下針對某種特定的自身抗原被活化的非抗原特異性Treg (Non-antigen specific Tregs)據(jù)推測沒有功能性的免疫抑制作用。因此，對于治療這些疾病，有助于生成大量的抗原特異性Treg的手段是非常令人期望的。而且，相比于利用體外分化或擴增的Treg進行過繼性轉(zhuǎn)移，更優(yōu)選有助于原位(例如對于T1D，在胰腺的胰島；對于潰瘍性結(jié)腸炎或克羅恩氏病，在固有層(lamina propria))從頭誘導(dǎo)(de novo induction)抗原特異性Treg的手段。
[0159]實施例5
[0160]BsB誘導(dǎo)的Treg以細胞-細胞接觸依賴性的方式發(fā)揮功能性抑制作用
[0161]為了評估BsB誘導(dǎo)的Treg是否有功能性抑制作用，將BsB誘導(dǎo)的Treg和TGF-β誘導(dǎo)的Treg (作為對照)使用熒光活化細胞分選(FACS)進行純化，并與不同比例的CFSE標記的同基因應(yīng)答T細胞以及同種異體APC混合。將細胞在transwell或常規(guī)培養(yǎng)孔中共培養(yǎng)三天，然后利用流式細胞術(shù)分析應(yīng)答T細胞的增殖。如圖5A中總結(jié)的，BsB誘導(dǎo)的Treg和TGF-β誘導(dǎo)的Treg在常規(guī)培養(yǎng)孔中培養(yǎng)時幾乎都完全抑制了應(yīng)答T細胞的增殖。BsB誘導(dǎo)的Treg的抑制活性的強度與TGF-β誘導(dǎo)的Treg相仿。與之對照的是，當在transwell中將T細胞與Treg分離時，無論是BsB產(chǎn)生的Treg或是TGF- β產(chǎn)生的Treg都沒有顯著抑制應(yīng)答T細胞的增殖。不拘于任何理論，Treg抑制活性依賴于細胞-細胞接觸而不是由分泌的細胞因子或其他因子介導(dǎo)的。對該觀點構(gòu)成支持的是，在常規(guī)培養(yǎng)孔中納入針對IL-10的抗體(克隆JES5-2A5)沒有影響B(tài)sB誘`導(dǎo)的Treg或TGF- β誘導(dǎo)的Treg的抑制活性(圖5Β)。添加針對TGF- β IDll的抗體也沒有影響B(tài)sB誘導(dǎo)的Treg的抑制活性，雖然部分地減少了 TGF-β誘導(dǎo)的Treg所致的抑制(圖5Β)。
[0162]實施例6
[0163]BsB指導(dǎo)OT-1I T細胞分化成抗原特異性Treg。
[0164]由于發(fā)現(xiàn)一種包含CD80wa和LAG3、可將CTLA-4與TCR交聯(lián)(藉由MHCII)的雙功能融合蛋白(BsB)能在同種異體MLR中誘導(dǎo)Foxp3+Treg的產(chǎn)生,考察了 BsB引發(fā)抗原特異性Treg產(chǎn)生的潛力。為了研究這一問題，從攜帶編碼針對一種雞卵清蛋白肽(323-339)(Barnden et al.，1998)的TCR(α-和β-亞單位)的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠純化幼稚OT-1IT細胞，并在0va323-339的存在下與同基因APC混合。培養(yǎng)5天后，在經(jīng)過BsB處理的OT-1IT細胞(圖4A，左邊中間小圖)中檢出的FoXp3+Treg的量顯著大于mlgG對照處理的(圖4A，左邊上部小圖)或CTLA-4Ig處理的OT-1I T細胞(數(shù)據(jù)未顯示)。在培養(yǎng)物中納入抗TGF-β抗體則該Treg誘導(dǎo)作用被抑制(圖4Α，左邊底下小圖)。不拘于特定理論，分化是由內(nèi)源產(chǎn)生的TGF-β以自分泌或旁分泌方式所介導(dǎo)的。在BsB處理的細胞的培養(yǎng)基中，IL-2的水平下降，而IL-10和TGF-β的水平增加(圖4Α，右邊各小圖)。
[0165]為了監(jiān)測誘導(dǎo)出的Treg的增殖活性，在OT-1I細胞上預(yù)加載熒光示蹤劑CFSE。如圖4B所示,從CFSE信號的稀釋可確定BsB誘導(dǎo)的Foxp3+Treg有增殖性(proliferative)。如預(yù)料的，添加共刺激阻斷物CTLA-4Ig減少了 T細胞增殖。由此可見，BsB在同種異體MLR和抗原特異性環(huán)境中都能夠抑制T細胞活化并誘導(dǎo)Treg產(chǎn)生。
[0166]實施例7
[0167]BsB誘導(dǎo)Treg可能涉及AKT/mTOR信號傳導(dǎo)途徑的弱化。
[0168]新近的報道表明AKT和mTOR信號傳導(dǎo)途徑在T細胞命運的決定中起著重要作用。T細胞中組成性活性AKT的存在以雷帕霉素敏感的方式減少Treg分化(Haxhinasto etal.，2008)，提示AKT和mTOR信號傳導(dǎo)途徑相互交叉以影響Treg命運。此外，mTOR缺陷的T細胞分化成 Treg 比正常對照 T 細胞更快(Delgoffe et al., (2009) Immunity30:832-844)。還報道了共刺激分子FO-l/PD-Ll在控制適應(yīng)性Treg發(fā)生(adaptive Treg development)中發(fā)揮拮抗AKT/mTOR 的必要作用(Francisco et al., (2009) J.Exp.Med.206:3015-3029)。為了確定BsB介導(dǎo)的Treg誘導(dǎo)中是否也牽涉這些途徑，將抗⑶3和抗⑶28抗體在96孔板上與BsB、mlgG或I3D-Ll共固定，將幼稚T細胞接種到該平板上?；罨?8小時，用針對磷酸化AKT和mTOR的熒光標記抗體將細胞染色，并用流式細胞術(shù)分析。BsB和TO-Ll共固定弱化了 AKT和mTOR 二者的磷酸化(圖6)。不拘于特定理論，在T細胞活化的過程中，CTLA-4和I3D-Ll抑制分子介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)事件可能在AKT/mTOR信號傳導(dǎo)途徑上的某點匯合以調(diào)控Treg分化。
[0169]實施例8 [0170]對BsB的暴露可維持被誘導(dǎo)的Treg中的Fox3+表達。
[0171]不同于完全定型的(fully committed)天然Treg,體內(nèi)誘導(dǎo)的Treg據(jù)報道穩(wěn)定性較差，在缺少原先的誘導(dǎo)物或視黃酸)的條件下長期培養(yǎng)時可能喪失Foxp3+表達(Selvaraj and Geiger, (2007) J.1mMino1.178:7667-7677)。在本研究中，BsB 誘導(dǎo)的Treg顯示了類似的不穩(wěn)定性，一些細胞在重復(fù)培養(yǎng)后喪失了 Foxp3表達(圖7)。為了測試用BsB再刺激是否能夠延長Foxp3表達，首先通過用抗-⑶3/抗-⑶28抗體和BsB包被96孔板誘導(dǎo)了 Treg。然后將經(jīng)純化的Treg在有或無BsB存在下再進行一輪培養(yǎng)。用BsB再刺激純化的Treg能夠維持大的Foxp3+Treg群體(總Treg的~93%)(圖7，右下小圖)，與之相比，響應(yīng)IgG對照的Foxp3表達為~40%(圖7，右上小圖)。
[0172]實施例9
[0173]BsB在小鼠中的藥動學
[0174]在用自身免疫性疾病動物模型測試BsB的治療用處之前，確定了 BsB的藥動學規(guī)律以幫助設(shè)計體內(nèi)的給藥方案。C57BL/6小鼠腹膜內(nèi)注射BsB導(dǎo)致循環(huán)水平的可測量的上升，然后迅速清除，估計的血漿半壽期(t1/2)為~12小時(圖8A)。該規(guī)律是出人預(yù)料的，因為含F(xiàn)e的融合蛋白或抗體的藥動學通常時間更長。由于抗體對新生兒Fe受體(FcRn)的結(jié)合是它們半壽期長的主要原因(Roopenian and Akilesh，2007)，比較了 BsB和一種對照IgG2a結(jié)合FcRn的相對能力。圖8B顯示這兩種蛋白質(zhì)對FcRn的結(jié)合特征非常相似,表明BsB對FcRn的結(jié)合的缺陷不太可能是BsB從循環(huán)迅速清除的原因。
[0175]BsB的迅速清除的另一個可能的解釋是由于它被非靶細胞上的糖受體所攫取。這樣的受體包括肝細胞上的無唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein receptor, ASGPR)(Weigel, 1994)和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(reticuloendothelial system)的內(nèi)皮細胞和巨卩遼細胞上的甘露糖受體(Pontow et al.，1992)。利用NetNGlyc服務(wù)器分析BsB提示其具有每個分子包含多達10個天冬酰胺連接的寡糖側(cè)鏈的潛力(圖9)。單糖組成分析顯示BsB含有大約37個甘露糖殘基，而且所有預(yù)測的天冬酰胺連接的糖基化位點可能都已被使用，因為這些天冬酰胺連接的寡糖聚糖含有具備三個甘露糖殘基的核心甘露糖結(jié)構(gòu)(總共30個甘露糖殘基)。此外，還可能存在少量的高甘露糖型寡糖來解釋多余的甘露糖殘基的去向。實際上，對從該蛋白質(zhì)釋放的泛甲基化(permethylated)聚糖的質(zhì)譜鑒定了顯著量的低唾液酸化(under-sialylated)三觸角和四觸角型天冬酰胺連接(tr1-and tetra-antennaryasparagine-1 inked)寡糖，以及一些高甘露糖型寡糖。這種預(yù)測也與SDS-PAGE分析顯示的BsB分子量IOOkDa相一致；而BsB的計算得到的分子量是80kDa。這些寡糖的存在合起來貢獻了分子量的差異(20kDa)。此外，BsB顯示唾液酸對半乳糖的比例為0.68 (圖9)，表明這些聚糖的唾液酸化不完全。不拘于特定理論，糖介導(dǎo)的ASGPR對BsB的清除對BsB從循環(huán)的迅速清除有貢獻。
[0176]實施例10
[0177]用BsB短期治療延遲了 NOD小鼠中自身免疫性糖尿病的發(fā)病
[0178]由于BsB在體外誘導(dǎo)Treg的EC5tl估計為大約ΙΟΟηΜ，且其循環(huán)半壽期短(t1/2為~12h),因此在NOD小鼠中以晚期預(yù)防范式(late prevention paradigm)測試BsB。當NOD小鼠為9-12周齡時，以短時間間隔(每隔一天，歷時四周)對其施用BsB。該年齡的小鼠已經(jīng)明顯有自身反應(yīng)性T細胞和胰島炎，但尚未發(fā)生顯性糖尿病。如圖1OA所示，與鹽水處理的對照相比，用BsB處理2周的NOD小鼠的血液中的Foxp3+Treg數(shù)目顯示有限的、但統(tǒng)計學顯著的增加(25%)。但是，Treg的這種增加是瞬時性的，因為在治療4周之后以及更晚的時間點不能檢測到Treg數(shù)目的差異。先前已有人提到用抗CD3抗體處理NOD小鼠后在淋巴器官中有類似的Treg瞬時增加(Nishio et al.，2010)。不拘于特定理論,BsB誘導(dǎo)的Treg可能在治療停止后變回Foxp3_T細胞。它們還可能已被特定的靶組織(例如胰腺)募集以執(zhí)行其功能。無論如何，這項按照晚期預(yù)防處理范式進行的短期BsB處理似乎有限地延遲了疾病發(fā)作并減少了表現(xiàn)顯性TlD的小鼠數(shù)目(圖10B)。
[0179]所觀察到的有限應(yīng)答可能是由于治療開始前的9周齡NOD小鼠中存在活動的胰島炎。已經(jīng)證明，炎性環(huán)境有利于活化T細胞向Thl7細胞轉(zhuǎn)化，而抑制它們向Treg轉(zhuǎn)化。還已經(jīng)證明，炎癥因子如IL-6或IL-4可抑制Treg轉(zhuǎn)化并促進Treg中Foxp3+表達的喪失(Caretto et al., 2010; Kastner et al., 2010; Koenen et al.，2008)。為了回避這些難題，在更早的年齡(4周)，在明顯的自身反應(yīng)性T細胞和胰島素炎的誘導(dǎo)發(fā)生之前，開始處理NOD小鼠。該研究中還納入了 CTLA-4Ig作為陽性對照，因為Bluestone及其同事(Lenschow et al., 1995)已經(jīng)顯示在這種模型中使用這種作用劑有好處；除了鹽水之外還使用mIgG2a作為額外的陰性對照。與更年長的小鼠中的結(jié)果(圖10A)形成對照的是，在用BsB處理2周的更年幼的NOD小鼠的外周血中Foxp3+Treg的數(shù)目相對于施用鹽水或mlgG的小鼠沒有增加(圖11A)。不拘于特定理論，這可能是由于在4周齡NOD小鼠(相對于早先的研究中使用的9-12周齡的小鼠)自身反應(yīng)性T細胞的數(shù)目非常低。誘導(dǎo)出的抗原特異性Treg的數(shù)目可能過小而不足以表現(xiàn)出高于這些動物中存在的基礎(chǔ)水平。在24周齡之前，與鹽水處理的對照相比`，施用BsB的NOD小鼠中TlD的發(fā)生率顯著更低(圖11B)。但在更晚的時間點，這種有益效果減少。[0180]與有關(guān)施用CTLA-4Ig的NOD小鼠的報道(Salomon et al.，2000) 一致，血液中Treg的水平(圖11A)被顯著壓低，推測這可能是由于CTLA_4Ig對⑶28/B7信號傳導(dǎo)的作用(Tang et al.，2003)。CTLA_4Ig處理還加重了疾病:與鹽水處理和mlgG處理的對照(圖11B)相比，小鼠顯示出更早的疾病發(fā)作(圖11B)和更高的疾病外顯率。這些實驗結(jié)果與Bluestone及其同事(Lenschow et al., 1995)報道結(jié)果的差異的原因不明，但有可能是由于所用的CTLA-4Ig或者采用的給藥方案的差異所致。在本研究中，使用10mg/kg劑量的人CTLA-4Ig(Orencia),而非 Bluestone 及其同事使用的 2.5mg/kg 小鼠 CTLA_4Ig。而且,BsB處理未持續(xù)超過7周。不拘于特定理論，更高劑量的CTLA-4Ig的使用提供了對Treg內(nèi)穩(wěn)態(tài)所需的共刺激信號的更完全的阻斷。
[0181]實施例11
[0182]更長期的BsB處理顯著延遲了 NOD小鼠中自身免疫性糖尿病的發(fā)病并減少了自身免疫性糖尿病的發(fā)生率。
[0183]早前的研究觀察到NOD小鼠中BsB應(yīng)對疾病取得的有益效果有限，其可能的原因包括:采用的療程相對較短，BsB誘導(dǎo)Treg產(chǎn)生的效力有限(EC5(l>100nM)，還有BsB的循環(huán)半壽期短，可能限制了 BsB暴露。鑒于BsB的效力和循環(huán)半壽期是該分子固有的性質(zhì)，因而難以輕易改變，測試了更長的療程。為此目的，當NOD小鼠為4周齡時，用BsB處理10周而非4周。如圖12A所示，用BsB處理10周的NOD小鼠顯示出TlD發(fā)作顯著延遲。重要的是，到35周齡為止，BsB處理的NOD小鼠只有~13%發(fā)生了 T1D，相比之下，在鹽水處理的對照中超過70%。由此可見，用BsB更長時間處理NOD小鼠似乎保護了這些動物免于發(fā)生自身免疫性糖尿病。
[0184]在研究結(jié)束時(當小鼠為35周齡時)，處死小鼠，采集它們的胰腺用于組織病理學分析。將相鄰的系列切片用H&E染色以進行胰島整體評估，用抗胰島素抗體探查所述切片以檢測細胞中胰島素的存在，并用抗CD3和抗Foxp3抗體對所述切片雙染色以定位T細胞和Treg。由于NOD小鼠的 遺傳異質(zhì)性，未處理的動物中有少數(shù)在35周齡時未發(fā)生疾病。對這些非糖尿病動物(來自鹽水處理組的)的胰島的分析顯示β_細胞完整，沒有淋巴細胞浸潤或胰島炎的明顯證據(jù)(圖12Β，小圖a-c)。在這些小鼠的胰島中存在少量FoXp3+Treg細胞(小圖c中的箭頭)。與之相對的是，來自糖尿病NOD小鼠(來自鹽水處理組的)的胰島顯示出侵襲性胰島炎的存在(圖12B，小圖d)和β-細胞的完全破壞(小圖e)。除了⑶3+T細胞和FoXp3+Treg之外，還明顯有大量的非T細胞淋巴細胞(圖12B，小圖f)。對于相應(yīng)的經(jīng)BsB處理的、在研究結(jié)束時保持無疾病或者在研究過程中發(fā)生了 TlD的小鼠，發(fā)現(xiàn)了相似的組織病理學結(jié)果。有趣的是，在~50%的經(jīng)BsB處理而保持無糖尿病的NOD小鼠的胰島中發(fā)現(xiàn)了胰島周圍炎的證據(jù)(圖12B，小圖g);然而，β-細胞得到完好保持(圖12Β，小圖h)?？贵w染色提示，這些胰島周圍的細胞主要包含⑶3+T細胞和Treg (圖12B，小圖1)。將圖像的一部分放大(圖12B，小圖1中的紅色方框)清楚顯示了許多F0Xp3+Treg的存在(圖12B，小圖j中的黃色箭頭)，其間散布有非Foxp3+但⑶3+的T細胞(圖12B，小圖j中的黑色箭頭)，以及非T細胞的單核細胞(藍色細胞核)。在年幼的(4-10周齡)NOD小鼠中(Anderson and Bluestone，2005)，以及在經(jīng)過其他有效治療劑處理而延遲或逆轉(zhuǎn)了 NOD小鼠中新發(fā)病 TlD 的更年長小鼠中(Chatenoud et al., 1994; Daniel et al., 2011; Simonet al., 2008; Vergani et al., 2010)已經(jīng)觀察到胰島周圍炎的發(fā)生。因此，用BsB更長期地處理NOD小鼠保護了這些動物免于發(fā)生侵襲性胰島炎和顯性T1D。不拘于特定理論，這至少部分是由胰島抗原特異性的Treg的從頭(并且可能是原位)誘導(dǎo)所介導(dǎo)的。
[0185]使用新的雙特異性融合蛋白(BsB)藉由MHCII交聯(lián)CTLA-4和TCR，高效地誘導(dǎo)了抗原特異性Treg的產(chǎn)生，以及抗炎細胞因子IL-10和TGF-β的產(chǎn)生。先前的研究顯示，Treg對于賦予免疫耐受是關(guān)鍵的，且抗原特異性Treg在自身免疫性疾病的動物模型中更有效。在自身免疫性疾病如TlD的動物模型中進一步對BsB進行了評價。不拘于特定理論，提出這樣的假說，即如果在NOD小鼠中BsB在自身反應(yīng)性T細胞活化的早期促進了抗原特異性Treg的誘導(dǎo),則它能夠通過將正在經(jīng)歷活化的自身反應(yīng)性T細胞轉(zhuǎn)化成Treg而延遲疾病的發(fā)病或者阻止疾病的進展。
[0186]雖然BsB顯示的效力有限(由于其對MHC-1I和TCR的親和力不高)，且循環(huán)半壽期短(這限制了它的暴露)，但對幼齡NOD小鼠(4-6周齡)和年齡更大的NOD小鼠(9_12周齡)進行短期處理，可重復(fù)地延遲了這些NOD小鼠中TlD的發(fā)病。但觀察到的有益效果是有限的，而且不能持續(xù)。用BsB更長期地(10周)處理NOD小鼠(4-13周齡)顯著延遲了疾病發(fā)病，并減少了動物中TlD的發(fā)生率。不拘于特定理論，該有益效果是誘導(dǎo)Treg的從頭生成所帶來的，這些誘導(dǎo)Treg或是局部產(chǎn)生的(例如在胰腺中或在胰腺引流淋巴結(jié)中)，或者是遠位產(chǎn)生后被募集到胰腺的，用來保護胰島免受自身反應(yīng)性T細胞或其他非T細胞的白細胞的破壞。對于用BsB處理后保持無糖尿病的35周齡小鼠的胰腺組織切片的免疫組化染色清楚地表明在胰島的周圍有FoXp3+Treg數(shù)目的增加。直觀上，它們似乎在防止⑶3+T細胞和非T細胞的淋巴細胞進入胰島。在經(jīng)BSB處理后在研究結(jié)束時保持無糖尿病的NOD小鼠的胰島中有~50%觀察到了該現(xiàn)象，但對照組中糖尿病動物的胰島中無一觀察到該現(xiàn)象。在對照組中少數(shù)無糖尿病小鼠的胰島保持沒有淋巴細胞浸潤且無胰島炎。已知由于NOD小鼠的遺傳異質(zhì)性，在如此大小的組中，總是有少數(shù)動物在該時間范圍內(nèi)不會發(fā)生糖尿病。在BsB處理組中其余的~50%的無糖尿病動物中，胰島也沒有淋巴細胞浸潤且無胰島炎。這些小鼠的無病狀態(tài)的可能原因包括BsB處理以及遺傳背景。
[0187]與組織病理學所見一致的是，與未處理的對照相比，在BsB處理的動物(在9-12周齡處理)的血液中檢測到了 FoXp3+Treg數(shù)目的較小但統(tǒng)計學顯著的增加。在更小的年齡(4周齡)開始處理的小鼠中，該增加不明顯。不拘于特定理論，這可能是因為9周齡小鼠中經(jīng)歷活化的自身反應(yīng)性T細胞比4周齡小鼠中更多。4周齡小鼠中自身反應(yīng)性T細胞的低水平可能導(dǎo)致無法檢出對現(xiàn)存的Treg環(huán)境中的誘導(dǎo)Treg之外的誘導(dǎo)Treg。Treg的增加也是瞬時性的。由于在接受抗CD3治療的動物中也觀察到類似的現(xiàn)象(Nishio etal.，2010),可能是誘導(dǎo)的Treg不穩(wěn)定,喪失了 Foxp3的表達。更可能的是，Treg從循環(huán)中被募集到了受影響的靶組織。與之對比的是，用CTLA-4Ig處理的NOD小鼠顯示循環(huán)Treg數(shù)目顯著減少。處理還加重了疾病，表現(xiàn)在疾病發(fā)病加快，且顯示顯性疾病的動物的發(fā)生率更高。與該結(jié)果一致的是，先前報道顯示，Treg內(nèi)穩(wěn)態(tài)牽涉共刺激途徑，且共刺激的缺乏可減少Treg的產(chǎn)生。在NOD小鼠中阻斷或敲除⑶80或⑶86也導(dǎo)致TlD更早發(fā)病(Salomonet al., 2000;Tang et al.，2003)。
[0188]通常在4- 9周齡的NOD小鼠的胰腺中觀察到胰島周圍炎的出現(xiàn)。如果不加控制，繼而發(fā)生侵襲性胰島炎，導(dǎo)致細胞完全破壞，在12-35周齡發(fā)生顯性糖尿病。已用BsB處理10周，并在35周齡進行分析的無糖尿病NOD小鼠的胰腺顯示出胰島周圍炎的進展似乎已被阻止的證據(jù)。未見侵襲性胰島炎或產(chǎn)胰島素的β-細胞被過度破壞的征象。有其他報道描述了在NOD小鼠中類似地延遲或防止疾病的不同治療介入(Shoda et al.，2005)。這里的結(jié)果與Lee et al.(2010)報道的結(jié)果最為類似，后者顯示，與施用含有⑶4+⑶25+Treg的總⑶4+T細胞的雌性N0D/SCID小鼠相比，將致糖尿病性的耗竭了⑶4+⑶25+Treg的CD4+CD25_BDC2.5T細胞轉(zhuǎn)移到雌性N0D/SCID小鼠中加速了侵襲性胰島炎的發(fā)生。侵襲性胰島炎大體上主要是樹突細胞(DC)、而非BDC2.5T本身的浸潤。作者基于其研究推測，Treg通過調(diào)節(jié)(至少部分地調(diào)節(jié))DC響應(yīng)于胰島分泌的趨化因子CCL19和CCL21的趨化性來調(diào)控DC向胰島中的侵襲性。在BsB處理的無糖尿病NOD小鼠的胰腺切片中見到的FoXp3+Treg、CD3+T細胞和非T細胞白細胞的免疫組化染色模式與他們的發(fā)現(xiàn)相一致(圖12B)。不拘于特定理論，NOD小鼠中響應(yīng)于BsB而產(chǎn)生的Treg可能發(fā)揮作用以阻止自身反應(yīng)性T細胞和非T細胞淋巴細胞向胰島中遷移。用BsB進行的更長期處理更為有效，因為該處理生成了更穩(wěn)健、持續(xù)的Treg誘導(dǎo)。該觀點得到了下述事實的支持:在細胞培養(yǎng)物中用BsB連續(xù)刺激誘導(dǎo)的 Treg 延長了 Treg 中 Foxp3+ 的表達(Karman et al., 2012)。
[0189]在自身免疫性疾病或器官移植動物模型中使用新鮮分離的、離體擴增的或體外誘導(dǎo)的Treg進行的細胞療法已經(jīng)顯示，Treg過繼性轉(zhuǎn)移能夠恢復(fù)Treg對效應(yīng)T細胞的平衡，從而控制與這些疾病相關(guān)的高度自身免疫(Allan et al., 2008; Jiang et al., 2006;Rileyet al., 2009; Tang et al.，2012)。但是，使用過繼性轉(zhuǎn)移作為治療策略在臨床應(yīng)用上還面臨若干難題。首先，能夠從人受試者的外周血分離的自體Treg的數(shù)量有限。因此往往需要進行大量的Treg離體擴增，這可能改變Treg的功能性和純度。其次，由于分離的Treg是多克隆的，它們可能對非目標的效應(yīng)T細胞產(chǎn)生泛免疫抑制作用。第三，也是最重要的，Treg的可塑性(plasticity)是不容忽視的挑戰(zhàn)(Bluestone et al., 2009;Zhouet al.，2009a)。已經(jīng)證明，過繼轉(zhuǎn)移的Treg可喪失Foxp3表達并重新分化為Thl7細胞(Koenen et al., 2008)或致病性記憶T細胞(Zhou et al.，2009b),這會提高加重自身免疫或炎癥的風險。因此，能夠在原位以抗原特異性方式誘導(dǎo)Treg生成的治療手段比過繼性Treg細胞療法更為有利。本文中提供的結(jié)果展示了這樣的一種可在小鼠TlD模型的背景下將CTLA-4與MHCII交聯(lián)的作用劑`(BsB)的實用性和有效性。響應(yīng)于BsB處理共同顯示IL-l0.TGF-β和Treg的產(chǎn)生，以及在TlD的NOD小鼠模型中的功效，有可能提供一種新的治療構(gòu)思。相比于其他免疫調(diào)節(jié)劑BsB還提供其他優(yōu)勢，因為其不影響靜息T細胞(restingT cells)或其他淋巴細胞。在我們的所有研究中，外周中的⑶4+T細胞和⑶19+B細胞的數(shù)目和百分比保持不變。不拘于特定理論，該手段能夠有效地延遲或者阻止疾病進展。更強力且具有更有利的藥動學規(guī)律的BsB變體的開發(fā)應(yīng)能驗證這些研究。因此，該構(gòu)思可能也可應(yīng)用于其他免疫介導(dǎo)的疾病的管理。
[0190]除非另有說明，本文中報道的結(jié)果是使用下述方法和材料獲得的。
[0191]動物.雌性野生型C57BL/6 (H_2b)，BALB/c (H_2d)，在C57BL/6遺傳背景下表達對雞卵清蛋白323-339 (0va323_339)特異性的小鼠α -鏈和β -鏈T細胞受體的轉(zhuǎn)基因OT-1I小鼠，以及雌性非肥胖糖尿病(NOD/LtJ)小鼠購自The Jackson Laboratory。動物維持在無病原體設(shè)施中，依照美國衛(wèi)生部頒布的指南(NIHPublication No86_23)和Genzyme的內(nèi)設(shè)動物照看和使用委員會頒布的指南進行研究。
[0192]抗體和試劑.功能級或熒光標記的抗小鼠⑶3(克隆145-2C11)、⑶25、胰島素和Foxp3+抗體購自 eBioscience或BD Biosciences。小鼠 CTLA_4_Fc和人CTLA-4Ig(Orencia)分別購自R&D Systems, Inc.和Bristol-Myers Squibb。小鼠IgG2a同種型對照獲自BioXCell Inc.。CFSE、超低Ig胎牛血清(FBS)、以及其他細胞培養(yǎng)基來自Invitrogen。雞0va323-339 月太獲自 New England Peptide。
[0193]雙特異性融合蛋白BsB的構(gòu)建和產(chǎn)生.如前人所述(Karman et al.，2012)構(gòu)建和表達雙特異性融合蛋白(BsB)，其包含⑶80w88a和LAG-3的胞外域，以及小鼠IgG2a的Fe (CD80wa-LAG-3-Fc, BsB)。
[0194]Biacore測定和單糖組成分析.利用Biacore來比較BsB和mIgG2a的對小鼠新生兒Fe受體(FcRn)的結(jié)合。簡而言之，利用胺化學將~1430RU的小鼠FcRn-HPC4固定化于CM5芯片。每個樣品在PBSP (含0.005%表面活性劑P-20的PBS)，ρΗ6.0中1:2系列稀釋到最終濃度為200-6.25ηΜ，然后一式二份用時3min注射，再用解離緩沖液洗滌3min。用IOmM硼酸鈉和IM NaCl, ρΗ8.5再生表面。根據(jù)Zhou等人描述的規(guī)程(Zhou et al.，2011)分析 BsB 的碳水化合物單糖組成(carbohydrate monosaccharide composition)。
[0195]幼稚T細胞的分離.來自8-12周齡雌性BALB/c或OT-1I小鼠的脾臟和淋巴結(jié)的幼稚T細胞通過磁力分離后續(xù)熒光激活細胞分選來加以純化。細胞首先通過磁力細胞分離(Miltenyi Biotech)進行負選擇，然后作為CD4+CD25_CD62L*CD44ffi細胞加以分選，至純度聞于98%。
[0196]抗原特異性Treg誘導(dǎo)測定.在同種異體MLR環(huán)境中的測定如前人報道(Karmanet al.,2012)那樣實施。對于抗原特異性T細胞活化，在圓底96孔平板中將IO5個幼稚OT-1I T細胞與IO5個經(jīng)輻射的同基因APC (60.5 μ g/ml的0va323_329和I μ g/ml的可溶性抗-CD28(克隆37.51 ，eBioscience)的存在下混合。以飽和濃度100 μ g/ml向培養(yǎng)細胞中加入測試構(gòu)建體、小鼠IgG2a或小鼠CTLA-4Ig。將細胞培養(yǎng)5天以誘導(dǎo)Treg的產(chǎn)生，并通過流式細胞術(shù)分析。收集培養(yǎng)基，使用ELISA試劑盒根據(jù)制造商的說明分析IL-2、IL-1O和TGF-β。為了評估T細胞增殖，用5μΜ CFSE將純化的幼稚OT-1I T細胞在37°C標記5min。然后洗滌它們以去除未結(jié)合的CFSE，并如上所述地將它們用于Treg誘導(dǎo)測定。將細胞培養(yǎng)5天以讓它們分裂，然后通過流式細胞術(shù)分析。為了檢測T細胞中的FoXp3+，如上所述對細胞進行表面標志物染色，然后用Fix/Perm緩沖液(eBioscience)透化,并用綴合有PE-Cy7的抗 Foxp3 抗體(克隆 FJK_16s, eBioscience)染色。
[0197]BsB在小鼠中的藥動學測量.測定了 8周齡C57BL/6小鼠中BsB的藥動學。通過腹膜內(nèi)注射將20mg/kg的BsB施用到小鼠中。在施用后I小時、5小時、24小時、48小時和72小時通過隱靜脈取血收集血液。利用ELISA測定測量每個時間點的BsB水平。簡而言之，將100 μ I溶于PBS的抗小鼠⑶80抗體(I μ g/ml)包被到96孔平板上，并在4°C溫育過夜。用5%胎牛血清將平板封閉lh，然后用PBS洗滌4次。然后向孔中加入100 μ I不同稀釋度的血樣。將平板在輕柔震蕩下室溫溫育2小時，并用PBS洗滌4次。加入生物素化的抗小鼠LAG-3抗體(I μ g/ml)并溫育2小時。用PBS將平板洗滌4次，然后加入鏈親和素-HRP。30min后，用PBS將平板洗滌6次，再對平板顯色以進行比色測量。使用在測定稀釋劑中稀釋到不同濃度的純化BsB作為標準物。
[0198]用BsB處理NOD小鼠.在短期處理中，將4周齡的雌性NOD小鼠用鹽水、20mg/kgBsB、20mg/kg小鼠IgG2a、或10mg/kg人CTLA_4Ig(Orencia)通過腹膜內(nèi)注射每周處理3次，歷時2.5周。對于晚期預(yù)防模型，將9-12周齡NOD小鼠用鹽水或20mg/kg BsB如上所述地處理4周。對于更長期的處理，將NOD小鼠從4周齡到13周齡用BsB或鹽水如上所述地處理10周。從8周齡開始每周監(jiān)測非空腹血液葡萄糖水平。當小鼠的葡萄糖讀數(shù)連續(xù)3次讀數(shù)均高于300mg/dL時則認為小鼠有糖尿病。在處理2周之后通過流式細胞術(shù)檢查外周血中的Foxp3+Treg。簡而言之，將50 μ I全血用未標記的抗-Fe Y RIIb和FcgRIII (克隆93, eBioscience)封閉20min。然后用突光標記的抗⑶4抗體將細胞染色30min,然后洗漆。使用FACS裂解溶液(BD Biosciences)裂解紅細胞5min。洗滌之后，將細胞固定、透化，并用FITC標記的抗-Foxp3抗體如上所述地染色30min。將胰腺切為兩半，一半在中性緩沖液福爾馬林中固定，另一半置于OCT化合物上然后在干冰上冷凍。
[0199]統(tǒng)計學分析.利用Prism5 (Graphpad, city and state)中的秩和(Cox-Mantel)檢驗比較用BsB或?qū)φ仗幚碇蟊憩F(xiàn)TlD和高血糖的NOD小鼠的累積發(fā)生率。認為p〈0.05是統(tǒng)計學顯著的。
[0200]組織病理學分析.對于中性緩沖液福爾馬林固定的胰腺，使用自動化處理器進行⑶3、Foxp3+細胞染色。組織切片用二甲苯-乙醇脫蠟，在檸檬酸緩沖液中溫育25min修復(fù)抗原，然后用血清封閉。將玻片與抗-CD3抗體溫育45min，然后與山羊抗兔辣根過氧化物酶聚合物溫育20min。通過與3，3’ - 二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸溫育2_4min獲得⑶3的生色團可視化。為了監(jiān)測Foxp3+,用血清再次封閉切片，然后暴露于抗-Foxp3抗體45min。然后將玻片與兔抗大鼠IgG抗體溫育30min，然后與山羊抗兔堿性磷酸酶聚合物溫育。用FastRedlOmin實現(xiàn)生色團可視化。組織切片用蘇木精復(fù)染2min,在步驟之間用0.05%Tween_20/Tris緩沖鹽水洗滌3次。用抗胰島素抗體如上所述地對鄰近的系列切片染色。使用附帶有Diagnostic Inc.產(chǎn)的數(shù)字照相機的Nikon Eclipse E800突光顯微鏡拍照，并使用SpotAdvanced軟件捕捉圖像。
[0201]序列
[0202]圖例
[0203]CD80w88a=CTLA_4 配體
[0204]IgG2a=IgG2Fc 區(qū)
[0205]G9=Gly9
[0206]Lag-3=MHC 配體
[0207]H6=His6
[0208]SEQ ID N0.1:
[0209]CTLA-4BsB (基因 I)=小鼠 CD80w88a (aal-235) _IgG2a (aa241_474) _G9_Lag-3 (aa25-260)-H6
[0210]小鼠替身構(gòu)建體(基因I)的核苷酸序列:
[0211 ] ATGGCTTGCAATTGTCAGTTGATGCAGGATACACCACTCCTCAAGTTTC
[0212]CATGTCCAAGGCTCATTCTTCTCTTTGTGCTGCTGATTCGTCTTTCACAA
[0213]GTGTCTTCAGATGTTGATGAACAACTGTCCAAGTCAGTGAAAGATAAG
[0214]GTATTGCTGCCTTGCCGTTACAACTCTCCTCATGAAGATGAGTCTGAAG [0215]ACCGAATCTACTGGCAAAAACATGACAAAGTGGTGCTGTCTGTCATTG
[0216]CTGGGAAACTAAAAGTGGCGCCCGAGTATAAGAACCGGACTTTATATG
【權(quán)利要求】
1.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項的包含對CTLA-4特異性的配體和對pMHC復(fù)合物特異性的配體的雙特異性生物制品用于耐受化T細胞的用途，所述耐受化是通過使所述T細胞與抗原呈遞細胞及所述雙特異性生物制品接觸而進行的，所述抗原呈遞細胞呈遞有與MHC分子復(fù)合的衍生自所述抗原的肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項的包含對CTLA-4特異性的配體和對pMHC復(fù)合物特異性的配體的雙特異性生物制品在治療選自自身免疫性疾病和移植排斥的疾病中的用途。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中所述自身免疫性疾病是I型糖尿病(TlD)。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的用途，其中所述對CTLA-4特異性的配體選自對CTLA-4 特異性的抗體，以及 CD80 (B7-1)或 CD86 (B7-2)。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的用途，其中所述對pMHC復(fù)合物特異性的配體選自抗MHC抗體和LAG-3。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的用途，其中所述對CTLA-4特異性的配體和對pMHC復(fù)合物特異性的配體被接頭分隔開來。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中所述接頭是聚氨基酸序列和抗體Fe域中的一種或多種。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的用途，其中所述聚氨基酸序列是G9(Gly-9)。
9.根據(jù)權(quán)利要求4的用途，其中所述對CTLA-4特異性的配體是⑶80。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的用途，其中CD80被突變而增加了對CTLA-4的特異性。`
11.根據(jù)權(quán)利要求10的用途，其中⑶80是包含下述突變中的至少一個的人⑶80:W84A, K71G, K71V, S109G, R123S, R123D, G124L, S190A, S201A, R63A, M81A, N97A 和 E196A。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的用途，其中⑶80包含人⑶80的突變W84A或E196A。
13.根據(jù)權(quán)利要求5的用途，其中所述對MHC復(fù)合物特異性的配體是LAG-3。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的用途，其中LAG-3被突變而增加了對pMHCII的特異性。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的用途，其中LAG-3是包含下述突變中的至少一個的人LAG-3:R73E, R75A, R75E 和 R76E。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的用途，其中LAG-3包含突變R75A或R75E。
17.一種雙特異性生物制品，其包含對CTLA-4特異性的配體和對pMHC復(fù)合物特異性的配體。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的雙特異性生物制品，其中所述對CTLA-4特異性的配體選自對CTLA-4 特異性的抗體，以及 CD80 (B7-1)或 CD86 (B7-2)。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或權(quán)利要求18的雙特異性生物制品，其中所述對pMHC復(fù)合物特異性的配體選自抗MHC抗體和LAG-3。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的的雙特異性生物制品，其中所述對CTLA-4特異性的配體和對pMHC復(fù)合物特異性的配體被接頭分隔開來。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的雙特異性生物制品，其中所述接頭是聚氨基酸序列和抗體Fe域中的一種或多種。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的雙特異性生物制品，其中所述聚氨基酸序列是G9(Gly-9)。
23.根據(jù)權(quán)利要求18的雙特異性生物制品，其中所述對CTLA-4特異性的配體是CD80。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的雙特異性生物制品，其中CD80被突變而增加了對CTLA-4的特異性。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的雙特異性生物制品，其中⑶80是包含下述突變中的至少一個的人 CD80:W84A, K71G, K71V, S109G, R123S, R123D, G124L, S190A, S201A, R63A, M81A, N97A 和E196A。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的雙特異性生物制品，其中⑶80包含人⑶80的突變W84A或E196A。
27.根據(jù)權(quán)利要求19的雙特異性生物制品，其中對MHC復(fù)合物特異性的配體是LAG-3。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的雙特異性生物制品，其中LAG-3被突變而增加了對pMHCII的特異性。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的雙特異性生物制品，其中LAG-3是包含下述突變中的至少一個的人 LAG-3:R73E, R75A, R75E 和 R76E。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的雙特異性生物制品，其中LAG-3包含突變R75A或R75E。
31.一種使T細胞對抗原耐受化的方法，包括使所述T細胞與抗原呈遞細胞及根據(jù)權(quán)利要求17-30中任一項的雙特異性生物制品接觸，所述抗原呈遞細胞呈遞有與MHC分子復(fù)合的衍生自所述抗原的肽。
32.—種治療患有選自自身免疫性疾病或移植排斥的病況的受試者的方法，包括對有此需要的受試者施用根據(jù)權(quán)利要求17-30中任一項的包含對CTLA-4特異性的配體以及對pMHC復(fù)合物特異性的配體的雙特異性生物制品的步驟。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述雙特異性生物制品與其他免疫抑制劑或調(diào)節(jié)劑組合施用。
34.根據(jù)權(quán)利要求32或權(quán)利要求33的方法，其中所述自身免疫性疾病選自:1型糖尿病(TlD)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、炎性腸病(IBD)、潰瘍性結(jié)腸炎(UC)、克羅恩病(CD)、多發(fā)性硬化(MS)、硬皮病、尋常型天皰瘡(PV)、銀屑病、特應(yīng)性皮炎、乳糜瀉、慢性阻塞性肺病、橋本氏甲狀腺炎、格雷夫斯病(甲狀腺)、舍格倫綜合征、格林-巴利綜合征、古德帕斯徹綜合征、阿狄森氏病、韋格納肉芽腫、原發(fā)性膽汁性硬化、硬化性膽管炎、自身免疫性肝炎、風濕性多肌痛、雷諾氏現(xiàn)象、顳動脈炎、巨細胞動脈炎、自身免疫性溶血性貧血、惡性貧血、結(jié)節(jié)性多動脈炎、貝切特氏病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、葡萄膜炎、心肌炎、風濕熱、強直性脊柱炎、腎 小球性腎炎、結(jié)節(jié)病、皮肌炎、重癥肌無力、多肌炎、斑禿、和白癜風。
【文檔編號】A61K39/395GK103796681SQ201280042085
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年6月29日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月30日
【發(fā)明者】朱云翔, J.卡曼, R.韋, C.蔣, S.程 申請人:建新公司