專利名稱：細胞粘連抑制劑的制作方法
許多細胞-細胞和細胞-細胞外基質(zhì)的相互作用是由蛋白配體(如纖連蛋白、玻連蛋白和VCAM-1)和它們的整聯(lián)蛋白受體[如VLA-4(α4β1]介導(dǎo)的。最新研究表明這些相互作用在許多生理(如胚的形成和傷口的愈合)和病理(如腫瘤細胞的侵入和轉(zhuǎn)移、炎癥、動脈粥樣硬化癥和自身免疫性疾病)狀態(tài)中起重要的作用。可以選擇性抑制部分此相互作用的藥物預(yù)計可用于治療某些疾病。
整聯(lián)蛋白為異源二聚體的細胞表面受體，它們含有非共價結(jié)合的α和β亞單位。應(yīng)用分子生物學和蛋白化學技術(shù)已經(jīng)鑒定了數(shù)種α和β亞單位。根據(jù)β亞單位可以將整聯(lián)蛋白家族再分為多個種類，它們可以與一個或多個α亞單位結(jié)合。最廣泛分布的整聯(lián)蛋白屬于β1類，也稱為非常后期抗原(VLA)。整聯(lián)蛋白的第二類為白細胞特異性受體，含有與β2蛋白復(fù)合的三個α亞單位(αL、αM或αX)中的一個。細胞粘連物(cytoadhesins)αⅡbβ3和αvβ3組成第三類整聯(lián)蛋白。第四類整聯(lián)蛋白包括α4β7。
多種的蛋白起著整聯(lián)蛋白受體配體的作用。一般而言，可以由整聯(lián)蛋白識別的蛋白歸為以下三類中的一種細胞外基質(zhì)蛋白、血漿蛋白和細胞表面分子。細胞外基質(zhì)蛋白，如膠原蛋白、纖連蛋白、纖維蛋白原、層粘連蛋白、血小板反應(yīng)蛋白和玻連蛋白可以與許多整聯(lián)蛋白結(jié)合。許多此類粘連蛋白也可以在血漿中循環(huán)并與活化的血細胞結(jié)合。血漿中整聯(lián)蛋白配體的其它成分包括纖維蛋白原和X因子。細胞結(jié)合的補體C3bi和數(shù)種跨膜蛋白，例如Ig-樣的細胞粘連分子(ICAM-1,2,3)和血管細胞粘連分子(VCAM-1)(Ig超家族的成員)也起著某些整聯(lián)蛋白細胞表面配體的作用。粘膜地址素細胞粘連分子-1(MAdCAM-1)為Ig超家族的另一個成員并被整聯(lián)蛋白α4β7結(jié)合。
已經(jīng)鑒定了多種整聯(lián)蛋白的靶氨基酸序列。例如在α5β1、αⅡβ3和αv5β3中靶序列為Arg-Gly-Asp三肽,在蛋白如纖連蛋白、纖維蛋白原、血小板反應(yīng)蛋白、1型膠原蛋白、玻連蛋白和vWF中發(fā)現(xiàn)。然而，Arg-Gly-Asp序列不是唯一的可以被粘連配體用作整聯(lián)蛋白的識別基元。另一整聯(lián)蛋白α4β1與纖連蛋白的可變區(qū)(CS1)是通過序列Leu-Asp-Val結(jié)合，血小板整聯(lián)蛋白αⅡbβ3也可以識別纖維蛋白原γ鏈的羧基-末端的序列His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gla-Ala-Gly-Asp-Val。
本發(fā)明主要涉及可以阻斷配體VCAM-1與其整聯(lián)蛋白受體VLA-4(α4β1)的相互作用的藥物[見對VLA-4的綜述整聯(lián)蛋白VLA-4的結(jié)構(gòu)和其細胞-細胞以及細胞基質(zhì)粘連功能，M.E.Hemler,M.J.Elices,C.Parker和Y.Takada,(Immunological Reviews),114(1990)45-65.]。整聯(lián)蛋白α4β1表達于許多造血細胞和已確立的細胞系中，包括造血前體、外周和細胞毒素T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核細胞、胸腺細胞和嗜酸性細胞。不同于僅僅涉及細胞-細胞外基質(zhì)相互作用的其它的β1整聯(lián)蛋白，α4β1可以介導(dǎo)細胞-細胞以及細胞-細胞外基質(zhì)的相互作用。表達活化的α4β1的細胞可以與纖連蛋白的羧基末端細胞結(jié)合區(qū)域結(jié)合(非Arg-Gly-Asp介導(dǎo)的)，可以與內(nèi)皮細胞表達的VCAM-1結(jié)合，可以相互結(jié)合以促進同型凝集。內(nèi)皮細胞的VCAM-1的表達可以受促炎細胞因子例如INF-γ、TNF-α和IL-1β的正調(diào)節(jié)。
本發(fā)明也涉及阻斷配體MAdCAM-1和整聯(lián)蛋白α4β7相互作用的藥物。
α4β1-介導(dǎo)的細胞粘連的調(diào)節(jié)在多種生理過程中起著重要的作用，包括T-細胞增殖、B-細胞在生發(fā)中心的定位以及活化的T細胞和嗜酸性細胞與內(nèi)皮細胞的粘連。此外，整聯(lián)蛋白α4β1-介導(dǎo)的過程與腫瘤細胞轉(zhuǎn)移和涉及淋巴細胞、單核細胞或嗜酸性細胞募集的疾病有關(guān)，如多發(fā)性硬化癥、類風濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、牛皮癬、胰島素依賴性糖尿病、腎小球性腎炎、炎癥性腸疾病、缺血性心臟病、心肌炎、外周血管疾病、移植排斥反應(yīng)如慢性同種移植排斥反應(yīng)和過敏性疾病。在上述疾病過程中涉及VLA-4/VCAM-1相互作用的證據(jù)已經(jīng)通過對下列的調(diào)查研究積累起來在各種體外和體內(nèi)炎癥的試驗?zāi)Ｐ?如小鼠接觸性皮膚過敏性反應(yīng))、試驗性自身免疫性腦脊髓炎、肺抗原激發(fā)、糖尿病、潰瘍性結(jié)腸炎、腎炎和同種移植排斥反應(yīng)中對VLA-4或VCAM-1特異性的肽CS-1和抗體的作用。此外，整聯(lián)蛋白α4β7-介導(dǎo)的過程與疾病例如炎癥性腸疾病和胰島素依賴性糖尿病的淋巴細胞的募集有關(guān)。
例如，在關(guān)節(jié)炎(通過單一腹膜內(nèi)注射得自A組鏈球菌細胞壁的肽聚糖-多糖片段在同系繁殖的雌性Lewis大鼠中誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎)試驗?zāi)Ｐ椭校o關(guān)節(jié)炎發(fā)病的動物在關(guān)節(jié)炎開始時(第0-4天，300μg/天)時或在第11-16天靜脈給予CS-1，表明可以抑制急性和慢性炎癥[參見通過干擾白細胞粘連和募集合成纖連蛋白肽抑制大鼠關(guān)節(jié)炎，S.M.Wahl,J.B.Allen,K.L.Hines,T.Imamichi,A.M.Wahl,L.T.Furcht和J.B.McCarthy,J.Clin.Invest.,94(1994)655-662]。
在另一個炎癥模型(噁唑酮(ozazalone)或2,4-二硝基氟代苯-敏感小鼠的接觸過敏反應(yīng))，靜脈給予抗-α-4特異性單克隆抗體R1-2或PS/2(在激發(fā)前4-6小時)可以顯著抑制(在耳腫脹反應(yīng)中減少50-60％)輸出反應(yīng)[參見對整聯(lián)蛋白α-4亞單位的單克隆抗體抑制鼠的接觸性過敏反應(yīng)，P.L.Chisholm,C.A.Williams和R.R.Lobb,Eur.J.Immunol.,23(1993)682-688]。在腸炎癥模型(在Cotton-top tamarin中的急性結(jié)腸炎)中，與VLA-4結(jié)合的抗-α4整聯(lián)蛋白單克隆抗體HP1/2導(dǎo)致急性結(jié)腸炎的顯著的減弱。相反，在Cotton-top tamarin中的10天治療階段后，兩種抗-E-選擇蛋白單克隆抗體(BB11和EH8)微微減弱結(jié)腸炎[參見在Cotton-top tamarin中由抗-α4整聯(lián)蛋白單克隆抗體的結(jié)腸炎減弱作用，D.K.Podolsky,R.Lobb,N.King,C.D.Benjamin,B.Pepinsky,P Sehgal和M.deBeaumont,J.Clin.Invest.,92(1993)372-380]。
已經(jīng)證明所述抗體對于自身免疫性腦脊髓炎(EAE)模型也有效。EAE為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥性疾病，與多發(fā)性硬化癥相似。在該模型中，實驗性誘導(dǎo)炎癥。在EAE和多發(fā)性硬化癥中，循環(huán)的白細胞可以穿過血-腦屏障并破壞髓鞘質(zhì)，從而導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)損傷和麻痹。通過啟動動物的CNS蛋白樣髓鞘質(zhì)堿性蛋白(MBP)可以活性地誘導(dǎo)EAE或通過注射對這些CNS抗原特異性的活化的淋巴細胞進行EAE的誘導(dǎo)。當給輻射的雌性(PL/J x SJL)F1小鼠注射時，各種單克隆抗體，MK/1(抗VCAM-1)和PS/2和LPAM-1(抗α4整聯(lián)蛋白)延緩疾病的發(fā)病。當在疾病發(fā)病后，繼續(xù)每3天注射α4整聯(lián)蛋白抗體(即LPAM-1和PS/2)時，不僅可以延緩疾病的發(fā)病，而且疾病的嚴重程度也可以顯著降低[參見Surface Expression of α4 Integrin by CD4 T Cells IsRequired for Their Entry into Brain Parenchyma,J.L.Baron,J.A.Madri,N.H.Ruddle,J.Hashim和C.A.Janeway,Jr.,J.Exp.Med.,177(1993)57-68]。
也已經(jīng)證明VCAM-1(M/K-1)和VLA-4(PS-2)的單克隆抗體在試驗性哮喘模型(抗原誘導(dǎo)的嗜酸性細胞和T-細胞募集)中有活性。當在吸入的卵白蛋白激發(fā)前24小時腹膜內(nèi)注射這兩種抗體時，它們可以顯著降低(73-74％)小鼠嗜酸性細胞的透過[參見Role of vascular celladhesion molecule-1/verv late activation antigen 4 and intracellularadhesion molecule 1/lymphocyte function-associated antigen linteractions in antigen-induced eosinophil and T-recruitment into thetissue,H.Nakajima,H.Sano,T.Nishimura,S.Yoshida and I.Iwamoto,JExp.Med.,179(1994)1145-1154]。當在卵白蛋白激發(fā)前注射抗VLA-4單克隆抗體HP1/2(3-10mg/kg)時，在豚鼠中獲得了相似的結(jié)果[參見Antibody to very late activation antigen 4 prevent antigen-inducedbronchial hyperreactivity and cellular infiltration in the guinea-pegairways,M.Pretolani,C.Ruffie,J-R Lapa e Silva,D.Joseph,R.R.Lobb和B.B.Vargafrig,J.Exp.Med.,180(1994),795-805和Role of the VLA-4 intergrin inleukocyte recruitment and bronchial hyperresponsiveness inthe guinea-pig,A.A.Y.Milne和P.J.Piper,European J Pharmacol.,282(1995),243-249]。
證明對α4-整聯(lián)蛋白(LPAM-1)和其配體之一VCAM-1特異性的抗體對于治療非過度肥胖性糖尿病小鼠的胰島素依賴性糖尿病也有效。認為胰島素依賴性糖尿病為自身免疫性疾病，其中活化的T淋巴細胞破壞胰島中產(chǎn)生胰島素的β-細胞?？贵wR1-2可以阻止非過度肥胖糖尿病小鼠劑量依賴性的胰島炎的出現(xiàn)。對于疾病的阻斷伴隨著胰島的淋巴細胞透過的顯著降低[參見The Pathogenesis of Adoptive MurineAutoimmune Diabetes Requires an Interaction Betweenα4-Integrins andVascular Cell Adhesion Molecule-1,J.L.Baron,E-P.Reich,I.Visintin和C.A.Janeway,Jr.,J.Clin.Invest.,93(1994)1700-1708]。
已經(jīng)證明表達整聯(lián)蛋白α4β1的細胞與肝素Ⅱ結(jié)合區(qū)域的序列結(jié)合并選擇性地剪接位于纖連蛋白的羧基末端細胞結(jié)合區(qū)域的Ⅲ型連接片段(ⅢCS)。在ⅢCS區(qū)域，α4β1與定義為CS-1的肽序列(一個25個氨基酸的肽)具有很高的結(jié)合力結(jié)合，表明這是纖連蛋白α4β1相互作用的主要位點。三肽Leu-Asp-Val是CS-1中能夠支持造血細胞粘連或能夠抑制α4β1-介導(dǎo)的細胞與纖連蛋白結(jié)合的最小序列[參見CS1:The Minimal Essential Sequence for a Major Cell Type-SpecificAdhesion Site(CS1)Within the Altematively Spliced TypeⅢConnecting Segment Domain of Fibronectin is Leucine-Aspartic Acid-Valine,A.Komoriya,L.J.Green,M.Mervic,S.S.Yamada,K.M.Yamada和M.J.Humphries,J.Biol.Chem.,23(1991)15075-15079；Activation-Dependent Recognition by Hematopoietic Cells of the LDVSequence in the V Region of Fibronectin,E.A.Wayner和N.L.Kovach,J.Cell Biol.,116(1992)489-497.]。
除含有Leu-Asp-Val的上述序列外，已經(jīng)報道環(huán)八肽1-金剛烷乙?；?Cys-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys(含有兩個半胱氨酸殘基間的二硫橋)在阻斷Jurkat細胞與CS-1包被板的粘連中與含有肽Cys-Leu-His-Gly-Pro-Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr的LDV同樣有效(IC5030μM)。所述環(huán)肽也可以抑制Jurkat細胞與纖連蛋白包被板的結(jié)合。除抑制α4β1-誘導(dǎo)的粘連外，所述八肽也可以抑制αvβ3功能以及αⅡbβⅢa-依賴性測定。因此，所述八肽對α4β1介導(dǎo)的粘連沒有選擇性[參見Cyclic RGD Peptide Inhibitsα4β1 Interaction with ConnectingFragment l and Vascular Cell Adhesion Molecule,P.M.Cardarelli,R.R.Cobb,D.M.Nowlin,W.Scholz,F.Gorcsan,M.Moscinski,M.Yasuhara,S-L.Chiang和T.J.Lobl,J.Biol.Chem.,269(1994)18668-18673]。
也已經(jīng)報導(dǎo)非常少的幾個非肽類化合物[參見Non-peptidicSurrogates of the Leu-Asp-Val Sequence and Their Use in the Treatmentof Inflammation,Autoimmune Diseases and Tumour progression,YEDAResearch and Development Co.Ltd,WO94/02445,1994年2月3日公開]可以抑制α4β1-誘導(dǎo)的粘連。
此外，在WO96/00581(1996年1月11日公開)中報道部分含有Leu-Asp-Val序列和至少一個Cys氨基酸殘基和/或Glu氨基酸殘基的環(huán)肽可以抑制α4β1整聯(lián)蛋白與VCAM-1或纖連蛋白的結(jié)合。然而，在該專利申請中公開的環(huán)肽中的三個(即c(Glu-Trp-Leu-Asp-Val)、c(Glu-Trp-Leu-Asp-Val-Asp)和c(Glu-Trp-Leu-Asp-Val-Pro-Glu-Trp-Leu-Asp-Val)，其中c代表所述氨基酸序列為環(huán)狀的)證明為HL-60細胞與VCAM-1-IgG融合蛋白結(jié)合的非常弱的抑制劑(IC50值分別為94、＞1000和＞1000μM)(參見P.Vanderslice,K.Ren,J.K.Revelle,D.C.Kim,D.Scott,R.J.Bjercke,E.T.H.Yeh,P.J.Beck和T.P.Kogan,J.Immunology,158(1997),1710-1718]。
也已經(jīng)報道二硫環(huán)五肽Arg-Cys-Asp-硫代脯氨酸-Cys(硫代脯氨酸=噻唑烷-4-羧酸)為白細胞與纖連蛋白粘連的抑制劑。此外，該環(huán)肽也可以抑制與纖連蛋白的120kDa的胰凝乳蛋白酶(chymotryptic)片段的結(jié)合，胰凝乳蛋白酶含有Arg-Gly-Asp中心細胞結(jié)合區(qū)域。同樣，該肽對于α4β1和α5β1結(jié)合沒有選擇性[參見A Novel CyclicPentapeptide Inhibitsα4β1和α5β1 Intergrin-Mediated Cell Adhesion,D.M.Nowlin,F.Gorcsan,M.Moscinski,S-L.Chiang,T.J.Lobl和P.M.Cardarelli,J.Biol.Chem.,268(1993)20352-20359]。
在我們共同未決的PCT申請WO96/20216(1996年7月4日公開)中報道了抑制α4β1整聯(lián)蛋白與VCAM-1或纖連蛋白結(jié)合的含有Leu-Asp-Val序列的環(huán)肽。
盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種抑制VCAM-1和纖連蛋白與整聯(lián)蛋白VLA4相互作用的肽，但是仍然需要可抑制該種相互作用的替代化合物，特別是可以制成緩釋藥用組合物的化合物。也需要可抑制MAdCAM-1與整聯(lián)蛋白α4β7相互作用的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面提供具有下式的環(huán)肽或其鹽
其中Xaa1可從選自Phe、Lys和Arg的L-氨基酸；選自Phe和Met的D-氨基酸，所述L-和D-氨基酸任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；和MeIle中選擇；Xaa2為Leu，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；Xaa3為Asp，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；Xaa4為Val，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；X1可從選自Ala、Phe、Arg、Lys、Trp、hArg(Et)2、Orn(CHMe2)、Orn(Me2)、Lys(CHMe2)和Arg(Pmc)的D-氨基酸，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；
NH(CH2)5CO和NH(CH2)2S(CH2)yCO，其中y為1或2中選擇；X2可從選自Ala、Arg、Lys、His、hArg(Et)2、Orn(CHMe2)和Orn(Me2)的D-氨基酸，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；NH(CH2)2SCH2CO和NH(CH2)xCO，其中x為2或3中選擇；Xaa5和Xaa6各自獨立為選自Ala和Arg的D-氨基酸，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；p為0或1；q為0或當p為1時，q為0或1；其前提為當Xaa1為MeIle,Xaa2為Leu,Xaa3為Asp,Xaa4為Val,p和q均為0，ⅰ)當X1為D-Ala時，X2不為D-Ala、D-Arg或D-Lys；ⅱ)當X1為
時，X2不為D-Arg；ⅲ)當X1為D-Arg時，X2不為D-Ala、D-Arg或D-His；ⅳ)當X1為D-Orn(CHMe2)或D-Arg(Pmc)時，X2不為D-Ala；ⅴ)當X1為D-Lys時，X2不為D-Ala或D-Lys；ⅵ)當X1為D-Phe或D-Trp時，X2不為D-Lys或D-Arg。
優(yōu)選所述環(huán)肽在此后所述MOL T-4細胞-纖連蛋白測定中，具有IC50小于10μM，更優(yōu)選小于5μM，或者在此后所述的MOL T-4細胞/重組可溶性VCAM-1測定中，具有IC50小于30μM，更優(yōu)選小于5μM。
所述環(huán)肽在此后所述的JY細胞/MAdCAM-1粘連測定中也具有活性。
可以理解除特別指明外，氨基酸具有L-構(gòu)型，所有的殘基成分即Xaa1至Xaa6、形成所述環(huán)肽的X1和X2是沿氨基(N-末端)至羧基(C-末端)方向由左向右書寫的。所述殘基成分連接在一起使一個殘基的羧基末端與相鄰殘基的氨基末端相連。在天然存在的氨基酸具有一個以上的羧基和/或氨基的情況下，連接分別通過α-羧基和α-氨基完成。D-hArg(Et)2、D-Orn(CHMe2)、D-Orn(Me2)、D-Lys(CHMe2)和D-Arg(Pmc)殘基的連接此后根據(jù)符號進行定義。在環(huán)肽中天然存在的氨基酸殘基一般以三個字母代碼來定義，Ala代表丙氨酸，His代表組氨酸，Ile代表異亮氨酸，Lys代表賴氨酸，Arg代表精氨酸，Val代表纈氨酸，Asp代表天冬氨酸，Met代表甲硫氨酸，Phe代表苯丙氨酸，Leu代表亮氨酸和Trp代表色氨酸。MePhe和MeIle分別指N-甲基苯丙氨酸和N-甲基異亮氨酸。D-hArg(Et)2、D-Orn(CHMe2)、D-Orn(Me2)、D-Lys(CHMe2)和D-Arg(Pmc)在此后的所述符號中定義。
可以理解一般性術(shù)語例如“烷基”包括直鏈和支鏈的變異體。本發(fā)明的化合物包括溶劑化物例如水化物，并包括前體藥物例如在體內(nèi)可以水解的酯。
優(yōu)選Xaa1包括L-MeIle、L-MePhe、L-Lys、L-Arg、D-Phe和D-Met。優(yōu)選的Xaa2、Xaa3和Xaa4分別為Leu、Asp和Val。X1優(yōu)選可從選自Ala、Phe、Arg、Lys、Trp、hArg(Et)2、Orn(CHMe2)、Orn(Me2)、Lys(CHMe2)和Arg(Pmc)的D-氨基酸；和
NH(CH2)5CO和NH(CH2)2S(CH2)yCO，其中y為1或2中選擇。X2優(yōu)選可從選自Ala、Arg、Lys、His、hArg(Et)2、Orn(CHMe2)和Orn(Me2)的D-氨基酸；NH(CH2)2SCH2CO和NH(CH2)xCO，其中x為2或3中選擇；Xaa5和Xaa6優(yōu)選各自獨立為D-Ala或D-Arg。
其中X1、X2、(Xaa5)p和(Xaa6)q中的任何兩個為D-Arg的環(huán)肽或其鹽代表本發(fā)明特別優(yōu)選的方面。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，環(huán)肽或其鹽具有下式
其中Xaa1可從選自Phe、Lys和Arg的L-氨基酸；選自Phe和Met的D-氨基酸，所述L-和D-氨基酸任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；和MeIle中選擇；最優(yōu)選為MePhe；Xaa2為Leu，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；Xaa3為Asp，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；Xaa4為Val，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；X1可從選自Ala、Phe、Arg、Lys、Trp的D-氨基酸，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基、hArg(Et)2、Orn(CHMe2)、Orn(Me2)、Lys(CHMe2)和Arg(Pmc)取代；和
NH(CH2)5CO和NH(CH2)2S(CH2)yCO，其中y為1或2中選擇；X2可從選自Ala、Arg、Lys、His的D-氨基酸，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基、hArg(Et)2、Orn(CHMe2)和Orn(Me2)取代；NH(CH2)2SCH2CO和NH(CH2)xCO，其中x為2或3中選擇；Xaa5和Xaa6各自獨立為選自Ala和Arg的D-氨基酸，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；p為0或1；q為0或當p為1時，q為0或1；其前提為當p和q均為0時，Xaa1不為MeIle。在這樣的環(huán)肽中，當Xaa1為MeIle時，p為1和q為0或1。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，環(huán)肽或其鹽具有下式
其中Xaa1為選自MePhe和MeIle的L-氨基酸；Xaa2為Leu，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；Xaa3為Asp，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；Xaa4為Val，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；X1可從選自Ala和Arg的D-氨基酸，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；
和NH(CH2)2S(CH2)yCO，其中y為1或2中選擇；X2可從選自Ala和Arg的D-氨基酸，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；和NH(CH2)xCO，其中x為2或3中選擇；Xaa5和Xaa6各自獨立為選自Ala和Arg的D-氨基酸，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；p為l；q為0或l。
根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的環(huán)肽為具有此后表2中化合物1-38任一結(jié)構(gòu)的環(huán)肽或其鹽。結(jié)構(gòu)1-38的任一氨基酸任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基(特別是甲基)取代。優(yōu)選的環(huán)肽為化合物8、20-23、25-32、37和38中任何一個。更優(yōu)選的環(huán)肽為化合物20、21、27和31中任何一個。
本發(fā)明的環(huán)肽具有至少下列的一個優(yōu)點在我們的試驗中它們比已知的化合物如CS-1(25個氨基酸的肽)更有效；它們比CS-1更小，因此更易合成，為環(huán)狀對酶降解更穩(wěn)定；它們與緩釋藥用組合物是相容的。
優(yōu)選的化合物在多種小鼠體內(nèi)篩選中具有活性，例如在噁唑酮誘導(dǎo)的皮膚的延緩型過敏反應(yīng)(接觸過敏，CHS)或由卵白蛋白誘導(dǎo)的爪墊過敏(延緩型過敏，DTH)、膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、抗原誘導(dǎo)的細支氣管(bronchiolar)灌洗嗜酸性細胞和試驗性過敏性腦脊髓炎中。例如，在DTH中產(chǎn)生半數(shù)-最大抑制反應(yīng)所需的CS-1的劑量為1mg/kg/天，而化合物20僅為0.01mg/kg/天。在有效劑量下沒有觀察到本發(fā)明的化合物的毒性作用。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供含有本發(fā)明的環(huán)肽以及藥學上可接受的稀釋劑或載體的藥用組合物。本發(fā)明也提供藥用組合物，它包含根據(jù)本發(fā)明的環(huán)肽的藥學上可接受的鹽以及藥學上可接受的稀釋劑或載體。
藥學上可接受的鹽包括例如，對于具有足夠堿性的環(huán)肽如那些具有游離的胍基像精氨酸的環(huán)肽而言，與形成生理上可接受的陰離子酸的鹽，例如與無機酸像鹵氫酸如鹽酸、氫溴酸、磺酸和膦酸形成的鹽；與有機酸特別是乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸、對-甲苯磺酸、甲磺酸等形成的鹽。對于具有足夠酸性的環(huán)肽，例如那些具有游離的羧酸基團的環(huán)肽而言，與形成生理上可接受的陽離子堿的鹽，例如與堿金屬如鈉和鉀形成鹽；與堿土金屬如鎂和鈣形成鹽；鋁和銨鹽，以及與有機堿如乙醇胺、甲胺、二乙胺、異丙胺、三甲基胺等形成的鹽。用本領(lǐng)域已知的任何適當?shù)姆椒梢灾苽浯祟慃}。
所述組合物可以為經(jīng)下列途徑使用的任何形式經(jīng)口使用，例如片劑、膠囊劑、水溶液或油溶液、懸浮液或乳液；經(jīng)鼻使用，例如吸入劑、鼻噴霧劑或鼻滴劑；經(jīng)陰道或直腸使用，例如栓劑；吸入給藥，例如精細粉末或液體氣霧劑；舌下或頰使用，例如片劑或膠囊劑；或胃腸外使用(包括靜脈、皮下、肌內(nèi)、血管內(nèi)或輸注)，例如無菌水溶液或油溶液或懸浮液，或?qū)⑺幬飺饺肟缮锝到饩酆衔镏械陌駝?depot formulation)。所述組合物可以為適于局部給藥的形式，例如乳油、軟膏或凝膠劑。也設(shè)計了皮膚貼劑。一般的制劑在ComprehensiveMedicinal Chemistry(第5卷，Hansch等編輯，Pergamon出版社1990)中第25.2章中描述。
一般而言，上述組合物可以用常規(guī)的賦形劑以常規(guī)的方法制備。然而，在為口服給藥的組合物的情況下，所述組合物包括包衣物以保護所述環(huán)肽活性成分在胃中不受酶的作用可能比較方便。
本發(fā)明優(yōu)選的組合物為一適于口服給藥的單位劑型，例如在每一單位劑量中含有2.5-500mg，優(yōu)選10-100mg環(huán)肽的片劑或膠囊劑，或者為一適于胃腸外給藥的單位劑型，每ml溶液含有0.5-100mg環(huán)肽，優(yōu)選每ml溶液含有1-10mg環(huán)肽。
優(yōu)選胃腸外組合物為等滲的鹽水或等滲的葡聚糖溶液，緩沖至pH5-9(如果需要)?；蛘?，將所述胃腸外組合物設(shè)計為緩釋的組合物，在此情況下，每單位劑量的環(huán)肽的量一般比使用常規(guī)的注射制劑時所需的量大。優(yōu)選的緩釋制劑為連續(xù)的釋放制劑，例如在歐洲專利說明書58481號中所述類型的制劑。對于含有聚乙酸/聚羥基乙酸基聚合物的緩釋制劑而言，優(yōu)選本發(fā)明的環(huán)肽含有堿性基團。對于此類環(huán)肽，另外的緩釋制劑述于國際專利申請公開號WO93/24150中。堿性氨基酸定義為在其側(cè)鏈含有堿性官能團例如氨基或胍基的氨基酸，所述兩個基團任一個可任選被C1-4烷基取代。一個此類特別優(yōu)選的堿性氨基酸為精氨酸。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案中，在式Ⅰ環(huán)肽中，X1、X2、(Xaa5)q和(Xaa6)q中任何兩個為D-Arg。含有堿性氨基酸的此類環(huán)肽可以與酸封端的聚酯如聚交酯(polyactide)形成所謂的“肽-聚合物”鹽。這些鹽具有溶解特征的優(yōu)勢，因此使它們特別適合生產(chǎn)緩釋胃腸外制劑，它們具有有利的釋放模式并具有儲存穩(wěn)定性。優(yōu)選的緩釋胃腸外制劑每單位劑量含有1-100mg環(huán)肽。設(shè)計的優(yōu)選的胃腸外給藥的藥用組合物可以緩慢釋放至少5天的時間。
本發(fā)明的組合物正常給藥，使日口服劑量為0.1mg/kg-50mg/kg，日胃腸外劑量為5，優(yōu)選20μg/kg-10mg/kg。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供在需要此治療的溫血哺乳動物例如人類中，抑制VCAM-1和/或纖連蛋白和整聯(lián)蛋白受體VLA-4之間相互作用的方法，該方法包括給予所述動物有效量的本發(fā)明的環(huán)肽或其藥學上可接受的鹽。本發(fā)明也提供此環(huán)肽或其藥學上可接受的鹽在生產(chǎn)用于治療由纖連蛋白和/或VCAM-1(特別是VCAM-1)和整聯(lián)蛋白受體VLA-4間的相互作用介導(dǎo)的疾病或身體紊亂的藥物中的用途。也可以用作研究的工具。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供在需要此治療的溫血哺乳動物例如人類中，抑制MAdCAM-1和整聯(lián)蛋白α4β7間相互作用的方法，該方法包括給予所述動物有效量的本發(fā)明的環(huán)肽或其藥學上可接受的鹽。本發(fā)明也提供此環(huán)肽或其藥學上可接受的鹽在生產(chǎn)用于治療由MAdCAM-1和整聯(lián)蛋白α4β7間相互作用介導(dǎo)的疾病或身體紊亂的藥物中的用途。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供在此所述的本發(fā)明的環(huán)肽作為藥物的用途。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供在需要此治療的哺乳動物中，抑制VCAM-1和/或纖連蛋白和整聯(lián)蛋白受體VLA-4間相互作用的方法，該方法包括給予所述哺乳動物有效量的在此所述的藥用組合物。在優(yōu)選的實施方案中，需要此治療的哺乳動物患有多發(fā)性硬化癥或類風濕性關(guān)節(jié)炎。在另一個優(yōu)選的實施方案中，需要此治療的哺乳動物患有哮喘或牛皮癬。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供在需要此治療的哺乳動物中，抑制MAdCAM-1和整聯(lián)蛋白α4β7間相互作用的方法，該方法包括給予所述動物有效量的在此所述的藥用組合物或其藥學上可接受的鹽。在優(yōu)選的實施方案中，需要治療的哺乳動物患有炎癥性腸疾病和胰島素依賴性糖尿病。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供本發(fā)明的環(huán)肽或其藥學上可接受的鹽在生產(chǎn)用于治療由VCAM-1或纖連蛋白和整聯(lián)蛋白受體VLA-4間相互作用介導(dǎo)的疾病或身體紊亂的藥物中的用途。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供本發(fā)明的環(huán)肽或其藥學上可接受的鹽在生產(chǎn)用于治療由MAdCAM-1和整聯(lián)蛋白α4β7間相互作用介導(dǎo)的疾病或身體紊亂的藥物中的用途。
合成詳述可以根據(jù)可用于相似化合物合成的肽化學領(lǐng)域熟知的任何方法制備本發(fā)明的環(huán)肽。因此，例如用與Athertion和Sheppard的“固相肽合成方法一條可行的途徑”(由Oxford大學出版社的IRL出版，1989)、Stewart和Young的“固相肽合成”(由Pierce Chemical Company出版，Illinois,1984)、M.Bodanszky的“肽合成的原理”(由Springer-Verlag出版，Berlin Heidelberg,1984)、M.Bodanszky和A.Bodanszky的“肽合成的實踐”(由Springer-Verlag出版，Berlin Heidelberg,1984)以及叢書“氨基酸、肽和蛋白”(第1-26卷；1995年出版的第26卷)(由Royal Society of Chemistry出版，Cambridge,UK)中所公開的相似的方法可以獲得本發(fā)明的環(huán)肽。除這些書外，也發(fā)表了許多關(guān)于肽的合成的綜述[如“固相肽合成銀年會報告”，G.Barany,N.Kneib-Cordonier和D.G.Mullen,Intemational Journal of Peptide and Protein Research,30(1987)705-739；“用9-芴基甲氧基羰基氨基酸進行的固相肽合成”，G.B.Fields和R.L Noble,International Journal of Peptide andProtein Research,35(1990)161-214]。合成進展也發(fā)表于美國、歐洲和日本肽研討會的會議論文集上。用自動或人工的方法可以進行合成。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供制備本發(fā)明環(huán)肽的方法，選自(a)以逐步的方式，將所需的線性肽裝配(assembling)(一次增加一個氨基酸)，接著選擇性去除N-和C-末端的任何保護基團，環(huán)化并最后去質(zhì)子化得到本發(fā)明的環(huán)肽，并任選(如果需要)將如此獲得的產(chǎn)物制成其鹽；(b)通過使兩個肽單元偶合形成酰胺鍵，所述一個肽單元含有羧酸基團或其活性的衍生物，而另一個含有氨基基團，以產(chǎn)生本發(fā)明的保護或未保護的環(huán)肽，并如果需要用下列方法(c)去除保護基團，如果需要可任選將如此獲得的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為其鹽；和(c)從在Asp側(cè)鏈的酸基團上具有保護基團的保護的環(huán)肽中去除一個或多個常規(guī)的肽保護基團，得到本發(fā)明的環(huán)肽，并任選同時或隨后也去除存在的任何另外的常規(guī)肽保護基團，并任選如果需要將如此獲得的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為其鹽。
上述的去保護和偶合步驟可以用用于有機化合物合成的常規(guī)技術(shù)在固相載體(固相肽合成)或在溶液中進行。除固相載體外，所有其它的保護基團、偶合試劑、解封試劑和純化技術(shù)都與固相和液相肽合成技術(shù)相似。
對于固相載體上的肽合成而言，選擇適當?shù)臉渲摌渲趶乃鰳渲狭呀夂罂梢蕴峁┯坞x的羧基，或可選擇性去保護的肽衍生物以得到C-末端羧基。該固體載體可以含有聚苯乙烯珠粒、聚二甲基丙烯酰胺珠粒、聚二甲基丙烯酰胺-聚苯乙烯復(fù)合物(Polyhipe)或聚苯乙烯-聚氧化乙烯樹脂(Tentagel樹脂)。含有用于固相肽合成的固相載體的適當?shù)倪B接基團的幾個實例示于下列中。除所示的連接劑外，也可以使用部分其它的連接劑如羥基巴豆酰氨基甲基(HYCRAM)。然后通過本申請中所述的肽合成的方法或通過使用于肽合成中的任何偶合試劑使第一個氨基酸與所述樹脂偶合。部分偶合試劑的實例也在本申請中描述。
在肽的裝配過程中，可以用各種保護基團保護不參加反應(yīng)的所述氨基酸的官能團。例如，可以用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧基羰基(Boc)、聯(lián)苯基異丙氧基羰基(Bpoc)、2-[3,5-二甲氧基苯基]丙基-2-氧基羰基(Ddz)、金剛烷基氧基羰基(Adoc)、烯丙氧基(Aloc)、2,2,2-三氯乙氧基羰基(Troc)、芐氧基羰基和各種取代的芐氧基羰基保護N-末端和所述側(cè)鏈氨基。需要時，用標準的技術(shù)(如酸或堿處理、催化氫解和Pd(0)處理或鋅/乙酸處理)可以裂解這些保護基團。
用于保護α-羧基或側(cè)鏈羧基的適合的保護基團包括各種酯(如甲基、乙基、叔丁基、芐基、硝基芐基、烯丙基和9-芴基甲基的酯)。
用于在含有精氨酸殘基的肽中保護側(cè)鏈胍基的適合的保護基團包括包括硝基、金剛烷基氧基羰基、4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺?；?Mtr)、2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；?Pbf)和2,2,5,7,8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺?；?Pmc)。用于在含有組氨酸殘基的肽中保護側(cè)鏈咪唑基的適合的保護基團包括三苯甲基、對甲苯磺?；?、二硝基苯基、Adoc、Boc或Fmoc基團。
在溫度4-40℃范圍內(nèi)(優(yōu)選在室溫，約25℃)進行所述保護基團的裂解反應(yīng)。所述裂解反應(yīng)可以進行10分鐘至24小時。
用于各個氨基酸或肽片段偶合的適合的偶合方法包括通常使用的疊氮化物、對稱的酸酐、混合的酸酐和各種活性的酯和碳二亞胺。在各種碳二亞胺(如二環(huán)己基-或二異丙基-碳二亞胺)的情況下，也可以加入添加劑[如1-羥基苯并三唑和N-羥基琥珀酰亞胺]。此外，用多種其它的試劑如1H-苯并三唑-1-基-氧代-三-吡咯烷六氟代磷酸鏻(PyBOP)、(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基四氟硼酸脲鎓(uronium)(TBTU)和(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3,-四甲基六氟磷酸脲鎓(HBTU)]。
所述偶合反應(yīng)可以于-20℃至40℃溫度范圍內(nèi)進行。完成該反應(yīng)所需的時間為10分鐘至24小時。
用于中間體和終產(chǎn)物的適當?shù)募兓椒ò媪鞣植?、離子交換、凝膠過濾和各種其它的層析技術(shù)，包括高壓液相層析(HPLC)以及有機化學中使用的多種其它的標準技術(shù)(如溶劑萃取和結(jié)晶)。
用下列非限定性實施例說明本發(fā)明，其中

圖1說明化合物1號的合成(表2)；圖2說明化合物20號的合成(表2)；圖3說明化合物24號的合成(表2)；圖4說明D-Orn(CHMe2)的結(jié)構(gòu)；圖5說明D-Lys(CHMe2)的結(jié)構(gòu)；圖6說明D-Orn(Me2)的結(jié)構(gòu)；圖7說明D-hArg(Et)2的結(jié)構(gòu)；和圖8說明D-Arg(Pmc)的結(jié)構(gòu)。
在圖4-8中帶箭頭鍵代表連接點或直接的鍵(即不是-CH2-基團)。例如，參照在化合物4(表1)中的D-Lys(CHMe2)(圖5)，氮原子上的帶箭頭鍵與Val的C-末端的-C(O)-連接，-C(O)-上的帶箭頭鍵與D-Ala的N-末端的氮原子連接。
使用下列縮寫hArg(Et)2高-Arg(Et)2Orn鳥氨酸實施例化合物1-38的合成(見表1和2)根據(jù)本發(fā)明的環(huán)肽在表1和2中的編號為1-38。通過使表1中編號39-75的相應(yīng)的前體肽(一般為線性)環(huán)化獲得這些環(huán)肽?；衔?、20和24合成的細節(jié)在下面詳細描述(見圖1-3)。在其它化合物的情況下，僅僅提到標準方法的改變。
實施例11．化合物1的合成(圖1)
通過固相方法，用2-氯代三苯甲基氯樹脂制備所述環(huán)肽(圖1，步驟5)。將部分保護的線性肽裝配于所述樹脂上后，從所述樹脂上裂解該肽，并且不經(jīng)任何純化用于隨后的步驟。然而，在鑒定前，用反相高壓液相層析(HPLC)對終產(chǎn)物進行充分地純化。
1.1．化合物1的合成(步驟1，圖1)將溴代乙酸叔丁酯(4.88g,25mmol)的二氯甲烷(50ml)溶液加至1-哌嗪羧酸叔丁酯(4.65g,25mmol)和三乙胺(3.5ml,25mmol)的二氯甲烷(30ml)溶液中。將該反應(yīng)混合物攪拌過夜，過濾去除過夜析出的固體，蒸發(fā)濾液至干。使殘留物分配于乙酸乙酯和水之間，然后用水洗滌有機層，經(jīng)硫酸鎂干燥并蒸發(fā)至干。使殘留物從乙醚-異己烷中結(jié)晶得到產(chǎn)物(5.66g,75％,m.p.99-100℃)。[元素分析實測值C,59.8％,H,9.6％,N,9.1％；C15H28N2O4理論值C,60.0％；H,9.4％；N,9.33％]。[在硅膠板上進行薄層層析顯示為單一點；在乙酸乙酯-異己烷(1∶1)中Rf為0.38；在甲醇-氯仿(1∶9)中為0.68)]。
1.2．化合物1的合成(步驟2，圖1)用三氟乙酸-水(95∶5,50ml)的混合液處理部分1.1所述的化合物(5g,16.6mmol)1小時。真空蒸發(fā)去除所述酸，用乙醚研磨殘留的油狀物得到固體，收集該固體，用乙醚洗滌，在真空下經(jīng)五氧化二磷/氫氧化鉀干燥(6.25g,m.p.177-182℃)。然后將該固體溶于含有碳酸鉀(6.92g,3當量)的水和丙酮(1∶1,150ml)混合液中。在攪拌下，用20分鐘加入9-芴基甲基-N-羥基琥珀酰亞胺(5.66g,16.7mmol)的丙酮(30ml)溶液。通過加入M的碳酸鉀溶液維持該溶液的pH約為9。于室溫下攪拌過夜后，真空蒸發(fā)去除丙酮，用硫酸氫鉀溶液酸化水溶液。將產(chǎn)物萃取入乙酸乙酯中，用水洗滌該溶液(6次)，用飽和的氯化鈉溶液洗滌。經(jīng)硫酸鎂干燥有機層，蒸發(fā)得到油狀物，用異己烷和乙醚研磨后固化(產(chǎn)量3.72g,60％)。使樣品從乙醇-乙醚中重結(jié)晶，m.p.179-182℃,(M+H)+367。
1.3．化合物1的合成(步驟3和4，圖1)將在二氯甲烷(15ml)和二異丙基乙胺(1.05ml,3當量)的上述的Fmoc-哌嗪衍生物(732mg,2mmol)加至2-氯代三苯甲基氯樹脂(Novabiochem.,2.05g)中，將該反應(yīng)混合物輕輕振搖60分鐘。加入10％二異丙基乙胺的甲醇溶液(10ml)，并繼續(xù)振搖10分鐘。濾除樹脂，順序用二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二氯甲烷和乙醚洗滌，于50℃在真空干燥箱中干燥(重2.55g)。
將上述樹脂置于配有燒結(jié)玻璃盤的反應(yīng)器中。然后人工進行下列一系列反應(yīng)得到所需的肽樹脂。
(a)經(jīng)20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液處理兩次(1×5min和1×15min)，隨后用二甲基甲酰胺洗滌5次，以去除過量的試劑并裂解產(chǎn)物而去除Fmoc基團。
(b)在二甲基甲酰胺(8ml)中，用經(jīng)O-(苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟代磷酸脲鎓(HBTU)(1.90g,5mmol)活化的Fmoc-Val(1.70g,5mmol)?；?小時。用二甲基甲酰胺將所述樹脂再洗滌5次去除過量的試劑。
用Fmoc-Asp(Obut)(2.06g,5mmol)、Fmoc-Leu(1.77g,5mmol)、Fmoc-MeIle(1.83g,5mmol)、Fmoc-D-Arg(Pbf)(3.76g,5mmol)重復(fù)上述的去保護和偶合循環(huán)。在Fmoc-D-Arg(Pbf)的情況下，用O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟代磷酸脲鎓(HATU)(1.90g,5mmol)活化所述氨基酸衍生物。然后解封一半的所述樹脂，用HBTU(1.14g,3mmol)和二異丙基乙胺(1.05ml,6mmol)，使其與Fmoc-NH(CH2)2-COOH(911mg,3mmol)反應(yīng)得到與氯代三苯甲基樹脂連接的保護的五肽衍生物(步驟3)。用在二甲基甲酰胺中的20％哌啶裂解N-末端Fmoc基團(1×5min和1×15min)，順序用二甲基甲酰胺、二氯甲烷和乙醚洗滌該肽樹脂，于50℃在真空干燥箱中干燥。
用乙酸-三氟乙醇-二氯甲烷(2∶2∶6)的混合液(25ml)將肽樹脂處理1小時。過濾出樹脂，用裂解劑再處理1小時。蒸發(fā)合并的濾液，用乙醚研磨殘留物得到為乙酸鹽的線性五肽衍生物(824mg,0.682mmol)。然后通過將所述乙酸鹽溶于水-乙腈(2∶1,60ml)的混合液中，冷卻至0℃，加入1.05當量的1N HCl并冷凍干燥內(nèi)容物將乙酸鹽轉(zhuǎn)化為鹽酸鹽。
1.4．化合物1的合成(步驟5，圖1)通過下列c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala-D-Arg)(化合物24)相當?shù)牟襟E中所述方法使線性肽環(huán)化并去保護得到最終的環(huán)肽終產(chǎn)物(1)。
2.c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Arg)(化合物20，圖2)的合成通過固相方法，用2-氯代三苯甲基氯樹脂制備該環(huán)肽。合成的詳細方法見下述。使部分保護的線性肽裝配于所述樹脂上后，將該肽從所述樹脂上裂解，并不經(jīng)任何純化用于隨后的步驟。然而，在鑒定前，用反相高壓液相層析(HPLC)對終產(chǎn)物進行充分地純化。
2.1 Fmoc-Val-氯代三苯甲基樹脂的制備(步驟1，圖2)使2-氯代三苯甲基氯樹脂(Alexis Corporation；1.31mmol Cl/g；10g)在二氯甲烷(40ml)(經(jīng)分子篩干燥)中溶脹5分鐘。加入Fmoc-Val(3.39g,10mmol)和二異丙基乙胺(5.6ml,32mmol)的二氯甲烷(20ml)溶液，將該懸浮液機械振搖45分鐘。加入甲醇(9ml)和二異丙基乙胺(1ml)并繼續(xù)振搖5分鐘。過濾收集樹脂，順序用二氯甲烷、二甲基甲酰胺和二氯甲烷洗滌并立即用于下一個步驟的合成(2.2)。
2.2 D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-MePhe-Leu-Asp(OBut)-Val-氯代三苯甲基樹脂的制備(步驟2和3，圖2)將上述Fmoc-Val樹脂置于配有燒結(jié)玻璃盤的反應(yīng)器中。然后人工進行下列一系列反應(yīng)得到所需的肽樹脂。
(a)經(jīng)20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液處理兩次(1×5min和1×15min)，隨后用二甲基甲酰胺洗滌5次，以去除過量的試劑并裂解產(chǎn)物而去除Fmoc基團。
(b)在二甲基甲酰胺(22ml)中，用經(jīng)O-(苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟代磷酸脲鎓(HBTU)(5.70g,15mmol)和二異丙基乙胺(5.25ml,30mmol)活化的Fmoc-Asp(OBut)(6.17g,15mmol)?；?小時。用二甲基甲酰胺將所述樹脂再洗滌5次去除過量的試劑。
用Fmoc-Leu(5.29g,15mmol)、Fmoc-MePhe(6.01g,15mmol)、Fmoc-D-Arg(Pbf)(11.27g,15mmol)和Fmoc-D-Arg(Pbf)(11.27g,15mmol)重復(fù)上述的去保護和偶合循環(huán)得到Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-MePhe-Leu-Asp(OBut)-Val-氯代三苯甲基樹脂。如同在化合物l的情況下，用O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟代磷酸脲鎓(HATU)和二異丙基乙胺達到Fmoc-D-Arg衍生物的偶合。用在二甲基甲酰胺中的20％哌啶裂解N-末端Fmoc基團(1×5min和1×15min)(步驟3)，順序用二甲基甲酰胺和二氯甲烷洗滌肽樹脂D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-MePhe-Leu-Asp(OBut)-Val-氯代三苯甲基樹脂。
2.3．D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-MePhe-Leu-Asp(OBut)-Val,HCl的制備(步驟4，圖2)將肽樹脂D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-MePhe-Leu-Asp(OBut)-Val-氯代三苯甲基樹脂懸浮在乙酸-三氟乙醇-二氯甲烷(2∶2∶6)的混合液(100ml)中1小時。過濾出樹脂，用相同的混合液再處理1小時。蒸發(fā)合并的濾液，用乙醚處理殘留物得到為乙酸鹽的D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-MePhe-Leu-Asp(OBut)-Val(11.66g)。然后通過將所述乙酸鹽溶于水-乙腈(2∶1,350ml)的混合液中，冷卻至0℃，加入1.05當量的1N HCl并冷凍干燥內(nèi)容物將乙酸鹽轉(zhuǎn)化為鹽酸鹽(重11.5g)。
2.4．c(D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-MePhe-Leu-Asp(OBut)-Val)的制備(步驟5，圖2)將上述線性肽鹽酸鹽，D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-MePhe-Leu-Asp(OBut)-Val(HCl)(11.5g,8.1mmol)溶于二甲基甲酰胺(8000ml)中，向該溶液中加入O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟代磷酸脲鎓(HATU)(4.62g,12.15mmol)和二異丙基乙胺(5.67ml,32.4mmol)。用分析性HPLC監(jiān)測該環(huán)化反應(yīng)。所述反應(yīng)完成后(于室溫下2小時)，真空將該反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干。用10％碳酸氫鈉水溶液研磨殘留物。收集固體，用10％碳酸氫鈉、水、10％硫酸氫鉀溶液，最后用水洗滌。在真空干燥箱中，于45℃用五氧化二磷干燥該固體[在Vydac 218TP54柱上的保留時間為24.80分鐘，用含有0.1％三氟乙酸的乙腈-水(40-80％)梯度洗脫，流速1.0ml/min，洗脫30分鐘]，將其不經(jīng)任何純化用于下一步驟。
2.5．c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Arg)[化合物20]的制備(步驟6，圖2)用三氟乙酸-水(95∶5,80ml)和三異丙基硅烷(3ml)的混合液將上述保護的環(huán)肽，c(D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-MePhe-Leu-Asp(OBut)-Val)處理90分鐘，以去除精氨酸和天冬氨酸側(cè)鏈保護基團。將該反應(yīng)混合物蒸發(fā)至小體積并分配于水和乙醚之間。用乙醚洗滌水層4次，冷凍干燥得到10.9g粗品產(chǎn)物。將該粗品產(chǎn)物在Vydac C18218TP1015100柱(4英寸×25cm)上經(jīng)制備性反相HPLC純化，用含有0.1％三氟乙酸的乙腈-水(15-35％)梯度洗脫80分鐘，流速為180.ml/min。合并含有產(chǎn)物的組分并冷凍干燥得到純化的環(huán)肽(3.63g)。用氨基酸分析和質(zhì)譜鑒定該肽(表2)。
3．c(D-Arg-MeIle-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala)(化合物24，圖3)的合成通過固相方法，用2-氯代三苯甲基氯樹脂制備該環(huán)肽。使部分保護的線性肽裝配于所述樹脂上后，將該肽從所述樹脂上裂解，并不經(jīng)任何純化用于隨后的步驟。然而，在鑒定前，用反相高壓液相層析(HPLC)對終產(chǎn)物進行充分地純化。
3.1 Fmoc-D-Ala-氯代三苯甲基樹脂的制備(步驟1，圖3)使2-氯代三苯甲基氯樹脂(Nova Biochem.；1.35mmol Cl/g；lg)在二氯甲烷(10ml)(經(jīng)分子篩干燥)中溶脹5分鐘。加入Fmoc-D-Ala(311mg,1mmol)和二異丙基乙胺(525μl,3mmol)的二氯甲烷(8ml)溶液，將該懸浮液機械振搖45分鐘。加入甲醇(9ml)和二異丙基乙胺(1ml)并繼續(xù)振搖5分鐘。過濾收集樹脂，順序用二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二氯甲烷、異丙醇和乙醚洗滌，最后在真空干燥箱中于50℃干燥(重1.51g)。
3.2 D-Arg(Pmc)-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val-D-Ala-D-Ala-氯代三苯甲基樹脂的制備(步驟2和3，圖3)將上述的Fmoc-D-Ala樹脂置于配有燒結(jié)玻璃盤的反應(yīng)器中。然后人工進行下列一系列反應(yīng)得到所需的肽樹脂。
(a)經(jīng)20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液處理兩次(1×5min和1×15min)，隨后用二甲基甲酰胺洗滌5次，以去除過量的試劑并裂解產(chǎn)物而去除Fmoc基團。
(b)在二甲基甲酰胺(3ml)中，用經(jīng)O-(苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟代磷酸脲鎓(HBTU)(760mg,2mmol)和二異丙基乙胺(700μl,4mmol)活化的Fmoc-D-Ala(622mg,2mmol)?；?小時。用二甲基甲酰胺將所述樹脂再洗滌5次去除過量的試劑。
用Fmoc-Val(678mg,2mmol)、Fmoc-Asp(OBut)(822mg,2mmol)、Fmoc-Leu(700mg,2mmol)、Fmoc-MeIle(734mg,2mmol)和Fmoc-D-Arg(Pmc)(1.40g,2mmol)重復(fù)上述的去保護和偶合循環(huán)得到Fmoc-D-Arg(Pmc)-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val-D-Ala-D-Ala-氯代三苯甲基樹脂。如同在化合物1的情況下，用O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟代磷酸脲鎓(HATU)和二異丙基乙胺獲得Fmoc-D-Arg衍生物的偶合。用在二甲基甲酰胺中的20％哌啶裂解N-末端Fmoc基團(1×5min和1×15min)(步驟3)，順序用二甲基甲酰胺、二氯甲烷和乙醚洗滌肽樹脂D-Arg(Pmc)-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val-D-Ala-D-Ala-氯代三苯甲基樹脂并在真空干燥箱中于50℃干燥(重2.5g)。
3.3．D-Arg(Pme)-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val-D-Ala-D-Ala(HCl)的制備(步驟4，圖3)將肽樹脂D-Arg(Pmc)-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val-D-Ala-D-Ala-氯代三苯甲基樹脂懸浮在乙酸-三氟乙醇-二氯甲烷(2∶2∶6)的混合液(25ml)中1小時。過濾出樹脂，用相同的混合液再處理1小時。蒸發(fā)合并的濾液，用乙醚研磨殘留物得到為乙酸鹽的D-Arg(Pmc)-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val-D-Ala-D-Ala(1.18g)。然后通過將所述乙酸鹽溶于水-乙腈(2∶1,60ml)的混合液中，冷卻至0℃，加入1.05當量的1N HCl并冷凍干燥內(nèi)容物將乙酸鹽轉(zhuǎn)化為鹽酸鹽。
3.4．c(D-Arg(Pmc)-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val-D-Ala-D-Ala)的制備(步驟5，圖3)將上述線性肽鹽酸鹽，D-Arg(Pmc)-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val-D-Ala-D-Ala(HCl)(1.18g,1.02mmol)溶于二甲基甲酰胺(1000ml)中，向該溶液中加入O-(苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟代磷酸脲鎓(HBTU)(395mg,1.02mmol)和二異丙基乙胺(545μl,3.1mmol)。用分析性HPLC監(jiān)測該環(huán)化反應(yīng)。所述反應(yīng)完成后(于室溫下2小時)，真空將該反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干。使殘留物分配于乙酸乙酯和水之間。然后順序用1M檸檬酸、飽和的氯化鈉、10％碳酸氫鈉水溶液和飽和的氯化鈉洗滌有機層，經(jīng)硫酸鎂干燥并于真空中蒸發(fā)至干。收集產(chǎn)物[在Vydac 218TP54柱上的保留時間為27.06分鐘，用含有0.1％三氟乙酸的乙腈-水(20-80％)梯度洗脫，流速1.0ml/min，洗脫30分鐘]，將其不經(jīng)任何純化用于下一步驟。
3.5．c(D-Ala-D-Ala-D-Arg-MeIle-Leu-Asp-Val)[化合物24]的制備(步驟6，圖3)用三氟乙酸-水(95∶5,30ml)和三異丙基硅烷(1ml)的混合液將上述保護的環(huán)肽c(D-Ala-D-Ala-D-Arg(Pmc)-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val)處理4小時，以去除精氨酸和天冬氨酸側(cè)鏈保護基團。將該反應(yīng)混合物蒸發(fā)至小體積并用乙醚研磨得到粗品環(huán)肽(575mg)。將粗品產(chǎn)物在Deltapak C18柱(30×30mm)上經(jīng)制備性反相HPLC純化，用含有0.1％三氟乙酸的乙腈-水(10-30％)梯度洗脫80分鐘，流速為30.0ml/min。合并含有產(chǎn)物的組分并冷凍干燥得到純化的環(huán)肽(353mg)。用氨基酸分析和質(zhì)譜鑒定該肽[在HPLC上為單峰，在Vydac 218TP54柱上，用含有0.1％三氟乙酸的乙腈-水(10-40％)梯度洗脫30分鐘，流速為1.0ml/min，保留時間為21.19分鐘](表2)。
4．化合物2的合成用化合物1使用的合成途徑(如圖1所示)，但是用γ-氨基丁酸代替β-丙氨酸合成化合物2。
5．化合物3-5的合成通過使環(huán)肽c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Orn-D-Orn)或c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Lys-D-Ala)與所需的醛或酮和氰基硼氫化鈉反應(yīng)制備上述環(huán)肽。例如，通過將環(huán)肽c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Orn-D-Orn)(100μmol)溶于無水丙酮(2ml)中并與氰基硼氫化鈉(10當量)反應(yīng)制備化合物3。1小時后，將該反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干，將溶于水(5ml)中的殘留物用乙酸酸化并于高度真空下蒸發(fā)。經(jīng)HPLC純化粗品肽。
根據(jù)圖3所示的化合物24的合成途徑合成母體環(huán)肽c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Orn-D-Orn)和c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Lys-D-Ala)。
6．化合物6-8的合成根據(jù)化合物24所述的方法獲得化合物6-8所需的線性肽D-hArg(Et)2-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val-D-Ala、D-hArg(Et)2-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val-D-Phe和D-hArg(Et)2-D-hArg(Et)2-MeIle-Leu-Asp(OBut)-Val。由所需的C-末端氨基酸即D-Ala開始合成化合物6，由D-Phe開始合成化合物7，由Val開始合成化合物8)。Boc-D-hArg(Et)2的合成途徑在以前的文獻中已報道[H.B.Arzeno等，Synthetic Communications,20(1990)3433-3437；J.J.Nestor,Jr.等，Journal of Medicinal Chemistry,35(1992)3942-3948]。通過標準的方法將該衍生物轉(zhuǎn)化為Fmoc-D-hArg(Et)2并用于上述線性肽的合成中。然后根據(jù)圖3所示的化合物24的環(huán)化方法由相應(yīng)的線性肽獲得化合物6-8。
7．化合物9-19的合成用與化合物24所述相似的方法合成環(huán)肽9-19。如表1所述，所有的線性肽都是用Fmoc-纈氨酸作原料在氯代三苯甲基樹脂上合成的。
8．化合物21-23和25-32的合成用與化合物20所述相似的方法合成環(huán)肽21-23和25-32。如表1所述，所有的線性肽都是用Fmoc-纈氨酸作原料在氯代三苯甲基樹脂上合成的。
9．化合物33-35的合成用與化合物20所述相似的方法合成環(huán)肽33-35。然而，如表1所示，分別用Fmoc-NH(CH2)5-COOH、Fmoc-NH(CH2)2-S-CH2-COOH或Fmoc-NH(CH2)2-S-(CH2)2COOH衍生物作原料代替Fmoc-纈氨酸在氯代三苯甲基樹脂上合成該三種線性肽。
同氨基己酸(可以由商業(yè)獲得)不一樣，可以用下列方法合成其它兩種含硫氨基酸衍生物。由2-氨基乙硫醇和2-溴代乙酸獲得Fmoc-NH(CH2)2-S-CH2-COOH(上述使用的)。將2-氨基乙硫醇鹽酸鹽(5.68g,50mmol)溶于水(200ml)中，向其中加入碳酸氫鈉(25.2g,300mmol)。用30分鐘，將溶于乙腈(100ml)中的2-溴代乙酸(6.95g,50mmol)逐份加至上述制備的攪拌溶液中。于室溫下1小時后，加入9-芴基甲基-N-羥基琥珀酰亞胺(Fmoc-OSu)(16.85g,50mmol)的乙腈(150ml)溶液中，并繼續(xù)攪拌16小時。蒸發(fā)微微渾濁的溶液以去除大部分的乙腈，用乙酸乙酯(3×50ml)萃取殘留的水溶液，通過加入鹽酸酸化(pH2)。收集白色固體，用水洗滌，于45℃真空干燥。產(chǎn)率17g(95％),(M+H)+358.0。
根據(jù)上述Fmoc-NH(CH2)2-S-CH2-COOH所述方法，用3-溴代丙酸和2-氨基乙硫醇獲得Fmoc-NH(CH2)2-S-(CH2)2-COOH。(M+H)+372。
10．化合物36-38的合成用與化合物20所述相似的方法合成環(huán)肽36-38。如表1所示，除化合物61外，所有的線性肽都是用Fmoc-纈氨酸作原料在氯代三苯甲基樹脂上合成的。如圖2所示，用Fmoc-Ala作原料制備化合物61。在線性肽的合成中的適合的階段，用Fmoc-NH(CH2)2-S-CH2-COOH加入含硫的氨基酸殘基-NH(CH2)2-S-CH2-CO-。
實施例2-體外和體內(nèi)測定在該實施例中使用下列縮寫和原料來源。
MOLT-4細胞-淋巴細胞T細胞系(由ATCC衍生)纖連蛋白-根據(jù)E.Nengvall、E.Ruoslahti(Int.J.Cancer,1977,20,第1-5頁)和J.Forsyth等(Methods in Enzymology,1992,215，第311-316頁)所述方法制備或為試劑級的人纖連蛋白。經(jīng)明膠-瓊脂糖親和層析由人血漿中純化后者(見Bio Products Elstree UK.Product No9136)。關(guān)于纖連蛋白的綜述文章為纖連蛋白-細胞表面和血液的粘附糖蛋白(K.M.Yamada和K.Olden,Nature,275(1978)179-184。rsVCAM-1-(參考Biochem Biophys Res Comm 1991 178 N3；1498-1504)。VCAM-1為血管內(nèi)皮以及巨噬細胞樣和dandritic細胞型對某些炎癥刺激反應(yīng)產(chǎn)生的細胞表面糖蛋白。VCAM-1與單核白細胞中存在的整聯(lián)蛋白VLA-4相互作用。
通過從IL-1β活化的人內(nèi)皮細胞中篩選cDNA庫，分離VCAM-1的cDNA。用桿狀病毒表達體系在昆蟲細胞中表達大量蛋白。已經(jīng)表明VCAM-1表達細胞與各種VLA-4表達細胞系(Jurkat、THP-1、U937)特異性結(jié)合。
關(guān)于VCAM-1的另一篇文獻為桿狀病毒感染的昆蟲細胞合成的重組人血管細胞粘附分子-1(VCAM-1)的表達和功能鑒定(J.K.Stoltenborg,R.A.Straney,R.J.Tritch,W.M.Mackin和H.J.George,蛋白表達和純化，4(1993)585-593)。
PRMI-1640-細胞培養(yǎng)基。來自Gibco BRL(Lifetechnologies,CatNo 31870-025)。
FCS-胎牛血清。來自Advanced protein products(West MidlandsUK)Cat No AS-302-50。
BCECF-AM-2’,7’-雙(2羧基乙基)-5-(ε6)-羧基fluoroscein乙酰氧基甲酯)。來自Molecular Probes Inc USA；Cat No B-1150。
CHO DG44-中國倉鼠卵巢細胞系(由ATCC衍生；參考Som CellMol Gen 1986；12；555-666)DMEM-Dulbecco氏改良伊格爾培養(yǎng)基。來自Gibco BRL(Lifetechnologies；Cat No 41966-029)。
抗生素-青霉素-鏈霉素。來自Gibco BRL(Life Technologies；CatNo 15070-022)。
FluorskanTM-為熒光計。
HUVEC-人臍靜脈內(nèi)皮細胞。由組織樣品中制備的初級培養(yǎng)物。(參考J Clin Invest.1973 52；2745-2747)。
重組人TNFα-腫瘤細胞壞死因子Alzet滲透微型泵-皮下植入的微型滲透泵，Alza Corporation PaloAlto,California。
在下列測定和模型中，參照化合物指本發(fā)明的環(huán)肽。
2.1 細胞/固定配體測定2.1.1 MOLT-4細胞/纖連蛋白-VCAM-1粘附測定。
使用MOLT-4細胞/纖連蛋白-VCAM-1粘附測定以研究表達于MOLT-4細胞膜上的整聯(lián)蛋白VLA4(非常后期抗原，α4/β1)與纖連蛋白或重組可溶性VCAM-1(rs VCAM-1)的相互作用。于4℃分別將纖連蛋白或rs VCAM-1以20μg/ml和1μg/ml的濃度包被于聚苯乙烯96-孔微量滴定板上。接著，加入濃BSA溶液(10mg/ml)以阻斷非特異性結(jié)合位點。當這些溶液吸收后，加入等體積的化合物和MOLT-4細胞懸浮液(1×10E6細胞/毫升)。于37℃孵育2小時過程中發(fā)生粘附反應(yīng)，輕輕攪動接著真空吸入去除未粘附或粘附不牢固的細胞。用酸性磷酸酶活性的比色測定法對殘留的粘附細胞進行定量，定量數(shù)據(jù)可從分光光度計上讀出。抑制粘附的化合物具有較低的吸收值。標準、對照和受試條件用一式三份進行測定。根據(jù)每個培養(yǎng)板上總(無抑制劑)和非特異性(無纖連蛋白)標準計算抑制的百分比。
2.1.2 JY細胞/MAdCAM-1粘附測定使用JY細胞(人B成淋巴母細胞的)/MAdCAM-1粘附測定以研究表達于JY細胞膜上的整聯(lián)蛋白α4β7與重組可溶性MAdCAM-1的相互作用。將MAdCAM-1以10μg/ml的濃度包被于聚苯乙烯96-孔微量滴定板上1小時。此后，將濃BSA溶液(10mg/ml)加入以阻斷非-特異性結(jié)合位點。吸入這些溶液后，加入等體積的化合物和JY細胞懸浮液(1×10E6細胞/毫升)。測定物中含有終濃度為0.2mM的錳以活化JY細胞上的α4β7。于37℃孵育20分鐘過程中發(fā)生粘附。通過輕輕攪動接著真空吸入去除未粘附或粘附不牢固的粘附細胞。然后用5％戊二醛固定粘附細胞20分鐘，用0.1％結(jié)晶紫溶液染色20分鐘。加入10％乙酸溶解結(jié)晶紫，通過在分光光度計上于405nm處測定吸收度對粘附細胞數(shù)目進行定量。抑制粘附的化合物產(chǎn)生較低的吸收值。標準、對照和受試條件以一式五份進行測定。相對于每培養(yǎng)板上總(無抑制劑)和非-特異性(無MAdCAM-1)標準計算抑制的百分比。
2.2 細胞-細胞測定2.2.1．VCAM-1 CHO細胞用熒光染料BCECF-AM(30μg/ml，每3×10E6細胞)對MOLT-4細胞(補充有5％FCS和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640)進行標記。通過FACS分析對用全長度VCAM-1 cDNA轉(zhuǎn)染的CHO DG44進行選擇作為VCAM-1表達并于96孔組織培養(yǎng)板上生長至融合。在用于粘附測定前，將CHO DG44細胞洗滌三次(用含有5％FCS,2mM L-谷氨酰胺和2％抗生素的DMEM)。使MOLT-4(10E5細胞/孔)細胞覆蓋表達VCAM-1的CHO細胞，于37℃、5％二氧化碳中孵育30分鐘。通過洗滌三次所述培養(yǎng)板(用含有5％FCS和2mM L-谷氨酰胺的RPMI1640)去除未粘附細胞，接著在組織紙上吸干所述板。向每孔中加入100μl的2％Triton X-100，用Flroroskan(激發(fā)=485nM，發(fā)射=538nM)讀出所述板。將化合物溶于適當?shù)娜軇┲?，在加至HUVEC培養(yǎng)物中前加至MOLT-4細胞中。通過比較對照溶媒處理的細胞和化合物處理的細胞的粘附(熒光)水平計算粘附抑制。
2.2.2 人臍靜脈內(nèi)皮細胞用熒光染料BCECF-AM(30μg/ml每3×10E6細胞)對MOLT-4細胞(用5％FCS和2mM L-谷氨酰胺補充的RPMI 1640)進行標記。使初級HUVEC在96孔組織培養(yǎng)板上生長至融合，用2U/ml重組人TNFα孵育18小時。在用于粘附測定前，洗滌(用5％FCS、2mM L-谷氨酰胺和2％抗生素補充的M199)初級HUVEC單層細胞。將MOLT-4(10E5細胞/孔)細胞覆蓋于初級HUVEC上，并于37℃、5％二氧化碳中孵育30分鐘。通過洗滌所述培養(yǎng)板3次(補充5％FCS和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640)除去未粘附細胞，在組織紙上吸干。向每孔中加入100μl的2％Triton X-100，用Flroroskan(激發(fā)=485nM，發(fā)射=538nM)讀出所述板。將化合物溶于適當?shù)娜軇┲校诩又罤UVEC培養(yǎng)物中前加至MOLT-4細胞中。通過比較對照溶媒處理的細胞和化合物處理的細胞的粘附(熒光)水平計算粘附抑制。
2.3 體內(nèi)接觸過敏反應(yīng)通過將噁唑酮(50μl 0.24％的丙酮/橄欖油溶液)局部應(yīng)用于剃光的背部皮膚區(qū)域?qū)alb/C雄性小鼠(20-25g)致敏。7天后，通過將噁唑酮(25μl 0.25％的丙酮/橄欖油溶液)局部應(yīng)用于其耳的表面對所述小鼠進行激發(fā)。24小時后發(fā)生該耳的紅腫，測定該耳的厚度并與激發(fā)前的厚度比較，計算耳厚度增加的百分比。在噁唑酮激發(fā)前24小時，由皮下植入的Alzet滲透微型泵使化合物以10mg/kg/天-0.001mg/kg/天的劑量連續(xù)輸注釋放。比較溶媒處理的動物和化合物處理的動物(每組n=6個動物)計算對炎癥反應(yīng)的抑制。
2.4 體內(nèi)卵白蛋白延緩型過敏模型用卵白蛋白(Sigma；0.1ml皮下注射2mg/ml的與完全福氏佐劑混合(1∶1)的溶液，Difco)乳液在脅腹對Balb/C雌性小鼠(20-25g)進行免疫。7天后，通過足底下注射卵白蛋白(30μl的1％熱凝集的卵白蛋白生理鹽水)至左后足墊激發(fā)所述鼠。24小時發(fā)生該足的紅腫，測定該足墊的厚度并與激發(fā)前的厚度比較。計算足墊厚度增加的百分比。在卵白蛋白激發(fā)前24小時，由皮下植入的Alzet滲透微型泵使化合物以10mg/kg/天-0.001mg/kg/天的劑量連續(xù)輸注釋放。比較溶媒處理的動物和化合物處理的動物(每組n=5個動物)計算對炎癥反應(yīng)的抑制。
2.5 體內(nèi)抗原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型用在完全福氏佐劑中的100μg甲基化的BSA(s.c.)對小鼠進行免疫并于7天后加強，接著腹膜內(nèi)注射博代氏桿菌屬百日咳菌。加強兩周后，用100μg甲基化的-牛血清白蛋白(BSA)關(guān)節(jié)內(nèi)激發(fā)加強的動物，通過檢測膝關(guān)節(jié)的紅腫、組織學和急性期蛋白的變化測定炎癥/關(guān)節(jié)炎的程度。通過在激發(fā)前24小時，由皮下植入的Alzet滲透微型泵使化合物以30mg/kg/天-0.001mg/kg/天的劑量連續(xù)輸注釋放。比較對照動物和對側(cè)膝蓋的炎癥/關(guān)節(jié)炎程度。
2.6 實驗的自身免疫腦脊髓炎模型通過s.c.注射脊髓勻漿、髓鞘質(zhì)堿性蛋白(MBP)或腦脊髓(encephalogenic)肽與完全福氏佐劑(CFA)的混合液以及i.p注射百日咳毒素誘導(dǎo)疾病。對于急性病，在免疫后兩天重復(fù)百日咳注射。對于慢性病，省略百日咳，在7天間隔內(nèi)對小鼠注射兩次在CFA中的抗原。用組織學支持的臨床分級評價疾病。通過在激發(fā)前24小時，由皮下植入的Alzet滲透微型泵使化合物以10mg/kg/天-0.001mg/kg/天的劑量連續(xù)輸注釋放。癥狀與對照動物比較。
2.7 小鼠細支氣管灌洗嗜酸性細胞模型在4-5天間隔內(nèi)，通過i.p.注射0.1ml含有100μg卵白蛋白和2.5mg氫氧化鋁的鹽水三次使雄性C57BL/6J小鼠(20-25g)致敏。在最后一次致敏注射10-14天后，將所述動物置于Perspex室內(nèi)，并暴露于由DeVilbiss Aerosonic噴霧器釋放進入空氣流的溶于生理鹽水(高達15mg/ml)的氣霧化卵白蛋白，空氣流以約3L/min的速率進入該室。將小鼠暴露于氣霧化的卵白蛋白2-4小時，連續(xù)3-4天，在最后一次暴露的當天，通過過量的巴比妥鈉使小鼠致死。暴露每個小鼠的氣管，用園端的針進行插管，用4×1ml生理鹽水進行支氣管泡(bronchioalveolar)灌洗。將收集的灌洗液體中的細胞涂于玻璃顯微鏡片上，固定并用Leukostat染色。計數(shù)最少200個白細胞進行差別細胞計數(shù)，并計算嗜酸性細胞的百分比。通過在霧化卵白蛋白激發(fā)前24小時，由皮下植入Alzet滲透微型泵使測試化合物以10mg/kg/天-0.001mg/kg/天的劑量連續(xù)釋放。通過比較給予溶媒組或化合物組小鼠(每組n=5-10)計算嗜酸性細胞的抑制。
2.8 膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型用0.1ml等份的在0.05M乙酸中的牛膠原蛋白Ⅱ型(2mg/ml)和完全福氏佐劑(Sigma)的混合物免疫DBA/l雄性小鼠(ex Harlan/OlacU.K.)。將該混合物在尾底部注射。20分鐘后，通過皮下的Alzet滲透微型泵，使化合物或溶媒以10mg/kg/天-3mg/kg/天的劑量連續(xù)輸注釋放。在第二天，每只動物腹膜內(nèi)加強注射在乙酸中的0.1ml膠原蛋白Ⅱ型。比較溶媒處理和化合物處理的動物的關(guān)節(jié)炎的程度。
表1．環(huán)肽的合成和純化
用反相(C18)1英寸直徑的Vydac柱(218TP1022,22×25mm)進行制備性HPLC。在某些情況下(如表中所述)，可以使用Deltapak柱(30×300mm)或Vydac4”柱。所述溶劑體系含有水和乙腈(每一種都含有0.1％三氟乙酸)。用逐漸增加乙腈濃度的梯度(溶劑的比例和時間列于表中)洗脫所述柱，Vydac柱流速為10ml/min,Deltapak柱為30ml/min,4”Vydac柱為100ml/min。
表2．環(huán)肽的合成和鑒定
<p>用反相(C18)Vydac柱(218TP54,4.6×250mm)或Novapak柱(3.9×150mm)進行分析性HPLC。除特別指明外，在上述表中的化合物使用Vydac柱。所述溶劑體系含有水和乙腈(每一種都含有0.1％三氟乙酸)。用逐漸增加乙腈濃度的梯度洗脫所述柱(溶劑的比例和時間列于表中)，流速為1ml/min。在氨基酸分析時觀察到存在部分非天然的氨基酸，但是沒有估計含量。
權(quán)利要求
1．具有下式的環(huán)肽或其鹽
其中Xaa1可從選自Phe、Lys和Arg的L-氨基酸；選自Phe和Met的D-氨基酸，所述L-和D-氨基酸任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；和MeIle中選擇；Xaa2為Leu，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；Xaa3為Asp，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；Xaa4為Val，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；X1可從選自Ala、Phe、Arg、Lys、Trp、hArg(Et)2、Orn(CHMe2)、Orn(Me2)、Lys(CHMe2)和Arg(Pmc)的D-氨基酸，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；
NH(CH2)5CO和NH(CH2)2S(CH2)yCO，其中y為1或2中選擇；X2可從選自Ala、Arg、Lys、His、hArg(Et)2、Orn(CHMe2)和Orn(Me2)的D-氨基酸，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；NH(CH2)2SCH2CO和NH(CH2)xCO，其中x為2或3中選擇；Xaa5和Xaa6各自獨立為選自Ala和Arg的D-氨基酸，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；p為0或1；q為0或當p為1時，q為0或1；其前提為當Xaa1為MeIle,Xaa2為Leu,Xaa3為Asp,Xaa4為Val,p和q均為0，ⅰ)當X1為D-Ala時，X2不為D-Ala、D-Arg或D-Lys；ⅱ)當X1為
時，X2不為D-Arg；ⅲ)當X1為D-Arg時，X2不為D-Ala、D-Arg或D-His；ⅳ)當X1為D-Orn(CHMe2)或D-Arg(Pmc)時，X2不為D-Ala；ⅴ)當X1為D-Lys時，X2不為D-Ala或D-Lys；和ⅵ)當X1為D-Phe或D-Trp時，X2不為D-Lys或D-Arg。
2．權(quán)利要求1的環(huán)肽或其鹽其中Xaa1可從選自MeIle、MePhe、Lys和Arg的L-氨基酸和選自Phe和Met的D-氨基酸中選擇；Xaa2、Xaa3和Xaa4分別為Leu、Asp和Val；X1可從選自Ala、Phe、Arg、Lys、Trp、hArg(Et)2、Orn(CHMe2)、Orn(Me2)、Lys(CHMe2)和Arg(Pmc)的D-氨基酸；
NH(CH2)5CO和NH(CH2)2S(CH2)yCO，其中y為1或2中選擇；X2可從選自Ala、Arg、Lys、His、hArg(Et)2、Orn(CHMe2)和Orn(Me2)的D-氨基酸；NH(CH2)2SCH2CO和NH(CH2)xCO，其中x為2或3中選擇。Xaa5和Xaa6各自獨立為選自Ala和Arg的D-氨基酸。
3．權(quán)利要求1的環(huán)肽或其鹽，其中X1、X2、(Xaa5)p和(Xaa6)q中的任何兩個為D-Arg。
4．下式的環(huán)肽或其鹽
其中Xaa1可從選自Phe、Lys和Arg的L-氨基酸；選自Phe和Met的D-氨基酸，所述L-和D-氨基酸任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；和MeIle中選擇；Xaa2為Leu，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；Xaa3為Asp，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；Xaa4為Val，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；X1可從選自Ala、Phe、Arg、Lys、Trp、hArg(Et)2、Orn(CHMe2)、Orn(Me2)、Lys(CHMe2)和Arg(Pmc)的D-氨基酸，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；
NH(CH2)5CO和NH(CH2)2S(CH2)yCO，其中y為1或2中選擇；X2可從選自Ala、Arg、Lys、His、hArg(Et)2、Orn(CHMe2)和Orn(Me2)的D-氨基酸，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；NH(CH2)2SCH2CO和NH(CH2)xCO，其中x為2或3中選擇；Xaa5和Xaa6各自獨立為選自Ala和Arg的D-氨基酸，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；p為0或1；q為0或當p為1時，q為0或1；其前提為當p和q都為0時，Xaa1不為MeIle。
5．權(quán)利要求4的環(huán)肽，其中Xaa1為MePhe。
6．具有下式的環(huán)肽或其鹽
其中Xaa1為選自MePhe和MeIle的L-氨基酸；Xaa2為Leu，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；Xaa3為Asp，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；Xaa4為Val，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；X1可從選自Ala和Arg的D-氨基酸，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代；
和NH(CH2)2S(CH2)yCO，其中y為1或2中選擇；X2可從選自Ala和Arg的D-氨基酸，任選在其α-碳或其α-氨基上被C1-4烷基取代和NH(CH2)xCO，其中x為2或3中選擇；Xaa5和Xaa6各自獨立為選自Ala和Arg的D-氨基酸，任選在其α-碳或其α-氨基上被G1-4烷基取代；p為1；q為0或1。
7．權(quán)利要求6的環(huán)肽或其鹽，其中p為1,q為l。
8．權(quán)利要求6的環(huán)肽或其鹽，其中p為1,q為0。
9．權(quán)利要求1的環(huán)肽，其中所述環(huán)肽選自
c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Orn(CHMe2)-D-Orn(CHMe2))c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Lys(CHMe2)-D-Ala)c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Orn(Me2)-D-Orn(Me2))c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-hArg(Et)2)c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Phe-D-hArg(Et)2)e(MeIle-Leu-Asp-Val-D-hArg(Et)2-D-hArg(Et)2)c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Lys-D-His)c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Arg(Pmc)-D-Lys)c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Lys-D-Arg)c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Lys)c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Lys)c(Lys-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala)c(Arg-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala)c(D-Phe-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Lys)c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala)c(D-Phe-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Lys)c(D-Met-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Lys)c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Arg)c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-His)c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Trp-D-Arg)c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Ala-D-Arg)c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala-D-Arg)c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Ala-D-Arg)c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Arg-D-Arg)c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Arg-D-Arg)c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Arg-D-Ala)c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Arg-D-Ala)c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala-D-Arg-D-Arg)c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala-D-Arg-D-Arg)c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Ala)c(D-Arg-MeIle-Leu-Asp-Val-NH(CH2)5CO)c(D-Arg-MeIle-Leu-Asp-Val-NH(CH2)2-S-(CH2)2-CO)c(D-Arg-MeIle-Leu-Asp-Val-NH(CH2)2-S-CH2-CO)c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Arg-NH(CH2)2-S-CH2CO)c(MeIle-Leu-Asp-Val-NH-CH2-CH2-S-CH2-CO-D-Arg-D-Arg)c(MePhe-Leu-Asp-Val-NH-CH2-CH2-S-CH2-CO-D-Arg-D-Arg)。
10．權(quán)利要求9的環(huán)肽選自c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-hArg(Et)2-D-hArg(Et)2)c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Arg)c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-His)c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Trp-D-Arg)c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Ala-D-Arg)c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Ala-D-Arg)c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Arg-D-Arg)c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Arg-D-Arg)c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Arg-D-Ala)c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Arg-D-Ala)c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala-D-Arg-D-Arg)c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala-D-Arg-D-Arg)c(MeIle-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Ala)c(MeIle-Leu-Asp-Val-NH-CH2-CH2-S-CH2-CO-D-Arg-D-Arg)c(MePhe-Leu-Asp-Val-NH-CH2-CH2-S-CH2-CO-D-Arg-D-Arg)。
11．下式的權(quán)利要求10的環(huán)肽c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-His)。
12．下式的權(quán)利要求10的環(huán)肽c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Arg-D-Arg)。
13．下式的權(quán)利要求10的環(huán)肽c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Arg-D-Arg)。
14．下式的權(quán)利要求10的環(huán)肽c(MePhe-Leu-Asp-Val-D-Ala-D-Ala-D-Arg-D-Arg)。
15．含有權(quán)利要求1-14中任何一項的環(huán)肽或其藥學上可接受的鹽以及藥學上可接受的稀釋劑或載體的藥用組合物。
16．制備權(quán)利要求1-14中任何一項的環(huán)肽或其鹽的方法，該方法選自(a)以逐步的方式，裝配所需的線性肽(一次增加一個氨基酸)，接著選擇性去除N-和C-末端任何的保護基團，環(huán)化并最后去質(zhì)子化得到權(quán)利要求1-14中任何一項的環(huán)肽，并任選(如果需要)將如此獲得的產(chǎn)物制成其鹽；(b)通過使兩個肽單元偶合形成酰胺鍵，所述一個肽單元含有羧酸基團或其活性的衍生物，而另一個含有氨基基團，以產(chǎn)生權(quán)利要求1-14中任何一項的保護或未保護的環(huán)肽，并如果需要用下列方法(c)去除保護基團，并任選如果需要將如此獲得的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為其鹽；和(c)從下式的保護的環(huán)肽中除去一個或多個常規(guī)肽保護基團
其中Pr1為Xaa3側(cè)鏈中的所述酸性基團上的保護基團，得到權(quán)利要求1-14任何一項的環(huán)肽，并任選同時或隨后去除存在的任何另外的常規(guī)肽保護基團，并任選如果需要將如此獲得的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為其鹽。
17．在需要此治療的哺乳動物中，抑制VCAM-1和/或纖連蛋白和整聯(lián)蛋白受體VLA-4間相互作用的方法，該方法包括給予所述哺乳動物有效量的權(quán)利要求1-14中任何一項的環(huán)肽、其藥學上可接受的鹽或權(quán)利要求15的藥用組合物。
18．權(quán)利要求17的方法，用于治療多發(fā)性硬化癥、類風濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘或牛皮癬。
19．在需要此治療的哺乳動物中，抑制MAdCAM-1和整聯(lián)蛋白α4β7間相互作用的方法，該方法包括給予所述哺乳動物有效量的權(quán)利要求1-14中任何一項的環(huán)肽、其藥學上可接受的鹽或權(quán)利要求15的藥用組合物。
20．權(quán)利要求1-14中任何一項的環(huán)肽或其藥學上可接受的鹽在制備用于治療由VCAM-1或纖連蛋白和整聯(lián)蛋白受體VLA-4間相互作用介導(dǎo)的疾病或紊亂的藥物中的用途。
21．權(quán)利要求1-14中任何一項的環(huán)肽或其藥學上可接受的鹽在制備用于治療由MAdCAM-1和整聯(lián)蛋白α4β7間相互作用介導(dǎo)的疾病或紊亂的藥物中的用途。
全文摘要
式(Ⅰ)的環(huán)肽或其鹽,其中Xaa
文檔編號C07K14/435GK1222918SQ9719572
公開日1999年7月14日 申請日期1997年6月18日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月18日
發(fā)明者A·S·杜塔 申請人:曾尼卡有限公司