預防和治療豬的繼發(fā)感染的呼吸系統(tǒng)疾病的抗原組合物及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了預防和治療豬的繼發(fā)感染的呼吸系統(tǒng)疾病的抗原組合物，其中，該抗原組合物包含至少一種免疫量的豬繁殖與呼吸綜合征抗原和至少一種免疫量的副豬嗜血桿菌抗原以及佐劑，該豬繁殖與呼吸綜合征抗原和副豬嗜血桿菌抗原各自獨立地包括減毒活全抗原、滅活的全抗原、亞單位抗原、重組活載體抗原和DNA載體的抗原；該抗原組合物不僅不會產生兩種抗原成份的相互免疫干擾或影響，而且豬繁殖與呼吸綜合征和副豬嗜血桿菌抗原有相互增強免疫效果的作用，且該抗原組合物接種程序簡便，安全性好。
【專利說明】預防和治療豬的繼發(fā)感染的呼吸系統(tǒng)疾病的抗原組合物及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種預防和治療副豬嗜血桿菌病與豬繁殖與呼吸綜合征的疫苗組合物及其制備方法，屬于獸用疫苗領域。
【背景技術】
[0002]豬繁殖與呼吸綜合征(PorcineReproductive and RespiratorySyndrome,PRRS)，又稱豬藍耳病，是由單股正鏈RNA豬繁殖和呼吸障礙綜合征病毒引起，以妊娠母豬的繁殖障礙(流產、死胎、木乃伊胎)及各種年齡豬特別是仔豬的呼吸道疾病為特征，現(xiàn)已經成為規(guī)?；i場的主要疫病之一。2006年我國部分地區(qū)爆發(fā)的高致病性豬藍耳病是由豬繁殖與呼吸障礙綜合征(俗稱藍耳病)病毒變異株引起的一種急性高致死性疫病，屬于國家二類動物疫病。該病在我國出現(xiàn)新的流行特點，病毒發(fā)生變異，致病力增強，在部分地區(qū)出現(xiàn)大規(guī)模爆發(fā)流行。臨床以高熱、皮膚發(fā)紺、眼結膜炎、呼吸系統(tǒng)癥狀、神經癥狀及死亡為主，解剖后可見肺臟呈間質性肺炎，淋巴結腫大并伴有出血充血，表現(xiàn)為發(fā)病快、癥狀嚴重、病變明顯，死亡率高，短時間內母豬大量流產，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經濟損失。直至今日，疫病形勢依然嚴峻，同其他病毒性疾病一樣，目前尚無有效的治療性藥物用于繁殖與呼吸綜合征的治療，疫苗免疫接種是防制該病的最有效方法。
[0003]副豬嗜血桿菌病是副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis, Hps)引起的豬的多發(fā)性漿膜炎和關節(jié)炎，該病又稱為豬革拉澤氏病(Glasser’ sDisease) 0副豬嗜血桿菌可以影響從2周齡到4月齡的青年豬，主要在斷奶后和保育階段發(fā)病，通常見于5~8周齡的豬，發(fā)病率可達40%，死亡率可達50%。主要臨床癥狀表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難、消瘦、跛行和被毛粗亂；剖檢可見纖維素性胸膜炎、心包炎、關節(jié)炎和腦膜炎，也可見腹腔器官表面出現(xiàn)纖維素性滲出物，導致腸道之間粘連等。此外，副豬嗜血桿菌還可引起敗血癥，并且在急性感染后可能留下后遺癥，即母豬流產、公豬慢性跛行。在大量分離副豬嗜血桿菌的基礎上，發(fā)現(xiàn)該菌的血清型復雜多樣，按`Kieletein-Rapp-Gabriedson(KRG)瓊脂擴散血清分型方法，至少可將副豬嗜血桿菌分為15個血清型；根據我國血清流行病學調查和分離菌株的鑒定，以4、5型最為流行。近年來，由于我國目前飼養(yǎng)技術的調整進行不當，以及突發(fā)新的呼吸道綜合征，使得該病日趨流行，危害日漸嚴重。
[0004]根據近幾年豬場流行病學研究結果顯示，呼吸系統(tǒng)疾病越來越多，臨床上表現(xiàn)為呼吸道癥狀，主要特征是發(fā)熱、生長遲緩、食欲降低、呼吸困難，死亡豬四肢、耳朵發(fā)紫；母豬流產前體溫升高，厭食，尤其第一胎的母豬更為常見。死亡豬剖檢呈現(xiàn)心包炎、胸膜炎、腹膜炎和關節(jié)炎，肺部炎癥，淋巴結出血、腫大。從發(fā)病豬中分離出最常見的病原體是豬繁殖與呼吸綜合征病毒和副豬嗜血桿菌，然而，本發(fā)明人在一項重現(xiàn)表現(xiàn)上述癥狀的呼吸系統(tǒng)疾病時發(fā)現(xiàn)，當豬群中只感染副豬嗜血桿菌，并不會引發(fā)疾病，只有當豬群中存在繁殖與呼吸綜合征的情況下，才會引發(fā)上述癥狀的呼吸系統(tǒng)疾病。表明這些癥狀的病豬是由這兩種病原體協(xié)同作用引起，并且，一旦繼發(fā)感染副豬嗜血桿菌引發(fā)疾病，各種抗菌藥物均難以奏效。
[0005]近年來，人們發(fā)現(xiàn)豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的豬易繼發(fā)感染其他病原，特別是侵害呼吸系統(tǒng)的病原體，臨床上最常見的是多殺性巴氏桿菌、肺炎支原體、鏈球菌、副豬嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、波氏桿菌和沙門氏菌等，造成豬群高發(fā)病率與高死亡率。楊漢春(“豬免疫抑制性疾病的流行特點與控制對策”，中國畜牧獸醫(yī)，2004，31 (5):41-43)、萬遂如(“防控豬免疫抑制的主要技術措施”，養(yǎng)豬，2009，1:42-46)等研究發(fā)現(xiàn)藍耳病病毒在豬體內的持續(xù)性感染還可導致豬瘟疫苗的體液免疫受到明顯的抑制，影響豬瘟弱毒疫苗的免疫效果，因此認為豬繁殖與呼吸綜合征是一種免疫抑制性疾病。
[0006]目前市場沒有出現(xiàn)副豬嗜血桿菌病和藍耳病的組合疫苗，以及二者的同時聯(lián)合使用，這是因為存在副豬嗜血桿菌滅活疫苗會對藍耳病活疫苗免疫效果產生影響，可能的原因有:一是滅活疫苗使用的油性佐劑粘度太大不能作為稀釋劑稀釋活疫苗；二是滅活疫苗部分所含的有毒成分:滅活劑如甲醛；防腐劑如硫柳汞、疊氮鈉；毒素如大量內毒素、培養(yǎng)過程代謝物及雜蛋白等對活疫苗毒價影響顯著而使活疫苗效力下降。而且市售商品疫苗需多次免疫，成本較高，對豬只的應激較大。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明所要解決的問題為提供一種能夠預防和治療豬的繼發(fā)感染的呼吸系統(tǒng)疾病的抗原組合物，所述抗原組合物包括至少一種免疫量的豬繁殖與呼吸綜合征抗原和至少一種免疫量的副豬嗜血桿菌抗原，所述豬繁殖與呼吸綜合征抗原和副豬嗜血桿菌抗原各自獨立地包含減毒活全抗原、滅活的全抗原、亞單位抗原、重組活載體抗原和DNA載體的抗原。所述呼吸系統(tǒng)疾病主要特征是發(fā)熱、生長遲緩、食欲降低、呼吸困難，死亡豬四肢、耳朵發(fā)紫。死亡豬剖檢呈現(xiàn)心包炎、胸膜炎、腹膜炎和關節(jié)炎。應該理解，對于給定組合，不一定使用相同形式。 此外，正如人們所已知的，抗原制品可包含獸醫(yī)學上可接受的載體或賦形劑，并可選擇包含獸醫(yī)學上可接受的佐劑。
[0008]本發(fā)明所要解決的另一個問題為提供一種能同時預防和治療豬繁殖與呼吸綜合征和副豬嗜血桿菌病的疫苗組合物，在給豬接種豬繁殖與呼吸綜合征疫苗，并聯(lián)合接種副豬嗜血桿菌疫苗。可以理解為給豬同時接種豬繁殖與呼吸綜合征疫苗和副豬嗜血桿菌疫苗。以解決在預防這兩種疾病時所面臨的上述問題，且在此過程中意外的發(fā)現(xiàn)，同時接種用副豬嗜血桿菌滅活疫苗稀釋的豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗，沒有影響抗副豬嗜血桿菌抗體的產生，抗原之間沒有出現(xiàn)相互干擾。聯(lián)合使用后，可以減輕豬繁殖與呼吸綜合征強病毒攻擊時的臨床癥狀，而且副豬嗜血桿菌病滅活疫苗抗原含量減半也能達到單獨使用時的免疫效果。
[0009]本發(fā)明的主題還涉及抵抗一種豬的繼發(fā)感染的呼吸系統(tǒng)疾病的免疫原性組合物或疫苗，其包含處于獸醫(yī)學上可接受的載體或賦形劑之中的有效量的上述豬繁殖與呼吸綜合征抗原+副豬嗜血桿菌抗原制品，并可選擇包含獸醫(yī)學上可接受的佐劑。免疫原性組合物引起免疫應答。因此，術語“免疫原性組合物”包括“疫苗組合物”。
[0010]本發(fā)明主題還涉及包裝上分開的抵抗豬繁殖與呼吸綜合征的抗原制品或免疫原性組合物或疫苗和抵抗副豬嗜血桿菌的抗原制品或免疫原性組合物或疫苗的免疫或疫苗接種試劑盒。所述試劑盒可具有上述定義抗原制品、免疫原性組合物和疫苗的各種特征。[0011]本發(fā)明主題還有抵抗一種豬的繼發(fā)感染的呼吸系統(tǒng)疾病的免疫或疫苗接種方法，包括施用抵抗豬繁殖與呼吸綜合征的免疫原性組合物或疫苗和抵抗副豬嗜血桿菌的免疫原性組合物或疫苗，或施用在同一制劑中包含一種對兩種病原均特異的抗原制品的二聯(lián)免疫原性組合物或疫苗。具體地，所述免疫或接種方法使用上述疫苗。
[0012]本發(fā)明的主題還在于抵抗特別是以上定義的抵抗副豬嗜血桿菌的抗原制品或免疫原性組合物或疫苗，聯(lián)合抵抗豬繁殖與呼吸綜合征的抗原制品或免疫原性組合物或疫苗，在制備用于抵抗一種豬的繼發(fā)感染的呼吸系統(tǒng)疾病的藥物組合物中的應用。
[0013]在聯(lián)合免疫或疫苗接種計劃中，抵抗豬繁殖與呼吸綜合征和副豬嗜血桿菌的免疫或疫苗接種也可聯(lián)合抵抗其它豬病原體特別是可能與繼發(fā)感染的呼吸系統(tǒng)疾病有關的病原體的免疫或疫苗接種。因此，根據本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗可包含與其它豬病原體相應的其他效價，這些豬病原體選自豬肺炎支原體、和/或豬鼻支原體、和/或豬傳染性胸膜肺炎、和/或豬萎縮性鼻炎、和/或豬流感病毒、和/或偽狂犬病毒、和/或豬圓環(huán)病毒、和/或豬霍亂及其組合。因此，可使用任何形式的免疫原性組合物或疫苗，特別是任何可獲得的商業(yè)疫苗，以便其與本文所述的抵抗豬繁殖與呼吸綜合征和副豬嗜血桿菌的免疫原性組合物或疫苗聯(lián)合使用。
[0014]因此，本發(fā)明主題還在于多價免疫原性組合物和疫苗、多疫苗試劑盒、以及使得可采用這種聯(lián)合免疫或疫苗接種計劃的聯(lián)合免疫或疫苗接種方法。
[0015]技術方案
[0016]本發(fā)明提供了預防和治療一種豬的繼發(fā)感染的呼吸系統(tǒng)疾病的抗原組合物，其中，所述抗原組合物包含至少一種免疫量的豬繁殖與呼吸綜合征抗原和至少一種免疫量的副豬嗜血桿菌抗原以及佐劑，所述豬繁殖與呼吸綜合征抗原和副豬嗜血桿菌抗原各自獨立地包括減毒活全抗原、滅活的全抗原、亞單位抗原、重組活載體抗原和DNA載體的抗原。
[0017]所述“豬繁殖與呼吸綜合征抗原”是指含有至少一種抗原的任何組合物，所述抗原當對豬給藥時，可誘導、刺激或增強抵抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的免疫應答。優(yōu)選地，本發(fā)明所述疫苗組合物中，豬繁殖與呼吸綜合征抗原為全病毒抗原，包括本領域技術人員熟知的臨床分離的野毒株，含有，優(yōu)選為滅活形式的豬繁殖與呼吸綜合征全病毒，改良的豬繁殖與呼吸綜合征活病毒或減毒的豬繁殖與呼吸綜合征病毒，含有至少豬繁殖與呼吸綜合征病毒的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，任何其它含至少豬繁殖與呼吸綜合征病毒的免疫原性氨基酸序列的多肽、亞單位或其他成分，豬繁殖與呼吸綜合征抗原還可以包含以下組合物的任一種抗原:如勃林格殷格翰動物保健(美國)有限公司生產的豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(Ingelvac_?prrs mlv)沖牧實業(yè)股份有限公司成都藥械廠、齊魯動物保健品有限公司等多家公司生產的豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗(NVDC-JXA1株)和哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司生產的豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗滅活疫苗(CH-1a株)；哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司生產的豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(CH-1R株)；廣東大華農動物保健品股份有限公司等生產的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXA1-R株)；江蘇南農高科技股份有限公司等生產的豬繁殖與呼吸綜合癥活疫苗(R98);哈藥集團生物疫苗有限公司等生產的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(HuN4-F112株)；新疆天康畜牧生物技術股份有限公司生產的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(TJM-F92株)。
[0018]優(yōu)選地，所述豬繁殖與呼吸綜合征抗原為NVDC-JXAl-R減毒全病毒疫苗，所述副豬嗜血桿菌抗原為血清型4型JS株和血清5型ZJ株的滅活全菌疫苗，所述副豬嗜血桿菌血清4型JS株保藏號為CCTCCN0.M2011172,所述副豬嗜血桿菌血清5型ZJ株保藏號為CCTCCN0.M2011173。
[0019]更優(yōu)選地，本發(fā)明所述疫苗組合物中，所述豬繁殖與呼吸綜合征全病毒抗原為每頭份病毒含量IO4 5TCID5tl~IO7 tlTCID5ci;更優(yōu)地，所述全病毒抗原為每頭份病毒含量IO4-8TCID50~106_ 5TCID5tl ;再優(yōu)選地，所述全病毒抗原為每頭份病毒含量105_°TCID5(I。
[0020]所述“副豬嗜血桿菌抗原”是指包含至少一種抗原的任何組合物，所述副豬嗜血桿菌抗原在對豬給藥后可誘導、刺激或增強抗副豬嗜血桿菌感染的免疫應答。優(yōu)選地，所述副豬嗜血桿菌抗原是完整的副豬嗜血桿菌全菌，包括本領域技術人員熟知的臨床分離的野菌株，含有，優(yōu)選為滅活形式的副豬嗜血桿菌全菌，改良的副豬嗜血桿菌活菌或減毒的副豬嗜血桿菌，含有至少副豬嗜血桿菌的免疫原性氨基酸序列的嵌合菌株，任何其它含至少副豬嗜血桿菌的免疫原性氨基酸序列的多肽、亞單位或其他成分，副豬嗜血桿菌抗原還可以包含以下組合物的任一種抗原:如勃林格殷格翰動物保健(美國)有限公司生產的副豬嗜血桿菌病滅活疫苗(Z-1517株)，西班牙海博萊生物大藥廠生產的副豬嗜血桿菌病滅活疫苗(血清I型SVl +血清6型SV6)，華中農業(yè)大學、武漢科前動物生物制品有限責任公司、中牧實業(yè)股份有限公司生產的副豬嗜血桿菌病滅活疫苗(血清4型MD0322 +血清5型SH0165)，山東省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所的副豬嗜血桿菌病滅活疫苗(血清I型LC株+血清5型LZ 株)。
[0021]更優(yōu)選地，所述血清4型副豬嗜血桿菌全病毒抗原含量為滅活前5X IO8CFU/頭份~8X IO9CFU/頭份；更優(yōu)地，所述副豬嗜血桿菌全病毒抗原含量為滅活前為4X IO9CFU/頭份，再優(yōu)選所述血清4型副豬嗜血桿菌全病毒抗原含量為滅活前2 X IO9CFU/頭份。
[0022]所述血清5型副豬嗜血桿菌全病毒抗原含量為滅活前5X108CFU/頭份~8 X IO9CFU/頭份；更優(yōu)地，所述副豬嗜血桿菌全病毒抗原含量為滅活前4 X IO9CFU/頭份，再優(yōu)選所述血清5型副豬嗜血桿菌全病毒抗原含量為滅活前2 X IO9CFU/頭份。
[0023]優(yōu)選地，所述佐劑包括納米化氫氧化鋁膠、礦物油、卡波姆、MONTANIDE GEL ST、蜂膠、細胞因子、脂質體、免疫刺激復合物、含CpC脫氧寡核苷酸、納米化ISA206、ISA760VG、納米化磷酸鋁、皂苷、山梨聚糖、植物油、油酸乙酯、二 (辛酸/癸酸)丙二醇酯、三(辛酸/癸酸)甘油酯、二油酸丙二醇酯、異硬脂酸酯、山梨聚糖、二縮甘露醇、甘油、聚甘油、丙二醇、油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸、羥基硬脂酸酯、聚氧丙烯、聚氧乙烯嵌段共聚物、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、順丁烯二酸酐與烯基衍生物共聚物、糖或多元醇的聚烯基醚交聯(lián)的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物的的一種或幾種組合物。
[0024]優(yōu)選地，所述佐劑為水性佐劑，術語水性佐劑是不含油或含油量為5%(w/v)的佐劑的統(tǒng)稱。例如卡波姆水溶液、SEPPIC公司生產的MONTANIDE GEL ST水性佐劑、納米化氫氧化鋁膠。更優(yōu)選地， 所述佐劑為水性佐劑，所述水性佐劑包括卡波姆水溶液、206佐劑、納米化氫氧化招膠佐劑、Montanide IMS1313 VG、Montanide ISA15A VG、Montanide GEL 01PR以及Montanide GEL ST聚合物佐劑。
[0025]本發(fā)明還提供了一株血清4型副豬嗜血桿菌JS株，保藏號為CCTCCN0.M2011 172 ；和一株血清5型副豬嗜血桿菌ZJ株，保藏號為CCTCCN0.M2011173。
[0026]本發(fā)明的優(yōu)選方式涉及疫苗組合物的耐熱凍干保護劑，優(yōu)選為明膠、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、谷氨酸鈉、牛血清白蛋白、山梨醇、羧甲基纖維素鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、乳糖、脫脂牛奶的一種或幾種組合物。
[0027]優(yōu)選地，所述NVDC-JXAl-R減毒全病毒疫苗還包括耐熱凍干保護劑，所述耐熱凍干保護劑包括1%~2%明膠、5%~10%海藻糖、1%~2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、0.5%~2%谷氨酸鈉、0.1%~2%牛血清白蛋白、0.1%~1%山梨醇、0.1%~0.2%羧甲基纖維素鈉、
0.164%磷酸二氫鉀以及0.052%磷酸氫二鈉,其余為水。
[0028]作為本發(fā)明豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗-副豬嗜血桿菌病滅活疫苗組合物的優(yōu)選實施方案，所述副豬嗜血桿菌滅活疫苗部分，菌液制備用培養(yǎng)基為本實驗室優(yōu)選的副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基(MHPs):多聚蛋白胨(5~10g/L)、酵母抽提物(3~10g/L)、谷氨酸鈉(2~8g/L)、水解乳蛋白(I~5g/L)、氯化鈉(I~6g/L)、磷酸氫二鉀(I~5g/L)、葡萄糖(0.1~4g/L)，用NaOH調pH值至6.8~8.0，116~121°C滅菌10~40min，再加入豬血清(5~100ml/L)、l%的NADH (I~50ml/L)，制備固體培養(yǎng)基時在滅菌前加入瓊脂粉(I~20g/U?？乖浔葹?:1 (血清4型JS株:副豬嗜血桿菌血清5型ZJ株)，抗原總體積為所述疫苗總體積的75%~90%，疫苗中含量為滅活前副豬嗜血桿菌血清4型和5型活菌數均為5.0XlO8CFU / 頭份~8.0XlO9CFU / 頭份。
[0029]作為本發(fā)明豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗-副豬嗜血桿菌病滅活疫苗組合物的優(yōu)選實施方案，所述豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗部分，PRRS弱毒是國內流行的毒株經過化學的或者其他方法致弱的且證明不返強的CH-1R株、JXAl-R株、R98株、HuM-Fl 12株或者TJM-F92株，加入耐熱凍干保護劑為1%~2%明膠、5%~10%海藻糖、1%~2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、0.5%~2%谷氨酸鈉、0.1%~2%牛血清白蛋白、0.1%~1%山梨醇、0.1%~0.2%羧甲基纖維素鈉、0.164%磷酸二氫鉀、0.052%磷酸氫二鈉，凍干后即為成品(每頭份病毒含量 104.5TCID5tl ~107.ciTCID50)。
[0030]本發(fā)明提供了一種制備預防和治療豬的繼發(fā)感染的呼吸系統(tǒng)疾病的抗原組合物的方法，所述方法包括制備豬繁殖與`呼吸綜合征活疫苗的步驟和制備副豬嗜血桿菌滅活疫苗的步驟:
[0031]所述制備豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗的步驟包括增殖所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒，與耐熱凍干保護劑混合制備，凍干得豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗；
[0032]所述制備副豬嗜血桿菌滅活疫苗的步驟包括增殖所述副豬嗜血桿菌，滅活，與佐劑混合配制。
[0033]副豬嗜血桿菌病滅活疫苗的制備包括如下步驟:⑴分別將副豬嗜血桿菌血清4型JS株、5型ZJ株菌種繁殖培養(yǎng)，得到副豬嗜血桿菌4型JS株菌液、5型ZJ株菌液分別將步驟⑴培養(yǎng)得到的副豬嗜血桿菌4型JS株菌液、5型ZJ株菌液按各自總量加入0.3%的甲醛溶液，放置37°C滅活24h，期間攪拌3~5次，根據計數結果超濾菌液；⑶將上述已滅活、超濾的副豬嗜血桿菌4型JS株菌液1:1比例混合，然后和佐劑進行乳化，佐劑含量為10%~25% ;成品副豬嗜血桿菌病滅活疫苗抗原含量為滅活前副豬嗜血桿菌血清4型和5型活菌數均為5.0X IO8CFU /頭份~8.0X IO9CFU /頭份。⑷以適量體積分裝新型副豬嗜血桿菌病滅活疫苗。豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗的制備方法包括如下步驟:⑴潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)生物反應器中，加入1.0X IO9~2.0X 109cells/g微載體的Marc-145細胞或其克隆細胞株傳代細胞及細胞生長液，培養(yǎng)傳代細胞，運行程序:載體上下運行頻率為O~lOmm/s，載體在載體瓶中上下端點停留時間為O~2min。⑵傳代細胞培養(yǎng)至1.5X 101(lcellS/L~2.0父101(1(^118/1時換用細胞維持液，按照感染復數為1 0.1.=0.0001~1.0接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒，培養(yǎng)豬繁殖與呼吸綜合征病毒；(3)收獲豬繁殖與呼吸綜合征病毒液加入耐熱凍干保護劑進行凍干，制得豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗。
[0034]作為本發(fā)明豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗-副豬嗜血桿菌病滅活疫苗組合物的優(yōu)選實施方案，所述組合物要進行相容性檢驗，各取2瓶活疫苗部分，分別用副豬嗜血桿菌病滅活疫苗部分(待檢稀釋液)和參考稀釋液(無菌注射用水)，按照使用說明(活疫苗部分I頭份/瓶，滅活疫苗部分I頭份(2ml)/瓶)復原。20±3°C放置2h，依照豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗滴定方法檢驗。通過與參考稀釋液的比較，評估待檢稀釋液對病毒活性組分的影響，病毒組分的滴定結果的差值應不超過0.71ogl0。
[0035]本發(fā)明還提供了一種所述抗原組合物在制備預防和治療豬的繼發(fā)感染的呼吸系統(tǒng)疾病藥物中應用。
[0036]優(yōu)選地，所述應用包括在應用前用所述副豬嗜血桿菌滅活疫苗復原所述豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗。
[0037]本發(fā)明還提供了一種試劑盒，所述試劑盒包括在包裝上分開的抵抗豬繁殖與呼吸綜合征的抗原制品或免疫原性組合物或疫苗和抵抗副豬嗜血桿菌的抗原制品或免疫原性組合物或疫苗。
[0038]技術效果
[0039]本發(fā)明采用了副豬嗜血桿菌血清4型、5型和豬繁殖與呼吸綜合征毒株，發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)不僅幾株毒株的免疫效果良好，而且相互之間不影響，能夠有效預防預防由副豬嗜血桿菌引起的副豬嗜血桿菌病和豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的豬藍耳病及其二者的混合感染；本發(fā)明滅活疫苗部分采用了水溶性聚合物類佐劑和適宜的配苗技術制備了副豬嗜血桿菌病滅活疫苗，用其作為稀釋劑可以稀釋豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗，二者作為組合物聯(lián)合使用安全、質量可控，免疫效果良好，攻毒保護率達到80%~100%。
[0040]本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點:
[0041]I)解決了現(xiàn)有技術困難，改變了人們對豬繁殖與呼吸綜合征病毒和副豬嗜血桿菌同時感染時的認識偏見，首次將豬繁殖與呼吸綜合征抗原和副豬嗜血桿菌抗原按照合適的比例聯(lián)合使用，尤其是，首次將副豬嗜血桿菌滅活抗原用作稀釋豬繁殖與呼吸綜合征活抗原這種疫苗組合方式來使用，而在本發(fā)明之前，一直沒有人認為兩種病可以同時進行預防進而這兩種疫苗可以聯(lián)合使用。
[0042]11本發(fā)明的豬繁殖與呼吸綜合征和副豬嗜血桿菌抗原組合物及使用所述抗原組合物制備的預防和治療豬繁殖與呼吸綜合征和副豬嗜血桿菌感染的二聯(lián)疫苗，不僅不會產生兩種抗原成份的相互免疫干擾或影響，而且意外發(fā)現(xiàn)豬繁殖與呼吸綜合征和副豬嗜血桿菌的抗原混合后，豬繁殖與呼吸綜合征和副豬嗜血桿菌的抗原組合物不僅能產生的保護性免疫應答的同時，還意外發(fā)現(xiàn)豬繁殖與呼吸綜合征和副豬嗜血桿菌抗原有相互增強免疫效果的作用，而且如本發(fā)明后`續(xù)實施例所證明的，特別是存在其中一種抗原的情況下，另一種抗原量減半仍能維持本抗原的免疫效果，而這出乎本領域普通技術人員預料的。
[0043]本發(fā)明的豬繁殖與呼吸綜合征和副豬嗜血桿菌抗原組合物及使用所述組合物制備的預防和治療豬繁殖與呼吸綜合征和副豬嗜血桿菌感染的二聯(lián)疫苗，與豬繁殖與呼吸綜合征或副豬嗜血桿菌的單疫苗的效力相比，在對豬注射免疫過程中，豬體無副反應，注射部位不會發(fā)生紅腫、化膿等炎癥反應，因此，本發(fā)明的二聯(lián)疫苗安全性更佳，可以避免多次接種免疫出現(xiàn)的不良反應。
[0044]4)含有兩種或兩種以上抗原、可以預防兩種或兩種以上疾病的聯(lián)合疫苗以其方便、多效、低成本成為新一代疫苗研究的特點。與單一疫苗相比，聯(lián)合疫苗可以減少疫苗的接種次數，避免因漏種而不能得到全程免疫。
[0045]5)本發(fā)明預防和治療豬肺炎支原體相關疾病和豬鏈球菌相關疾病的二聯(lián)疫苗，制備方法簡單，疫苗的效價含量高，免疫方便快捷，與現(xiàn)有技術中的多次免疫，至少需要打2針或3針才能防治以上二種疾病的疫苗及其免疫方法相比，本發(fā)明僅免疫I次就能夠預防豬肺炎支原體和豬鏈球菌兩種病原感染，降低了免疫成本，節(jié)約了免疫程序，更加經濟可
O
[0046]6)此外，本 申請人:在一項重現(xiàn)主要特征是傳播迅速、體溫升高、食欲降低、呼吸困難，死亡豬四肢、耳朵發(fā)紫，剖檢可見間質性肺炎、心包積液、腹膜器官表面大量纖維性滲出物、腸管和腹腔壁粘連、關節(jié)腫大并有積液和淋巴結腫大的呼吸系統(tǒng)疾病時發(fā)現(xiàn)，當豬群中只感染副豬嗜血桿菌，并不會出現(xiàn)以上大量特征性臨床癥狀及病變，只有當豬群中存在繁殖與呼吸綜合征的情況下，才會引發(fā)上述癥狀的呼吸系統(tǒng)疾病。意外發(fā)現(xiàn)這些癥狀的病豬是由這兩種病原體協(xié)同作用引起，并且，一旦繼發(fā)感染副豬嗜血桿菌引發(fā)混合感染，各種抗菌藥物均難以奏效，發(fā)病迅速、死亡率高。本發(fā)明豬繁殖與呼吸綜合征和副豬嗜血桿菌抗原組合物對所述呼吸系統(tǒng)疾病有良好的預防了控制作用。
[0047]菌株保藏說明:
[0048]副豬嗜血桿菌病血清4型JS株
[0049]分類命名:副豬嗜血桿菌血清4型JS株(Haemophilus parasuisSerotype
4,strain JS),`
[0050]保藏號為:CCTCCΝ0:Μ 2011172;
[0051]保藏日期:2011年5月18日，
[0052]保藏地址:中國武漢,武漢大學，中國典型培養(yǎng)物保藏中心
[0053]保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)。
[0054]副豬嗜血桿菌病血清5型ZJ株:
[0055]分類命名:副豬嗜血桿菌血清5型ZJ株(Haemophilus parasuisSerotype
5,strainZJ),
[0056]保藏號為:CCTCCΝ0:Μ 2011173;
[0057]保藏日期:2011年5月18日，
[0058]保藏地址:中國武漢,武漢大學，中國典型培養(yǎng)物保藏中心
[0059]保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0060]圖1為潮汐式微載體懸浮生物反應器示意圖；
[0061]圖2為副豬嗜血桿菌疫苗內毒素含量測定結果。
[0062]附圖標記[0063]進料桶1、收料桶2、自動饋料儀3、pH/DO監(jiān)控器4、恒溫振蕩箱5、培養(yǎng)液袋6、電腦控制器7、載體罐8、載體9、恒溫培養(yǎng)艙10、進/取樣管11。
【具體實施方式】
[0064]本發(fā)明實施例中采用的潮汐式生物反應器結構如圖1所示。
[0065]載體罐8放置于恒溫培養(yǎng)艙10中，恒溫培養(yǎng)艙10為載體罐8提供一個恒溫的環(huán)境。載體罐8是細胞培養(yǎng)與病毒增殖的場所，細胞貼附生長在載體罐8內部的載體9上，當培養(yǎng)液袋6內的培養(yǎng)液泵入載體罐8時，載體罐8內的培養(yǎng)液液面上升并淹沒細胞，向細胞供給養(yǎng)分，并將細胞的新陳代謝產物從細胞上去除。當載體罐8內的培養(yǎng)液泵入培養(yǎng)液袋6時，載體罐8中的培養(yǎng)液液面隨之下降，細胞露出，進行通風供氧。間歇淹沒與暴露載體床的培養(yǎng)方式使載體9上的細胞能夠得到足夠的營養(yǎng)和氧氣，同時產生的代謝廢物能夠有效地被排出去。
[0066]載體罐8的蓋子上裝有數根管道，這些管道的作用包括:人工手動方式向載體罐8內注入液體(如接種細胞懸液等)或排出載體罐8內的液體；由電腦控制器7控制向載體罐8注入氣體，氣體通常是壓縮空氣、氧氣及CO2三種的混合物，三種氣體在混合物中的比例可以自動調節(jié)控制，以適應細胞培養(yǎng)需要。電腦控制器7可自動控制混合氣體向載體罐8內的注入與排出，并為潮汐提供動力。培養(yǎng)液袋6用以盛裝培養(yǎng)液，并通過兩條管道與載體罐8底部相通，兩條管道分別為液體灌流通道，通過與載體罐8之間的液體流動，從而完成潮汐過程。培養(yǎng)液在潮汐過程中的灌流速度可通過電腦控制器7進行調整。培養(yǎng)液的換液量是指在一次潮汐過程中，泵入或泵出載體罐8的液體量，換液量的大小決定了載體罐8內液面頂部和底部所處的位置。在培養(yǎng)液袋6與載體罐8之間相連通的管道上設有進/取樣管11，可使用無菌注射器通過進/取樣管11對培養(yǎng)液進行取樣，用以檢測其中的葡萄糖含量及病毒含量等指標 。葡萄糖的添加:若葡萄糖低于規(guī)定標準，則根據葡萄糖測定儀測定培養(yǎng)液中剩余葡萄糖的含量，及培養(yǎng)液的總體積計算出需補加的葡萄糖量，利用無菌注射器抽取配制的葡萄糖溶液從進/取樣管11中注射到載體罐8與培養(yǎng)液袋6之間的導管中，葡萄糖溶液隨著載體罐的換液得以從導管進入培養(yǎng)液袋6并做進一步混勻。恒溫振蕩箱5通過加熱與振蕩，來維持培養(yǎng)液袋6內培養(yǎng)液溫度的恒定及成分的勻質性。pH/DO監(jiān)控器4可以監(jiān)測培養(yǎng)液袋內培養(yǎng)液的酸堿度(pH值)及溶氧(D0)，并通過注入堿性溶液(NaOH或NaHCO3溶液)將培養(yǎng)液的PH值控制在合適范圍內。收料桶2及進料桶I均通過自動饋料儀3與培養(yǎng)液袋6相連，培養(yǎng)液袋6內的培養(yǎng)液需要進行收獲時，可通過自動饋料儀3進入收料桶2，而進料桶I內的培養(yǎng)液則可以通過自動饋料儀3對培養(yǎng)液袋6進行補充。
[0067]本發(fā)明的方法對于所用的設備、裝置或儀器沒有特殊要求，其他各種類型的生物反應器也可以使用本發(fā)明的方法完成。
[0068]本發(fā)明的具體實驗方法可參見《中華人民共和國獸藥典(二〇一〇年版)》及附錄。其他未注明的試劑或原料均可由本領域技術人員根據現(xiàn)有技術獲得。
[0069]下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內。實施例1潮汐式微載體懸浮生物反應器大規(guī)模生產豬繁殖與呼吸綜合征病毒及疫苗制備
[0070]本實施例中所用的微載體為聚酯纖維，用于制備繁殖與呼吸綜合征病毒抗原的病毒株為NVDC-JXAl-R毒株(該毒株公開于中國專利CN101307305A，以保藏號N0.1964保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心)，以對繁殖與呼吸綜合征病毒具有良好敏感性的細胞系非洲綠猴腎細胞(Marc-145細胞)，作為制苗用細胞系，選用20L載體瓶潮汐式生物反應器。
[0071]I).細胞的接種與培養(yǎng)
[0072]先使用細胞生長液(含5%牛血清MEM培養(yǎng)基，pH值為7.25)利用轉瓶擴增培養(yǎng)Marc-145細胞。20L生物反應器中，加入無菌載體1300g，把轉瓶內的細胞消化分散后以細胞密度為1.0X 109Cells/L接入20L生物反應器中，使之與載體結合，生物反應器與裝有生長液的37°C恒溫振蕩箱5 (容量500L)連接，培養(yǎng)條件為吸附程序:培養(yǎng)液的液面上升速度5mm / s,下降速度3mm / s,液面在反應器上下端點停滯時間為60s/10s。培養(yǎng)溫度37.0°C, pH值調節(jié)7.3，溶氧調節(jié)65%，二氧化碳濃度調節(jié)10%。
[0073]自運行吸附程序計時，3h后啟動培養(yǎng)程序:培養(yǎng)液的液面升降速度均為4mm/ s,液面在反應器上下端點停滯時間為50s/50 S。灌注培養(yǎng)5天，培養(yǎng)溫度37.(TC，采用7.5%(W / V) NaHCO3自動調節(jié)pH值，使pH值控制在7.2左右，溶氧為50%，二氧化碳濃度為5%。細胞接種后按每24h的時間點取載體樣和培養(yǎng)基樣，控制培養(yǎng)液中葡萄糖濃度1000~4500mg / L0
[0074]2)病毒的接種與培養(yǎng)在20L潮汐式懸浮培養(yǎng)生物反應器中，細胞培養(yǎng)至第5天，Marc-145細胞在生物反應器內的密度達3.5 X IOltl個/L，把培養(yǎng)液袋6中的培養(yǎng)液換成維持液含有1%牛血清的標準MEM培養(yǎng)基)，按M.0.1.為0.001接種繁殖與呼吸綜合征病毒。運行接毒程序:培養(yǎng)液的液面上升速度4mm/s，下降速度2mm/s，液面在反應器頂部停留55s，底部停留10s，病毒吸附3h。之`后，運行病毒培養(yǎng)程序:維持液的液面上升與下降速度均為4mm/s，液面在反應器頂部停留50s，底部停留50s。培養(yǎng)溫度37.5°C ;采用7.5% (ff/V) NaHCO3自動調節(jié)pH，使pH值維持在7.2 ;溶氧為30%，二氧化碳濃度為3%。
[0075]4)病毒的收獲培養(yǎng)至接毒后第3天即收獲病毒液，先對載體瓶8運行病毒液排出程序，使之全部流入培養(yǎng)液袋6中，對培養(yǎng)液袋6中的病毒液，采用50L的自動收料桶2按照5L/min的流速進行收集，一 20°C保存。收獲病毒液500L，病毒滴度保持在109 5TCID50/ml以上。
[0076]Marc-145細胞在利用其他體積的潮汐式生物反應器時，細胞培養(yǎng)和病毒增殖情況基本相同，收獲病毒也的滴度也無明顯差異。
[0077]5)制苗毒液的檢驗:按照高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXAl-R株)檢驗規(guī)程進行。
[0078]6)配苗、分裝及凍干:將檢驗合格的病毒液，混合于同一容器中，按1:1 (v/v)加入1%~2%明膠、5%~10%海藻糖、1%~2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、0.5%~2%谷氨酸鈉、0.1%~2%牛血清白蛋白、0.1%~1%山梨醇、0.1%~2%羧甲基纖維素鈉、0.164%磷酸二氫鉀、0.052%磷酸氫二鈉和水組成的耐熱凍干保護劑組分及配方(見表1，按百分比表示)，充分混勻，定量分裝；分裝后迅速進行冷凍真空干燥后即得成品(每頭份病毒含量105°TCID5。)。[0079]表1耐熱凍干保護劑組分及配方
[0080]
【權利要求】
1.預防和治療豬的繼發(fā)感染的呼吸系統(tǒng)疾病的抗原組合物，其中，所述抗原組合物包含至少一種免疫量的豬繁殖與呼吸綜合征抗原和至少一種免疫量的副豬嗜血桿菌抗原以及佐劑，所述豬繁殖與呼吸綜合征抗原和副豬嗜血桿菌抗原各自獨立地包括減毒活全抗原、滅活的全抗原、亞單位抗原、重組活載體抗原和DNA載體的抗原。
2.根據權利要求1所述的抗原組合物，其中，所述豬繁殖與呼吸綜合征抗原為NVDC-JXAl-R減毒全病毒疫苗，所述副豬嗜血桿菌抗原為血清型4型JS株和血清5型ZJ株的滅活全菌疫苗，所述副豬嗜血桿菌血清4型JS株保藏號為CCTCC N0.M2011172，所述副豬嗜血桿菌血清5型ZJ株保藏號為CCTCC N0.M2011173。
3.根據權利要求1或2所述的抗原組合物，其中，所述豬繁殖與呼吸綜合征全病毒抗原為每頭份病毒含量IO4 5TCID5tl~IO7 tlTCID5ci ;更優(yōu)地，所述全病毒抗原為每頭份病毒含量IO4-8TCID50~106_ 5TCID5tl ;再優(yōu)選地，所述全病毒抗原為每頭份病毒含量105_°TCID5Q。
4.根據權利要求1或2所述的抗原組合物，其中，所述血清4型副豬嗜血桿菌全病毒抗原含量為滅活前5 X IO8CFU/頭份~8 X IO9CFU/頭份；更優(yōu)地，所述副豬嗜血桿菌全病毒抗原含量為滅活前為4 X IO9 CFU/頭份，再優(yōu)選所述血清4型副豬嗜血桿菌全病毒抗原含量為滅活前2 X IO9CFU/頭份； 所述血清5型副豬嗜血桿菌全病毒抗原含量為滅活前5 X IO8CFU/頭份~8 X IO9CFU/頭份；更優(yōu)地，所述副豬嗜血桿菌全病毒抗原含量為滅活前4 X IO9CFU/頭份，再優(yōu)選所述血清5型副豬嗜血桿菌全病毒抗原含量為滅活前2 X IO9CFU/頭份。
5.根據權利要求1-2任意一項所述的抗原組合物，其中，所述佐劑包括納米化氫氧化鋁膠、礦物油、卡波姆、MONTANIDE GEL ST、蜂膠、細胞因子、脂質體、免疫刺激復合物、含CpC脫氧寡核苷酸、納米化ISA206、ISA760VG、納米化磷酸鋁、皂苷、山梨聚糖、植物油、油酸乙酯、二(辛酸/癸酸)丙二醇酯、三(辛酸/癸酸)甘油酯、二油酸丙二醇酯、異硬脂酸酯、山梨聚糖、二縮甘露醇、甘油、聚甘油、丙二醇、油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸、羥基硬脂酸酯、聚氧丙烯、聚氧乙烯嵌段共聚物、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、順丁烯二酸酐與烯基衍生物共聚物、糖或多元醇的聚烯基醚交聯(lián)的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物的一種或幾種組合物；優(yōu)選地，所述佐劑為水性佐劑，所述水性佐劑包括卡波姆水溶液、206佐劑、納米化氫氧化鋁膠佐劑、MontanideIMS1313 VG、Montanide ISA15A VG、Montanide GEL 01 PR 以及MontanideGEL ST聚合物佐劑。
6.根據權利要求2所述的抗原組合物，其中，所述NVDC-JXAl-R減毒全病毒疫苗還包括耐熱凍干保護劑，所述耐熱凍干保護劑包括1%~2%明膠、5%~10%海藻糖、1%~2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP )、0.5%~2%谷氨酸鈉、0.1%~2%牛血清白蛋白、0.1%~1%山梨醇、0.1%~0.2%羧甲基纖維素鈉、0.164%磷酸二氫鉀以及0.052%磷酸氫二鈉，其余為水。
7.制備預防和治療一種豬的繼發(fā)感染的呼吸系統(tǒng)疾病的抗原組合物的方法，所述方法包括制備豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗的步驟和制備副豬嗜血桿菌滅活疫苗的步驟: 所述制備豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗的步驟包括增殖所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒，與耐熱凍干保護劑混合制備，凍干得豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗； 所述制備副豬嗜血桿菌滅活疫苗的步驟包括增殖所述副豬嗜血桿菌，滅活，與佐劑混合配制。
8.根據權利要求7所述的制備方法，其中，所述增殖所述副豬嗜血桿菌使用MHPs副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基，所述MHPs副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基包括5~10g/L多聚蛋白胨、3~10g/L酵母抽提物、2~8g/L谷氨酸鈉、I~5g/L水解乳蛋白、I~6g/L氯化鈉、I~5g/L磷酸氫二鉀、0.1~4g/L葡萄糖，pH值為6.8~8.0,116~121°C滅菌10~40min,再加入5~100ml/L豬血清、I~50ml/L NADH，制備固體培養(yǎng)基時在滅菌前加入I~20g/L瓊脂粉。
9.根據權利要求1-2任意一項所述的抗原組合物在制備預防和治療豬的繼發(fā)感染的呼吸系統(tǒng)疾病藥物中應用。
10.根據權利要求9所述的應用，所述應用包括在應用前用所述副豬嗜血桿菌滅活疫苗復原所述豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗。
11.一種試劑盒，所述試劑盒包括在包裝上分開的抵抗豬繁殖與呼吸綜合征的抗原制品或免疫原性組合物或疫 苗和抵抗副豬嗜血桿菌的抗原制品或免疫原性組合物或疫苗。
【文檔編號】A61K39/12GK103784951SQ201210435109
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年11月1日 優(yōu)先權日:2012年11月1日
【發(fā)明者】張許科, 孫進忠, 白朝勇 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司