專利名稱：檢測甲型h1n1病毒抗原的免疫檢測試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及利用基因工程技術(shù)制備的DNA疫苗，及 由其制備的單克隆抗體和免疫檢測試劑。
背景技術(shù)：
血凝素(hemagglutinin HA)是流感病毒的主要外膜蛋白，HA具有免疫原性，能使 人體產(chǎn)生保護性抗體，但其容易變異，是流感流行的原因。制備針對流感病毒血凝素蛋白特 異性單抗和多抗是流感病毒蛋白分型檢測的基礎(chǔ)，目前針對HA的抗體制備采用常規(guī)的蛋 白免疫方法，其中王慧娟等⑴在昆蟲桿狀病毒中表達甲型Hmi的HA蛋白用于免疫抗原和 篩選抗原。張祥斌等2(ChineseVeterinary Science 2008. 38(11) :962-967)用大腸桿菌 表達豬流感的HA經(jīng)純化用于免疫抗原和篩選抗原。關(guān)于甲型Hmi的HA為目標的流感分型檢測試劑盒目前還未見報道，現(xiàn)有的文獻 工作僅僅局限于抗體制備上，目前檢測試劑主要存在問題在于由于ELISA試劑局限性，而 臨床樣本(主要咽拭子)病毒含量極低，低于ELISA試劑的檢測限，無法檢出。如將病毒接 種細胞培養(yǎng)可檢出病毒。該試劑如配合病毒培養(yǎng)可大大改善對臨床樣本的檢出。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供含有甲型Hmi病毒血凝集素蛋白DNA序列的重組表 達載體和由其表達的針對甲型Hmi病毒抗原的DNA疫苗。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種雜交瘤細胞，以上述甲型Hmi病毒DNA疫苗免 疫小鼠后制備得到。本發(fā)明的又一個目的在于提供一種針對甲型Hmi病毒抗原的單克隆抗體，由上 述雜交瘤細胞制備。本發(fā)明的再一個目的在于提供一種免疫診斷試劑。根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供針對甲型Hmi病毒抗原的DNA疫苗，通過將合 成的甲型HlNl流感病毒A/California/04/2009HA基因(序列如SEQ IDN0. 1所示)插入 ρ⑶NA3. 1 (+)載體多克隆位點(如附圖1)構(gòu)建含有甲型Hmi病毒DNA序列的重組表達載 體ρ⑶NA3. 1/SF-HA載體，提取重組質(zhì)粒DNA，即獲得甲型Hmi病毒DNA疫苗。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供針對甲型Hmi病毒抗原的單克隆和多克隆 抗體，用上述甲型Hmi病毒DNA疫苗免疫小鼠，取其脾臟細胞，與SP2/0骨髓瘤細胞融合 后制備雜交瘤細胞，篩選雜交瘤細胞，獲得表達穩(wěn)定分泌單克隆抗體，二株篩選出來具有對 甲型Hmi流感病毒高特異性，且表達穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株命名為2B1和 3G4，于2010年9月27日提交到中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號為CCTCC C201095和CCTCCC201096。培養(yǎng)上述2B1和3G4細胞株，制備單克隆抗體，純化并鑒定，其 分別屬于IgGh亞類和IgGl亞類。用上述甲型Hmi病毒DNA疫苗免疫動物，例如兔，制備多克隆抗體。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供檢測甲型Hmi病毒抗原的免疫學(xué)方法和免疫檢測 試劑，這樣的檢測法通常包括一個或多個能夠識別和結(jié)合甲型Hmi病毒抗原的抗體，并且 可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種免疫學(xué)測試法中實現(xiàn)，包括但不限于各種類型的放射免 疫實驗、酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)、酶聯(lián)免疫熒光實驗(ELIFA)等。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，提供一種使用ELISA方法檢測甲型Hmi病毒抗 原的免疫檢測試劑。本發(fā)明進一步提供為以上的檢測應(yīng)用的試劑盒。試劑盒中包含酶聯(lián)免疫所需的針 對甲型Hmi病毒抗原的單克隆和多克隆抗體，試劑盒也包含與抗原或抗體結(jié)合的酶結(jié)合 物和/或含報告分子的試劑，所述報告分子例如生物素結(jié)合蛋白質(zhì)、例如抗生物素蛋白或 鏈霉素抗生物素蛋白，例如酶、熒光素或放射性同位素標記物。此外，試劑盒中還包含陽性 和陰性對照物以及其他必要時可以包含在其中的緩沖液、稀釋劑、濾器、針、注射器和試劑 盒的使用說明書。本發(fā)明在抗體制備的基礎(chǔ)上利用生物素-親和素放大系統(tǒng)進一步研制特異性檢 測甲型HmiELISA檢測試劑盒，直接用DNA疫苗做免疫原，篩選抗原用WHO提供的甲型Hmi 裂解疫苗株3(上海生物制品所提供)。其優(yōu)點在于1)在單抗制備上利用核酸疫苗進行免疫，避免了用全病毒蛋白做基礎(chǔ)免疫蛋白 成分過多、過雜的缺點，大大提高了免疫效率。同時，核酸疫苗在動物真核細胞中表達也避 免了用基因表達單一抗原免疫造成許多空間位點缺失的缺點。同時用全病毒甲型Hmi疫 苗株3做篩選抗原，普通流感裂解疫苗Hmi/H3N1 (購自賽諾菲巴斯德公司)做對照篩選抗 原，該方法獲得抗單一組分蛋白(HA)特異性好、親和力高的單抗細胞株和多克隆抗體，這 為后面免疫檢測提供了質(zhì)量非常好的抗體來源，對試劑盒靈敏度和特異性的提高起了關(guān)鍵 的作用。2)DNA免疫較常規(guī)蛋白免疫強而持久，因此用DNA免疫制備單克隆抗體和多克隆 抗體可以省時省力。3)檢測方法上用生物素-親和素放大系統(tǒng)，大幅度提高提高試劑的靈敏度。


圖1為pcDNA3. 1 (+)載體結(jié)構(gòu)圖。生物材料的保藏分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株命名為2B1和3G4，于2010年9月27日提交到中 國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號為CCTCC C201095和CCTCC C201096。
具體實施例方式以下實施例以舉例的方式描述本發(fā)明，其不應(yīng)視為對本發(fā)明的限制。所使用的實 驗材料如無特別說明，均為市售購買。實施例1DNA疫苗的制備甲型 Hmi 流感病毒 A/California/04/2009HA 基因序列如 SEQ ID NO. 1 所示， HA序列經(jīng)上海生工合成后雙酶切OChoI/Apal)插入ρ⑶NA3. 1 (+)載體多克隆位點，構(gòu)建成 pCDNA3. 1/SF-HA 載體。
質(zhì)粒DNA的大量制備按照QIAGEN公司生產(chǎn)的QIAGEN Plasmid Maxi Kit的步驟，提取重組質(zhì)粒DNA， 將所得DNA溶于TE溶液，在紫外分光光度計上測定所制備的質(zhì)粒DNA的0D260值和0擬80 值，按照計算DNA的純度及濃度的公式算出DNA的純度和濃度。根據(jù)其初始濃度稀釋至終 濃度為ι μ g/ μ ι，作電泳鑒定，其余置-20°c冰箱保存?zhèn)溆谩?b>實施例2鼠抗Hmi病毒抗原單克隆抗體的制備1.免疫方法和稈序免疫途徑采用股四頭肌肌肉注射法，每只6-8周齡BALB/c小鼠注射DNA的量為 50 μ g，注射后在接種位點兩側(cè)5mm加入正反各3次的電擊(100V電壓，電擊時間為50ms)， 初次免疫后3周進行加強免疫一次。2.單抗制備2. 1細胞融合2. 1. 1處死小鼠，無菌操作下取出脾臟，將脾臟放于5ML RPMI-1640的培養(yǎng)皿中 (不加血清)，切成2半，然后用滅菌器材將細胞擠壓出來。2. 1. 2將細胞吸到1支無菌塑料管中，靜置5分鐘使組織塊沉降下來，將細胞移入 另一支無菌試管并于300XG離心10分鐘。2. 1. 3洗下培養(yǎng)中SP2/0 (Agl4)細胞在同樣的離心機中沉淀。2. 14將此2個沉淀懸浮在5ml RPMI-1640 (不加血清)中，彼此混合并在300XG離 心10分鐘。2. 15輕輕敲打管子使沉淀分散，并置管于37°C水浴。2. 16將預(yù)熱的50%聚乙二醇(PEG)和RPMI-1640 (不加血清)帶到準備融合的操 作箱內(nèi)。2. 17于1分鐘內(nèi)在細胞沉淀中滴加入0. 8ml 50% PEG。保持37°C，立即滴加入 2ml預(yù)熱的RPMI-1640 (無血清)，12分鐘左右，然后在3分鐘內(nèi)加入8mlRPMI_1640。2. 18細胞在300XG離心10分鐘。輕輕懸浮在所需容量的RPM_1640_20% FCS中， 并接種到96孔板上。。2. 19培養(yǎng)板置于37 °C 5 % C02孵溫箱內(nèi)培養(yǎng)，24小時后，每孔加入等體積的 RPMI-1640-2XHAT-20% FCS培養(yǎng)液。然后培養(yǎng)板放在孵溫箱內(nèi)直至出現(xiàn)雜交瘤細胞集落， 早期雜交瘤細胞培養(yǎng)物。直至集落達2-3MM時需要篩選上清液中抗體的活性。經(jīng)鑒定適合 于進一步克隆的雜交瘤細胞，用無菌巴斯德管吸出于M孔培養(yǎng)板中并進一步克隆。直至形 成穩(wěn)定的分泌抗體的細胞株。2. 2細胞株篩選全病毒甲型Hmi疫苗株3包被進行ELISA篩選，同時用普通流感 裂解疫苗Hmi/H3N1 (購自賽諾菲巴斯德公司)做對照篩選抗原，篩選出單抗只是特異性針 對甲型Hmi病毒反應(yīng)，與普通流感不反應(yīng)。用這種方式我們篩選到親和力高特異性好的兩 株抗甲型Hmi流感病毒抗原的單克隆抗體，分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株命名為2B1和 3G4，于2010年9月27日提交到中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號為CCTCC C201095 和 CCTCC C201096。2. 3單抗制備每株細胞擴大培養(yǎng)注射到降植烷處理BALB/C小鼠腹腔制備腹水， 經(jīng)PROTEIN-Α親和純化，抗體純度用SDS-PAGE鑒定，要求上樣蛋白質(zhì)在25KD和50KD出現(xiàn)清晰兩條帶。純度在90%以上。克隆編號及亞類如表1 表1 克隆編號和對應(yīng)的亞類
權(quán)利要求
1.一種重組表達載體，含有如SEQ ID NO. 1所示的甲型Hmi流感病毒血凝集素蛋白基因。
2.權(quán)利要求1所述的重組表達載體，其中將如SEQID NO. 1所示的甲型Hmi流感病毒 血凝集素蛋白基因插入PCDNA3. 1(+)載體的多克隆位點而構(gòu)建。
3.針對甲型Hmi流感病毒抗原的DNA疫苗，由權(quán)利要求1所述的重組表達載體產(chǎn)生。
4.雜交瘤細胞，由權(quán)利要求3所述的DNA疫苗免疫小鼠制備，其保藏號為CCTCC C201095。
5.針對甲型Hmi流感病毒抗原的單克隆抗體，由權(quán)利要求4所述的雜交瘤細胞制備。
6.針對甲型Hmi流感病毒抗原的多克隆抗體，由權(quán)利要求3所述的DNA疫苗免疫動物 制備。
7.一種免疫檢測試劑，包含權(quán)利要求5所述的針對甲型Hmi流感病毒抗原的單克隆抗體。
8.權(quán)利要求7所述的免疫檢測試劑，其進一步包含權(quán)利要求6所述的針對甲型Hmi流 感病毒抗原的多克隆抗體。
9.一種試劑盒，包含權(quán)利要求7所述的免疫檢測試劑。
10.檢測樣本中甲型Hmi流感病毒抗原的方法，包括將待測樣本與權(quán)利要求7所述的 免疫檢測試劑接觸，根據(jù)檢測結(jié)果判斷樣本中是否存在甲型Him流感病毒抗原的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供含有甲型H1N1病毒血凝集素蛋白DNA序列的重組表達載體和由其表達的針對甲型H1N1病毒抗原的DNA疫苗，將合成的甲型H1N1流感病毒HA基因插入質(zhì)粒載體構(gòu)建含有甲型H1N1病毒HA基因序列的重組表達載體，提取重組質(zhì)粒DNA，即獲得甲型H1N1病毒DNA疫苗，用甲型H1N1病毒DNA疫苗免疫小鼠，制備單克隆抗體，本發(fā)明也提供檢測甲型H1N1病毒抗原的免疫學(xué)方法和免疫檢測試劑，本發(fā)明獲得特異性好、親和力高的單抗細胞株和多克隆抗體，由此制備的免疫檢測試劑靈敏度好、特異性高。
文檔編號A61K48/00GK102041265SQ20101050155
公開日2011年5月4日 申請日期2010年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月30日
發(fā)明者嚴兵, 陳建軍 申請人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所