抗原嵌合體、抗原組合物、疫苗及其制備方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種抗原嵌合體，包括：抗原與能形成多聚體的黏膜免疫佐劑蛋白質(zhì)單體的融合蛋白，和所述能形成多聚體的黏膜免疫佐劑蛋白質(zhì)單體，其中，所述能形成多聚體的黏膜免疫佐劑蛋白質(zhì)單體選自霍亂毒素B亞單位(CTB)和大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)中的一種，所述多聚體為五聚體，而且在所述嵌合體中所述融合蛋白與所述能形成多聚體的黏膜免疫佐劑蛋白質(zhì)單體的摩爾比為1:4。本發(fā)明利用黏膜免疫佐劑蛋白質(zhì)能形成五聚體的特性，形成嵌合結(jié)構(gòu)，從而形成效價(jià)更高的抗原。同時(shí)，利用黏膜免疫佐劑蛋白質(zhì)增強(qiáng)免疫的作用，起到增強(qiáng)抗原免疫原性的效果。另外，本發(fā)明的重組抗原構(gòu)成的嵌合蛋白抗原刺激黏膜產(chǎn)生分泌型IgA，誘導(dǎo)黏膜免疫產(chǎn)生。
【專利說明】抗原嵌合體、抗原組合物、疫苗及其制備方法和試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本申請涉及免疫領(lǐng)域，特別是用于黏膜免疫的抗原、疫苗及其制備方法和試劑盒?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]黏膜免疫系統(tǒng)是廣泛分布于呼吸道、胃腸道、泌尿生殖道黏膜下及一些外分泌腺處的淋巴組織，是執(zhí)行局部特異性免疫功能的主要場所。
[0003]由于95%以上的機(jī)體相關(guān)感染發(fā)生在黏膜部位或經(jīng)由黏膜入侵機(jī)體，因此黏膜是病原體侵入體內(nèi)的最大門戶。當(dāng)前對(duì)動(dòng)物生命與健康危害極大的以及難以防治的重要傳染病，如流感、結(jié)核、鼻疽、沙門氏菌病等都屬于由黏膜入侵或與黏膜相關(guān)的疾病，且由此引起的黏膜損傷及黏膜免疫功能的紊亂，常常成為機(jī)會(huì)性病原菌感染，甚至腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制。
[0004]黏膜免疫系統(tǒng)是機(jī)體抵抗病原體入侵的第一道免疫屏障，具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)和功能的獨(dú)立免疫體系，對(duì)于防治病原體的定植和侵入有著積極的意義。有別于傳統(tǒng)的系統(tǒng)免疫系統(tǒng)，黏膜免疫系統(tǒng)是大量免疫細(xì)胞和免疫分子彌散在黏膜上皮內(nèi)或黏膜下固有層(彌散淋巴組織)，或由單個(gè)或多個(gè)淋巴濾泡聚集成的黏膜相關(guān)淋巴組織，機(jī)體50%以上的淋巴組織和80%以上的免疫細(xì)胞集中于黏膜免疫系統(tǒng)。并且黏膜分泌物中的抗體以分泌型IgA和SlgM抗體為主。黏膜免疫系統(tǒng)按功能不同可分為兩個(gè)部位:誘導(dǎo)部位和效應(yīng)部位。在誘導(dǎo)部位和效應(yīng)部位間，主要通過淋巴細(xì)胞歸巢發(fā)生聯(lián)系。黏膜免疫系統(tǒng)主要功能是對(duì)黏膜表面吸入或攝入的大量種類繁多的抗原進(jìn)行識(shí)別并做出反應(yīng)。既可對(duì)大量無害抗原下調(diào)免疫反應(yīng)或產(chǎn)生耐受,也可對(duì)有害抗原或病原體產(chǎn)生高效體液和細(xì)胞免疫,進(jìn)行有效免疫排斥或清除。
[0005]黏膜免疫理論上是預(yù)防經(jīng)黏膜感染產(chǎn)生致病作用病原體最為有效的免疫途徑，因?yàn)橥ㄟ^其它途徑免疫時(shí)，疫苗難以誘導(dǎo)產(chǎn)生明顯的黏膜免疫反應(yīng)。然而，迄今為止已獲批準(zhǔn)或正在臨床研究中的疫苗，絕大多數(shù)卻仍舊采用的是注射途徑免疫，僅有少數(shù)為黏膜途徑免疫。究其原因，困擾黏膜免疫疫苗產(chǎn)品開發(fā)的主要困難除了局部黏膜免疫特異性抗體檢測的困難外，更為重要的是因?yàn)闄C(jī)體的宿主防御作用，黏膜免疫無法如注射途徑免疫時(shí)能準(zhǔn)確的控制進(jìn)入機(jī)體的抗原水平。抗原通過口服或者局部給藥達(dá)到黏膜表面后，將經(jīng)歷黏膜分泌液稀釋、粘液凝膠吸附、蛋白酶/核酸酶水解以及被內(nèi)膜屏障清除，因此只有極少數(shù)的抗原能通過黏膜進(jìn)入體內(nèi)，發(fā)揮有效的黏膜免疫反應(yīng)。一般，水溶性以及無黏膜作用的抗原黏膜攝取率低，并且部分可能會(huì)在腸內(nèi)產(chǎn)生免疫耐受現(xiàn)象。解決黏膜免疫攝取率低最為有效的方法是通過對(duì)天然黏膜病原體的特征模擬，以及應(yīng)用有效的黏膜佐劑，增強(qiáng)與機(jī)體黏膜表面結(jié)合水平(最好能選擇性的粘附于M細(xì)胞)。目前仍然需要更為有效的黏膜免疫疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了增強(qiáng)用于黏膜免疫抗原的免疫原性，本發(fā)明提供了一種抗原嵌合體，其包括:抗原與能形成多聚體的黏膜免疫佐劑蛋白質(zhì)單體的融合蛋白，和所述能形成多聚體的黏膜免疫佐劑蛋白質(zhì)單體，其中，所述能形成多聚體的黏膜免疫佐劑蛋白質(zhì)單體選自霍亂毒素B亞單位(CTB)和大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)中的一種，所述多聚體為五聚體，并且在所述嵌合體中所述融合蛋白與所述能形成多聚體的黏膜免疫佐劑蛋白質(zhì)單體的摩爾比為1:4，其中所述抗原嵌合體穩(wěn)定存在的PH大于7.0,優(yōu)選pH為8.0。CTB和LTB都是非常有效的黏膜免疫佐劑，而且都能夠形成穩(wěn)定的五聚體，利用這一性質(zhì)制備的抗原嵌合體，不但可保持其黏膜免疫佐劑性質(zhì)，還增大了抗原體積，易于被抗原遞呈細(xì)胞(antigenpresenting cell,APC)攝取,有利于進(jìn)一步促進(jìn)黏膜免疫和系統(tǒng)免疫的激發(fā)。并且,嵌合體的穩(wěn)定性與其PH值密切相關(guān)，在本發(fā)明中，所述嵌合體穩(wěn)定存在的PH大于7.0，優(yōu)選pH為8.0。而此條件下的嵌合體，特別是CTB形成五聚體的嵌合體，能夠最有效地增強(qiáng)黏膜免疫效果。
[0007]在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中，所述的抗原嵌合體中的CTB和LTB為其天然組成結(jié)構(gòu)或其能夠形成五聚體的突變體。與真核表達(dá)時(shí)發(fā)生糖基化修飾的CTB和LTB相比，通過原核表達(dá)載體表達(dá)的具有天然結(jié)構(gòu)的CTB和LTB及其突變體能夠更加有效地激發(fā)抗原的免疫反應(yīng)，發(fā)揮其佐劑的功能。
[0008]在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗原嵌合體中所述抗原的分子量在10至IOOkD范圍內(nèi)，優(yōu)選16kD至65kD。在IO-1OOkD范圍內(nèi)的抗原能夠更好地保證CTB或LTB折疊成正確的構(gòu)象，以易于形成穩(wěn)定的五聚體?？乖肿恿窟^小可能會(huì)受CTB或LTB影響，促使融合蛋白其自身形成聚體，從而不能正確折疊，分子量過大則可能產(chǎn)生位阻效應(yīng)，阻礙CTB或LTB五聚體的形成。
[0009]在本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述抗原為適用于黏膜免疫的抗原。特別是經(jīng)由黏膜途徑感染人體或動(dòng)物體的病原菌的抗原，包括但不限于幽門螺桿菌抗原、傷寒抗原、流感HA抗原。
[0010]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述幽門螺桿菌抗原選自幽門螺桿菌尿素酶B亞單位(UreB)、幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A(CagA)蛋白和幽門螺桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白(NAP)中的至少一種。這些抗原具較強(qiáng)的免疫原性，無毒性，是良好的疫苗候選抗原。
[0011]在本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述融合蛋白包含位于所述抗原與所述黏膜免疫佐劑蛋白質(zhì)單體之間的3個(gè)G4S(Gly-Ser-Ser-Ser-Ser)連接體。此柔性連接體的加入可以避免抗原蛋白質(zhì)與CTB或LTB在復(fù)性折疊時(shí)的相互影響，有助于形成正確的構(gòu)象。
[0012]本發(fā)明還提供了一種抗原組合物，包含如上所述的抗原嵌合體，其中所述抗原嵌合體穩(wěn)定存在的PH大于7.0，優(yōu)選pH為8.0。
[0013]本發(fā)明還提供了一種疫苗，包含上述抗原組合物和適用于疫苗的賦形劑。優(yōu)選地，所述疫苗為口服疫苗、經(jīng)鼻給藥的疫苗或經(jīng)直腸給藥的疫苗。
[0014]本發(fā)明還提供了一種用于制備抗原組合物的試劑盒，包括表達(dá)上述融合蛋白的載體和表達(dá)上述能形成多聚體的黏膜免疫佐劑蛋白質(zhì)單體的載體。優(yōu)選地，其中所述載體均為原核表達(dá)載體。
[0015]本發(fā)明還提供了制備上述抗原嵌合體的方法，包括用上述試劑盒中的載體分別表達(dá)所述融合蛋白和所述能形成多聚體的黏膜免疫佐劑蛋白質(zhì)單體，然后通過復(fù)性方法使這兩種蛋白結(jié)合形成所述嵌合體，其中所述復(fù)性方法包括將所述兩種蛋白共同放置在含有尿素和DTT (或巰基乙醇)的復(fù)性液中進(jìn)行復(fù)性的步驟。優(yōu)選所述復(fù)性液中尿素的濃度為1.0M至2.5M。所述DTT或巰基乙醇的濃度為0.2mM至1.0mM。
[0016]本發(fā)明還提供了一種通過復(fù)性制備嵌合體的方法，所述嵌合體包含(I) 一種蛋白質(zhì)與能形成多聚體的單體蛋白質(zhì)的融合蛋白和(2)能形成多聚體的單體蛋白質(zhì)，通過所述
(I)融合蛋白中的單體蛋白質(zhì)和所述(2)單體蛋白質(zhì)形成多聚體來形成嵌合體，所述方法包括:
[0017]將所述⑵能形成多聚體的單體蛋白質(zhì)在含6M至9M，優(yōu)選8M的尿素，且pH為3.0至4.0的緩沖液中預(yù)復(fù)性0.5至3小時(shí)，優(yōu)選預(yù)復(fù)性I小時(shí)；和
[0018]將所述(I)融合蛋白和所述(2)能形成多聚體的單體蛋白質(zhì)在含有1.0M至2.5M的尿素和0.2mM至1.0mM的DTT或巰基乙醇的復(fù)性液中復(fù)性形成所述嵌合體，
[0019]優(yōu)選地，所述復(fù)性液的pH大于7.0，更優(yōu)選所述復(fù)性液的pH為8.0。
[0020]在本發(fā)明中，我們選擇在復(fù)性液中保持一定濃度的尿素和DTT (或巰基乙醇)，能夠有效避免形成多聚體的單體其自身聚集成為五聚體，并且在一定PH條件下，能夠促進(jìn)嵌合體的形成，提高嵌合體組裝的效率，有效克服了采用常規(guī)復(fù)性處理導(dǎo)致嵌合體組裝效率較低的缺陷。該復(fù)性方法可用于形成需要形成蛋白質(zhì)嵌合體的多個(gè)領(lǐng)域，并不限于此處所述的疫苗領(lǐng)域。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為電腦模擬的霍亂毒素(CT)立體結(jié)構(gòu)圖；
[0022]圖2為電腦模擬的CTB五聚體立體結(jié)構(gòu)圖；
[0023]圖3為電腦模擬的CTB-UreB融合蛋白立體結(jié)構(gòu)圖；
[0024]圖4為電腦模擬的CTB_UreB/4CTB嵌合體蛋白的立體結(jié)構(gòu)圖；
[0025]圖5為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式制備的PET-28a-CTB_X質(zhì)粒雙酶切電泳圖，其中各個(gè)泳道的樣品如下:M:DL10000DNA Marker ;泳道1，2，3:PET-28a-CTB-UreB雙酶切；泳道4，5，6:PET-28a-CTB-CagA 雙酶切；泳道 7:PET-28a-CTB_NAP 雙酶切；
[0026]圖6為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式制備的CTB-UreB融合蛋白的蛋白質(zhì)電泳圖，其中各個(gè)泳道的樣品如下:M:Fermentas蛋白預(yù)染Marker ;泳道I, 2, 3, 4, 5, 6, 7:IPTG誘導(dǎo)后PET-28a-CTB-UreB/BL21-DE3 菌體；
[0027]圖7為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式制備的CTB-CagA和CTB-NAP融合蛋白的蛋白電泳圖，其中各個(gè)泳道的樣品如下:M:Fermentas蛋白預(yù)染Marker ;泳道1，2, 3, 4:IPTG誘導(dǎo)后含 PET-28a-CTB-CagA/BL21-DE3 菌體；泳道 5，6，7，8 =IPTG 誘導(dǎo)后含 PET-28a-CTB_NAP/BL21-DE3 菌體；
[0028]圖8為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式制備的C T B-Ure B融合蛋白純化電泳圖，其中各個(gè)泳道的樣品如下:M:Fermentas蛋白預(yù)染Marker ;泳道1:SP HP峰前樣品；泳道2，3: SP HP洗脫峰樣品；泳道4:SP HP峰后樣品；
[0029]圖9A為根 據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式制備的C T B— U r e B /4 C T B嵌合體蛋白純化電泳圖，其中各個(gè)泳道的樣品如下:M:Fermentas蛋白預(yù)染Marker ;泳道1，2, 3, 4:QHP洗脫峰；
[0030]圖9B為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式制備的C T B— U r e B /4 C T B嵌合體蛋白穩(wěn)定性研究結(jié)果的電泳圖，其中各個(gè)泳道的樣品如下=M = Fermentas蛋白預(yù)染；泳道1_7樣品分別為ρΗ9.0、8.0、7.0、6.0、5.0、4.0、3.0條件下處理后的樣品電泳結(jié)果。
[0031]圖10為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式制備的CTB-CagA融合蛋白純化電泳圖，其中各個(gè)泳道的樣品如下:M:Fermentas蛋白預(yù)染Marker ;泳道1，2, 3, 4:QHP洗脫峰；
[0032]圖1lA為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式制備的CTB_CagA/4CTB嵌合體蛋白純化電泳圖，其中各個(gè)泳道的樣品如下:M:Fermentas蛋白預(yù)染Marker ;泳道1，2, 3:SP HP洗脫峰；
[0033]圖1lB為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式制備的CTB_CagA/4CTB嵌合體蛋白穩(wěn)定性研究結(jié)果的電泳圖，其中各個(gè)泳道的樣品如下=M = Fermentas蛋白預(yù)染；泳道1_7樣品分別為ρΗ9.0、8.0、7.0、6.0、5.0、4.0、3.0條件下處理后的樣品電泳結(jié)果；
[0034]圖12為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式制備的CTB-NAP融合蛋白純化電泳圖，其中各個(gè)泳道的樣品如下:M:Fermentas蛋白預(yù)染Marker ;泳道1:包涵體(8 M尿素);泳道2,3,4:
QHP洗脫峰；
[0035]圖13為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式制備的CTB-NAP/4CTB嵌合體蛋白純化電泳圖，其中各個(gè)泳道的樣品如下:M:Fermentas蛋白預(yù)染Marker ;泳道1，2, 3:QHP洗脫峰；
[0036]圖14為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式CTB_UreB/4CTB嵌合體蛋白免疫小鼠血清特異性IgG檢測結(jié)果；
[0037]圖15為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式CTB_UreB/4CTB嵌合體蛋白免疫小鼠腸黏膜特異性slgA檢測結(jié)果；
[0038]圖16為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式CTB_CagA/4CTB嵌合體蛋白免疫小鼠腸黏膜特異性IgG檢測結(jié)果；
[0039]圖17為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式CTB_CagA/4CTB嵌合體蛋白免疫小鼠腸黏膜特異性slgA檢測結(jié)果；
[0040]圖18為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式CTB-NAP/4CTB嵌合體蛋白免疫小鼠血清特異性IgG檢測結(jié)果；
[0041]圖19為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式CTB-NAP/4CTB嵌合體蛋白免疫小鼠腸黏膜特異性slgA檢測結(jié)果；
[0042]圖20為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式CTB_UreB/4CTB嵌合體蛋白免疫小鼠，用HPSSl攻擊后其特異性血清IgG抗體檢測結(jié)果圖；
[0043]圖21為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式CTB_UreB/4CTB嵌合體蛋白免疫小鼠，用HPSSl攻擊后其特異性腸黏膜slgA抗體檢測結(jié)果圖；
[0044]圖22為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式CTB_UreB/4CTB嵌合體蛋白免疫小鼠，用HPSSl攻擊后胃組織病理切片檢測結(jié)果。其中A:CTB-UreB/4CTB嵌合體蛋白組小鼠胃組織切片(X250) ;B:UreB組小鼠胃組織切片(X250) ;C:UreB組小鼠胃組織切片(X400)-；
[0045]圖23A和23B分別為UreB_CTA2/5CTB與CTB_UreB/4CTB組裝效率比較結(jié)果的電泳圖，泳道I為對(duì)比例I的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，泳道2為根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0046] 為了更加清楚地闡述本發(fā)明，下文將詳細(xì)地說明本發(fā)明的各個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，以及各個(gè)實(shí)施方式的技術(shù)效果。[0047]本發(fā)明主要提供了增強(qiáng)免疫原性的抗原及其制備方法。一方面，其通過利用黏膜免疫佐劑加強(qiáng)免疫反應(yīng)；另一方面，利用CTB或LTB形成五聚體的特點(diǎn)，提高黏膜免疫佐劑效果的同時(shí)，增大了抗原的體積，易于被APC攝取，更加有利于免疫應(yīng)答的發(fā)生。另外，本發(fā)明的發(fā)明人選擇在復(fù)性液中保持一定濃度的尿素和DTT (或尿素和巰基乙醇)，能夠有效避免形成多聚體的單體其自身聚集成為五聚體，從而促進(jìn)嵌合體的形成，提高嵌合體組裝的效率。有效克服了采用常規(guī)復(fù)性處理導(dǎo)致嵌合體組裝效率較低的缺陷。
[0048]下面從免疫佐劑的選擇、抗原的選擇和復(fù)性方法等幾個(gè)方面更加詳細(xì)地說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0049]關(guān)于免疫佐劑
[0050]為了增強(qiáng)抗原的免疫原性，本發(fā)明選用了 CTB或LTB分別與抗原結(jié)合形成新的抗原組合物。
[0051]霍亂毒素是一種強(qiáng)有力的黏膜免疫佐劑，由I個(gè)A亞單位和5個(gè)B亞單位(見圖1)組成。5個(gè)B亞單位以非共價(jià)結(jié)合成非常緊湊穩(wěn)定的圓桶狀五聚體(見圖2)，B亞單位單體兩側(cè)各有一個(gè)三鏈反平行片層，在五聚體中彼此相鄰的單體通過片層和大量的鹽鍵相互作用，使B亞單位五聚體成為最穩(wěn)定的蛋白復(fù)合物之一。CTA是霍亂毒素的活性部分，CTB無毒性，其主要功能是通過與哺乳動(dòng)物小腸上皮細(xì)胞上的單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(GMl)結(jié)合而使得CTA進(jìn)入細(xì)胞而產(chǎn)生免疫反應(yīng)。CTB具有很強(qiáng)的免疫原性，因?yàn)樗送ㄟ^與GMl結(jié)合而提高腸道對(duì)經(jīng)它協(xié)助的口服疫苗的攝取率，還能特異地影響小腸黏膜細(xì)胞間的緊密聯(lián)結(jié)或小帶閉鎖結(jié)構(gòu)，增加通透性，防止口服疫苗在小腸黏膜處被消化分解，保持其抗原性，從而提高機(jī)體產(chǎn)生的抗體效價(jià)，使機(jī)體產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)。目前認(rèn)為CTB是至今為止最有效、最安全的黏膜免疫佐劑之一。 [0052]LTB也是高效的黏膜免疫佐劑。大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)為產(chǎn)腸毒性大腸桿菌分泌到胞周質(zhì)的一種熱不穩(wěn)定外毒素，是由具有ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶活性的A亞單位以及與神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合的B亞單位組成的AB5型六聚體蛋白，A亞單位是其毒性的主要單位，B亞單位具有免疫原性和佐劑功能。LT不僅具有免疫原性，而且是一種有效的黏膜佐劑，能明顯增強(qiáng)機(jī)體針對(duì)候選抗原的IgA和IgG反應(yīng)，同時(shí)還能降低機(jī)體對(duì)這些候選抗原的免疫耐受性，誘發(fā)針對(duì)它們的長期記憶，因此LTB作為黏膜佐劑得到了廣泛關(guān)注。
[0053]本發(fā)明提供了一種重組抗原組合物，包括:抗原與CTB或LTB的融合蛋白；和相應(yīng)的CTB或LTB蛋白。利用5個(gè)CTB或LTB非共價(jià)鍵結(jié)合的特性，能夠形成上述融合蛋白與另外4個(gè)相應(yīng)的CTB或LTB單體的復(fù)合物的嵌合結(jié)構(gòu)，從而增大了抗原的有效體積，易于被APC攝取。同時(shí)，已知CTB和LTB是強(qiáng)有力的免疫佐劑，能夠降低機(jī)體對(duì)候選抗原的免疫耐受，從而更有效地發(fā)揮其免疫促進(jìn)作用。并由于形成抗原與5個(gè)CTB或LTB的嵌合蛋白而形成了效價(jià)更高的抗原，從而增強(qiáng)了整個(gè)抗原組合物的免疫原性。
[0054]關(guān)于抗原
[0055]為了更好地發(fā)揮黏膜免疫的作用，優(yōu)先選用經(jīng)黏膜感染的病原菌的抗原，包括但不限于幽門螺桿菌抗原、傷寒抗原、流感HA抗原。利用本發(fā)明制備的抗原嵌合體，能夠增強(qiáng)相關(guān)抗原的免疫原性，利于構(gòu)建更加有效的疫苗。
[0056]下文中以幽門螺桿菌為例，詳細(xì)說明和驗(yàn)證了本發(fā)明的技術(shù)方案和技術(shù)效果。
[0057]幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, HP)是一種是寄生于胃上皮細(xì)胞表面的革蘭氏陰性微需氧菌，1983年由澳大利亞學(xué)者Warren和Marshall首先從人胃黏膜中分離出，HP能在酸性環(huán)境下定植和生存，使機(jī)體產(chǎn)生炎癥和免疫反應(yīng)，破壞胃黏膜屏障，使胃黏膜上皮細(xì)胞的凋亡增殖平衡失調(diào)。HP是人類上消化道疾病的重要致病菌，是慢性胃炎、胃潰瘍及十二指腸潰瘍的主要病因。1994年WHO已確認(rèn)其與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，并將其列為一類致癌因子。HP是全球感染率最高的細(xì)菌之一，據(jù)報(bào)道，90%的亞洲人和60%的歐洲人感染HP,因此預(yù)防和治療HP感染成為了全球關(guān)注的焦點(diǎn)。
[0058]目前臨床上主要使用二聯(lián)或三聯(lián)抗生素治療HP感染。但存在以下明顯不足之處:I)耐藥菌株產(chǎn)生；2)易復(fù)發(fā)與再感染；3)毒副作用與費(fèi)用較高；4)無法達(dá)到群體防治效果，無法有效控制HP傳播與感染。因此，研制療效明確的疫苗對(duì)于預(yù)防和控制HP感染具有十分重要的意義。目前所研究的HP疫苗主要為全菌疫苗、亞單位疫苗(基因工程疫苗)、活載體疫苗和DNA疫苗。大多數(shù)研究采用HP全菌或全菌裂解物，或HP毒性蛋白如尿素酶、空泡毒素、毒素相關(guān)蛋白、中性粒細(xì)胞激活蛋白等單獨(dú)或聯(lián)合不同佐劑進(jìn)行接種，在動(dòng)物模型中均能引起保護(hù)性應(yīng)答反應(yīng)。
[0059]預(yù)防性疫苗是通過機(jī)體的免疫應(yīng)答發(fā)生作用，因此選擇有效的HP抗原免疫機(jī)體，可刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答，從而起到預(yù)防機(jī)體感染HP的作用。隨著HP致病機(jī)制研究的深入以及分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展-基因工程菌株的構(gòu)建和運(yùn)用為有效抗原的篩選提供了有利條件，同時(shí)為預(yù)防和根除HP感染邁出了關(guān)鍵的一步。
[0060]以幽門螺桿菌相關(guān)疫苗的制備為例，發(fā)明人優(yōu)先選擇了幽門螺桿菌尿素酶、幽門螺桿菌CagA蛋白和幽門螺桿菌NAP作為用于幽門螺桿菌的有效抗原。本發(fā)明應(yīng)用基因生物工程技術(shù)，制備了三種HP抗原和CTB的融合蛋白(CTB-X(X = UreB, CagA, NAP))(見圖3)，并利用5個(gè)CTB非共價(jià)鍵結(jié)合的特性，形成CTB-X (X = UreB, CagA, NAP) -4CTB的嵌合結(jié)構(gòu)(見圖4)，從而通過HP抗原與5個(gè)CTB的嵌合蛋白形成效價(jià)更高的抗原，并進(jìn)行了相關(guān)的動(dòng)物免疫原性試驗(yàn)驗(yàn)證。
[0061]尿素酶
[0062]尿素酶(Ure)在HP定植感染過程中有分解尿素、中和胃酸的作用，對(duì)HP的致病性具有重要意義，HP尿素酶既是定植因子又是毒力因子。尿素酶基因是所有HP菌株共同擁有的，其編碼的蛋白具有很強(qiáng)的尿素酶活性，尿素酶分布于HP表面，占全菌總蛋白量的5~10%。目前發(fā)現(xiàn)尿素酶基因大小約為7.5kb，共有9個(gè)讀碼框(ORF)分別為UreA、UreB、UreC、UreD、UreE、UreF、UreG、UreH和UreI。其中UreA和UreB為尿素酶的兩個(gè)結(jié)構(gòu)亞單位，具有高度的保守性，是PCR檢測HP感染常選擇的目的基因，以及基因疫苗的侯選基因。
[0063]UreB是HP主要的外膜抗原成分，由569個(gè)氨基酸殘基編碼產(chǎn)生，是HP抗原性最強(qiáng)的保護(hù)性蛋白，具有無毒性、抗原性強(qiáng)且相對(duì)保守等特點(diǎn)，其在HP的致病過程中起關(guān)鍵作用。通過不同菌株的比較，其尿素酶B亞單位氨基酸同源性達(dá)到97.9%以上，表明HP菌株間UreB的抗原變異性極小。此外，UreB的主要活性部分位于菌體表面，其大分子量和顆粒狀結(jié)構(gòu)有利于黏膜免疫接種，因此尿素酶分子可以作為疫苗抗原的合理選擇。同時(shí)在體內(nèi)HP表面具有黏附胞質(zhì)蛋白的特性，能夠?qū)⒆匀茚尫诺哪蛩孛葛じ降交罹砻?，這給HP疫苗的研究又提供了一個(gè)重要的理論依據(jù)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，通過黏膜免疫途徑給予UreB蛋白疫苗，能夠誘導(dǎo)并激發(fā)機(jī)體的保護(hù)性免疫應(yīng)答，表明UreB是HP感染重要的保護(hù)性候選抗原之一，也是基因工程疫苗的首選抗原，具有顯著的優(yōu)勢。[0064]大量的文獻(xiàn)報(bào)道，用重組的尿素酶亞單位B(rUreB) 口服免疫預(yù)先感染了貓胃螺桿菌(Helicobacter Felis, Hf)的小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫的小鼠不僅徹底清除了 Hf感染，而且能夠預(yù)防小鼠再次感染；Kleanth0us等用rUreB加上LT作為黏膜佐劑免疫小鼠，與對(duì)照組相比結(jié)果發(fā)現(xiàn):免疫組胃內(nèi)尿素酶活性顯著降低，且胃黏膜組織HP定量培養(yǎng)顯示HP減少97%以上；Michetti等對(duì)口服不同劑量(180mg、60mg、20mg，4次/天)的尿素酶與LT(5y g)的安全性和免疫原性進(jìn)行了臨床實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn):所有的志愿者都能夠耐受，且能夠減少胃內(nèi)HP的定植，從而減輕了胃炎的程度；Saldinger等采用rUreB結(jié)合霍亂毒素(CT)免疫感染了 Hf的BALB/c小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn):免疫組小鼠全部清除了 Hf ;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，脾臟⑶4+T細(xì)胞增生，血清中IgGl增加，同時(shí)伴隨IL-4的增高，Y-干擾素的減少，從而推測rUreB可能誘導(dǎo)了 Th2⑶4+T細(xì)胞的增生，有助于清除HP。有學(xué)者對(duì)HP感染志愿者進(jìn)行了I期臨床實(shí)驗(yàn)，用UreB結(jié)合LT免疫后，同樣發(fā)現(xiàn)HP感染的密度顯著減少；Lee等對(duì)非人靈長類動(dòng)物進(jìn)行的類似研究也表明，通過減少胃內(nèi)HP的密度有助于減輕胃炎的程度。然而Solnick等報(bào)道用尿素酶口服和肌肉注射免疫恒河猴，而后進(jìn)行HP攻擊試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):UreB雖然能夠誘導(dǎo)體液免疫，但是所有給予HP攻擊的恒河猴都感染了 HP，而且細(xì)菌密度在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。上述結(jié)果顯示目前的UreB相關(guān)的HP疫苗還不夠完善，有待于進(jìn)一步研究。 [0065]CagA 蛋白
[0066]CagA基因也稱為細(xì)胞毒素相關(guān)基因,其表達(dá)廣物為CagA蛋白。作為細(xì)菌分泌的一種毒素，它由IV型分泌系統(tǒng)Cag致病島(pathogenecityisland, PAI)從細(xì)菌轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主細(xì)胞中被磷酸化，參與宿主細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及引起細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的重排。研究表明，cagA陽性HP為毒力菌株，與萎縮性胃炎、胃癌與消化道潰瘍等常見的消化道疾病密切相關(guān)，90%以上的HP臨床分離菌株cagA呈陽性表達(dá)。具有CagA基因的HP幾乎都表達(dá)CagA蛋白，并產(chǎn)生可測的抗體反應(yīng)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道CagA陽性菌株能夠直接或間接(通過NF-κΒ)誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞分泌IL-8，而IL-8在中性粒細(xì)胞趨化和激活過程中起重要作用，可導(dǎo)致胃黏膜的損傷。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CagA基因和CagA蛋白與胃炎、消化性潰瘍，尤其是胃癌的發(fā)生有良好的相關(guān)性。Marchetti等用重組CagA免疫HP小鼠感染模型，證實(shí)能產(chǎn)生誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)，保護(hù)率達(dá)到了 70%。Crabtree等應(yīng)用重組CagA作為抗原，經(jīng)胃免疫長期感染HP的小鼠，結(jié)果成功清除了 HP，且有效保護(hù)了小鼠免遭HP的再次感染。提示CagA作為HP疫苗保護(hù)性抗原具有較高的可行性，但這種抗原產(chǎn)生的保護(hù)作用僅局限于產(chǎn)生CagA的菌株有效，對(duì)不產(chǎn)生CagA的菌株無保護(hù)作用?？梢姡壳搬槍?duì)CagA蛋白也尚無滿意的疫苗。
[0067]NAP
[0068]Evans等在HP的水溶性抽提物中發(fā)現(xiàn)一種NAP，它能夠募集并活化嗜中性粒細(xì)胞，促進(jìn)中性粒細(xì)胞對(duì)胃上皮細(xì)胞的黏附，激活中性粒細(xì)胞釋放反應(yīng)性氧代謝物，而引起胃黏膜炎癥病變。
[0069]NAP高度保守，臨床研究發(fā)現(xiàn)60%的HP感染者血清中存在NAP特異抗體。NAP是一種鐵蛋白，編碼它的NAP基因幾乎在所有HP中可檢測到，但是在體外表達(dá)的NAP其活性存在很大差異。它能夠通過⑶Ila/⑶18和⑶Ilb/⑶18與內(nèi)皮細(xì)胞間粘附分子(ICAM-1)相互作用，而使白細(xì)胞黏附內(nèi)皮細(xì)胞；選擇性地與中性粒細(xì)胞的酸性糖鞘脂相結(jié)合而調(diào)節(jié)白細(xì)胞的功能；與粘蛋白相結(jié)合為HP定植于胃黏膜上皮細(xì)胞埋下了伏筆，因此NAP在其黏附和致病過程中起重要作用。Satin等采用純化重組的NAP 口服免疫了 10只小鼠，結(jié)果8只小鼠獲得了保護(hù)性免疫。提示NAP可作為有效的保護(hù)性抗原用于HP感染的疫苗防治。[0070] 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種重組幽門螺桿菌抗原組合物，包括幽門螺桿菌抗原與CTB的融合蛋白和CTB蛋白。借助CTB本身能夠形成五聚體的性質(zhì)，增大抗原的體積，易于被APC攝取。另外，CTB是良好的免疫佐劑。因此，本發(fā)明的重組幽門螺桿菌抗原組合物能夠有效增強(qiáng)幽門螺桿菌抗原的免疫原性，利于構(gòu)建更加有效的疫苗。[0071 ] 在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述幽門螺桿菌抗原選自幽門螺桿菌UreB蛋白、幽門螺桿菌CagA蛋白和幽門螺桿菌NAP中的至少一種。這幾種抗原均是目前已知的幽門螺桿菌抗原中無毒性、抗原性強(qiáng)而且相對(duì)保守的抗原，更加適合用于疫苗。
[0072]抗原與免疫佐劑的結(jié)合方式的選擇
[0073]常規(guī)免疫佐劑的使用一般是通過與抗原的直接混合，然后與抗原同時(shí)給藥以激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，但是其增強(qiáng)抗原免疫原性的效果不理想。本發(fā)明通過制備抗原與黏膜免疫佐劑蛋白質(zhì)單體的融合蛋白，再將其與這種能形成多聚體的黏膜免疫佐劑蛋白質(zhì)單體通過非共價(jià)結(jié)合形成嵌合蛋白，不但可保持其黏膜免疫佐劑性質(zhì)，還可增大了抗原體積，更易于被抗原遞呈細(xì)胞攝取。
[0074]對(duì)于融合蛋白的制備，本發(fā)明中在抗原和CTB(或LTB)的蛋白之間加入柔性連接體，以使得蛋白融合后抗原和CTB(或LTB)各自的折疊不會(huì)受到影響，從而分別形成正確的構(gòu)象。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明選擇了 3個(gè)G4S的連接體。但是，本發(fā)明中并不限于用此種連接體，其余連接體，比如螺旋形式的連接體(linker)肽(A(EAAAK)nA)以及葡萄糖球菌蛋白A(PA)等也可用于本發(fā)明中。
[0075]進(jìn)一步地，在保證了融合蛋白兩個(gè)部分，尤其是CTB (或LTB)構(gòu)象的基礎(chǔ)上，有利于五聚體的正確形成和 形成五聚體的效率。
[0076]嵌合體的制備方法
[0077]本發(fā)明還提供了一種試劑盒，包括表達(dá)上述抗原與CTB(或LTB)的融合蛋白的載體和表達(dá)相應(yīng)黏膜免疫佐劑單體蛋白(CTB或LTB)蛋白的載體。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知，除了目的蛋白之外，所述表達(dá)載體中還應(yīng)包括表達(dá)目的蛋白質(zhì)所必需的元件，例如啟動(dòng)子、終止子、可選的標(biāo)記基因等。
[0078]所述表達(dá)載體優(yōu)選是原核表達(dá)載體，例如，pET系列等原核載體。使用原核表達(dá)載體制備目的蛋白的方法和試劑為本領(lǐng)域所公知，可參見本領(lǐng)域常用工具書，例如冷泉港實(shí)驗(yàn)室編譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》((美)薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，北京，科學(xué)出版社出版)、《細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南》((美)D.L.斯佩克特等著，黃培堂等譯，北京，科學(xué)出版社出版)等。
[0079]對(duì)于嵌合體的制備，一直以來都屬于一個(gè)技術(shù)難題。如何在與融合蛋白嵌合之前避免單體自身形成五聚體，是影響嵌合體收率的關(guān)鍵。一般情況下，原核表達(dá)蛋白后大部分會(huì)形成包涵體，需要經(jīng)過洗滌之后用尿素溶液溶解包涵體。被尿素溶液所溶解的蛋白質(zhì)基本屬于變性狀態(tài)，很難產(chǎn)生其天然構(gòu)象。而常規(guī)的復(fù)性過程就是逐步除去尿素的過程，以使其逐步重折疊形成正確的構(gòu)象。但是，對(duì)于能夠形成多聚體的單體蛋白質(zhì)，其去除尿素的過程中，很容易自發(fā)形成多聚體，而不是跟融合蛋白中的單體蛋白質(zhì)形成多聚體。因此，常規(guī)方法制備嵌合體時(shí)產(chǎn)率會(huì)非常低。
[0080]本發(fā)明的發(fā)明人選擇在復(fù)性液中保持一定濃度的尿素和DTT (或尿素和巰基乙醇)，能夠有效避免形成多聚體的單體其自身聚集成為五聚體，促進(jìn)嵌合體的形成，提高嵌合體組裝的效率。有效克服了采用常規(guī)復(fù)性處理導(dǎo)致嵌合體組裝效率較低的缺陷。
[0081]本發(fā)明提供了一種通過復(fù)性制備嵌合體的方法，所述嵌合體包含(I) 一種蛋白質(zhì)與能形成多聚體的單體蛋白質(zhì)的融合蛋白和(2)能形成多聚體的單體蛋白質(zhì)，通過所述
(1)融合蛋白中的單體蛋白質(zhì)和所述(2)單體蛋白質(zhì)形成多聚體來形成嵌合體，所述方法包括:將所述(2)能形成多聚體的單體蛋白質(zhì)在含6M至9M，優(yōu)選8M的尿素，且pH為3.0至4.0的緩沖液中預(yù)復(fù)性0.5至3小時(shí)，優(yōu)選預(yù)復(fù)性I小時(shí)；和將所述(I)融合蛋白和所述
(2)能形成多聚體的單體蛋白質(zhì)在含有1.0M至2.5M的尿素和0.2mM至1.0mM的DTT或巰基乙醇復(fù)性液中復(fù)性形成所述嵌合體。
[0082]不同于一般的復(fù)性液，本發(fā)明采用含一定濃度尿素和還原劑的復(fù)性液，使融合蛋白和單體蛋白質(zhì)緩慢復(fù)性過程中組合成為所需的嵌合體。在優(yōu)選過程中通過在一定pH條件下進(jìn)行預(yù)復(fù)性，然后在還原劑存在下，在濃度稍低的尿素溶液中緩慢復(fù)性，意外地得到了高收率的嵌合體。
[0083]而對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)來說，收率的高低直接影響了生產(chǎn)的成本，更直接影響了大規(guī)模生產(chǎn)的可能性。采用本發(fā)明的方法，嵌合體的收率可以達(dá)到實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)的水平。
[0084]下文通過具體的實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。
[0085]1.抗原的制備方法
[0086]實(shí)施例1CTB-UreB/4CTB 制備:
[0087]1.1.1 重組工程菌 PET-28a-CTB-UreB/BL21_DE3 的構(gòu)建
[0088]1.1.1.1 融合基因 CTB-UreB 的構(gòu)建:
[0089]UreB DNA序列來自HP菌株MEL-HP27，CTB DNA序列來自霍亂弧菌0395株，在融合DNA片段間引入富含甘氨酸/絲氨酸具有柔性功能的(G4S)3連接體(linker)序列(用斜體下劃線表示)，并合成CTB-UreB基因密碼子。
[0090]基因序列為SEQ ID N0.1:
[0091]ATGACACCTCAAAATATTACTGATTTGTGTGCAGAATACCACAACACACA 50
[0092]AATACATACGCTAAATGATAAGATATTTTCGTATACAGAATCTCTAGCTG 100
[0093]GAAAAAGAGAGATGGCTATCATTACTTTTAAGAATGGTGCAACTTTTCAA 150
[0094]GTAGAAGTACCAGGTAGTCAACATATAGATTCACAAAAAAAAGCGATTGA 200
[0095]AAGGATGAAGGATACCCTGAGGATTGCATATCTTACTGAAGCTAAAGTCG 250
[0096]AAAAGTTATGTGTATGGAATAATAAAACGCCTCATGCGATTGCCGCAATT 300
[0097]AGTATGGCAAAT 'SGTeGTeeTeGTTCTGGTGeTeeTGGTTCTeGTGGTGe 350
[0098]TGGTTCT ATGAAAAAGATTAGCAGAAAAGAATATGTTTCTATGTATGGCC 400
[0099]CTACTACAGGCGATAAAGTGAGATTGGGCGATACAGACTTGATCGCTGAA450
[0100]GTAGAACATGACTACACCATTTATGGCGAAGAGCTTAAATTCGGTGGCGG500
[0101]TAAAACTTTGAGAGAAGGCATGAGCCAATCCAACAACCCTAGCAAAGAAG550
[0102]AACTGGATTTAATCATCACTAACGCTTTAATCGTGGATTACACCGGTATT600
[0103]TATAAAGCGGATATTGGTATTAAAGATGGCAAAATCGCTGGCATTGGCAA650
[0104]AGGCGGCAACAAAGACATGCAAGATGGCGTTAAAAACAATCTTAGCGTGG700
[0105]GTCCTGCTACTGAAGCCTTAGCTGGTGAAGGTTTGATCGTAACTGCTGGT750
【權(quán)利要求】
1.一種抗原嵌合體，包括: 抗原與能形成多聚體的黏膜免疫佐劑蛋白質(zhì)單體的融合蛋白，和 所述能形成多聚體的黏膜免疫佐劑蛋白質(zhì)單體，其中， 所述能形成多聚體的黏膜免疫佐劑蛋白質(zhì)單體選自霍亂毒素B亞單位和大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位中的一種， 所述多聚體為五聚體，而且 在所述嵌合體中所述融合蛋白與所述能形成多聚體的黏膜免疫佐劑蛋白質(zhì)單體的摩爾比為1:4, 其中所述抗原嵌合體穩(wěn)定存在的PH大于7.0,優(yōu)選pH為8.0。
2.如權(quán)利要求1所述的抗原嵌合體，其中所述霍亂毒素B亞單位和大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位為其天然組成結(jié)構(gòu)或其能夠形成五聚體結(jié)構(gòu)的突變體。
3.如權(quán)利要求1或2所述的抗原嵌合體，其中所述抗原的分子量在10至IOOkD范圍內(nèi)，優(yōu)選16kD至65kD。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的抗原嵌合體，其中所述抗原為適用于黏膜免疫的抗原。
5.如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的抗原嵌合體，其中所述抗原選自經(jīng)由黏膜途徑感染人體或動(dòng)物體的病原菌的抗原，包括但不限于幽門螺桿菌抗原、傷寒抗原、流感血凝素(HA)抗原。
6.如權(quán)利要求5所述的抗原嵌合體，其中所述幽門螺桿菌抗原選自幽門螺桿菌尿素酶B亞單位(UreB)、幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A(CagA)蛋白和幽門螺桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白(NAP)中的至少一種。
7.如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的抗原嵌合體，其中所述融合蛋白包含位于所述抗原與所述黏膜免疫佐劑蛋白質(zhì)單體之間的3個(gè)G4S連接體。
8.—種抗原組合物，包含如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的抗原嵌合體，其中所述抗原嵌合體穩(wěn)定存在的PH大于7.0，優(yōu)選pH為8.0。
9.一種疫苗，包含如權(quán)利要求8所述的抗原組合物和適用于疫苗的賦形劑。
10.如權(quán)利要求9所述的疫苗，為口服疫苗、經(jīng)鼻給藥的疫苗或經(jīng)直腸給藥的疫苗。
11.一種用于制備抗原組合物的試劑盒，包括表達(dá)如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)中所定義的融合蛋白的載體和表達(dá)如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)中所定義的能形成多聚體的黏膜免疫佐劑蛋白質(zhì)單體的載體。
12.如權(quán)利要求11所述的試劑盒,其中所述載體均為原核表達(dá)載體。
13.制備如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述抗原嵌合體的方法，包括用權(quán)利要求10所述的試劑盒中的載體分別表達(dá)所述融合蛋白和所述能形成多聚體的黏膜免疫佐劑蛋白質(zhì)單體，然后通過復(fù)性方法使這兩種蛋白結(jié)合形成所述嵌合體，其中所述復(fù)性方法包括將所述兩種蛋白共同放置在含有尿素和二硫蘇糖醇(DTT)或尿素和巰基乙醇的復(fù)性液中進(jìn)行復(fù)性的步驟，優(yōu)選所述復(fù)性液的PH大于7.0，更優(yōu)選所述復(fù)性液的pH為8.0。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述復(fù)性液中尿素的濃度為1.0M至2.5M。
15.如權(quán)利要求13或14所述的方法，其中所述DTT或巰基乙醇的濃度為0.2mM至.1.0mM0
16.如權(quán)利要求13至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中在所述復(fù)性液中進(jìn)行復(fù)性步驟之前，先將所述蛋白質(zhì)單體在含6M至9M，優(yōu)選8M的尿素，且pH為3.0至4.0的緩沖液中預(yù)復(fù)性0.5至3小時(shí)，優(yōu)選預(yù)復(fù)性I小時(shí)。
17.—種通過復(fù)性制備嵌合體的方法，所述嵌合體包含(I) 一種蛋白質(zhì)與能形成多聚體的單體蛋白質(zhì)的融合蛋白和(2)能形成多聚體的單體蛋白質(zhì)，通過所述(I)融合蛋白中的單體蛋白質(zhì)和所述(2)單體蛋白質(zhì)形成多聚體來形成嵌合體，所述方法包括: 將所述⑵能形成多聚體的單體蛋白質(zhì)在含6M至9M，優(yōu)選8M的尿素，且pH為3.0至.4.0的緩沖液中預(yù)復(fù)性0.5至3小時(shí)，優(yōu)選預(yù)復(fù)性I小時(shí)；和 將所述(I)融合蛋白和所述(2)能形成多聚體的單體蛋白質(zhì)在含有1.0M至2.5M的尿素和0.2mM至1.0mM的DTT或巰基乙醇的復(fù)性液中復(fù)性形成所述嵌合體，優(yōu)選所述復(fù)性液的PH大于7.0，更 優(yōu)選所述復(fù)性液的pH為8.0。
【文檔編號(hào)】A61P31/16GK103990121SQ201410217707
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月6日
【發(fā)明者】李克英, 耿雨紅 申請人:上海聯(lián)合賽爾生物工程有限公司