專利名稱：體干細(xì)胞的制作方法
體干細(xì)胞相關(guān)申請本發(fā)明系依據(jù)2010年8月4日申請的美國臨時(shí)申請案61/370，600號、2010年9月17日申請的美國臨時(shí)申請案61/383，842號、2011年2月25日申請的美國臨時(shí)申請案61/446，669號請求優(yōu)先權(quán)。此等前案以全文引用的方式納入本案中。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞為在活體內(nèi)或試管內(nèi)可分化成許多或所有細(xì)胞譜系(cell lineages)的多能性(pluripotent)或全能性(totipotent)細(xì)胞。由于其的多能性,一般相信胚胎干(ES)細(xì)胞具有治療退化性或遺傳性疾病的遠(yuǎn)大前景。但是倫理上的考慮阻礙了人類干細(xì)胞的使用。非胚胎來源的干細(xì)胞則可規(guī)避該障礙。因此，對于非胚胎干細(xì)胞具有需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明系關(guān)于體干細(xì)胞，其為多能性或全能性，以及相關(guān)方法。一方面，本發(fā)明的特征為經(jīng)離析的體干細(xì)胞，其尺寸為0.3至6.0微米(尺寸為，例如，0.3至5.0微米、0.3至4.0微米及0.3至3.0微米)且為⑶9+。該經(jīng)離析的體干細(xì)胞可為⑶9+CD349+或⑶9+⑶349_。細(xì)胞標(biāo)記(marker)后的符號“ + ”代表用標(biāo)記-特異性抗體染色時(shí)顯示較強(qiáng)的熒光，而用該抗體的同型(isotype)對照組染色時(shí)顯示較弱的熒光。細(xì)胞標(biāo)記后的符號代表用標(biāo)記-特異性抗體染色時(shí)所顯示的熒光強(qiáng)度與用該抗體的同型對照組染色時(shí)所顯示者相同。在一具體實(shí)施例中，該經(jīng)離析的體干細(xì)胞為非吸附性。在本文中該細(xì)胞被稱為“SB-1”細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明的特征為經(jīng)離析的體干細(xì)胞，其尺寸為0.3至6.0微米(尺寸為，例如，0.3至5.0微米、0.3 至4.0微米及0.3至3.0微米)且為SSEA1+、SSEA4+、CD13+、或Strol+。在一具體實(shí)施例中，該經(jīng)離析的體干細(xì)胞為非吸附性。在本文中該細(xì)胞被稱為“SB-2” 細(xì)胞。又另一方面，本發(fā)明的特征為制造體干細(xì)胞群的方法。該方法包括:從個(gè)體(例如人類或非人類)得到含有多個(gè)細(xì)胞的體液(例如血液、骨髓、臍帶血、月經(jīng)、及羊水)樣品；將該樣品與二價(jià)陽離子螯合劑(例如，EDTA、EGTA、及檸檬酸鈉)或肝素(heparin)在容器中培養(yǎng)直至該樣品分為上層及下層；收集該上層；以及從該上層離析一群尺寸為0.3至6.0微米的體干細(xì)胞(尺寸為，例如，0.3至5.0微米、0.3至4.0微米及0.3至3.0微米)。在該上層中的細(xì)胞在本文中被稱為“SB細(xì)胞”或“SB細(xì)胞群”。在SB細(xì)胞群中的體干細(xì)胞可為CD9+、SSEA1+、SSEA4+、CD13+、或Strol+。例如其可為⑶9+⑶349+。此等體干細(xì)胞非為吸附性且可具有受精卵細(xì)胞的形態(tài)及生長特征。再者，其可被誘發(fā)生成所有3層胚層，即內(nèi)胚層、外胚層及中胚層。來自上層的SB細(xì)胞的離析可借由根據(jù)細(xì)胞尺寸的方法(例如離心或過濾)或根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)記的方法(例如流式細(xì)胞測量術(shù))進(jìn)行。該方法進(jìn)一步包括于收集該上層后，將其與ADP —起培養(yǎng)以允許血小板/微粒沉淀而使干細(xì)胞進(jìn)一步富化(enriched)。此外,該方法亦包括將從肝素處理過的的樣品得到的的上層與二價(jià)陽離子螯合劑一起培育，以使干細(xì)胞活化而從細(xì)胞周期GO進(jìn)入G1。再一方面，本發(fā)明的特征為借由上述方法制備的SB細(xì)胞群。又再一方面，本發(fā)明的特征為細(xì)胞銀行，其包括多個(gè)群的體干細(xì)胞。此等群系借由上述方法從不同個(gè)體的體液樣品(例如血液及骨髓)分開制備。本發(fā)明的進(jìn)一步特征為增加樣品中所含的干細(xì)胞的數(shù)目的方法。該方法包括:將二價(jià)陽離子螯合劑加至該樣品中以及將該樣品中的干細(xì)胞與二價(jià)陽離子螯合劑一起培養(yǎng)。該方法進(jìn)一步包括在加入螯合劑的前及將該等細(xì)胞與螯合劑一起培養(yǎng)的后測定樣品中所述及的細(xì)胞(例如SB-1細(xì)胞、SB-2細(xì)胞、以及SB-1細(xì)胞與SB-2細(xì)胞二者)的計(jì)數(shù)。待用本方法檢驗(yàn)的干細(xì)胞的例子包括在SB群中的干細(xì)胞，例如SB-1細(xì)胞。評估個(gè)體是否有老化相關(guān)性異常或癌癥的危險(xiǎn)的方法亦在本發(fā)明的范圍內(nèi)。老化相關(guān)性異常的例子包括:自行-修復(fù)缺陷、退化性疾病、自體免疫疾病、心血管疾病或糖尿病。該方法包括:個(gè)體取得某些體干細(xì)胞群，以及測定該體干細(xì)胞的計(jì)數(shù)。所得到的體干細(xì)胞可為 SB-1 細(xì)胞或 SB-2 細(xì)胞。此等可為 CD9+、CD349+、SSEA1+、SSEA4+、CD13+、或 Strol+。此等各個(gè)的尺寸為0.3至6.0微米。在SB群中的干細(xì)胞可借由上述方法得到，較佳使用肝素以將體液樣品分離成上層及下層。若該計(jì)數(shù)低于第一預(yù)定值，則該個(gè)體被認(rèn)定有罹患該異常的危險(xiǎn)，或者若該計(jì)數(shù)高于第二預(yù)定值，則該個(gè)體有罹患癌癥的危險(xiǎn)。第一值可從年輕且健康的第一對照個(gè)體得至IJ。第二值可從罹患癌癥的第二對照個(gè)體得到。本發(fā)明亦包括在個(gè)體中增加體干細(xì)胞的數(shù)目的方法。該方法包括將有效量的在SB細(xì)胞群中的體干細(xì)胞投與至需要其的個(gè)體。于投與的前及的后可測定在來自該個(gè)體的樣品(例如血液及骨髓)中所述及的細(xì)胞(諸如SB-1細(xì)胞)的個(gè)別計(jì)數(shù)。舉例言之，為了實(shí)施該方法?？墒褂迷诤?0ηΜ-5 μ M EDTA的250毫升磷酸鹽緩沖液中的體干細(xì)胞。最后，本發(fā)明的特征為治療肌肉受傷或肌肉退化性疾病的方法。該方法包含將有效量的在SB細(xì)胞群中的體干細(xì)胞投與至需要其的個(gè)體。該肌肉退化性疾病的例子包括肌肉營養(yǎng)不良癥、纖維肌痛、肌肉病變、皮肌炎、多發(fā)性肌炎、橫紋肌溶解癥或心肌炎。本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)具體實(shí)施例的細(xì)節(jié)述于附圖及以下說明中。從該說明及附圖以及從權(quán)利要求可顯而易知本發(fā)明的其他特征、目的及優(yōu)點(diǎn)。


圖1包括5個(gè)散點(diǎn)圖(scatter plot),其顯示估計(jì)Pl-圈選區(qū)(Pl-gated region)中的細(xì)胞的尺寸用的標(biāo)準(zhǔn)珠粒的尺寸。圖2包括3個(gè)散點(diǎn)圖，其顯示當(dāng)以流式細(xì)胞測量術(shù)分析時(shí)在P3-圈選區(qū)中各具有小于6微米的尺寸的細(xì)胞。左圖為顯示具有大(> 6微米)、小細(xì)胞二者的全血的圖；中間圖為顯示純化后在SB細(xì)胞群中的細(xì)胞的圖；以及右圖為顯示只有緩沖液的圖。 圖3包括3個(gè)散點(diǎn)圖，其顯示在P3-圈選區(qū)的SB細(xì)胞群，該SB細(xì)胞群包括在P2-圈選區(qū)的SB-1細(xì)胞及在P5-圈選區(qū)的SB-2細(xì)胞。注意緩沖液、血小板及微粒分別在P4-、P1-、P2-圈選區(qū)中。圖4包括2個(gè)散點(diǎn)圖，其顯示在P2-圈選區(qū)的SB-1細(xì)胞，該SB-1細(xì)胞系從血液中離析而來。如左側(cè)格所示，幾乎所有的SB-1細(xì)胞以SYTO染色時(shí)皆呈陽性。圖5包括2個(gè)散點(diǎn)圖，其顯示在P5-圈選區(qū)的SB-2細(xì)胞，該SB_2細(xì)胞系從血液中離析而來。如左圖所示，幾乎所有的SB-2細(xì)胞以SYTO染色時(shí)皆呈陰性。圖6包括2個(gè)散點(diǎn)圖，其顯示在P6-圈選區(qū)的紅血球，該紅血球系從血液中離析而來。如左圖所示，所有紅血球以SYTO染色時(shí)皆呈陰性。詳細(xì)說明本發(fā)明至少部分系基于下述未預(yù)期的發(fā)現(xiàn):(i)多能性或全能性干細(xì)胞群，即SB細(xì)胞群可從一般相信不含細(xì)胞的樣品中離析出；(ii) 二價(jià)陽離子螯合劑(例如EDTA)會(huì)活化該群中的多能性或全能性干細(xì)胞并在未使其喪失其分化潛力下強(qiáng)迫其增殖；以及(iii)該多能性或全能性干細(xì)胞群可被分化成外胚層、內(nèi)胚層及中胚層細(xì)胞。在該群中的SB-1細(xì)胞針對CD9染色時(shí)呈陽性，在該群中的SB-2細(xì)胞于染色時(shí)下述標(biāo)記的I個(gè)或多個(gè)呈陽性，即SSEA1+、SSEA4+、CD13+、或Strol+。SB細(xì)胞群、SB-1細(xì)胞及SB-2細(xì)胞可從人類或非人類動(dòng)物離析。為上述體干細(xì)胞的取得來源的非人類動(dòng)物的例子如下:靈長類、狗、嚙齒動(dòng)物、天竺鼠、貓、馬、牛、羊及豬。換言之，其包括，但非限于，寵物動(dòng)物、農(nóng)場動(dòng)物、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及疾病-模型動(dòng)物。A.細(xì)胞本發(fā)明系關(guān)于SB細(xì)胞群，其系從非胚胎來源制備的多能性或全能性干細(xì)胞。如同ES細(xì)胞，在該群中的細(xì)胞為全能性或多能性。更重要地，該群可以極高產(chǎn)率容易地得至IJ。所以在治療各種退化性疾病或組織損傷時(shí)可用于再生已分化的功能性細(xì)胞。如下述實(shí)施例所示，該群可容易地在試管中制備、維持及擴(kuò)增，且可借由使用例行的技術(shù)途徑誘發(fā)其分化。此外，于將該群中的干細(xì)胞移植至動(dòng)物個(gè)體(例如小鼠)時(shí)，無惡性腫瘤生長的跡象。此等干細(xì)胞，由于含有正常的染色體組(chromosomal complement),所以非由譜系提交(lineage-uncommitted) 而可形成身體的所有體細(xì)胞(非生殖細(xì)胞)。其亦可形成生殖配子即精子及/或卵子、胚胎的細(xì)胞及組織、以及胎盤的胎兒部分。此等干細(xì)胞能回應(yīng)譜系-誘生劑、增殖劑、以及分化抑制劑。由于此等優(yōu)點(diǎn)，其可做為其他干細(xì)胞的替代物。術(shù)語“干細(xì)胞”在本文中系指全能性或多能性細(xì)胞，亦即此等細(xì)胞能分化成許多的最終分化細(xì)胞類型。全能性干細(xì)胞典型地具有發(fā)育成任何細(xì)胞類型的能力。全能性干細(xì)胞在來源上可為胚胎或非胚胎。多能性干細(xì)胞典型地為能分化成數(shù)種不同的最終分化細(xì)胞類型的細(xì)胞。單能干細(xì)胞只能產(chǎn)生一種細(xì)胞類型，但具有自行換新(self-renewal)性質(zhì),此為其與非干細(xì)胞的區(qū)別。此等干細(xì)胞可源自各種組織或器官系統(tǒng)，包括血液、神經(jīng)、肌肉、皮膚、腸、骨格、腎臟、肝臟、胰臟、胸腺等。本文所揭示的干細(xì)胞為實(shí)質(zhì)純。該術(shù)語“實(shí)質(zhì)純”，當(dāng)用于描述干細(xì)胞或從其衍生的細(xì)胞(例如分化細(xì)胞)時(shí)。意指特定細(xì)胞構(gòu)成制劑中的大部分細(xì)胞(即，例如，大于20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%)。一般而言，實(shí)質(zhì)純化的細(xì)胞群系構(gòu)成制劑中的至少約70%的細(xì)胞，通常構(gòu)成制劑中的約80%的細(xì)胞，尤其構(gòu)成制劑中的至少約90%的細(xì)胞(例如，95%、97%、99%或100%)。因此，本發(fā)明具有“可得到特定類型細(xì)胞(例如，SB-1細(xì)胞)的實(shí)質(zhì)純?nèi)后w而未被其他類型細(xì)胞污染”的優(yōu)點(diǎn)。可用來自個(gè)體的各種含細(xì)胞樣品制備本發(fā)明的細(xì)胞群。在本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例中，細(xì)胞群系從血液或骨髓樣品制備。
為了確證該被離析的群實(shí)際上含有SB-1細(xì)胞，可檢查許多特征，包括(I)懸浮液中細(xì)胞的尺寸系在0.3至6.0微米之間，以0.5至5.0微米為較佳，以及(2)細(xì)胞表面標(biāo)記?？墒褂脤辜?xì)胞表面標(biāo)記(諸如CD9)的抗體。此等抗體可與適當(dāng)?shù)木順?biāo)結(jié)合，此等卷標(biāo)諸如突光素異硫氰酸酯(fluorescein isothiocyanate, FITC)、藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)或量子點(diǎn)。SB-1細(xì)胞，其為CD+，可借由使用流式細(xì)胞儀而進(jìn)一步富化。此等經(jīng)離析或富化的細(xì)胞然后借由標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)檢驗(yàn)。為了確證在SB細(xì)胞群中的干細(xì)胞的分化潛力，其借由本技藝已知的方法誘發(fā)以形成，例如，神經(jīng)-膠質(zhì)細(xì)胞、骨細(xì)胞及含脂肪細(xì)胞。例如，將此等細(xì)胞繼代培養(yǎng)至細(xì)胞長滿生長平面，然后移至生骨培養(yǎng)基或生脂培養(yǎng)基上并培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間(例如3星期)。骨生成的分化潛力系借由鈣蓄積的礦化(mineralization)而評估,該礦化可借由馮科薩(von Kossa)染色顯現(xiàn)。為了檢定生脂分化，細(xì)胞內(nèi)脂肪小滴可借由油紅0(0il Red 0)染色及于顯微鏡下觀察。就神經(jīng)分化而言，可將此等細(xì)胞在生神經(jīng)(neurogenic)培養(yǎng)基中培養(yǎng)適當(dāng)期間(例如7日)，然后承受血清耗竭(serum depletion)及與巰基乙醇一起培養(yǎng)。分化后，其顯示具有被排列成網(wǎng)狀的延伸軸突樣結(jié)構(gòu)的可彎折細(xì)胞體的形態(tài)。進(jìn)一步進(jìn)行譜系特異性標(biāo)記的RT PCR及免疫細(xì)胞化學(xué)染色以確證神經(jīng)分化。此等標(biāo)記的例子包括具神經(jīng)元特異性的第III類一微管蛋白(Tuj-1)、神經(jīng)絲(neurofilament)及 GFAP。或者，為了確認(rèn)經(jīng)離析細(xì)胞的身份，可利用SB-1細(xì)胞會(huì)響應(yīng)二價(jià)陽離子螯合劑(EDTA)而迅速增殖的發(fā)現(xiàn)。為此，可將經(jīng)離析的細(xì)胞與，例如，EDTA，一起培育。于該條件下，SB-1細(xì)胞將增殖。相對照地，⑶66e+細(xì)胞行為模式不同?？蓪B細(xì)胞群中的干細(xì)胞在未分化培養(yǎng)基中進(jìn)一步繁殖達(dá)10、20、50或100次倍增，且不會(huì)顯示自然的分化、衰老、形態(tài)改變、生長速率增加或分化成神經(jīng)元的能力改變。此等干細(xì)胞于使用前可借由標(biāo)準(zhǔn)方法貯存。術(shù)語“增殖”及“擴(kuò)增”在本文中用于描述細(xì)胞時(shí)可交換使用，其系指借由分裂相同類型的細(xì)胞的數(shù)目增加。術(shù)語“分化”系指使細(xì)胞變得特殊化而具有特定功能的發(fā)育過程，例如細(xì)胞獲得I種或多種不同于初始細(xì)胞類型的形態(tài)特征及/或功能。術(shù)語“分化”包括譜系提交(lineage commitment)及終末分化過程。分化可借由，例如利用免疫組織化學(xué)或其他精于本技藝者已知的其他程序監(jiān)測譜系標(biāo)記的存在與否來評估。從祖先細(xì)胞衍生的已分化后代細(xì)胞可，但非必須，與做為干細(xì)胞的來源組織的相同胚層或組織有關(guān)。例如，神經(jīng)祖先細(xì)胞及肌肉祖先細(xì)胞可分化成造血細(xì)胞譜系。術(shù)語“譜系提交(lineagecommitment) ”及“特異化(specification) ”在本文中可交換使用，系指干細(xì)胞所經(jīng)歷的一過程，其中該干細(xì)胞生成祖先細(xì)胞，該祖先細(xì)胞被提交形成有限范圍的特定類型的分化細(xì)胞。被提交的祖先細(xì)胞常能夠自行換新或細(xì)胞分裂。術(shù)語“終末分化(terminal differentiation) ”系指細(xì)胞最終分化為成熟、充分分化的細(xì)胞。例如，神經(jīng)祖先細(xì)胞及肌肉祖先細(xì)胞可分化成造血細(xì)胞譜系，該造血細(xì)胞譜系的終末分化導(dǎo)致分化成屬特定細(xì)胞類型的成熟血球。通常，終末分化連同發(fā)生從細(xì)胞周期的抽離及增殖的中止。術(shù)語“祖先細(xì)胞”在本文中系指被提交于特定細(xì)胞譜系的細(xì)胞，其借由一系列的細(xì)胞分裂生成該譜系的細(xì)胞。祖先細(xì)胞的一例可為成肌細(xì)胞，其能夠只分化成一類型的細(xì)胞，但其本身未充分成熟或充分分化。具有多個(gè)上述干細(xì)胞群的細(xì)胞銀行或細(xì)胞庫在本發(fā)明的范圍內(nèi)。 此等干細(xì)胞可為人類細(xì)胞或非人類細(xì)胞。該銀行可借由下述方法制備:分別從不同的個(gè)體收取SB細(xì)胞群；賦予此等SB細(xì)胞群特征以使各群得到至少一預(yù)定特征，根據(jù)該至少一預(yù)定特征將此等SB細(xì)胞群的各個(gè)分類。為了制備該銀行，可將SB細(xì)胞群進(jìn)一步擴(kuò)增。該特征的例子包括個(gè)體的名字、性別、身體狀況(包括遺傳異常及MHC信息)。B.細(xì)胞的使用含有例如SB-1細(xì)胞的上述SB細(xì)胞群可以各種方式使用。 篩詵方法:在SB細(xì)胞群中的上述干細(xì)胞可被用于篩選分析以鑒定出可影響特定細(xì)胞類型的藥物，而指示出在治療與該細(xì)胞類型相關(guān)的異常上有用的藥物。例如，可將干細(xì)胞用于鑒定治療疾病(例如退化性疾病)的候選藥的方法。該方法包括使受試化合物與干細(xì)胞接觸并測定于該疾病中被下調(diào)的多肽的表達(dá)度(level)的步驟。存在該受試化合物下的表達(dá)度，若高于不存在該化合物下的表達(dá)度，則該化合物為治療該疾病的候選藥。該疾病的例子包括:糖尿病、神經(jīng)退化疾病、關(guān)節(jié)炎、癌癥或自體免疫異常。表達(dá)度系以mRNA量(level)或蛋白質(zhì)量來測定。因此，本發(fā)明的一態(tài)樣系關(guān)于鑒定會(huì)改變SB細(xì)胞群中未分化細(xì)胞的功能的作用劑(agent)的方法，其系借由將該等細(xì)胞與受試作用劑接觸。存在該受試作用劑下細(xì)胞的功能或基因表達(dá)度與不存在該受試作用劑下的功能相較發(fā)生改變，表示該受試作用劑為能改變細(xì)胞的功能或細(xì)胞中基因表達(dá)的作用劑。術(shù)語“受試作用劑”系指正被檢查是否具有改變細(xì)胞功能或細(xì)胞中基因表達(dá)的能力的任何分子。雖然該方法通常系用于篩選分析以鑒定具有期望活性的先前未知分子，但本發(fā)明的篩選方法亦可用于確證已知具有特定活性的作用劑。該功能可為典型在細(xì)胞中表達(dá)(或未表達(dá))的基因的表達(dá),且該作用劑可借由增加或減少被表達(dá)基因的表達(dá)度、或者借由啟動(dòng)細(xì)胞中未表達(dá)基因的表達(dá)(例如誘導(dǎo)譜系-特異性抗原的表達(dá))而改變該功能。在一具體實(shí)施例中，會(huì)影響細(xì)胞功能的作用劑為能誘導(dǎo)干細(xì)胞分化者，借此產(chǎn)生分化細(xì)胞。此等分化細(xì)胞可為多潛能(multipotential)人類干細(xì)胞(例如造血干細(xì)胞)或終末分化細(xì)胞(例如，肌肉細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、血球、結(jié)締組織或上皮細(xì)胞)。因此，該方法可被用于鑒定能誘導(dǎo)在SB細(xì)胞群中的干細(xì)胞分化成終末分化細(xì)胞的作用劑，其中終末分化細(xì)胞包括胰臟β細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞或任何其他細(xì)胞類型。如此鑒定出的作用劑或化合物可用于治療退化性異常、癌癥或免疫異常。表達(dá)度系以mRNA量(level)或蛋白質(zhì)量來測定。測量樣品中mRNA量的方法在本技藝中為熟知。為了測量mRNA量，可將細(xì)胞溶裂，在溶裂物中mRNA的量，不論純化與否，皆可借由例如雜交分析(使用附有可檢測標(biāo)簽的基因-特異性DNA或RNA探針)及定量或半定量RT-PCR(使用適當(dāng)?shù)幕?特異性引物)來測定。另一選擇為使用附有可檢測標(biāo)簽(例如熒光或酶)的DNA或RNA探針對組織切片或未溶裂細(xì)胞懸浮液進(jìn)行定量或半定量原位雜交分析。另外的mRNA-定量方法包括RNA保護(hù)分析(RPA)法及基因表達(dá)的系列分析(SAGE)法。測量樣品中蛋白質(zhì)量的方法在本技藝中亦為熟知。其中一些使用可特異性地結(jié)合于標(biāo)靶蛋白質(zhì)的抗體(例如單株或多株抗體)。在此種分析中，可使該抗體本身或結(jié)合于該抗體的二次抗體附上可檢測的標(biāo)簽。另一選擇為該抗體可與生物素(biotin)結(jié)合。其的存在可由附有可檢測標(biāo)簽的抗生物素蛋白(avidin)測定。此等途徑的組合(包括“多層三明治”分析)可用于增加此等方法的敏感度。一些蛋白質(zhì)-測量分析(例如ELISA或西方點(diǎn)潰法)可應(yīng)用于體液或細(xì)胞的溶裂物，以及一些(例如免疫組織化學(xué)染色法或熒光流式細(xì)胞測量術(shù))可應(yīng)用于組織切片或未溶裂細(xì)胞懸浮液。適當(dāng)?shù)臉?biāo)簽包括放射性核素(例如1251、1311、35S、3H或32P)、酶(例如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、熒光素酶或半乳糖苷酶)、熒光/發(fā)光劑(例如突光、若丹明(rhodamine)、藻紅蛋白(phycoerythrin)、GFP、BFP及奈米粒子(例如，Qdot ,由 Quantum Dot Corporation 供應(yīng)，Palo Alto, CA)。其他可應(yīng)用的方法包括定量免疫沉淀或補(bǔ)體固定分析。受試化合物或作用劑可為任何類型的分子，例如，多核苷酸、肽、模擬肽、類肽(peptoids)(諸如乙烯肽)、小有機(jī)分子或類似物，且可以各種方式的任一種作用而改變SB細(xì)胞群中干細(xì)胞的功能。例如，受試作用劑可借由結(jié)合于由細(xì)胞所表達(dá)的細(xì)胞表面受器而作用于細(xì)胞外，借此改變通常結(jié)合于該受器并經(jīng)由該受器作用的配體于結(jié)合時(shí)所媒介的功能。另一選擇為:該受試作用劑可為被動(dòng)或經(jīng)由主動(dòng)運(yùn)輸機(jī)制橫越細(xì)胞膜，并在細(xì)胞內(nèi)作用而改變功能者。肽類受試作用劑可為胺基酸或胺基酸類似物的任何聚合物，其可由約3至4個(gè)殘基乃至數(shù)百個(gè)或數(shù)千個(gè)殘基構(gòu)成。肽類受試作用劑可借由化學(xué)合成、或使用蛋白質(zhì)純化的方法制備，繼而進(jìn)行蛋白質(zhì)水解，且若期望，進(jìn)一步借由層析或電泳方法純化；或者可從編碼聚核苷酸表達(dá)。肽類受試作用劑可以已知肽(例如天然肽)為主體，但可從天然序列變化，例如含有一種或多種胺基酸類似物。聚核苷酸類作用劑可為由磷酸二酯鍵鍵結(jié)在一起的2個(gè)或多個(gè)脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的序列。該聚核苷酸類作用劑可為RNA或DNA,其可為基因或基因的一部分，例如cDNA、RNAi劑、合成多脫氧-核糖核酸序列或類似物，且可為單股或雙股、以及DNA/RNA雜交物。其可為天然核酸分子以及合成分子，該天然核酸分子可從細(xì)胞離析，該合成分子可借由例如化學(xué)合成方法或借由酶方法(諸如借由聚合物酶連鎖反應(yīng)(PCR))制備。在各種具體實(shí)施例中，本發(fā)明的聚核苷酸可含有核苷或核苷酸類似物或者磷酸二酯鍵以外的主干鍵結(jié)。此等核苷酸類似物在本技藝中為熟知且可從市面取得，含有此種核苷酸類似物的聚核苷酸亦復(fù)如此(Pagratis et al., Nature Biotechnol.15:68-73，1997)?？墒褂帽疚乃沂镜姆椒ɑ虮炯妓囈阎钠渌椒▽⒕酆塑账犷愂茉囎饔脛┡cSB細(xì)胞群中的干細(xì)胞接觸或引進(jìn)該等干細(xì)胞中。一般而言，但非必須，將聚核苷酸引進(jìn)細(xì)胞中，在該細(xì)胞中其直接發(fā)揮其功能或于轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)譯(translation)或二者的后發(fā)揮其功能。例如，該聚核苷酸可編碼肽類受試作用劑，該肽類受試作用劑在細(xì)胞中被表達(dá)并改變該等細(xì)胞的功能。聚核苷酸類受試作用劑亦可為或可編碼反義分子、核酶(ribozyme)或三聯(lián)劑(triplexingagent),其可被設(shè)計(jì)成標(biāo)定I種或多種特異性標(biāo)祀核酸分子。待篩選的候選作用劑或化合物(例如蛋白質(zhì)、肽、模擬肽、類肽、抗體、小分子或其他藥物)可借由使用在本技藝中已知的組合庫方法中的許多途徑的任一者而得到。此等庫包括:肽庫、類肽庫(具有肽的官能基，但具有對酶降解有抗性的新穎非肽類主干)；可空間尋址的并行固相(spatially address able parallel solid phase)庫或溶液相庫；借由重迭合法(deconvolution)或親和性層析選擇得到的合成庫；以及“一株粒、一化合物”庫。參見，例如，Lam, 1997, Anticancer Drug Des.12:145。分子庫的合成方法的例子記載于,例如，Angew.Chem.1nt.Ed.Engl.33:2061;以及 Gallop et al., 1994 J.Med.Chem.37:1233。化合物庫可以溶液形式(例如Houghten, 1992，Biotechniques 13:412-421)呈現(xiàn),或在珠粒(Lam, 1991，Nature 354:82-84)、芯片(Fodor, 1993, Nature 364:555-556)、細(xì)菌(美國專利第 5，223，409 號)、孢子(美國專利第 5，223，409 號)、質(zhì)體(Cull et al.，1992，PNASUSA 89:1865-1869)、或嗜菌體(Felicil991, J.Mol.Biol.222:301-310;以及美國專利第5，223，409 號)上。治療退化性異?？梢允褂迷诒疚闹兴沂镜脑赟B細(xì)胞群中的干細(xì)胞治療退化性或遺傳性疾病，而可規(guī)避人類胚胎處理所涉及的倫理考慮。為了如此做，可從病患離析SB細(xì)胞群，該病患例如為缺少組織或器官適當(dāng)發(fā)育所必需的功能性基因者。然后將編碼該基因的功能版(functional version)的表達(dá)核酸載體引進(jìn)SB細(xì)胞群中的干細(xì)胞中?？山?jīng)由各種技術(shù)將該載體引入干細(xì)胞中，此等技術(shù)包括磷酸隹丐共沉淀、DEAE-葡聚糖-媒介的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(Iipofection)、電穿孔、顯微注射、或病毒-媒介技術(shù)。以不會(huì)影響該等細(xì)胞的多能性為較佳。此等技術(shù)的說明記載于，例如，美國專利第7，422，736號及第5，591，625號。將功能基因輸送入干細(xì)胞后，可用本技藝已知的方法將其移植回該病患。當(dāng)干細(xì)胞系從該病患制得時(shí)，該治療不會(huì)引起免疫排斥。另一選擇為:可從由健康人制備的SB細(xì)胞群制造全適供體細(xì)胞(universaldonor cells)。制造全適供體細(xì)胞的方法在本技藝中為已知,從SB細(xì)胞群制造通用多能干細(xì)胞的方法述于下文中。于適當(dāng)條件下，被移植的干細(xì)胞可發(fā)育成功能性組織或器官。為了促進(jìn)該發(fā)育，可將誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)育的因子投與該病 人。此等因子可為小分子化合物、肽及核酸。其的例子包括，但非限于，轉(zhuǎn)形生長因子β、骨形成蛋白質(zhì)(bone morphogenic protein)、及神經(jīng)生長因子。全適供體干細(xì)胞在研究譜系發(fā)育及分化的發(fā)育或分化機(jī)制上亦有用。可借由使用此種細(xì)胞做為模型系統(tǒng)而鑒定出誘導(dǎo)全能或多能干細(xì)胞發(fā)育成特定組織或器官的條件。再者，可借由使用本技藝已知的分化cDNA篩選而離析出于發(fā)育期間扮有角色的基因?？蓮囊驯徽T導(dǎo)而發(fā)育成某種譜系(例如上述神經(jīng)-膠質(zhì)譜系)的細(xì)胞制備cDNA庫。該庫繼而可用于離析及研究被分化地表達(dá)的基因。可進(jìn)一步研究此等經(jīng)離析的基因以界定其在個(gè)別過程中的角色。相關(guān)技術(shù)在本技藝中為已知。請參見，例如美國專利第7，422，736號。多能性干細(xì)胞亦可借由使用本技藝已知的方法而發(fā)育成動(dòng)物的器官或純系(clone)。所以，就寵物及家畜產(chǎn)業(yè)而言，此等細(xì)胞有價(jià)值，且可用于保存瀕臨絕種的動(dòng)物。在一方面，本發(fā)明的特征為治療個(gè)體退化性疾病的方法。該方法包含將有效量的上述干細(xì)胞投與至需要其的個(gè)體。在一具體實(shí)施例中，此等細(xì)胞的至少一種包括重組核酸。該重組核酸可編碼多肽且該干細(xì)胞可含有編碼多肽的mRNA。退化性疾病的例子包括糖尿病、神經(jīng)退化性疾病及關(guān)節(jié)炎。神經(jīng)退化性疾病的例子包括帕金森氏癥。在另一方面，本發(fā)明的特征為治療個(gè)體自體免疫性疾病的方法。該方法包括將有效量的上述組成物投與至需要其的個(gè)體。待治療上述異常的一的個(gè)體可借由該特定異常用的標(biāo)準(zhǔn)診斷技術(shù)來鑒定?！爸委煛毕抵笇⒔M成物(例如細(xì)胞組成物)投與至罹患該異常或有發(fā)展成該異常的虞的個(gè)體，其目的為治愈、減輕、緩解、彌補(bǔ)、延遲出現(xiàn)、預(yù)防或改善該異常、該異常的癥狀、繼發(fā)于該異常的疾病狀態(tài)、發(fā)展成損傷/異常的傾向?！坝行Я俊毕抵附M成物在接受治療的個(gè)體中能產(chǎn)生醫(yī)療上期望結(jié)果的量。該治療方法可單獨(dú)進(jìn)行或與其他藥物或治療并用。退化性疾病系指受犯組織或器官的功能或結(jié)構(gòu)隨時(shí)間經(jīng)過逐漸變差，而不論其系因遺傳缺陷、受傷、缺乏適當(dāng)?shù)募?xì)胞分化(例如在細(xì)胞增殖異常中者)、常態(tài)身體負(fù)荷(normal bodily wear)或生活方式的選擇。退化性疾病的例子包括神經(jīng)退化性疾病(例如阿茲海默癥、帕金森氏癥、亨丁頓氏舞蹈癥、多發(fā)性硬化癥、及肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS));其他神經(jīng)系統(tǒng)異常(例如，橫紋肌炎、腦或脊索外傷后脫髓鞘、急性腦損傷、頭部外傷、脊髓損傷、周圍神經(jīng)損傷、缺血性腦損傷、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的遺傳性髓鞘異常、癲癇、新生兒周產(chǎn)期窒息、窒息、缺氧癥、重積性癲癇、謝-德拉格(Shy-Drager)癥候群、自閉癥及中風(fēng))；癌癥或相關(guān)癌癥治療(例如化學(xué)治療)所引起的病況；代謝性疾病(例如糖尿病及尼曼匹克(Niemann Pick)癥)；自體免疫或發(fā)炎相關(guān)性疾病(例如紅斑癥、炎性腸疾病(IBD)、干癬癥、骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、狼瘡、糖尿病及氣喘)；眼睛異常(例如，青光眼、網(wǎng)膜色素變性、諾理(Norrie)疾病、以及黃斑點(diǎn)退化)；心臟及循環(huán)異常(例如，粥腫樣硬化、心衰竭、心肌梗塞及心血管疾病)；血液異常(例如威斯科特-奧爾德里奇(WiscottAldrich)癥候群)；肌肉萎縮；胃腸道疾??；腎臟疾?。桓闻K疾病；肺臟疾病；腎上腺異常(例如愛迪生氏癥)；由傷害引起的病況(例如燒傷、中風(fēng)、受傷組織(包括外傷、老化受傷細(xì)胞及老化受傷組織))；與老化相關(guān)的病況(例如掉發(fā)，包括雄性禿及圓形禿)；病毒病癥(例如C型肝炎感染癥及后天免疫缺乏異常)；以及可用器官移植或干細(xì)胞恢復(fù)、再生或改善與異常相關(guān)的征候及/或癥狀的任何其他異常。本發(fā)明的方法可用于治療勃起功能障礙以及用于女性的整形外科或乳房移植。治療個(gè)體中大腦或中樞神經(jīng)組織損傷或減輕該異常的癥狀的方法亦在本發(fā)明的范圍內(nèi)。該方法包括鑒定罹患腦組織損傷或有發(fā)展成該癥的虞的個(gè)體。該個(gè)體可為人類或非人類哺乳動(dòng)物，諸如貓、狗或馬。該腦組織損傷的例子包括由腦缺血(例如慢性中風(fēng))所引起者或神經(jīng)退化性疾病(例如 帕金森氏癥、阿茲海默癥、脊髓小腦疾病、亨丁頓氏舞蹈癥)。待治療的個(gè)體可借由診斷所論及的病況或異常的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來鑒定。治療方法包含將有效量的上述干細(xì)胞或活性作用劑/化合物投與至需要其的個(gè)體?？筛鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)方法評估此等干細(xì)胞的療效。例如，為了確證在促進(jìn)腦血管的血管新生上的效力，可在治療的前及的后借由標(biāo)準(zhǔn)的腦照影技術(shù)檢查該個(gè)體，此等腦照影技術(shù)諸如計(jì)算機(jī)斷層攝影(CT)、都普勒(Doppler)超音波造影(DUI)、磁共振造影(MRI)、及質(zhì)子磁共振光譜術(shù)(1H-MRS)。例如，1H-MRS代表取得與腦代謝活性相關(guān)的生化信息的非侵入性手段(Lu et al.，1997，Magn.Reson.Med.37，18-23)。該技術(shù)可應(yīng)用于評估在施行或不施行干細(xì)胞移植下涉及腦缺血的代謝改變。例如，其可用于研究腦中N-乙酰基天冬胺酸(NAA)濃度，NAA為神經(jīng)元完整性的標(biāo)記。雖然NAA的再分布及陷于神經(jīng)元碎片限制其做為定量性神經(jīng)元標(biāo)記的用途，但腦缺血時(shí)腦中NAA濃度降低被認(rèn)為系神經(jīng)元減損或功能不良的指針(Demougeot et al.，2004，J.Neurochem.90，776-83)。所以，借由 1H-MRS 測得的 NAA 濃度為追蹤腦缺血后干細(xì)胞移植的效果的有用指示劑?；蛑委?br> 在本文中所述的干細(xì)胞可用于表達(dá)外源性重組多肽。因此，此種含有重組核酸的干細(xì)胞在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。該重組核酸可編碼多勝酞且該干細(xì)胞可含有編碼多肽的mRNA ο此等干細(xì)胞可予以基因加工(genetically manipulated),以使其不會(huì)表達(dá)β 2-微球蛋白基因或不會(huì)表達(dá)I種或多種由第I類主要組織兼容性復(fù)合體(MHC)基因所編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)會(huì)激發(fā)T淋巴球所媒介的對抗細(xì)胞的反應(yīng)。既然此等細(xì)胞不會(huì)導(dǎo)致移植片的宿主排斥，因此可將此等細(xì)胞用做全適供體細(xì)胞。所以，本發(fā)明的一特征為將異源核酸引進(jìn)個(gè)體中的方法。該方法包括取得上述干細(xì)胞以及將該等細(xì)胞投與至需要其的病患的步驟，其中該等干細(xì)胞的至少一個(gè)包括異源核酸。該異源核酸可編碼多肽。術(shù)語“異源”為相對性術(shù)語，當(dāng)用于描述核酸的部分時(shí)表示該核酸包含2個(gè)或更多個(gè)亞序列，此等亞序列彼此的關(guān)系在自然界中未被發(fā)現(xiàn)。例如，以重組方式產(chǎn)生的核酸典型地具有2個(gè)或更多個(gè)來自不相關(guān)基因的序列，此等序列被人工排列而制成新穎的功能性核酸，此等序列例如為來自一來源的啟動(dòng)子及來自另一來源的編碼序列。因此，在本文中該二核酸被稱為彼此異源。重組核酸，當(dāng)被加入細(xì)胞中時(shí)，對于該細(xì)胞的內(nèi)生性基因而言亦為異源。因此，在染色體中，異源核酸將包括被整合入該染色體的非原生(非天然產(chǎn)生)核酸、或非原生(非天然產(chǎn)生)染色體外核酸。相對地，染色體的天然易位片段在本申請案的范疇內(nèi)不被認(rèn)為系屬異源，因?yàn)槠浒瑢ν蛔兗?xì)胞而言為原生的內(nèi)生性核酸序列。同樣地，異源蛋白質(zhì)表示該蛋白質(zhì)包含2個(gè)或更多個(gè)亞序列，此等亞序列彼此的關(guān)系在自然界中未被發(fā)現(xiàn)(例如，“融合蛋白質(zhì)”，其中該二亞序列系由單一核酸序列所編碼)。此種蛋白質(zhì)可借由重組技術(shù)產(chǎn)生。術(shù)語“重組”，當(dāng)用于描述，例如，細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體時(shí)，表示該細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體已借由異源核酸或蛋白質(zhì)的引進(jìn)或者原生核酸或蛋白質(zhì)的改變而修飾，或者表示從如此修飾的細(xì)胞衍生的細(xì)胞。因此，舉例言之，重組細(xì)胞表達(dá)在細(xì)胞的原生(天然)形式中未曾發(fā)現(xiàn)的基因，或者表達(dá)原生基因的第2套(copy)，該原生基因可為正?；虍惓１磉_(dá)、已被表達(dá)或完全未被 表達(dá)。上述干細(xì)胞及方法可用于本技藝已知的各種基因治療方法?；蛑委煱ɑ铙w外及活體內(nèi)技術(shù)。更特定而言，上述干細(xì)胞可用寡核苷酸調(diào)節(jié)因子(modulator)或編碼該調(diào)節(jié)因子的核酸分子予以活體外基因加工，然后將該經(jīng)基因加工的細(xì)胞提供給待治療的病患?？烧{(diào)配細(xì)胞培養(yǎng)物以投與至病患，例如，可借由解離該細(xì)胞(例如，借由機(jī)械解離)并將該細(xì)胞與醫(yī)藥上容許的載劑(例如，磷酸鹽緩沖食鹽溶液)充分混合來達(dá)成。另一選擇為:可將細(xì)胞在適當(dāng)?shù)纳锛嫒菪灾С治锷吓囵B(yǎng)，然后移植入病患。此等經(jīng)基因加工的細(xì)胞通常為自體的(autologous)以規(guī)避異種(xenogeneic)排斥或異型(allotypic)排斥。此等活體外方法為本技藝所熟知。此等細(xì)胞可借由使用本技藝已知的技術(shù)投與寡核苷酸或核酸分子而予以基因加工。例如，寡核苷酸或其他核酸分子可借由下述方法投與:直接注射“裸露”的核酸分子(美國專利第5，679，647號)或被調(diào)配成組合物的核酸分子，其中該組成物系由該核酸分子與I種或多種可促進(jìn)核酸分子被細(xì)胞攝取的其他作用劑[諸如皂素(saponin)(參見，例如，美國專利第5，739，118號)或陽離子多元胺(參見，例如，美國專利第5，837，533號)]調(diào)配而成；施行微粒轟擊(例如，經(jīng)由使用“基因槍”(gene gun, Biolistic),杜邦公司)；用脂質(zhì)、細(xì)胞-表面受器或轉(zhuǎn)染劑涂布核酸分子；將核酸分子包封在脂質(zhì)體、微?；蛭⒛z囊中；投與連結(jié)于肽的核酸分子，其中該肽已知會(huì)進(jìn)入核；或投與連結(jié)于配體的核酸分子，其中該配體會(huì)遭受受器-媒介的內(nèi)吞作用而可用于標(biāo)定特異性表達(dá)該受器的細(xì)胞類型?？尚纬珊怂?配體復(fù)合物，其中該配體包含可使內(nèi)涵體(endosome)破裂的融合病毒肽，使得核酸免于被溶酶體(lysosome)降解；或者核酸分子可借由標(biāo)定特異性受器而在活體內(nèi)被細(xì)胞特異性攝取及表達(dá)所標(biāo)定。此外，在細(xì)胞核中引進(jìn)、表達(dá)及蓄積反義(ant1-sense)寡核苷酸的有效率方法被記載于美國專利第6，265, 167號中，該方法允許該反義寡核苷酸與核中的有意義(sense)mRNA雜交,借此防止反義核酸被加工或被輸送至細(xì)胞質(zhì)。本發(fā)明亦涵蓋借由本技藝已知的同源重組，將核酸分子引進(jìn)至細(xì)胞內(nèi)繼而并入宿主細(xì)胞DNA中以供表達(dá)。聚核苷酸亦可被并入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中。許多適于基因治療應(yīng)用的載體在本技藝中為已知(參見，例如，Viral Vectors:·Basic Science and Gene Therapy, EatonPublishing C0.(2000))。表達(dá)載體可為質(zhì)體載體。制造及純化質(zhì)體DNA的方法迅速且直接。此外，質(zhì)體DNA通常不會(huì)整合入宿主細(xì)胞的基因組，而系以分立的實(shí)體維持在游離基因位置，此可免除染色體整合可能引起的基因毒性問題。現(xiàn)在各種質(zhì)體可容易地從市面獲取且包括從大腸桿菌及枯草桿菌衍生者，此等中有許多經(jīng)特別設(shè)計(jì)以供哺乳動(dòng)物系統(tǒng)使用?？捎糜诒景l(fā)明的質(zhì)體的例子包括，但非限于:真核表達(dá)載體pRc/CMV(Invitrogen)、pCR2.1 (Invitrogen)、pAd/CMV 及 pAd/TR5/GFPq(Massie et al., (1998)Cytotechnology 28:53-64)。在一例示的具體實(shí)施例中，質(zhì)體為 pRc/CMV、pRc/CMV2 (Invitrogen)、pAdCMV5 (IRB-NRC)、pcDNA3 (Invitrogen)、pAdMLP5 (IRB-NRC)、或 PVAX Invitrogen)。表達(dá)載體可為病毒系載體。病毒系載體的例子包括，但非限于:衍生自復(fù)制缺陷性反轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)、慢病毒(Ientivirus)、腺病毒(adenovirus)、腺病毒相關(guān)病毒。反轉(zhuǎn)錄病毒及腺病毒相關(guān)病毒載體目前為在活體內(nèi)轉(zhuǎn)移外源性寡核苷酸(尤其是轉(zhuǎn)移至人體內(nèi))的首選重組基因輸送系統(tǒng)。此等載體提供基因的有效率輸送至細(xì)胞內(nèi)，且被轉(zhuǎn)移的核酸被安定地整合入宿主的染色體DNA。使用反轉(zhuǎn)錄病毒的主要先決條件系確保其使用的安全性，尤其是有關(guān)將野生型病毒散布于細(xì)胞群的可能性?？蓮姆崔D(zhuǎn)錄病毒載體衍生的反轉(zhuǎn)錄病毒包括，但非限于:莫羅尼(Moloney)鼠白血病病毒、脾臟壞死病毒、勞氏(Rous)肉瘤病毒、哈維(Harvey)肉瘤病毒、鳥類白血病病毒、長臂猿白血病病毒、人類免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒及哺乳動(dòng)物腫瘤病毒。特異性反轉(zhuǎn)錄病毒包括pLJ、pZIP、PWE及pEM，此等為精于本技藝人士所熟知。律立細(xì)朐銀行本發(fā)明的特征為便于系統(tǒng)性存取不同干細(xì)胞系的干細(xì)胞銀行或細(xì)胞庫。在該銀行或庫中的SB細(xì)胞群衍生自健康個(gè)體或具有已知疾病狀態(tài)或疾病癥狀的個(gè)體，其對于使用者，例如，研究者為無價(jià)的。具有從上述干細(xì)胞分化而來的細(xì)胞的細(xì)胞銀行或細(xì)胞庫亦在本發(fā)明的范圍內(nèi)。從干細(xì)胞分化而來的細(xì)胞的例子包括:腦細(xì)胞、神經(jīng)元、星形細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、胰島細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心臟細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、腎臟細(xì)胞、肺臟細(xì)胞、肌肉細(xì)胞及眼睛細(xì)胞。該個(gè)體可為人類或非人類脊椎動(dòng)物。干細(xì)胞可衍生自任何哺乳動(dòng)物，諸如人類、小鼠、兔子、牛、豬等。在銀行或庫中的細(xì)胞系根據(jù)預(yù)定的特征來分類，此等特征包括表型數(shù)據(jù)、形態(tài)特征、分化模式、血形、主要組織兼容性復(fù)合體、供體(donor)的疾病狀態(tài)、或基因型數(shù)據(jù)(例如，與基因相關(guān)的特異性核酸序列的單一核酸多型性(SNP)、或者基因組DNA或粒線體DNA)。此等細(xì)胞貯存于適當(dāng)?shù)臈l件(通常被冷凍)以使此等干細(xì)胞保持存活及具有功能。編目(cataloguing)可建立所得到的各細(xì)胞群的特征的集中記錄，諸如，但非限于:書寫記錄或輸入有數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫。本具體實(shí)施例主要系關(guān)于干細(xì)胞銀行的制造。干細(xì)胞銀行利于從多個(gè)特異性干細(xì)胞的樣品中選出適于使用者需要的樣品。因此，本發(fā)明的另一具體實(shí)施例系關(guān)于干細(xì)胞銀行，其包含從分離來源取得的多個(gè)干細(xì)胞樣品且根據(jù)至少一種預(yù)定特征鑒定此等樣品的特征及編目。另一具體實(shí)施例系關(guān)于建立干細(xì)胞銀行的方法，該方法包含從多個(gè)來源收集干細(xì)胞樣品；根據(jù)至少一種預(yù)定特征將此等樣品編目并于可保持細(xì)胞存活的條件下貯存細(xì)胞。干細(xì)胞銀行系統(tǒng)亦在本發(fā)明的范圍內(nèi)，該干細(xì)胞銀行系統(tǒng)含有:多個(gè)干細(xì)胞群，此等干細(xì)胞群被配置在個(gè)別容器中并貯存在能保持此等干細(xì)胞存活的條件下；數(shù)據(jù)庫計(jì)算機(jī)，其包含至少一個(gè)處理模塊、顯示器、儲(chǔ)存媒體，其中該儲(chǔ)存媒體包含各干細(xì)胞群的至少一種特征數(shù)據(jù)；以及至少一個(gè)程序代碼模塊(program code module),其于用戶下達(dá)指令時(shí)可使該數(shù)據(jù)顯現(xiàn)在該顯示器上。在一特定具體實(shí)施例中，本發(fā)明的干細(xì)胞銀行系統(tǒng)中干細(xì)胞群具有從患有病癥的個(gè)體得到的干細(xì)胞。該病癥可包括上述的退化性疾病。SB細(xì)胞群系從患有不同疾病的不同個(gè)體收取并鑒定干細(xì)胞的特征。將該特征輸入數(shù)據(jù)庫計(jì)算機(jī)。此夕卜，或另一選擇，細(xì)胞系根據(jù)特異性表型鑒定特征，該特異性表型非必須與病癥有關(guān)。例如肝細(xì)胞可根據(jù)其代謝某些化合物(如咖啡因、酒精、藥劑等)的能力來鑒定特征，以研究此等不同代謝能力的遺傳基礎(chǔ)或與其相關(guān)的生理原因。其他類型的細(xì)胞可根據(jù)功能及/或形態(tài)表型來鑒定特征。在某些具體實(shí)施例中，可經(jīng)由引進(jìn)經(jīng)基因加工的載體或其他遺傳物質(zhì)而使從SB細(xì)胞群中的干細(xì)胞分化而來 的細(xì)胞處于分化或去分化的條件下。去分化包含處理細(xì)胞使其具有較低分化細(xì)胞的性質(zhì)。

本發(fā)明的干細(xì)胞庫可用于以上述方式篩選可用于治療退化性異常、癌癥、或免疫異常的作用劑或化合物。此等庫適于高通量篩選以及可用于鑒定對于特定個(gè)體有特異性療效的作用劑。為了高通量篩選，可將干細(xì)胞引進(jìn)玻璃片或微芯片制的多孔盤的孔中并可與受試作用劑接觸。一般而言，將細(xì)胞排成數(shù)組，尤其是可設(shè)定地址的數(shù)組，以致便于使用機(jī)器人來操作細(xì)胞及溶液以及監(jiān)測細(xì)胞，尤其是有關(guān)正在檢查的功能。使用高通量格式的優(yōu)點(diǎn)在于可并行檢查許多受試作用劑，以及若期望，亦可在與試驗(yàn)條件相同的條件下進(jìn)行對照反應(yīng)。因此，本發(fā)明的篩選方法提供篩選一種、少許或大量受試作用劑的手段，以鑒定出可改變干細(xì)胞功能的作用劑，例如，能誘導(dǎo)細(xì)胞分化成所期望的細(xì)胞類型的作用劑，或者鑒定出，例如，借由維持調(diào)節(jié)分子的高度表達(dá)而防止自然分化的作用劑。全話供體細(xì)朐上述干細(xì)胞可被基因加工以產(chǎn)生移植用的組織兼容性供體細(xì)胞或組織。移植及細(xì)胞治療的目標(biāo)為用功能性供體組織或器官成功地置換衰竭的組織或器官。不過，為了使移植成功，需要克服2種主要障礙:適當(dāng)供體組織或器官的可獲取性以及免疫反應(yīng)。衰竭的組織或器官的置換以及排斥的治療受限于有限數(shù)目的合格供體以及對于同時(shí)投與毒性免疫抑制藥物及長期免疫抑制療程的需求。目前移植及實(shí)驗(yàn)性移植療程主要仰賴親屬供體、其他少數(shù)異體(allogeneic)供體、以及異種(xenogeneic)供體。上述經(jīng)基因加工的干細(xì)胞可用于克服此等限制。更特定而言，本文所述的干細(xì)胞可被基因加工成在其表面不會(huì)表達(dá)第II類MHC分子。更佳地，此等細(xì)胞被加工成不會(huì)實(shí)質(zhì)地表達(dá)所有細(xì)胞表面第I類及第II類MHC分子。在本文中，術(shù)語“不會(huì)表達(dá)”意指在細(xì)胞表面的表達(dá)量不足以激發(fā)響應(yīng)或缺乏被表達(dá)的蛋白質(zhì)以致無法激發(fā)響應(yīng)。MHC分子系指HLA分子，尤其是HLA A、B、C類及第II類HLA DP、DQ及DR以及此等的亞類。該術(shù)語一般被詮釋為專指人類MHC，但在本文中意圖包括來自供體細(xì)胞物種的對等MHC基因，例如，若細(xì)胞的來源為豬，則不論為MHC I或II，術(shù)語HLA皆系指對等豬MHC分子。當(dāng)?shù)贗I類MHC分子被移除時(shí)，CD4+T-細(xì)胞不會(huì)識(shí)別經(jīng)基因加工的內(nèi)皮細(xì)胞；當(dāng)?shù)贗類及第II類MHC分子皆被移除時(shí)，CD4+及CD8+細(xì)胞皆不會(huì)識(shí)別經(jīng)修飾的細(xì)胞。對于干細(xì)胞進(jìn)行的較佳基因修飾包括:1)破壞內(nèi)生性恒定鏈基因(invariantchain gene)，該基因具有集合及運(yùn)輸?shù)贗I類MHC分子至細(xì)胞表面并負(fù)載抗原性肽的功能；以及2)破壞內(nèi)生性β2_微球蛋白基因(β2 M基因)，該基因編碼所有第I類MHC分子的細(xì)胞表面表達(dá)所需的蛋白質(zhì)。另一選擇為:只有恒定鏈基因被破壞。咸信恒定鏈為抗原性肽片段插入第II類MHC分子所必需者?？乖噪募癕HC系一起由T細(xì)胞識(shí)別。在抗原性肽不存在下，通常得不到T細(xì)胞識(shí)別，第II類MHC分子也無法適當(dāng)?shù)卣鄣Ｒ虼?，若?xì)胞中缺乏恒定鏈，肽的展現(xiàn)(presentation)將缺失,而且即使得到極少量的細(xì)胞表面MHC,其也可能無法展現(xiàn)肽，所以不會(huì)產(chǎn)生免疫作用。此等基因的破壞可借由同源重組基因標(biāo)定技術(shù)來達(dá)成。此等技術(shù)為本技藝所熟知，請參見，例如，美國專利第6916654號及第6986887號。鉬成物本發(fā)明提供含有上述細(xì)胞或活性作用劑/化合物的醫(yī)藥組成物。該醫(yī)藥組成物可借由將治療有效量的細(xì)胞或活性作用劑/化合物，視需要連同其他活性物質(zhì)，與醫(yī)藥上容許的載劑混合而制備。該載劑可視投與途徑而具有不同形式。其他活性物質(zhì)的例子包括已知或借由上述篩選方法所鑒定出的活性化合物。上述醫(yī)藥組成物可借由使用習(xí)知醫(yī)藥賦形劑及制備方法來制備?？蓪⑺匈x形劑與崩散劑、溶劑、制粒劑、潤濕劑及黏合劑混合。在本文中，術(shù)語“有效量”或“治療有效量”系指能使特異性異常的至少一種癥狀或變量有可測得的改善的量。上述干細(xì)胞的治療有效量可由本技藝已知的方法決定。治療異常的有效量可容易地由本技藝中具有普通技術(shù)的人士所已知的經(jīng)驗(yàn)法來測定。投與至病患的確切量將視異常的狀態(tài)及嚴(yán)重度以及病患的身體狀況而變。任何癥狀或變量的可測得改善可由精于本技藝人士所測定或由病人向醫(yī)師報(bào)告。應(yīng)了解上述異常的任何癥狀或變量的任何臨床上或統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義的減輕或改善皆在本發(fā)明的范圍內(nèi)。臨床上有意義的減輕或改善意指可由病患及/或醫(yī)師覺察到者。詞組“醫(yī)藥上可容許”系指 此種組成物的分子實(shí)體及其他成分當(dāng)投與至人類時(shí)，為生理上可耐受且通常不會(huì)產(chǎn)生不期望的反應(yīng)。較佳地，術(shù)語“醫(yī)藥上可容許”系指聯(lián)邦政府或州政府的管理機(jī)構(gòu)所許可，或者美國藥典或其他一般公認(rèn)的藥典所列出用于哺乳動(dòng)物，更特定而言，用于人類者。醫(yī)藥上容許的鹽、酯、酰胺及原藥系指在經(jīng)深思熟慮的醫(yī)療判斷下，被認(rèn)為適合用于與病患的組織接觸且無過度的毒性、刺激、過敏反應(yīng)等而與合理的利/弊比相稱，且就其的預(yù)期用途而言為有效的那些鹽(例如羧酸鹽、胺基酸加成鹽)、酯、酰胺及原藥。應(yīng)用于上述醫(yī)藥組成物的載劑系指與化合物一起投與的稀釋劑、賦形劑或載劑。此等醫(yī)藥載劑可為無菌液體，諸如水及油。較佳地使用水或水溶液、食鹽溶液以及葡萄糖及甘油水溶液，尤其是注射溶液，作為載劑。適當(dāng)?shù)尼t(yī)藥載劑被記載于Remington' sPharmaceutical Sciences by E.W.Martin, 18th Edition?？蓪⑸鲜龈杉?xì)胞經(jīng)由輸注或注射(例如，靜脈內(nèi)、鞘內(nèi)、肌內(nèi)、腔內(nèi)、氣管內(nèi)、腹膜腔內(nèi)或皮下)、口服、穿皮、或本技藝已知的其他方法投與至個(gè)體。投與可為每2星期I次，每星期I次或更常，但在疾病或異常的維持期(maintenance phase)可減少頻率。

可使用異源及自體細(xì)胞二者。在前一情況中，應(yīng)進(jìn)行HLA-配對以避免或減少宿主反應(yīng)。在后一情況中，將自體細(xì)胞從個(gè)體富化及純化并貯存供稍后使用。此等細(xì)胞可于存在宿主或活體外移植T細(xì)胞下培養(yǎng)并將其再引進(jìn)宿主中。此可具有宿主本身能識(shí)別該等細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)以及提供較佳的T細(xì)胞活性降低。劑量及投與頻率視臨床征候而定，借由精于本技藝人士所已知的急性期臨床征候的至少I種或多種(較佳多于I種)減少或消失來確證緩解期的維持。更廣泛言之，劑量及頻率系部分視以上述組成物所治療的病理性征候以及病況或異常的臨床及亞臨床癥狀的消退而定。劑型及投與法可視所投與對象的年齡、性別及身體狀況，在待治療的病患或哺乳動(dòng)物個(gè)體中的效益及副作用，以及醫(yī)師的判斷而定，如精于本技藝的人士所了解。在所有上述方法中，可將干細(xì)胞以每次IxlO4至IxIOki的量投與至個(gè)體。評估方法本文所揭示的干細(xì)胞及方法可用于評估個(gè)體。一般而言，年輕的健康個(gè)體具有相對較高比率的干細(xì)胞(諸如SSEA4+細(xì)胞、⑶66e+/BLSCs、或⑶9+/SB-1細(xì)胞)。如在下文實(shí)施例4中所討論，當(dāng)個(gè)體老化時(shí)或因遺傳缺陷或暴露于不利的環(huán)境因子，此等細(xì)胞的數(shù)目或百分率減少。該減少危害個(gè)體的干細(xì)胞相關(guān)性能力，包括受傷后修復(fù)組織的能力。在下文的實(shí)施例4中亦顯示，此等改變可被用于評估個(gè)體患有老化相關(guān)性異常的危險(xiǎn)。例如，若個(gè)體具有高于平均值的干細(xì)胞，則其具有受傷后修復(fù)組織的優(yōu)異能力以及發(fā)生癌癥的高度危險(xiǎn)。換言之，在得自個(gè)體的樣品中上述干細(xì)胞的高濃度表示個(gè)體具有年輕的發(fā)育狀態(tài)且(I)修復(fù)組織損傷、從受傷恢復(fù)、及防御致病菌的能力較佳以及(2)發(fā)生自體免疫疾病、心血管疾病、糖尿病及其他與老化相關(guān)的異常的機(jī)率較低。另一方面，此種較高濃度與罹患癌癥的較高危險(xiǎn)性呈正向關(guān)系。下文中的特異性實(shí)施例僅為例示說明，非以任何方式限制揭示內(nèi)容的其余部分。咸信在未進(jìn)一步詳細(xì)闡述下，精于本技藝人士可依據(jù)本文中的說明充分利用本發(fā)明。本文所引用的所有刊物以其全文被引用的方式納入。再者，下文所提出的任何機(jī)制不會(huì)以任何方式限制所請求發(fā)明的范圍。實(shí)施例1從人抽取血液樣品及骨髓樣品并置于抗凝血EDTA試管或肝素試管中。將該試管于4°C靜置6至48小時(shí)后，該樣品分離成2層。上層含有SB細(xì)胞群，其系進(jìn)一步借由C6Accuri流式細(xì)胞測量術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)及RNA萃取/RT-PCR進(jìn)一步分析。底層含有紅血球及白血球，此等不小于6.0微米。在頂層中的粒子借由流式細(xì)胞測量術(shù)的定尺寸珠粒來分析。發(fā)現(xiàn)此等粒子小于
6.0微米。已知盤及微量盤比6.0微米小，但沒有核，所以無法被DAPI或SYTO染色。為了檢查粒子，進(jìn)行DAPI或SYTO染色。結(jié)果顯示許多粒子以二種染料，即DAPI及SYTO染色時(shí)為陽性，此暗示此等粒子為含有DNA核的細(xì)胞，而非為血小板及微粒。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)DAP1-陰性粒子為約0.01至1.5微米。此等結(jié)果暗示上層(被稱為StemBios細(xì)胞群或SB細(xì)胞群)含有細(xì)胞/干細(xì)胞、血小板及微粒。為了確證DAP1-陽性粒子實(shí)際上為細(xì)胞，將此等粒子放在細(xì)胞培養(yǎng)皿中并于含有3%FBS及IOnM bFGF及EGF的Opt1-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)I星期后，于顯微鏡下檢查此等皿。發(fā)現(xiàn)粒子的數(shù)目增加而且許多尺寸大于3微米的細(xì)胞出現(xiàn)。DAPI染色再次展現(xiàn)粒子中的DNA。培養(yǎng)數(shù)星期后，此等細(xì)胞中的丨些形成圓球。此外，此等細(xì)胞中的丨些顯示GAPDH基因表達(dá)，如同借由RT-PCR所展現(xiàn)者，其中RT-PCR所使用的引物為:AGC TGA ACG GGA AGC TCA CT (序列編號:I)及TGC TGT AGC CAAATT CGT TG (序列編號:2)。為了進(jìn)一步確證DAPI陽性粒子為細(xì)胞，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)培育此等粒子并用含GFP表達(dá)匣的慢病毒感染。培育后，發(fā)現(xiàn)此等粒子表達(dá)GFP。由于慢病毒必須整合入染色體才會(huì)表達(dá)GFP，該結(jié)果暗示此等粒子含有染色體。此等結(jié)果證明此等小于3微米的粒子實(shí)際上為細(xì)胞，其會(huì)增殖并產(chǎn)生大于3微米的細(xì)胞。然后對此等細(xì)胞進(jìn)行C6 Accuri流式細(xì)胞測量術(shù)分析以確證其尺寸。更特定而言，尺寸為0.1至7微米的珠粒與FITC結(jié)合并借由流式細(xì)胞測量術(shù)分析。根據(jù)圖1所示的此等珠粒的分散模式，測知圖2所示的P3圈選區(qū)中細(xì)胞的尺寸為0.3至6微米。相對地，紅血球(RBC)各具有約6微米的尺寸且T淋巴球各具有約6至7微米的尺寸。用DAPI的進(jìn)一步分析指出在P3圈選區(qū)中的90%粒子為活細(xì)胞，因?yàn)槠滹@示核染色。然后對用EDTA試管所制備的SB細(xì)胞群中的所有細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記分析。發(fā)現(xiàn)在離析的SB細(xì)胞群的P3圈選區(qū)(圖3)中的細(xì)胞的70%針對CD9染色時(shí)呈強(qiáng)陽性且此等細(xì)胞的98%以SYTO染色時(shí)呈陽性(圖4)。在一些情況中，SB細(xì)胞群的P3圈選區(qū)中的細(xì)胞多達(dá)90%為⑶9+。此等以SYTO染色呈陽性的⑶9+細(xì)胞被命名為“SB-1細(xì)胞”。亦發(fā)現(xiàn)SB細(xì)胞群的P3圈選區(qū)(圖3)中的細(xì)胞的約15%于針對下述標(biāo)記染色時(shí)呈陽性，即SSEA1+、SSEA4+、⑶13+及/或Strol+。幾乎所有此等細(xì)胞以SYTO染色時(shí)呈陽性(圖5)。其被命名為“SB-2細(xì)胞”。相對地，在P6圈選區(qū)中的⑶235a+紅血球(RBCs)以SYTO染色時(shí)呈陰性(圖6)。再者發(fā)現(xiàn)所有被測試的SB細(xì)胞群含有⑶349+細(xì)胞。在此等⑶9+細(xì)胞中，高達(dá)約25%亦為CD349+。RT-PCR分析顯示在SB細(xì)胞群中的干細(xì)胞表達(dá)CD9、CD349、0ct4、及Nanog，但不表達(dá)Sox2及CXCR4。 供RT-PCR用的引物示于下文中:GAPDHF: 5! - AGC TGA ACG GGA AGC TCA CT - 3’(序列編號: 1)
R: 5! — TGC TGT AGC CAA ATT CGT TG - 3‘(序列編號: 2) 4-OctF: 5! - CTC ACC CTG GGG GTT CTA TT - 3’(序列編號: 3)
R: 5，- CTC CAG GTT GCC TCT CAC TC - 3‘(序列編號:4) NanogF: 5' - CAT GAG TGT GGA TCC AGC TTG - 3’(序列編號: 5)
R: 5，— CCT GAA TAA GCA GAT CCA TGG- 3’ (序列編號: 6)
Sox 2F: 5，- TCG GCG CCG GGG AGA TAC AT - 3’(序列編號: 7)
R: 5’ - CCC CCG GCG GCA ATA GCA - 3’ (序列編號:8)
CD9F: S'-TGCACCAGACCAGTGCAAACATTC- 3'(序列編號: 9)借由流式細(xì)胞測量術(shù)測定的40種不同的血液樣品的額外分析顯示SB細(xì)胞群的上述P3圈選區(qū)含有少于5%的⑶31+、CXCR4+、⑶66+及/或⑶271+細(xì)胞。在大多數(shù)樣品中，該區(qū)含有少于1%的⑶66e或⑶66a陽性細(xì)胞，而只有三個(gè)樣本含有多于2%的⑶66e或⑶66a陽性細(xì)胞。此暗示Blastomere-樣干細(xì)胞非為SB干細(xì)胞群的主要成分。事實(shí)上，發(fā)現(xiàn)⑶9+或⑶9+⑶349+細(xì)胞為SB干細(xì)胞群中的主要成分。再者，發(fā)現(xiàn)SB細(xì)胞群中的一些細(xì)胞為⑶90陽性，⑶90為間葉干細(xì)胞(MSCs)的標(biāo)記；且一些為⑶34陽性，⑶34為造血干細(xì)胞(HSCs)的標(biāo)記。但是，此等細(xì)胞在SB細(xì)胞群的上述P3圈選區(qū)的細(xì)胞中的比率小于1%。此外，SB細(xì)胞群的上述P3圈選區(qū)中的細(xì)胞，小于1%呈CD 133陽性。即使SB細(xì)胞群可能含有血小板，不過，血小板的半衰期只有5 9日。SB細(xì)胞群于抽血至EDTA或肝素試管中后，于4°C可存活超過12日且仍具有非常強(qiáng)的⑶9及⑶349表達(dá)。令人感到興趣地，在一分析檢定中，從患有免疫疾病的18歲病患制備SB細(xì)胞群。檢查該樣品的上述干細(xì)胞標(biāo)記后，發(fā)現(xiàn)該病患與健康人(對照濃度)相較，具有較高濃度的SSEA4、CD66e、CXCR4、SSEAl、Strol、CD34、CD9、CD349、CD56、或 CD184。實(shí)施例2進(jìn)行分析以展示上文所指出的增殖的SB細(xì)胞為能分化成不同細(xì)胞譜系的干細(xì)胞。簡言之，SB細(xì)胞群以上述方式得自個(gè)體。然后將此等細(xì)胞在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)。二星期后發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中，⑶9+CD349+細(xì)胞及⑶9+⑶349_細(xì)胞形成球粒，且該等球粒的細(xì)胞為SSEA4 (ES細(xì)胞標(biāo)記)、⑶66e (BLSC標(biāo)記)、⑶90及⑶73陽性。亦發(fā)現(xiàn)在SB細(xì)胞群中的干細(xì)胞形成受精卵樣的結(jié)構(gòu)且在以膠原包覆的盤上長成多層。
進(jìn)行另外的分析以檢定SB細(xì)胞群進(jìn)一步分化成外胚層(例如神經(jīng)細(xì)胞及表皮細(xì)胞)、中胚層(例如脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞及肌肉細(xì)胞)及內(nèi)胚層細(xì)胞(例如肝細(xì)胞、胰島細(xì)胞)的能力。所有用于借由實(shí)時(shí)RT-PCR檢測分化標(biāo)記的引物列于下文:
GADPHF: 5 -GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3 ’(G列編吟:15)
R: 5'- TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3' () :列編', : 16)
GA巳ARF: 5!-TTATCTCACCCCTTCCTTGG-3’(序列編 1O: 17)·R: 5:- GCCATCATGTAGCATTCCTG-3; (J f 列編::18) HNF4aF:5'- TGTGAGTGGCCCCGACCCTG-3'(片列: 19)
R: 5'-ACGATTGTGGCGACGGCTCC~3'(廠,:列編',j: 20)
CD44F: 5J-TCGAAGAAGGTGTGGGCAGAAGA - Si () 列編:21)
R: S’-ATTTCCTGAGACTTGCTGGCCTCT -3:(卞列編 i0.: 22) I" I I'"!F:5'- TGTGAAACACAAGCCCAAGGCA-3' (; P 列編'V: 23)
R: 5'-CCCTCCTCGGCAAAGCAGGT-3'(1:〈列編: 24)
CD10F:5'-GGTTGGGAGCTGATGAAACT-3'(斤列編丨:25)
R:5'-GAATAGGGCTGGAACAAGGA-3' (!卜列編26)
CD31F: 5’- CAGGCTTCGGCTCAGGCACC-3' ()t:歹Ij編 >；:27)
R: 5'- ATCGGGGCCGGGTGACTTCA-31 ( V列編28) CD133F: 5'- AGCGATCAAGGAGACCAAAG-3: (i' j: 29)
R: 5'- AAGCACAGAGGGTCATTGAG-3 () r^Jii；i' J: 30) CXCR4F:5'-GTTGGCTGAAAAGGTGGTCT-3()t v: 31)'
R:5'-CACAACCACCCACAAGTCAT-3'(i iH編:-y: 32)
NR4A2F: 5 -GCTCAAGGAACCCAAGAGAG-3:(汴列編屮 33)
R: 5!-GGCACCAAGTCTTCCAATTT-3:(序列編 34)
MAP-2F: 5’-CGCACACCAGGCACTCCTGG-3'()::列編''j: 35)
R:5'- CACCTGGCCTGTGGCGGATG-3'(; j:列編 v: 36) 巢蛋白F: 5'-TGCCCGGCACTGGGGACTTA-3_ (斤:列編士 37)
R: 5'-TAGCGGGCCAGGCCTCTCAG-3'(h,^ v: 38) N-CamF:5'- CTCCAGCACAGCCCAGGTGC-3'(; 1:列編乂j: 39)
R:5’-TGCTGGCTTCCT丁GGCA丁CATGC-3'($列編 40) TauF: 5'-AAGATCGGCTCCACTGAGAA-3'(if 列編'/:41)
R: 5'-GGACGTGGGTGATATTGTCC-3' ()t:列編 v: 42)
,] 島素F:5'-AGCCTTTGTGAACCAACACC-3'(J:*:列編 43)
R: 5'-GCTGGTAGAGGGAGCAGATG-3'(序列編'v: 44)
起鐵飯 I'丨F: 5.-GAGGCCACTAAGTGCCAGAG-3' (Ji, 列編!,j.: 45)
R:5'-TTCTTCACCACAGCAACAGC-3' () .列編!'」.:46) α-胎兒蛋 F: 5'-AAATGCGTTTCTCGTTGCTT-3'(十列編: 47)
白R(shí):5'- GCCACAGGCCAATAGTTTGT-3'()t.列編'/: 48)
CD105F: 5'-CACTAGCCAGGTCTCGAAGG-3'()i.:列編'」:49)
R: 5.-CTGAGGACCAGAAGCACCTC-3'() /:列編 50)
酪胺酸羥 F: 5'-GCTCAGGAGCTATGCCTCAC-3'(ff ^lJm: 51)
化呢R: 5’-ACCTAGCCAATGGCACTCAG-3’(斤列編 52)神抒絲 MF:5'-AAGTCAGACCAAGCCGAAGA-3'(汴列編 53)
R: 5'-GCACAGGAGACTTGCCTTTC-3'(] f 列編: 54)
IJiL 球蛋丨 F: 5’-GCTGGAGTCCTCACAGAAGG-3'(印列編 55)
丨[ 鏈。6 (心肌 R: 5'-TCTCCAGCTCATGCACATTC-3'(序列編56)
細(xì)胞)
快 IliL 球 F:5’-TTCAGTGCTGACCAGATTGC-3’ (I 卜列編: 57) 較鏈 1 (傾 R: 5'-AAATGGCTTGCATCATAGGC-3.(序列編 58)
肌細(xì)胞)
■li'^Ii(OC)F:5'-TGAGAGCCCTCACACTCCTC-3'(.1卜:列編:59)
R:5'-TCAGCCAACTCGTCACAGTC-3'(if ViJiiI 'v: 60)誘導(dǎo)來自骨髓的SB細(xì)胞群表達(dá)巢蛋白，巢蛋白系形成神經(jīng)元(外胚層)及胰島細(xì)胞(內(nèi)胚層)的早期標(biāo)記。簡言之，將SB細(xì)胞群在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2至4星期，然后轉(zhuǎn)換至含有IOnM腎上腺糖皮質(zhì)素及10%FBS的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。經(jīng)I個(gè)月治療后，萃取RNA且基因表達(dá)系由實(shí)時(shí)(Real Time)PCR決定。巢蛋白的表達(dá)系由RT-PCR檢測，其中使用引物對:序列編號:37及38。內(nèi)皮細(xì)胞系以多角形為特征。檢測2種肝細(xì)胞標(biāo)記(運(yùn)鐵蛋白及白蛋白)及3種胰島細(xì)胞標(biāo)記(胰島素、α-胎兒蛋白及HNF4ci)的表達(dá)。此外，西方點(diǎn)潰及ELISA亦檢測在分化細(xì)胞中白蛋白的表達(dá)。此等結(jié)果指示SB細(xì)胞群中的干細(xì)胞被分化成肝細(xì)胞且一些分化成胰島細(xì)胞。外胚層細(xì)胞具有絲樣特征。SB細(xì)胞群中的干細(xì)胞分化成 神經(jīng)元細(xì)胞系借由實(shí)時(shí)RT-PCR確證；實(shí)時(shí)RT-PCR檢測許多神經(jīng)元標(biāo)記的表達(dá)，此等神經(jīng)元標(biāo)記包括⑶133、巢蛋白、微管-相關(guān)性蛋白質(zhì)I1、GABA受器、NR4A2、N-cam、酪蛋白羥化酶、神經(jīng)絲及Tau。再者，誘導(dǎo)來自血液的SB細(xì)胞群分化成脂肪細(xì)胞或成骨細(xì)胞，即中胚層細(xì)胞。更特定而言，將來自2供體(供體29及供體32)的血液的SB細(xì)胞群接續(xù)在培養(yǎng)基A、B、C、D及E中培養(yǎng)。然后，將培養(yǎng)基以脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng)基(InvitiOgen)置換共計(jì)8星期。將脂肪細(xì)胞用Oil-red-O染色并在0D490ELISA分光亮度計(jì)中檢測。供體29的SB細(xì)胞群的細(xì)胞計(jì)數(shù)不尋常地高，此造成脂肪細(xì)胞計(jì)數(shù)高?；蛘?，培養(yǎng)基以骨生成培養(yǎng)基(InvitiOgen)置換。置換培養(yǎng)基后觀察成骨細(xì)胞共計(jì)2至4星期。成骨細(xì)胞用Alizarin Red染色，并借由從細(xì)胞中萃取Alizarin Red而檢測,其系于分光亮度計(jì)中于OD 405nm測量。為了誘導(dǎo)生成其他中胚層細(xì)胞，將在SB細(xì)胞群中的干細(xì)胞于含有IOnM腎上腺糖皮質(zhì)素及10%FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。治療I個(gè)月后，從此等細(xì)胞萃取RNA，且數(shù)種基因的表達(dá)系由實(shí)時(shí)PCR測定。肌球蛋白重鏈及骨骼肌球蛋白輕鏈的可檢測表達(dá)指示SB細(xì)胞群中的干細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞及骨骼肌細(xì)胞。SB細(xì)胞群，如ES細(xì)胞，可在MEF供給細(xì)胞的上面增殖/生長并在其上生成球體。又，如同ES細(xì)胞，在相似條件下，SB細(xì)胞群可生成不同類型的細(xì)胞且形成類似受精卵的細(xì)胞自行分裂的結(jié)構(gòu)。上述結(jié)果暗示SB細(xì)胞群在組織中通常為休止?fàn)顟B(tài)。當(dāng)接收到信號(例如受傷)時(shí)，其被活化且分化成適當(dāng)?shù)慕M織以修復(fù)受損組織。因此，SB細(xì)胞群含有成人多能性干細(xì)胞且可用于基因治療、基因銀行、藥物篩選及創(chuàng)建全適供體細(xì)胞。又，此等細(xì)胞能用于治療退化性疾病、自體免疫疾病或癌癥。實(shí)施例3進(jìn)行分析檢定以檢查二價(jià)陽離子螯合劑EDTA在SB細(xì)胞群中的干細(xì)胞(包括SB-1細(xì)胞)上的角色。簡言之，以在上述實(shí)施例1中所述的方式，分別從使用EDTA試管或肝素試管的個(gè)體得到SB細(xì)胞群。在該二群中SB細(xì)胞的數(shù)目系借由標(biāo)準(zhǔn)方法測定。結(jié)果示于下表。
權(quán)利要求
1.種經(jīng)離析的體干細(xì)胞，其尺寸為0.3至6.0微米且為⑶9+。
2.權(quán)利要求1所述的經(jīng)離析的體干細(xì)胞，其中該經(jīng)離析的體干細(xì)胞為多能性或全能性。
3.權(quán)利要求1所述的經(jīng)離析的體干細(xì)胞,其中該細(xì)胞為人類細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1所述的經(jīng)離析的體干細(xì)胞，其中該細(xì)胞為非吸附性。
5.權(quán)利要求1所述的經(jīng)離析的體干細(xì)胞，其中該細(xì)胞為⑶9+CD349+。
6.種經(jīng)離析的體干細(xì)胞，其尺寸為0.3至6.0微米且為SSEA1+、SSEA4+、⑶13+、或Strol+o
7.權(quán)利要求6所述的經(jīng)離析的體干細(xì)胞，其中該經(jīng)離析的體干細(xì)胞為多能性或全能性。
8.權(quán)利要求6所述的經(jīng)離析的體干細(xì)胞，其中該細(xì)胞為人類細(xì)胞。
9.權(quán)利要求6所述的經(jīng)離析的體干細(xì)胞，其中該細(xì)胞為非吸附性。
10.種制造體干細(xì)胞群的方法，該方法包含: 從個(gè)體得到含有多個(gè)細(xì)胞的體液樣品； 將該樣品與EDTA或肝素(hepar in)在容器中培養(yǎng)直至該樣品分為上層及下層； 收集該上層；以及 從該上層離析一群尺寸為0.3至6.0微米的體干細(xì)胞。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中該體液樣品為血液或骨髓樣品。
12.權(quán)利要求10所述的方法，其中該個(gè)體為人類。
13.權(quán)利要求10所述的方法，其中該離析步驟系借由離心、流式細(xì)胞測量術(shù)或過濾而進(jìn)行。
14.權(quán)利要求10所述的方法，其于收集步驟的后，進(jìn)一步包含將上層與ADP—起培養(yǎng)。
15.權(quán)利要求10所述的方法，其中該培養(yǎng)步驟系借由將該樣品與肝素一起培養(yǎng)，以及于收集步驟的后及離析步驟的前，將所收集到的上層進(jìn)一步與EDTA —起培養(yǎng)而進(jìn)行。
16.種體干細(xì)胞群，其系借由如權(quán)利要求10所述的方法制備。
17.權(quán)利要求16所述的體干細(xì)胞群，其中該體干細(xì)胞為CD9+。
18.權(quán)利要求17所述的體干細(xì)胞群，其中該體干細(xì)胞為⑶9+CD349+。
19.權(quán)利要求16所述的體干細(xì)胞群，其中該體干細(xì)胞為SSEA1+、SSEA4+、⑶13+、或Strol+o
20.權(quán)利要求16所述的體干細(xì)胞群，其中該體干細(xì)胞群存在于得自個(gè)體的血液或骨髓樣品中。
21.權(quán)利要求16所述的體干細(xì)胞群，其中該個(gè)體為人類。
22.權(quán)利要求16所述的體干細(xì)胞群，其中該體干細(xì)胞為非吸附性。
23.種細(xì)胞銀行，其包含多個(gè)群的體干細(xì)胞，該多個(gè)群系從借由如權(quán)利要求10所述的方法從不同個(gè)體的血液或骨髓樣品制備。
24.種增加樣品中所含的干細(xì)胞的數(shù)目的方法，該方法包含: 將二價(jià)陽離子螯合劑加至該樣品中；以及 將該樣品中的干細(xì)胞與二價(jià)陽離子螯合劑一起培養(yǎng)。
25.權(quán)利要求24所述的方法，其中該二價(jià)陽離子螯合劑為EDTA或EGTA。
26.權(quán)利要求24所述的方法，其中該干細(xì)胞的尺寸為0.3至6.0微米。
27.權(quán)利要求26所述的方法，其中該干細(xì)胞為CD9+。
28.種評估個(gè)體是否有老化相關(guān)性異?；虬┌Y的危險(xiǎn)的方法，該方法包含: 借由如權(quán)利要求10所述的方法從個(gè)體取得體干細(xì)胞群，其尺寸各為0.3至6.0微米； 測定此等體干細(xì)胞的計(jì)數(shù)； 其中若該計(jì)數(shù)低于第一預(yù)定值，則該個(gè)體有罹患該異常的危險(xiǎn)，若該計(jì)數(shù)高于第二預(yù)定值，則該個(gè)體有罹患癌癥的危險(xiǎn)。
29.權(quán)利要求28所述的方法，其中該體干細(xì)胞為CD9+、CD349+、SSEA1+、SSEA4+、CD13+、或 Strol+o
30.權(quán)利要求28所述的方法，其中肝素用于培養(yǎng)步驟以得到體干細(xì)胞群。
31.權(quán)利要求28所述的方法，其中該老化相關(guān)性異常為自行-修復(fù)缺陷、退化性疾病、自體免疫疾病、心血管疾病或糖尿病。
32.種在個(gè)體中增加體干細(xì)胞的數(shù)目的方法，其包含將有效量的體干細(xì)胞投與至需要其的個(gè)體，該體干細(xì)胞系借由如權(quán)利要求10所述的方法所制備。
33.種治療肌肉受傷或肌肉退化性疾病的方法，該方法包含將有效量的借由如權(quán)利要求10所述的方法所制備的體干細(xì)胞投與至需要其的個(gè)體。
34.權(quán)利要求33所述的方法，其中該肌肉退化性疾病為肌肉營養(yǎng)不良癥、纖維肌痛、肌肉病變、皮肌炎、多發(fā)性肌炎、橫紋肌溶解癥或心肌炎。
全文摘要
本發(fā)明揭示一體干細(xì)胞群及其制法。亦揭示其二亞群以及此等的各種用途。
文檔編號A61P21/00GK103097519SQ201180035415
公開日2013年5月8日 申請日期2011年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月4日
發(fā)明者王俊麟 申請人:干細(xì)胞生物科技公司