專利名稱：副痘病毒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含來源于犬瘟熱病毒(CDV)的異源DNA的重組副痘病毒以及它們?cè)诿庖咴越M合物和疫苗中的用途。本發(fā)明還涉及用于接種以抗CDV、治療或預(yù)防由CDV引起的疾病的方法。本發(fā)明還涉及重組副痘病毒用于診斷的用途。
背景技術(shù)：
痘病毒科(Poxviridae)的病毒為橢圓形、相當(dāng)大的雙鏈DNA病毒。副痘病毒屬(Parapoxvirus，PPV)包括在此類病毒中。它們測(cè)量為長(zhǎng)度約220_300nm，寬度140_170nm。它們具有獨(dú)特的使它們與其它痘病毒相區(qū)別的螺旋形外殼。PPV被分成3個(gè)不同物種。然而，仍然未清楚這些病毒是副痘病毒屬內(nèi)的獨(dú)立物種，還是它們就是相同的物種。第一物種，綿羊副痘病毒(Parapoxvirus ovis, ORF病毒，0RFV)，被認(rèn)為是該屬的原型。其也稱為傳染性痘瘡病毒、接觸性膿瘡皮炎病毒或orf病毒。第二物種，牛副痘病毒(Parapoxvirus bovis) I,也稱為牛膿皰口炎病毒或牛丘疫口炎病毒。第三物種，牛副痘病毒2，也稱為乳房痘病毒(udderpoxvirus)、副痘苗病毒、假牛痘病毒或擠乳者結(jié)節(jié)病毒。副痘病毒物種常見于反芻動(dòng)物中。已在赤鹿、馴鹿、紅松鼠和斑海豹中發(fā)現(xiàn)PPV。PPV感染可引起動(dòng)物和人的局部疾病。PPV物種的動(dòng)物傳染病的宿主為綿羊、山羊和牛。它們通過與被感染的動(dòng)物直接接觸，與局部表皮損傷(所述損傷愈合而不留下疤痕)反應(yīng)來引起人的感染。防疫措施例如疫苗可用于控制疾病。先前已描述了用于表達(dá)外來遺傳信息的、基于禽痘病毒、洗熊痘病毒、羊痘病毒、豬痘病毒或痘苗病毒的載體(參見US5，942，235和US7，094，412)。副痘病毒代表可用于載體疫苗的不同候選物。然而，由于痘病毒的各個(gè)屬之間的形態(tài)學(xué)、結(jié)構(gòu)和遺傳差異，用于此類痘病毒的方法不能用于副痘病毒。此類差異的一個(gè)實(shí)例是，ORFV失去胸苷激酶(TK)基因，所述基因用于不同正痘病毒的重組體的選擇。此外，一些痘病毒還具有凝集紅細(xì)胞的能力，這通過表面蛋白質(zhì)血細(xì)胞凝集素來介導(dǎo)，然而副痘病毒不具有該能力。PPV可具有免疫調(diào)節(jié)作用，因?yàn)樗鼈兇碳ぜ棺祫?dòng)物的一般性(非特異性)免疫反應(yīng)。它們已成功地用于獸醫(yī)學(xué)，用于增加動(dòng)物的一般抗性。可將它們與同源和/或異源抗原組合，以提供具有持續(xù)數(shù)月至數(shù)年的病原體特異性作用以及快速的非病原體特異性作用的疫苗。綿羊副痘病毒先前已被用作載體，如美國(guó)專利6，365，393; Rziha等人，2000, J.Biotechnol.，83，137-145 ;W02004/054614 和 Fischer 等人，2003，J.Virol.77，9312-9323 中所描述的。當(dāng)用作載體時(shí)，其提供顯著的有利方面，包括非常窄的宿主范圍，不存在全身性感染，短期載體特異性免疫(允 許重復(fù)免疫)，早期接種(可在母體抗體存在的情況下開始免疫的誘導(dǎo))，和有益的免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)。本發(fā)明涉及，將副痘病毒用作來源于犬瘟熱病毒的異源DNA的載體。綿羊副痘病毒株D1701是能夠以與野生型病毒的滴度相當(dāng)?shù)牡味仍诩?xì)胞培養(yǎng)物中增殖的高度減毒的株系。其在支持感染性載體病毒復(fù)制的宿主(例如，綿羊和山羊)和不支持感染性載體病毒復(fù)制的宿主(例如，狗、豬、馬、小鼠和大鼠)中具有突出的免疫刺激性質(zhì)。來源于病毒株D1701的、作為化學(xué)滅活的綿羊副痘病毒的制劑的Zylexis (先前稱為Baypamime )用于感染性疾病的預(yù)防性、metaphylaxis和治療性治療以及用于預(yù)防動(dòng)物的應(yīng)激誘導(dǎo)的疾病(stress-1nduced disease)。犬瘟熱是在世界范圍內(nèi)存在的狗和其它食肉動(dòng)物的高度感染性、急性或亞急性、發(fā)熱性病毒性疾病。一些狗顯示原發(fā)性呼吸道體征、其它腸體征，并且至少30%的動(dòng)物產(chǎn)生神經(jīng)學(xué)癥狀。所有實(shí)驗(yàn)上感染的狗在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有組織病理學(xué)損傷。死亡率在30%至80%之間。在少數(shù)案例中，已恢復(fù)的狗繼續(xù)在腦細(xì)胞中攜帶病毒，在腦細(xì)胞中病毒緩慢地復(fù)制并且最終產(chǎn)生老犬腦炎。經(jīng)歷犬瘟熱而存活的狗對(duì)再感染具有終身免疫。推薦進(jìn)行免疫以控制狗的犬瘟熱；推薦每年進(jìn)行再接種。犬瘟熱由犬瘟熱病毒(CDV，麻疹病毒屬(Morbi llivirus)和副粘液病毒科(Paramyxoviridae)的成員)引起。CDV與引起麻疹和牛疫的病毒密切相關(guān)。犬瘟熱病毒體具有包被，且包含15，616個(gè)核苷酸的負(fù)鏈RNA基因組。已對(duì)適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)的Onderstepoort (OP-Q)V)株的整個(gè)基因組進(jìn)行了測(cè)序(Sidhu等人，1993,Virologyl93, 50-65)。病毒基因組編碼6個(gè)蛋白質(zhì):核衣殼(N)蛋白、磷蛋白(P)、基質(zhì)(M)蛋白、融合(F)蛋白、血凝素⑶蛋白和巨大(L)蛋白?；虬聪率鲰樞?3’-5’):N、P、Μ、F、H和L排列在基因組RNA中。每一種蛋白質(zhì)都從轉(zhuǎn)錄自負(fù)鏈RNA模板的獨(dú)特mRNA翻譯而來。H和F蛋白都為糖蛋白，且位于病毒包膜中。F蛋白前體(FO)經(jīng)歷翻譯后切割，從而產(chǎn)生 Fl 亞單位蛋白(Cherpillod 等人,2004, Arch.Virol.149, 1971-1983)。發(fā)明概述本發(fā)明總地來說涉及重組副痘病毒，特別地綿羊副痘病毒(PPVO)用于介導(dǎo)快速的先天免疫應(yīng)答以及抗犬瘟熱病毒的長(zhǎng)效的外來基因特異性免疫的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒包括來源于犬瘟熱病毒的異源DNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒包括綿羊副痘病毒株D1701。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒包括綿羊副痘病毒株D1701-V。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒為綿羊副痘病毒D1701-V-⑶V-Η。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒為綿羊副痘病毒D1701-V-⑶V-F。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒包括編碼犬瘟熱病毒的H蛋白的基因或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒包括編碼犬瘟熱病毒的F蛋白的基因或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒包括SEQ ID NO:1或與SEQ ID NO:1具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒包括SEQ ID N0:2或與SEQ ID N0:2具有至少98%的同一'丨生的多核苷酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，將異源DNA插入綿羊副痘病毒株D1701的HindIII片段H/H中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將異源DNA插入綿羊副痘病毒株D1701的HindIII片段H/H內(nèi)的VEGF編碼序列或相鄰非編碼序列內(nèi)。本發(fā)明包括制備重組副痘病毒的方法，其包括將異源DNA插入副痘病毒的基因組。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括使用綿羊副痘病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括使用綿羊副痘病毒株D1701。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括使用綿羊副痘病毒株D1701-V。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包 括制備綿羊副痘病毒D1701-V-⑶V-Η。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括制備綿羊副痘病毒D1701-V-CDV-F。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法中使用的異源DNA包括編碼犬瘟熱病毒的H蛋白的基因或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法中使用的異源DNA包括SEQ ID NO:1或與SEQ ID NO:1具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源DNA包括SEQ ID N0:2或與SEQ ID N0:2具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。本發(fā)明包括疫苗或免疫原性組合物,所述疫苗或免疫原性組合物包含含有來源于犬瘟熱病毒的異源DNA的重組副痘病毒以及載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒包括綿羊副痘病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒包括綿羊副痘病毒株D1701。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒包括綿羊副痘病毒株D1701-V。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒為綿羊副痘病毒D1701-V-CDV-H。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒為綿羊副痘病毒D1701-V-⑶V-F。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源DNA包括編碼犬瘟熱病毒的H蛋白的基因或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源DNA包括編碼犬瘟熱病毒的F蛋白的基因或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源DNA包括SEQ ID NO:1或與SEQ ID NO:1具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源DNA包括SEQ ID NO: 2或與SEQ ID NO: 2具有至少98%的同一'I"生的多核苷酸分子。本發(fā)明包括制備疫苗或免疫原性組合物的方法，其包括將含有來源于犬瘟熱病毒的源DNA的重組副痘病毒與載體組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒包括綿羊副痘病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒包括綿羊副痘病毒株D1701。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒包括綿羊副痘病毒株D1701-V。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒為綿羊副痘病毒D1701-V-⑶V-Η。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒為綿羊副痘病毒D1701-V-⑶V-F。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源DNA包括編碼犬瘟熱病毒的H蛋白的基因或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源DNA包括編碼犬瘟熱病毒的F蛋白的基因或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源DNA包括SEQ ID NO:1或與SEQ ID NO:1具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源DNA包括SEQ ID N0:2或與SEQ ID NO:2具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。本發(fā)明包括在動(dòng)物受試者中誘導(dǎo)抗犬瘟熱病毒的免疫應(yīng)答的方法，其包括給所述動(dòng)物施用治療有效量的疫苗或免疫原性組合物，所述疫苗或免疫原性組合物包含含有來源于犬瘟熱病毒的異源DNA的重組副痘`病毒以及載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒包括綿羊副痘病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒包括綿羊副痘病毒株D1701。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒為綿羊副痘病毒株D1701-V。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒為綿羊副痘病毒D1701-V-CDV-H。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒為綿羊副痘病毒D1701-V-⑶V-F。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源DNA包括編碼犬瘟熱病毒的H蛋白的基因或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源DNA包括編碼犬痕熱病毒的F蛋白或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源DNA包括SEQ ID NO:1或與SEQ ID NO:1具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源DNA包括SEQ ID N0:2或與SEQ ID NO:2具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答為CDV特異性抗體的誘導(dǎo)。在一個(gè)實(shí)施方案中，誘導(dǎo)了抗-H蛋白-特異性保護(hù)性免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，誘導(dǎo)了抗-F蛋白-特異性保護(hù)性免疫應(yīng)答。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答是抗-H蛋白血清抗體的誘導(dǎo)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答是抗-F蛋白血清抗體的誘導(dǎo)。本發(fā)明包括接種動(dòng)物受試者以抗犬痕熱疾病的方法,其包括給所述動(dòng)物施用治療有效量的包含含有來源于犬瘟熱病毒的異源DNA的重組副痘病毒和載體的疫苗或免疫原性組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒包括綿羊副痘病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒包括綿羊副痘病毒株D1701。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒包括綿羊副痘病毒株D1701-V。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒為綿羊副痘病毒D1701-V-⑶V-Η。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒為綿羊副痘病毒D1701-V-CDV-F。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源DNA包括編碼犬瘟熱病毒的H蛋白的基因或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源DNA包括編碼犬瘟熱病毒的F蛋白的基因或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源DNA包括SEQ ID NO:1或與SEQ ID NO:1具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源DNA包括SEQ ID N0:2或與SEQ ID NO:2具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。本發(fā)明包括治療動(dòng)物受試者以抗犬痕熱疾病的方法,其包括給所述動(dòng)物施用治療有效量的包括來源于犬瘟熱病毒的異源DNA的重組副痘病毒和載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒包括綿羊副痘病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒包括綿羊副痘病毒株D1701。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒包括綿羊副痘病毒株D1701-V。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒為綿羊副痘病毒D1701-V-CDV-H。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒為綿羊副痘病毒D1701-V-CDV-F。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源DNA包括編碼犬瘟熱病毒的H蛋白的基因或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源DNA包括編碼犬瘟熱病毒的F蛋白的基因或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源DNA包括SEQ ID NO:1或與SEQ ID NO:1具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源DNA包括SEQ ID N0:2或與SEQ ID NO:2具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。本發(fā)明包括包含來源于犬瘟熱病毒的異源DNA的重組副痘病毒用于制備治療動(dòng)物以抗犬瘟熱疾病的藥劑的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒包括綿羊副痘病毒株D1701。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒包括綿羊副痘病毒株D1701-V。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒為綿羊副痘病毒D1701-V-CDV-H。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒為綿羊副痘病毒D1701-V-⑶V-F。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒包括編碼犬瘟熱病毒的H蛋白的基因或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒包括編碼犬瘟熱病毒的F蛋白的基因或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒包括SEQ ID N0:1或與SEQ ID N0:1具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒包括SEQ ID NO: 2或與SEQ ID N0:2具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，將異源DNA插入綿羊副痘病毒株D1701的HindIII片段H/H內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將異源DNA插入綿羊副痘病毒株D1701的HindIII片段H/H內(nèi)的VEGF編碼序列或相鄰非編碼序列內(nèi)。本發(fā)明包括副痘病毒用于制備用于接種動(dòng)物以抗犬瘟熱疾病的藥劑的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包括來源于犬痕熱病毒的異源DNA的重組副痘病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒包括綿羊副痘病毒株D1701。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒包括綿羊副痘病毒株D1701-V。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒為綿羊副痘病毒D1701-V-⑶V-Η。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組副痘病毒為綿羊副痘病毒D1701-V-⑶V-F。在另一個(gè)實(shí)施方案中，異源DNA包括編碼⑶V的H蛋白的基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，異源DNA包括編碼⑶V的F蛋白的基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源DNA包括SEQ ID NO:1或與SEQID N0:1具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源DNA包括SEQ IDN0:2或與SEQ ID N0:2具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。本發(fā)明提供了確定存在于動(dòng)物受試者中的副痘病毒的來源的方法。 本文中描述的副痘病毒可在其基因組組成和表達(dá)的蛋白質(zhì)上與野生型株系相區(qū)別。這樣的區(qū)別允許區(qū)分接種的和感染的動(dòng)物。重組綿羊副痘病毒D1701-V-⑶V-H可用于DIVA測(cè)定。重組綿羊副痘病毒D1701-V-CDV-F可用于DIVA測(cè)定。下列詳細(xì)描述公開和包括了這些和其它實(shí)施方案。附圖概述通過參考所附附圖獲得對(duì)本發(fā)明的更好的理解，其中:

圖1:質(zhì)粒pdV-⑶V-H和pdV_⑶V-F的構(gòu)建。將⑶V H以及⑶V F基因作為BamH1-KpnI 片段克隆入轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pdV-Recl，以獲得質(zhì)粒pdV-CDV-H(lA)或pdV-CDV_F (IB)。

圖2:用D1701-V-CDV-F或D1701-V-CDV-H感染的細(xì)胞的免疫過氧化物酶染色(IPMA) ο Vero 細(xì)胞用重組 D1701-V-CDV-F (2A)或 D1701-V-CDV_H(2B)進(jìn)行感染。對(duì)照(未感染的)Vero細(xì)胞示于2C中。深色染色的細(xì)胞顯示特異性蛋白質(zhì)表達(dá)。圖3:由重組體表達(dá)的⑶V-F或-H蛋白的免疫熒光染色。用重組D1701-V-⑶V-H感染Vero細(xì)胞8小時(shí)(3A)和12小時(shí)(3B);或用重組D1701-V-CDV-H感染Vero細(xì)胞24小時(shí)(3C)。利用兔抗-⑶V-H抗體(1: 2000稀釋的)或利用兔抗-⑶V-F抗體(1: 200稀釋的)，以及抗-兔-Alexa-555 (1:2000稀釋的)實(shí)現(xiàn)特異性染色。對(duì)于陰性對(duì)照，使用未感染的細(xì)胞(D)。特異性染色的細(xì)胞由箭頭標(biāo)示。圖4: ORFV重組體感染的細(xì)胞中表達(dá)的⑶V的F-基因的Western印跡分析。從未感染的Vero細(xì)胞(ni)、從用重組D1701-V-CDV-F(M0I=3.0)感染4至72小時(shí)(感染后4、
8、24、48和72小時(shí))的細(xì)胞以及從CDV Ondersteport (參照株)感染的細(xì)胞(CDV對(duì)照)制備蛋白質(zhì)裂解物。圖5:D1701-V-CDV-H的單步驟生長(zhǎng)曲線(SSGC)。用親代病毒D1701-V(空心圓)或用重組D1701-V-CDV-H(實(shí)心圓)感染(Μ0Ι=3.0) Vero細(xì)胞。圖6.通過免疫熒光檢測(cè)⑶V-H特異性抗體。用重組D1701-V-⑶V-H(IO7Pfu)肌內(nèi)(1.m.)免疫的小鼠的血清(1: 1000稀釋)，圖6A-C顯示用CDV株Onderstepoort感染的Vero細(xì)胞。箭頭顯示與小鼠抗血清的特異性反應(yīng)。圖6D顯示未感染的Vero細(xì)胞。圖7:克隆的H基因片段的序列。犬瘟熱病毒H蛋白的編碼區(qū)(SEQ IDNO:1; 1824nt)，加上用作用于限制性酶切克隆和分析(BamHI和KpnI)的接頭序列的5’ -末端上的20nt和3’ -末端上的21nt。ATG起始密碼子以下劃線標(biāo)示。圖8:克隆的F基因片段的序列。犬瘟熱病毒F蛋白(SEQ ID N0:2;1989nt)的編碼區(qū)，加上用作用于限制性酶切克隆和分析(BamHI和KpnI)的接頭序列的5’-末端上的19nt和3’-末端上的16nt。ATG起始密碼子以下劃線標(biāo)示。發(fā)明詳述除非本文中另外定義，否則結(jié)合本發(fā)明使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義。此外，除非上下文另外要求，否則單數(shù)術(shù)語將包括復(fù)數(shù)形式，并且復(fù)數(shù)術(shù)語將包括單數(shù)形式。下列定義可用于本發(fā)明的實(shí)施方案的描述中使用的術(shù)語。它們替代通過引用并入本文的每一篇參考資料中包含的任何矛盾的定義。“約”或“大致”，當(dāng)與可測(cè)量的數(shù)字變量結(jié)合使用時(shí)，除非約用于指以周表示的時(shí)間間隔(其中“約3周”為17至25天，約2至約4周為10至40天)，否則是指，指定的變量值以及在指定的值的實(shí)驗(yàn)誤差內(nèi)(例如，在平均值的95%置信區(qū)間內(nèi))或在指定的值的10%偏差內(nèi)(以較大者為準(zhǔn))的所有變量值。如本文中所使用的，術(shù)語“動(dòng)物”和“受試者”包括易于發(fā)生犬瘟熱感染的任何動(dòng)物，包括哺乳動(dòng)物，家養(yǎng)的和野生的。如本文中所使用的，“抗體”為包含抗原結(jié)合位點(diǎn)的任何多肽，無論其來源、產(chǎn)生方法或其它特征。其是指由于對(duì)抗原的免疫應(yīng)答而特異性結(jié)合該抗原的免疫球蛋白分子或其片段。免疫球蛋白為包含具有“恒定區(qū)”和“可變區(qū)”的“輕鏈”和“重鏈”多肽的血清蛋白，并且基于恒定區(qū)的組成進(jìn)行分類(例如，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)?！疤禺悺庇诮o定的抗原的抗體表示，抗體的可變區(qū)排他地識(shí)別并且結(jié)合特異性抗原。該術(shù)語包括但不限于:多克隆抗體、單克隆抗體、單特異性抗體、多特異性抗體、人源化抗體、四聚體抗體、四價(jià)抗體、多特異性抗體、單鏈抗體、結(jié)構(gòu)域特異性抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體、結(jié)構(gòu)域缺失抗體、融合蛋白、ScFc融合蛋白、單鏈抗體、嵌合抗體、合成抗體、重組抗體、雜種抗體、突變型抗體和CDR-移植抗體?？贵w可以是來源于天然來源或來源于重組來源的完整免疫球蛋白，或可以是完整免疫球蛋白的免疫反應(yīng)性部分?！翱贵w”可被轉(zhuǎn)變成抗原結(jié)合蛋白，其包括但不限于抗體片段，所述抗體片段包括但不限于:Fab、F(ab’)2、Fab’片段、Fv片段、單鏈Fv(ScFv)片段、Fd片段、dAb片段、雙體抗體(diabody)、CDR3肽、受限的FR3-CDR3-FR4肽、納米抗體、雙價(jià)納米抗體、小模塊免疫藥物(small modular immunopharmaceutical, SMIP)和微小抗體(minibody)和任何上述片段，以及它們的化學(xué)或遺傳操作的對(duì)應(yīng)物，以及保留抗原結(jié)合功能的其它抗體片段。通常，此類片段包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)識(shí)到的，任何此類分子可被工程化(例如“種系化”)以減弱其免疫原性，增強(qiáng)其親和力，改變其特異性或用于其它目的。如本文中所使用的，“抗原”或“免疫原”是指，包含一個(gè)或多個(gè)表位(線性表位、構(gòu)象表位或兩者)的分子，所述表位在暴露給受試者后誘導(dǎo)特異于該抗原的免疫應(yīng)答。術(shù)語抗原是指亞單位抗原一與抗原天然結(jié)合的完整生物分離和分開的抗原一以及殺死的、減毒的或滅活的細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲或其它微生物。術(shù)語抗原還指抗體，例如抗-獨(dú)特型抗體或其片段，以及可模擬抗原或抗原決定簇(表位)的合成的肽模擬位(mimotopes)。術(shù)語抗原還指在體內(nèi)，例如在DNA免疫應(yīng)用中表達(dá)抗原或抗原決定簇的寡核苷酸或多核苷酸。如本文中所使用的，“抗原性”是指蛋白質(zhì)或多肽被針對(duì)所述蛋白質(zhì)或多肽產(chǎn)生的抗體免疫特異性結(jié)合的能力?！熬彌_劑”意指，防止另一種化學(xué)物質(zhì)的濃度變化的化學(xué)系統(tǒng)。質(zhì)子供體和受體系統(tǒng)用作防止氫離子濃度(PH)的顯著變化的緩沖劑。緩沖劑的其它實(shí)例為包含弱酸及其鹽(共軛堿)或弱堿及其鹽(共軛酸)的混合物的溶液。如本文中所使用的，“犬”包括通常稱為狗的動(dòng)物，且還包括犬科的其它成員。術(shù)語“犬瘟熱病毒”是指，單負(fù)病毒目(Mononega virales)中的副粘液病毒科的麻疫病毒屬的成員。如本文中所使用的，術(shù)語“細(xì)胞系”或“宿主細(xì)胞”意指，其中可復(fù)制或維持病毒的原核或真核細(xì)胞。

“細(xì)胞免疫應(yīng)答”或“細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答”是由T淋巴細(xì)胞或其它白細(xì)胞或兩者介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，且包括細(xì)胞因子、趨化因子和由活化的T細(xì)胞、白細(xì)胞或兩者產(chǎn)生的類似分子的產(chǎn)生?！氨Ｊ刂脫Q”已在本領(lǐng)域中進(jìn)行了定義，并且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，其被公認(rèn)為按照它們的相關(guān)物理性質(zhì)分類殘基。如本文中所使用的，術(shù)語“培養(yǎng)物”意指，在其它種類或類型不存在的情況下生長(zhǎng)的細(xì)胞或微生物的群體。如本文中所使用的，術(shù)語“DIVA”意指，能夠區(qū)分感染的動(dòng)物與接種的動(dòng)物的疫苗或免疫原性組合物。“劑量”是指施予受試者的疫苗或免疫原性組合物。“第一劑量”或“初次劑量”是指在第O天給予的此類組合物的劑量。“第二劑量”或“第三劑量”或“年劑量”是指，第一劑量之后提供的此類組合物的量，其可以是與第一劑量相同或不同的疫苗或免疫原性組合物?！氨砦弧笔侵?，結(jié)合T細(xì)胞受體或特異性抗體的抗原的特定位點(diǎn)，其通常包括約3個(gè)
氨基酸殘基至約20個(gè)氨基酸殘基。 如本文中所使用的，“賦形劑”是指疫苗或免疫原性組合物中不是抗原的任何組分?！捌巍笔侵傅鞍踪|(zhì)或基因的截短的部分。“功能片段”和“生物學(xué)活性片段”是指，保留全長(zhǎng)蛋白質(zhì)或基因的生物學(xué)性質(zhì)的片段?！懊庖咴曰钚云巍笔侵敢l(fā)免疫應(yīng)答的片段。如本文中所使用的，術(shù)語“F蛋白”是指犬瘟熱病毒的融合蛋白。如本文中所使用的，術(shù)語“H”蛋白是指犬瘟熱病毒的血凝素糖蛋白。如本文中所用的，術(shù)語“異源的”意指來源于不同的物種或株系。如本文中所用的，術(shù)語“同源的”意指來源于相同的物種或株系。“同源性”或“百分比同源性”是指，在對(duì)齊序列和引入空位(如有必要的話)以獲得最大百分比序列同源性并且還將任何保守置換當(dāng)作序列同源性的一部分后，候選序列中與比較序列中的殘基相同的核苷酸或氨基酸殘基的百分比?！巴次铩被颉拔锓N同源物”包括在兩種或更多種不同物種中發(fā)現(xiàn)的、具有顯著的多核苷酸序列同源性并且具有相同或相似的生物學(xué)功能和/或性質(zhì)的基因。優(yōu)選地，代表物種同源物的多核苷酸序列將在中等嚴(yán)緊條件下雜交，例如如本文中所描述的，并且具有相同或相似的生物學(xué)活性和/或性質(zhì)。在另一個(gè)方面，代表物種同源物的多核苷酸將共有大于約60%的序列同源性、大于約70%的序列同源性、大于約80%的序列同源性、大于約90%的序列同源性、大于約95%的序列同源性、大于約96%的序列同源性、大于約97%的序列同源性、大于約98%的序列同源性或大于約99%的序列同源性?！绑w液免疫應(yīng)答”是指至少部分由抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。“同一性”或“百分比同一性”是指，在對(duì)齊兩個(gè)序列和引入空位(如有必要的話)以獲得最大百分比序列同一性并且不將任何保守置換當(dāng)作序列同一性的一部分后，候選序列中與比較序列中的殘基相同的核苷酸或氨基酸殘基的百分比。受試者中的“免疫應(yīng)答”是指，針對(duì)抗原的體液免疫應(yīng)答、細(xì)胞免疫應(yīng)答或體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。免疫應(yīng)答可能足以用于診斷目的或其它測(cè)試，或可能足以預(yù)防疾病的體征或癥狀，包括由病原體感染引起的不利的健康效應(yīng)或其并發(fā)癥。免疫應(yīng)答通?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)免疫測(cè)定和中和測(cè)定來測(cè)定。如本文中所使用的，“免疫原性的”或“免疫原性”是指引發(fā)特異性針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的能力。如本文中所使用的，術(shù)語“免疫原性組合物”或“免疫有效量”或“有效地產(chǎn)生免疫應(yīng)答的量”是指，當(dāng)單獨(dú)地或與藥學(xué)上可接受的載體一起給動(dòng)物施用時(shí)，能夠被免疫系統(tǒng)識(shí)另Ij，從而導(dǎo)致特異性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生(即，具有免疫原性活性)的組合物或抗原。如本文中所使用的，“鼻內(nèi)”施用是指，物質(zhì)例如疫苗或免疫原性組合物經(jīng)由或通過鼻引入受試者體內(nèi)，且包括主要經(jīng)由鼻粘膜的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。如本文中所使用的，“分離的”意指，從其天然存在的環(huán)境中取出，單獨(dú)地或在異源宿主細(xì)胞或染色體或載體(例如，質(zhì)粒、噬菌體等)中。分離的微生物意指，其中生物大體上不含其它微生物(例如在培養(yǎng)物中，例如當(dāng)與其天然存在的環(huán)境分離時(shí))的組合物?！胺蛛x的”，當(dāng)用于描述任何具體定義的物質(zhì)，例如多核苷酸或多肽時(shí)，是指與通常在其中發(fā)現(xiàn)所述物質(zhì)例如多肽或核酸的原始細(xì)胞環(huán)境分離的所述物質(zhì)。因此，如本文中所使用的，例如，用本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建的重組細(xì)胞系利用“分離的”核酸?；蛘?，如果特定蛋白質(zhì)或指定的免疫原性片段被要求保護(hù)或用作疫苗或免疫原性組合物，那么其被認(rèn)為是分離的，因?yàn)槠湟驯昏b定，分離并且與其天然存在的形式相比，在一定程度上被純化。如果在產(chǎn)生抗原的重組細(xì)菌或真核表達(dá)載體中產(chǎn)生蛋白質(zhì)或其特定的免疫原性片段，那么其被認(rèn)為是以分離的蛋白質(zhì)或核酸的形式存在。例如，利用多核苷酸構(gòu)建的重組細(xì)胞系利用“分離的”核酸?！八巹笔侵福捎糜陬A(yù)防、治愈或改善疾病或預(yù)防一些生理病況或事件的任何試劑。術(shù)語〃感染復(fù)數(shù)"(Μ0Ι)是指，每細(xì)胞的生物數(shù)目的比率，其描述了多少接種物將被用于給定的感染中。如本文中所使用的，"單克隆抗體〃是指由單個(gè)雜交瘤細(xì)胞品系產(chǎn)生的抗體，其全都針對(duì)特定抗原上的一個(gè)表位。用于產(chǎn)生單克隆抗體的抗原可提供為病原體的分離的蛋白質(zhì)或整個(gè)病原體?！半s交瘤”是由通過融合骨髓瘤細(xì)胞與產(chǎn)生特定抗體的細(xì)胞而形成的雜交細(xì)胞組成的克隆性細(xì)胞系。通常，單克隆抗體是小鼠來源的。然而，單克隆抗體還指，通過噬菌體展示技術(shù)或與噬菌體展示等同的方法，或由非小鼠來源的雜交細(xì)胞產(chǎn)生的、針對(duì)抗原的特定表位的抗體的克隆性群體。如本文中所使用的，“ 口服”或“經(jīng)口”施用是指，物質(zhì)例如疫苗或免疫原性組合物經(jīng)由或通過口引入受試者的體內(nèi)，其包括吞咽或經(jīng)由口腔粘膜的轉(zhuǎn)運(yùn)(例如，舌下或口腔吸收)或兩者。氣管內(nèi)施用也是口服或經(jīng)口施用的方法。如本文中所使用的，“口鼻”施用是指，物質(zhì)例如免疫原性組合物或疫苗經(jīng)由或通過鼻和口引入受試者的身體內(nèi)，如可以例如通過將一滴或多滴小滴置于鼻中進(jìn)行的?？诒鞘┯冒ㄅc經(jīng)口和鼻內(nèi)施用相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。如本文中所使用的，術(shù)語“副痘病毒”、“副痘病毒株”是指屬于痘病毒科和副痘病
毒屬的病毒。

如本文中所使用的，術(shù)語“綿羊副痘病毒”和“0RFV”是指屬于痘病毒科、副痘病毒屬以及綿羊副痘病毒種的病毒。此類病毒也稱為傳染性痘瘡病毒、接觸性膿瘡皮炎病毒或orf病毒。它們具有使之與其它痘病毒相區(qū)別的獨(dú)特的螺旋形外殼。術(shù)語“綿羊副痘病毒株D1701”是指，美國(guó)專利6，365，393 (其通過引用并入本文)中描述的病毒?！熬d羊副痘病毒株D1701-V”是指適應(yīng)猿猴細(xì)胞系VeiO的綿羊副痘病毒株D1701?！拔改c外施用”是指，物質(zhì)例如疫苗或免疫原性組合物經(jīng)由或通過不包括消化道的途徑引入受試者的體內(nèi)。胃腸外施用包括但不限于皮下、肌內(nèi)、經(jīng)皮膚、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、目艮內(nèi)和靜脈內(nèi)施用。如本文中所使用的，術(shù)語“病原體”或“病原性微生物”意指，能夠在其宿主動(dòng)物中誘導(dǎo)或引起病害、疾病或異常狀態(tài)的微生物一例如犬瘟熱病毒?！八帉W(xué)上可接受的”是指，在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)，適用于接觸受試者的組織而無過度毒性、刺激、過敏應(yīng)答等，具有合理的收益風(fēng)險(xiǎn)比，并且對(duì)于它們期望的用途是有效的物質(zhì)。如本文中所使用的，"多克隆抗體"是指，針對(duì)特定病原體或抗原而產(chǎn)生的抗體的混合群體。一般地，群體包含多個(gè)抗體組，每一個(gè)組針對(duì)病原體或抗原的特定表位。為了產(chǎn)生多克隆抗體，通過接種入或感染宿主來引入完整病原體或分離的抗原，所述病原體或抗原誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生針對(duì)所述病原體或抗原的抗體。如本文中所使用的，術(shù)語“痘病毒”是指屬于痘病毒科的病毒。此類病毒是橢圓形的、相當(dāng)大的雙鏈DNA病毒。如本文中所使用的，術(shù)語“多核苷酸”意指，包含在鏈中共價(jià)鍵合的核苷酸單體的有機(jī)聚合物分子。DNA(脫氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)為具有獨(dú)特生物學(xué)功能的多核苷酸的實(shí)例。如本文中所使用的，術(shù)語“多肽”意指，包含在鏈中鍵合的兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸的有機(jī)聚合物分子。如本文中所使用的，術(shù)語“預(yù)防”、“防止”或“阻止”等意指，抑制微生物的復(fù)制，抑制微生物的傳播或抑制微生物在其宿主中產(chǎn)生其本身。如本文中所使用的，這些術(shù)語等還可意指，抑制或阻斷或緩解感染的一個(gè)或多個(gè)體征或癥狀。如本文中所使用的，關(guān)于疫苗或免疫原性組合物，“保護(hù)作用”、“保護(hù)”、“保護(hù)性免疫”等是指，疫苗或組合物預(yù)防或減輕由生物(所述疫苗或免疫原性組合物中使用的抗原源自于所述生物)引起的疾病的癥狀。術(shù)語“保護(hù)作用”和“保護(hù)”等還指，疫苗或免疫原性組合物可用于治療性治療已存在于受試者中的疾病或疾病的一種或多種癥狀?！爸亟M產(chǎn)生的PPV”或“重組PPV”為在其基因組中具有插入和/或缺失的PPV。使用分子生物學(xué)方法制備插入和缺失。術(shù)語“特異性結(jié)合”、“特異地結(jié)合”等定義為，形成在生理或測(cè)定條件下可測(cè)量的并且是選擇性的復(fù)合物的兩種或更多種分子。如果在適當(dāng)選擇的條件下，這樣的結(jié)合基本上不被抑制，然而同時(shí)非特異性結(jié)合被抑制，則抗體或其它抑制劑被認(rèn)為“特異性結(jié)合”蛋白質(zhì)。特異性結(jié)合的特征在于高親和力，并且對(duì)于化合物或蛋白質(zhì)是選擇性的。非特異性結(jié)合通常具有低親和力。例如，I gG抗體的結(jié)合的特征通常在于至少約10_7M或更高，例如至少約10_8M或更高，或至少約10_9M或更高，或至少約10_1CI或更高，或至少約10_nM或更高，或至少約IO-12M或更高的親和力。該術(shù)語也適用于例如抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異于許多抗原不具有的特定表位的情況，在該情況下具有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體通常不結(jié)合其它抗原。如本文中所使用的，“特異性免疫原性片段”是指，序列的可被特異于該序列的抗體或T細(xì)胞識(shí)別的部分。如本文中所使用的，“大體上同一的”是指至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的序列同一性的程度。如本文中所使用的，術(shù)語“治療有效量”意指，微生物或亞單位抗原或多肽或多核苷酸或其組合的足以在施用了其的受試者中引起免疫應(yīng)答的量。如本文中所使用的，〃治療劑"是指幫助治療病毒、細(xì)菌、寄生蟲或真菌感染、由其引起的疾病或病況的任何分子、化合物、病毒或治療，優(yōu)選經(jīng)減毒或殺死的病毒，或亞單位或化合物。如本文中所使用的，“治療有效量”是指，抗原或疫苗或免疫原性組合物的可在接受所述抗原或疫苗或免疫原性組合物的受試者(例如，狗)中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的量，所述量足以預(yù)防或緩解由病原體例如病毒、細(xì)菌、寄生蟲或真菌的感染引起的疾病的體征或癥狀，包括不利的健康效應(yīng)或其并發(fā)癥?？烧T導(dǎo)體液免疫或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫或體液及細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。動(dòng)物對(duì)抗原、疫苗或免疫原性組合物的免疫原性應(yīng)答可通過測(cè)量抗體滴度、淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定來間接評(píng)估，或通過在用野生型株系攻擊后監(jiān)測(cè)體征和癥狀來直接評(píng)估。由疫苗或免疫原性組合物賦予的保護(hù)性免疫可通過測(cè)量攻擊生物脫落的減少和/或臨床體征例如死亡率、發(fā)病率、溫度的下降以及受試者的總體身體狀況、健康和行為來評(píng)估。治療上有效的疫苗或免疫原性組合物的量可發(fā)生變化，這取決于具體使用的免疫原或受試者的狀況，并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員測(cè)定。如本文中所使用的，術(shù)語“治療”、〃醫(yī)治〃或“醫(yī)療”等意指，預(yù)防、減輕或消除微生物的感染。此類術(shù)語等還可意指，減少微生物的復(fù)制，減少微生物的傳播，降低微生物在其宿主中產(chǎn)生其本身的能力， 或預(yù)防微生物在其宿主中產(chǎn)生其本身。這些術(shù)語等，如本文中所用的，還可意指減輕、緩解或消 除微生物感染的一個(gè)或多個(gè)體征或癥狀，或加速從微生物感染中恢復(fù)。如本文中所使用的，術(shù)語“接種”和“預(yù)防接種”等意指，給動(dòng)物施用疫苗或免疫原性組合物。如本文中所使用的，術(shù)語〃疫苗〃和“疫苗組合物”意指，包含病毒或細(xì)菌(經(jīng)修飾的活的、減毒的或殺死的)或亞單位疫苗或上述物質(zhì)的任何組合的組合物，其預(yù)防或減少感染，或其預(yù)防或減少感染的一個(gè)或多個(gè)體征或癥狀。抗病原體的疫苗的保護(hù)性作用通常通過誘導(dǎo)受試者的免疫應(yīng)答來實(shí)現(xiàn)。一般而言，消除或減少的感染發(fā)病率、體征或癥狀的緩解或微生物從感染的受試者的加速消除表示疫苗組合物的保護(hù)性作用。本文中描述的疫苗提供了抗由犬瘟熱病毒引起的感染的保護(hù)性作用。如本文中所使用的，術(shù)語〃變體〃是指，給定的蛋白質(zhì)和/或基因序列的衍生物，其中除了突變差異外，衍生的序列基本上與給定的序列相同。所述差異可以是天然發(fā)生的，或合成或遺傳上產(chǎn)生的?！拜d體”或“載體病毒”為適合于異源DNA的插入的PPV，其可將插入的DNA轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞或生物體，并且適當(dāng)時(shí)，其使得異源DNA能夠被表達(dá)。如本文中所使用的，術(shù)語“獸醫(yī)學(xué)上可接受的”是指，在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)，適用于接觸動(dòng)物的組織而無過度毒性、刺激、過敏性應(yīng)答等，具有合理的收益風(fēng)險(xiǎn)比，并且對(duì)于它們期望的用途是有效的物質(zhì)。如本文中所使用的，術(shù)語“獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體”是指不干擾活性成分的生物學(xué)活性的功效，并且對(duì)于施用其的獸醫(yī)受試者是無毒性的載體介質(zhì)。病毒、免疫原性組合物和疫苗本發(fā)明包括副痘病毒用于制備包含來源于犬瘟熱病毒的異源DNA的重組副痘病毒的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用綿羊副痘病毒(PPVO)來制備包含來源于犬瘟熱病毒的異源DNA的重組副痘病毒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用綿羊副痘病毒株D1701。該株系描述于美國(guó)專利 6，365，393;Rziha 等人，2000，J.Biotechnol.，83，137-145 和 Cottone,等人，1998，Virus Research，56，53-67中。在其它實(shí)施方案中，使用綿羊副痘病毒株D1701-V。插入副痘病毒的基因序列包括來源于犬瘟熱病毒的異源DNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源DNA包括編碼犬瘟熱病毒的H蛋白的基因或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源DNA包括SEQ ID NO:1或與SEQ ID NO:1具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。包含犬瘟熱病毒的H基因的克隆的片段的完整序列(SEQ ID NO:1)示于圖7中。其包含全長(zhǎng)編碼區(qū)(1824nt)，并且在5’ _(20nt)和3’ -(2Int)末端上具有用于限制性酶切克隆和分析(BamHI和KpnI)的接頭序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源DNA包括編碼犬瘟熱病毒的F蛋白的基因或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源DNA包括SEQ ID N0:2或與SEQ ID NO:2具有至少98%的同一性的多核苷酸分子。包含犬瘟熱病毒的F基因的`克隆的片段的完整序列(SEQ ID NO: 2)示于圖8中。其包含全長(zhǎng)編碼區(qū)(1989nt)，并且在5’-(19nt)和3’-(16nt)末端上具有用于限制性酶切克隆和分析(BamHI和KpnI)的接頭序列。多核苷酸的序列信息使得可容易地獲得該多核苷酸的每一個(gè)可能的片段。因此，本發(fā)明提供了H蛋白的片段。因此，本發(fā)明還提供了F蛋白的片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了功能片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了生物學(xué)活性片段?？赏ㄟ^常規(guī)方法，例如通過過濾或?qū)游黾兓??？衫帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法通過重組產(chǎn)生片段。在制備重組副痘病毒時(shí)，將異源DNA插入綿羊副痘病毒株D1701的HindIII片段H/H內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將異源DNA插入綿羊副痘病毒株D1701的HindIII片段H/H內(nèi)的VEGF編碼序列或相鄰非編碼序列內(nèi)。用于將異源DNA插入副痘病毒的方法是標(biāo)準(zhǔn)的并且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。它們描述于美國(guó)專利6，365，393中。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含來源于犬瘟熱病毒的異源DNA的重組副痘病毒為綿羊副痘病毒D1701-V-⑶V-H或綿羊副痘病毒D1701-V-⑶V-F。按照國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約，將這些病毒保藏在歐洲動(dòng)物細(xì)胞保藏中心(ECACC)，PortonDown, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK,其為 Health Protection Agency CultureCollections (HPA Culture Collections)的一部分。質(zhì)粒pdV-CDV-H(7，975nt)的序列為SEQ ID NO: 3，其示于序列表中。質(zhì)粒pdV-CDV-F(8, 134nt)的序列為SEQ ID NO:4，其示于序列表中。本發(fā)明還包括，與本文中描述的序列具有至少約99%、至少約98%、至少約97%、至少約96%、至少約95%、至少約93%、至少約90%、至少約85%、至少約80%、至少約75%、至少約70%、至少約65%、至少約60%、至少約55%和至少約50%的同一性和/或同源性的多核苷酸序列。本發(fā)明還包括，在中度至高度嚴(yán)緊條件下與本文中描述的SEQ ID NO的任一序列的非編碼鏈或互補(bǔ)鏈雜交的多核苷酸序列，以及其物種同源物。示例性高嚴(yán)緊性條件包括，在65°C至75°C下于包含0.2X SSC/0.1%SDS的緩沖液中的終洗滌，而示例性中度嚴(yán)緊性條件包括，在35°C至45°C下于包含2X SSC/0.1%SDS的緩沖液中的終洗滌。在本領(lǐng)域中應(yīng)理解，等同的嚴(yán)緊性條件可通過溫度和緩沖液或鹽濃度的變化來實(shí)現(xiàn)，如Ausubel，等人(Eds.), Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons(1994)，pp.6.0.3 至 6.4.10中描述的?？稍诩?xì)胞、細(xì)胞系和宿主細(xì)胞中繁殖重組PPV。所述細(xì)胞、細(xì)胞系或宿主細(xì)胞可以是例如但不限于，哺乳動(dòng)物細(xì)胞和非哺乳動(dòng)物細(xì)胞。其中可繁殖PPV的細(xì)胞、細(xì)胞系和宿主細(xì)胞對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的并且可獲得的。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用VeiX)細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，使用牛腎或羊睪丸細(xì)胞。在用于免疫原性組合物或疫苗之前，還可將重組PPV進(jìn)一步減毒或滅活。減毒和滅活的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。用于減毒的方法包括但不限于，在適當(dāng)?shù)募?xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)物中連續(xù)傳代、紫外輻射以及化學(xué)誘變。用于滅活的方法包括但不限于，利用福爾馬林、β-丙內(nèi)酯(BPL)或二乙烯亞胺(BEI)的處理或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法?？赏ㄟ^將病毒懸浮物與37%的甲醛混合至0.05%的終甲醛濃度來進(jìn)行利用福爾馬林的滅活。通過在室溫下恒定地?cái)嚢杓s24小時(shí)來混合病毒-甲醛混合物。然后，通過在適當(dāng)?shù)募?xì)胞系上測(cè)定生長(zhǎng)來測(cè)試滅活的病毒混合物的殘留活病毒?？赏ㄟ^將本發(fā)明的病毒懸浮物與0.1M BEI (0.175Ν NaOH中的2_溴-乙胺)混合至ImM的終BEI濃度來進(jìn)行通過BEI的滅活。通過在室溫下恒定地?cái)嚢杓s48小時(shí)來混合病毒-BEI混合物，隨后添加1.0M硫代硫酸鈉至0.1mM的終濃度。繼續(xù)混合另外2小時(shí)。通過在適當(dāng)?shù)募?xì)胞系上測(cè)定生長(zhǎng)來測(cè)試滅活的病毒混合物的殘留活病毒。重組PPV可用于免疫原性組合物和疫苗中。免疫原性組合物和疫苗任選地可包括用作藥物媒介物、賦形劑或介質(zhì)的一種或多種獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體，包括液體、半固體或固體稀釋劑。如本文中所使用的，“獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體”包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、佐劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲劑、吸附延遲劑等。稀釋劑可包括水、鹽水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等滲劑可包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖等等。穩(wěn)定劑包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的白蛋白等等。防腐劑包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的硫柳汞等等。佐劑包括但不限于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的RIBI佐劑系統(tǒng)(Ribi Inc.)、明礬、氫氧化鋁凝膠、水包油乳劑、油包水乳劑例如弗氏完全和不完全佐劑、嵌段共聚物(CytRx, Atlanta Ga.) ,SAF-M(Chiron, Emeryville Calif.)、AMPHIGEN 佐劑、皂苷、QuilA、QS-21(Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.)、GP1-0100(Galenica Pharmaceuticals, Inc.，Birmingham, AL)或其它阜苷級(jí)分、單磷酰脂質(zhì)A、Avridine脂質(zhì)-胺佐劑、來自大腸桿菌(E.coli)的不耐熱 腸毒素(重組的或其他形式)、霍亂毒素或胞壁酰二肽等等?？捎杀绢I(lǐng)域技術(shù)人員容易地測(cè)定用于本發(fā)明的佐劑和添加劑的量和濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含約50 μ g至約2000 μ g佐劑的免疫原性組合物和疫苗。在另一個(gè)實(shí)施方案中，以約100 μ g至約1500 μ g,或約250 μ g至約1000 μ g,或約350 μ g至約750 μ g的量包含佐劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，以約500 μ g/2ml免疫原性組合物或疫苗的量包含佐劑。免疫原性組合物和疫苗還可包括抗生素。此類抗生素包括但不限于，來自氨基糖苷類、卡巴配能類、頭孢菌素類、糖肽類、大環(huán)內(nèi)酯類、青霉素類、多肽類、喹諾酮類、磺胺類和四環(huán)素類的抗生素。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有約I μ g/ml至約60μ g/ml的抗生素的免疫原性組合物和疫苗。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性組合物和疫苗包含約5 μ g/ml至約55 μ g/ml的抗生素，或約10 μ g/ml至約50 μ g/ml的抗生素,或約15 μ g/ml至約45 μ g/ml的抗生素,或約20 μ g/ml至約40 μ g/ml的抗生素,或約25 μ g/ml至約35 μ g/ml的抗生素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性組合物和疫苗包含少于約30 μ g/ml的抗生素。除了重組PPV外，免疫原性組合物和疫苗還可包括其它抗原?？乖梢詾闇缁畹奈⑸锏耐暾虿糠种苿┑男问?，或通過遺傳工程技術(shù)或化學(xué)合成獲得的抗原性分子的形式。適合用于根據(jù)本發(fā)明的用途的其它抗原包括但不限于來源于病原性細(xì)菌或病原性病毒的抗原。重組犬瘟熱病毒免疫原性組合物和疫苗還可任選地包含具有一種或多種另外的犬抗原例如犬艾希體(Ehrlichia canis)、犬細(xì)小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPI)、犬II型腺病毒(CAV-2)、犬腺病毒(CAV)、犬冠狀病毒(CCV)、出血性黃疸鉤端螺旋體(Leptospiraicterohemorrhagiae, LI)、犬鉤端螺旋體(Leptospira canicola, LC)、感冒傷寒型鉤端螺旋體(Leptospira grippotyphosa,LG)、波摩那鉤端螺旋體(Leptospira pomona,LP)、博氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)等的混合物?？乖囊粋€(gè)組合包括犬細(xì)小病毒、犬腺病毒和犬副流感病毒的分離株，具有或不具有冠狀病毒和鉤端螺旋體(包括新出現(xiàn)的血清型感冒傷寒型鉤端螺旋體和波摩那鉤端螺旋體)?？山o動(dòng)物施用本文中描述的免疫原性組合物和疫苗以誘導(dǎo)有效的抗CDV的免疫應(yīng)答。因此，本文中描述了刺激有效的抗CDV的免疫應(yīng)答的方法，包括給動(dòng)物施用治療有效量的包含含有來源于犬瘟熱病毒的異源DNA的重組副痘病毒的免疫原性組合物或疫苗。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法導(dǎo)致抗-H蛋白血清抗體的誘導(dǎo)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法導(dǎo)致抗-F蛋白血清抗體的誘導(dǎo)?？山o動(dòng)物施用本文中描述的免疫原性組合物和疫苗以接種動(dòng)物受試者以抗犬瘟熱病?？山o動(dòng)物施用免疫原性組合物和疫苗以預(yù)防或治療動(dòng)物的犬瘟熱病。因此，本文中描述了接種動(dòng)物以抗犬瘟熱病，和預(yù)防或治療犬瘟熱病的方法，包括給動(dòng)物施用治療有效量的包含含有來源于犬瘟熱病毒的異源DNA的重組副痘病毒的免疫原性組合物或疫苗。施用的形式、劑量、途徑可以以各種形式制備免疫原性組合物和疫苗，這取決于施用途徑。例如，可以以適用于注射用途的無菌水溶液或分散體的形式，或使用冷凍干燥技術(shù)以凍干的形式制備免疫原性組合物和疫苗。通常在約4°C下維持凍干的免疫原性組合物和疫苗，且可將其在穩(wěn)定溶液例如鹽水或/和HEPES中進(jìn)行重建。或者，可通過冷凍干燥保存免疫原性組合物和疫苗。還可以以懸浮液或乳劑的形式制備免疫原性組合物和疫苗。

免疫原性組合物和疫苗包括治療有效量的上述重組PPV?？蓪⒓兓牟《局苯佑糜诿庖咴越M合物或疫苗，或可將其進(jìn)一步減毒或滅活。通常，免疫原性組合物或疫苗包含約 I X IO2 至約 I X IO12PFU,或約 I X IO3 至約 I X IO11PFU,或約 I X IO4 至約 I X IO10PFU,或約
IX IO5至約I X IO9PFU,或約I X IO6至約I X 108PFU。可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定有效地提供保護(hù)作用的免疫原性組合物或疫苗中病毒的精確量。免疫原性組合物和疫苗通常以約0.5ml至約5ml的體積包含獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，載體的體積為約Iml至約4ml，或約2ml至約3ml。在另一個(gè)實(shí)施方案中，載體的體積為約1ml，或?yàn)榧s2ml，或?yàn)榧s3ml或?yàn)榧s5ml。適用于免疫原性組合物和疫苗的獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體可以是本文中描述的任何載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定，在施用之前病毒是否需要進(jìn)行減毒或滅活。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可將重組PPV給動(dòng)物直接施用而無需另外的減毒。病毒的治療上有效的量可發(fā)生變化，這取決于幾個(gè)因素(包括動(dòng)物的狀況和感染的程度)，并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員測(cè)定。根據(jù)本發(fā)明的方法，可給動(dòng)物施用單次劑量，或可選擇地，可以以約2至約10周的間隔進(jìn)行2次或更多次接種。加強(qiáng)方案可能是需要的，并且可調(diào)整給藥方案以提供最佳免疫。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定 最佳施用方案。可將免疫原性組合物和疫苗直接施用入血流、肌肉或內(nèi)臟器官?？蓪⑺鼈冞M(jìn)行口服或鼻內(nèi)施用。用于胃腸外施用的適當(dāng)方法包括但不限于靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、硬膜內(nèi)、心室內(nèi)、尿道內(nèi)、胸骨內(nèi)、顱內(nèi)、肌內(nèi)和皮下施用。用于胃腸外施用的適當(dāng)裝置包括針(包括顯微操作針)注射器、無針注射器和輸注技術(shù)。胃腸外制劑通常為可包含賦形劑例如鹽、碳水化合物和緩沖劑(優(yōu)選至約3至約9，或約4至約8，或約5至約7.5，或約6至約7.5，或約7至7.5的pH)的水溶液，但對(duì)于一些應(yīng)用，可更適當(dāng)?shù)貙⑺鼈兣渲茷闊o菌非含水溶液，或配制為干燥形式以與適當(dāng)?shù)拿浇槲锢鐭o菌無熱原水結(jié)合使用。在無菌條件下例如通過冷凍干燥來制備胃腸外制劑可容易地使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)制藥技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。本文中描述的重組副痘病毒和免疫原性組合物和疫苗可用于制備用于接種動(dòng)物以抗犬瘟熱病的藥劑。本發(fā)明提供了確定動(dòng)物受試者中存在的副痘病毒的來源的方法。利用DIVA疫苗一能夠區(qū)分感染的與接種的動(dòng)物的疫苗一的接種提供了用于確定存在于動(dòng)物受試者中的副痘病毒的來源的方法。該區(qū)分可通過多種診斷方法的任一種來實(shí)現(xiàn)，包括但不限于ELISA、Western印跡和PCR。此類和其它方法可易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，并且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。本文中描述的副痘病毒可在其基因組組成和表達(dá)的蛋白質(zhì)上與野生型株系相區(qū)另IJ。這樣的區(qū)別允許區(qū)分接種的動(dòng)物與感染的動(dòng)物。例如，可確定在某些實(shí)驗(yàn)室測(cè)試中對(duì)于副痘病毒被測(cè)試為陽性的動(dòng)物是具有野生型副痘病毒株還是具有先前通過接種獲得的
重組副痘病毒?？墒褂枚喾N測(cè)定來進(jìn)行確定。例如，可從對(duì)于副痘病毒測(cè)試為陽性的動(dòng)物分離病毒，且基于核酸的測(cè)定可用于確定指示先前的接種的副痘病毒基因組的存在。基于核酸的測(cè)定包括Southern或Northern印跡分析、PCR和測(cè)序。或者,可使用基于蛋白質(zhì)的測(cè)定。在基于蛋白質(zhì)的測(cè)定中，可從對(duì)于副痘病毒測(cè)試為陽性的動(dòng)物分離懷疑被感染的細(xì)胞或組織?？蓮拇祟惣?xì)胞或組織制備細(xì)胞提取物，并且可使用適當(dāng)?shù)尼槍?duì)病毒蛋白質(zhì)的抗體將所述提取物經(jīng)歷例如Western印跡，所述病毒蛋白質(zhì)可區(qū)別地鑒定先前接種的重組副痘病毒或野生型副痘病毒的存在?？墒褂枚喾N技術(shù)來評(píng)估動(dòng)物中誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的程度和性質(zhì)。例如，可從接種的動(dòng)物收集血清，并且在例如常規(guī)ELISA中測(cè)試特異于副痘病毒的抗體的存在或不存在。可通過測(cè)定例如T細(xì)胞增殖(其指示細(xì)胞免疫應(yīng)答的誘導(dǎo))來實(shí)現(xiàn)淋巴組織中的響應(yīng)性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的檢測(cè)。相關(guān)技術(shù)詳盡地描述于本領(lǐng)域中，例如，Coligan等人Current Protocols in Immunology, John ffiley&Sons Inc.(1994)中。重組綿羊副痘病毒D1701-V-⑶V-H可用于DIVA測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施方案中，其可用于檢測(cè)犬瘟熱N-基因或蛋白質(zhì)以區(qū)分感染的與接種的動(dòng)物的測(cè)定中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其可用于檢測(cè)犬瘟熱P-基因或蛋白質(zhì)以區(qū)分感染的與接種的動(dòng)物的測(cè)定中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其可用于檢 測(cè)犬瘟熱L-基因或蛋白質(zhì)以區(qū)分感染的與接種的動(dòng)物的測(cè)定中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其可用于檢測(cè)犬瘟熱M-基因或蛋白質(zhì)以區(qū)分感染的與接種的動(dòng)物的測(cè)定中。重組綿羊副痘病毒D1701-V-⑶V-F可用于DIVA測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施方案中，其可用于檢測(cè)犬瘟熱N-基因或蛋白質(zhì)以區(qū)分感染的與接種的動(dòng)物的測(cè)定中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其可用于檢測(cè)犬瘟熱P-基因或蛋白質(zhì)以區(qū)分感染的與接種的動(dòng)物的測(cè)定中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其可用于檢測(cè)犬瘟熱L-基因或蛋白質(zhì)以區(qū)分感染的與接種的動(dòng)物的測(cè)定中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其可用于檢測(cè)犬瘟熱M-基因或蛋白質(zhì)以區(qū)分感染的與接種的動(dòng)物的測(cè)定中。本發(fā)明還通過下列示例性、非限定性實(shí)施例來進(jìn)行描述。
實(shí)施例實(shí)施例1.表達(dá)CDV H和CDV F蛋白的重組病毒D1701-V-CDV-H和D1701-V-CDV-F的產(chǎn)生產(chǎn)生包含編碼⑶V的H蛋白的基因的重組綿羊副痘病毒以及包含編碼⑶V的F蛋白的基因的重組綿羊副痘病毒。評(píng)估H和F蛋白的表達(dá)。為了產(chǎn)生重組綿羊副痘病毒D1701-V-CDV-H和D1701-V-CDV-F，使用綿羊副痘病毒(PPVO)載體系統(tǒng)(美國(guó)專利6，365，393; Rziha等人，2000，J.Biotechnol., 83, 137-145;Fischer 等人，2003，J.Virol.77，9312-9323;Henkel 等人，2005，J.Virol.79，314-325)。通過 PCR 從病毒株 Rockborn 獲得 CDV H 基因和 F基因，將其克隆為大小為1865bp⑶或2024bp (F)的BamH1-KpnI DNA片段，隨后進(jìn)行BamH1-KpnI限制性酶切降解,進(jìn)行瓊脂糖凝膠(0.8%w/v)電泳,然后通過Qiaex II凝膠提取(Qiagen;Germany)來進(jìn)行純化。質(zhì)粒 pdV-Recl (Fischer 等人,2003)用 BamHI 和KpnI進(jìn)行雙降解，隨后用于連接(Fast ligation試劑盒，Promega;Germany)。在轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5aF’ (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; Germany)后，通過質(zhì)粒 DNA 的BamH1-KpnI限制性降解選擇插入物-陽性菌落。這導(dǎo)致產(chǎn)生轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pdV-⑶V_H(圖1A)或轉(zhuǎn)移質(zhì)粒PdV-CDV-F(圖1B)。質(zhì)粒中的相關(guān)限制性位點(diǎn)及其核苷酸位置標(biāo)示于圖中。還標(biāo)示了氨節(jié)青霉素抗性基因(AmpiR)以及T7和SP6啟動(dòng)子。利用Qiagen Plasmid Maxi試劑盒(Qiagen;Germany)制備兩種轉(zhuǎn)移質(zhì)粒,將其用于DNA測(cè)序。為此目的,分別使用位于pdV-Recl 中的插入位點(diǎn)上游的引物 0RF32N(SEQ ID NO: 5; 5’ -GCGCGCTGCGGGTGCGCTACCAATTCGCGC-3’)和位于 pdV-Recl 中的插入位點(diǎn)下游的引物 0RF31N(SEQ ID NO:6; 5’-GCATCCCGTTACCACCGGAGACCGACGCTCCC-3’)以及內(nèi)部 H-基因特異性引物 CDH-F (SEQ ID NO: 7; 5’ -CAGATGCAGTGGAGCTACTACTTC-3’)和 CDH-R (SEQ ID NO: 8; 5’ -GGATCTAGAGGTAATGTCAACCGC-3’)。這允許測(cè)定插入的H基因的完整序列(SEQ ID NO: 1)0內(nèi)部F基因特異性引物⑶F-F (SEQID N0:9，5’-CCCTGCTATGCAACATATGTCGTGTG-3’)和CDF-R(SEQ ID NO: 10，5’-CGTTATACCATATCAGGGTATTGCCTCC-3’)允許測(cè)定完整 F 基因序列(SEQ ID NO: 2)。利用Bluo-Gal染色選擇重組體用0.1MOI (感染復(fù)數(shù))的表達(dá)IacZ的病毒D1701_VrV感染Vero細(xì)胞(IO6個(gè)細(xì)胞)，2小時(shí)后按照制造商的推薦(Amaxa Nucleofector; Lonza, Germany)通過核轉(zhuǎn)染(nucleofection)用 2 μ g 的 pdV-CDV-H 或 pdV-CDV-F 質(zhì)粒 DNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。3-4 天后收獲病毒裂解物，將其用于在6孔板(Fisher Scientific;Germany)中在Vero細(xì)胞上進(jìn)行滴定。當(dāng)空斑變得可見時(shí)，如所描述的(Fischer等人，2003)，覆蓋含有Bluo-Gal的瓊脂糖。挑選具有白色外觀的病毒空斑，將單個(gè)空斑洗脫物(在4°C下于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中過夜)在48孔板的單個(gè)孔中用于同時(shí)感染Vero細(xì)胞(IXlO5個(gè)細(xì)胞)。通過空斑-PCR選擇重組體通過Pasamontes 等人(J.Virol.Methods35:137-141; 1991)的改進(jìn)方法從每一個(gè)病毒空斑分離株分離DNA。將病毒裂解物(0.2ml)冷凍(_70°C )和解凍(37°C )3次，在冰上超聲3次，每次20-30秒(超聲水浴)。在酚氯仿提取后，添加10 μ g酵母tRNA或3 μ IGlycoBlue (Ambion;Germany),然后進(jìn)行乙醇沉淀。用70%(v/v)乙醇洗漆DNA沉淀2次,在干燥后將其溶解在14 μ I重蒸懼水中。

對(duì)于CDV H-特異性PCR，將4 μ I DNA與I μ I引物混合物(由4.0pmolCDH-F(SEQ ID NO: 7)和 4.0pmol CDH-R(SEQ ID NO:8)引物組成)和 5 μ I ReddyMix2XPCR(Abgene, Thermo Fisher Scientific;Germany)在冰上混合。通過在 98°C下溫育 2 分鐘，隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)(在96°C下進(jìn)行I分鐘，在65°C下進(jìn)行30秒，在72°C下進(jìn)行30秒)，然后在72°C進(jìn)行2分鐘的終延伸步驟來在Trio Thermoblock (Biometra; Germany)中進(jìn)行PCR。除了在68°C (而非65°C )下進(jìn)行30秒外，分別使用引物CDF-F和CDF-R，將相同條件用于⑶V F-特異性PCR。在水平l%(w/v)瓊脂糖-溴化乙錠(0.3微克/ml)凝膠中分離PCR產(chǎn)物。稀釋來自顯示大小為686bp的H基因特異性PCR片段的空斑分離株的病毒裂解物，如上所述使用Bluo-Gal瓊脂糖覆蓋法再進(jìn)行空斑純化至少3次。也如對(duì)于包含H基因的病毒空斑所描述的，進(jìn)一步對(duì)來自利用質(zhì)粒PdV-CDV-F的轉(zhuǎn)染的空斑分離株(其顯示大小為766bp的F基因特異性PCR片段)進(jìn)行空斑純化。最后，在LacZ基因特異性PCR中，使用 4μ1 DNA, 3.95pmol 引物 lacZ-F (SEQ ID NO: 11; 5’-cgatactgtcgtcgtcccctcaa-3，)和 4.13pmol 引物 IacZ-R(SEQ ID NO: 12; 5’-caactcgccgcacatctgaact-3’)測(cè)試對(duì)于H或?qū)τ贔基因呈陽性的重組病毒空斑分離株的DNA。在添加5 μ I AccuPrime SuperMix
II(Invitrogen, Fisher Scientific;Germany)后，通過在 98°C下加熱 2 分鐘，隨后進(jìn)行 40個(gè)循環(huán)(在96°C下進(jìn)行I分鐘，在62°C下進(jìn)行30秒，和在68°C下進(jìn)行90秒)，然后在68 °C下進(jìn)行終延伸步驟2分鐘來進(jìn)行PCR。如上所述進(jìn)行PCR產(chǎn)物的分離。大小為508bp的LacZ基因特異性片段的不存在表明，相應(yīng)的重組病毒空斑分離株在3輪空斑純化后，不含表達(dá)LacZ的親代病毒D1701-VrV。在制備高滴度的D1701-V-CDV-H和D1701-V-CDV-F的病毒儲(chǔ)備液后，如下所述制備病毒DNA，將其用于在CDV-PCR和LacZ-PCR中進(jìn)行測(cè)試。重組病毒空斑的免疫組織化學(xué)染色(IPMA)首先通過IPMA測(cè)定插入的外來基因的成功表達(dá)，所述IPMA包括在24-孔板中在Vero細(xì)胞上滴定的重組病毒空斑的免疫組織化學(xué)染色。在病毒空斑出現(xiàn)后，從每一個(gè)孔抽吸培養(yǎng)基，通過在層流潔凈工作臺(tái)中將板敞開約10分鐘來干燥細(xì)胞。此后，在_20°C下用冰冷無水甲醇固定細(xì)胞，進(jìn)行15-20分鐘。在用冰冷1%(ν/ν)的在PBS中的胎牛血清(FCS)洗滌2次后，用含有10%(v/v)FCS的PBS在室溫(RT)下封閉細(xì)胞90分鐘。通過在RT下用1:2.000稀釋的抗F蛋白的多克隆兔(R)抗血清(由P.Plattet&A.Zurbriggen提供;Univ.Bern, Switzerland)(圖2A)或在1%的FCS (在PBS中)中以1:1.000稀釋的多克隆H蛋白-特異性兔抗血清 MC711 (由 V.von Messling 提供;Univ.Quebec, Canada)(圖 2B)溫育60分鐘來實(shí)現(xiàn)外來基因表達(dá)的檢測(cè)。在用PBS-T(包含0.05%(v/v)Tween-20的PBS)洗滌3次后,添加1:2000稀釋的偶聯(lián)有過氧化物酶的抗-兔第二抗體(Jackson-1mmunoRes.,DIANOVA; Germany)，在RT下溫育60分鐘。在用PBS-T和PBS充分洗滌后，如制造商的說明書所推薦的，添加底物(Vector Nova Red, Axxora;Germany),直至棕紅色的陽性染色變得可見。作為陰性對(duì)照，用1:100稀釋的抗F蛋白的多克隆兔抗血清(圖2C)溫育未感染的細(xì)胞。還將用D-1701-VrV或D-1701-V感染的細(xì)胞用作陰性對(duì)照。發(fā)現(xiàn)病毒空斑和感染的細(xì)胞對(duì)于CDV的F蛋白(圖2A)和H蛋白(圖2B)呈強(qiáng)陽性。實(shí)施例2.D1701-V-CDV-H 和 D1701-V-CDV-F 的表征病毒儲(chǔ)備液的制備為了獲得D1701-V-CDV-H和D1701-V-CDV-F的高滴度重組病毒儲(chǔ)備液，用0.5的MOI同時(shí)感染10-20個(gè)T150培養(yǎng)瓶(Greiner;Germany)。3天后，觀察到約80%的致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，收獲和收集所有培養(yǎng)瓶的細(xì)胞和上清液，用于離心(以13，OOOrpm在4°C下進(jìn)行2小時(shí))。小心地除去上清液，將病毒沉淀在4°C下于l_2ml PBS中溶解過夜。使用3次10秒的脈沖(100W)(每一次脈沖之間中斷10秒)在冰上通過超聲處理(超聲細(xì)胞破碎器，Branson; Germany)完全分散病毒懸浮物，隨后離心(以500_700xg在4°C下進(jìn)行10分鐘)以除去細(xì)胞碎片。將上清液貯存在冰上，而將細(xì)胞沉淀重懸浮于1.0ml PBS中，在冰上進(jìn)行超聲處理(2次20秒，之間中斷10秒，隨后再進(jìn)行一次30秒)。在低速離心后，將上清液與第一上清液組合，分成等分，滴定，然后于-70°C下貯存。病毒DNA的表征以Μ0Ι0.5感染Vero細(xì)胞，2_3天后(約80%CPE)通過胰蛋白酶消化收獲細(xì)胞，在4 下進(jìn)行短暫的低速離心。按照制造商的方案，使用Master Pure DNA IsolationKit (Epicentre Biotech nology, Biozym Scientific;Germany)分離 DNA。為了驗(yàn)證⑶V H或F基因在正確的基因座中插入，按照標(biāo)準(zhǔn)方法，將2ygDNA進(jìn)行限制性酶降解，在0.8%(w/v)瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離，將其轉(zhuǎn)移至尼龍膜(GEHealthcare; Germany)以進(jìn)行Southern印跡雜交。將CDV H或F基因特異性探針(CDV-H或⑶V-F PCR的產(chǎn)物)進(jìn)行凝膠分離,使用RediPrime (GE Healthcare; Germany)進(jìn)行放射性標(biāo)記(32P_dCTP，MP Biomedicals;Germany)。隨后將其用于在下述條件下進(jìn)行的Southern印跡雜交:在50°C下于包含0.5%(w/v)脫脂奶粉、1.0%(w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)和0.5mg/ml 變性小牛胸腺 DNA(KT-DNA, Sigma;Germany)的 4X SSPE(1X=0.18M NaCl，IOmMPP, ImM EDTA, pH7.4)中。在X-射線(Kodak X-Omat;Germany)暴露后，通過在 45°C下于0.4NNaOH 中溫育 30-60 分鐘，隨后在 100°C下于 0.1X SSC, 0.5%SDS, 0.2M Tris-HCl (ρΗ7.4)中進(jìn)行短暫溫育，從濾膜除去探針。為了進(jìn)行第二雜交，如所描述的(Cottone等人，1998.病毒 Res.56，53-67)，使用包含 vegF-E 基因座的 D1701-V 的 HindIII 片段 H。Southern 印跡結(jié)果確認(rèn)，H或F基因正確插入至D1701-VrV的基因組內(nèi)。

⑶V H或F基因特異性RNA的檢測(cè)用3-5 的 MOI 感染 Vero 細(xì)胞，使用 SurePrep Total RNA Extraction Kit (FisherScientific;Germany)在感染后(p.1.)不同時(shí)間分離總RNA。此外,從在胞喃唳阿拉伯糖苷(AraC;0.04mg/ml, Sigma;Germany)或環(huán)己酸亞胺(CHX, 0.lmg/ml, Serva;Germany)存在的條件下感染的細(xì)胞提取RNA，以測(cè)試插入的H-或F-基因的早期表達(dá)。作為對(duì)照，從未感染的細(xì)胞分離RNA。在含有甲醛的變性1%瓊脂糖凝膠中分離RNA，且如所描述的(Kroczek，R.A.&Siebert, E.Anal.Biochem.184:90-95，1990)，將其轉(zhuǎn)移至尼龍膜。將放射性標(biāo)記的 CDVH或⑶V F PCR片段在42°C下在UltraHyb溶液(Ambion;Germany)中用作雜交探針。結(jié)果清楚地顯示⑶V-H或⑶V-F基因的立即早期表達(dá)，這歸因于其在ORFV的早期vegF-E啟動(dòng)子的控制之下的調(diào)節(jié)(Rziha 等人 1999，J.Biotechnol.，73，235-242)。利用免疫熒光檢測(cè)⑶V的H或F蛋白對(duì)于免疫熒光，在4-腔室載玻片(BD Falcon;Germany)中以1.0的MOI感染Vero細(xì)胞(IXlO5個(gè)細(xì)胞/ml)。在感染后不同時(shí)間點(diǎn)，用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，用3.7%(v/v)的不含甲醇的甲醒(Pierce, Thermo Fisher Scientific;Germany)在 37°C下固定細(xì)胞 15 分鐘。在用PBS洗滌3次后，通過用0.2%(v/v) Triton X-1OO在37°C下處理5分鐘來透化細(xì)胞。在PBS洗滌后，用5%的在PBS中的FCS在37°C下封閉細(xì)胞30-40分鐘。為了進(jìn)行⑶V-H或⑶V-F蛋白檢測(cè)，用兔抗-⑶V-H抗體(1:2000稀釋)或用兔抗-⑶V-F抗體(1:200稀釋)和抗-兔-Alexa-555 (1:2000稀釋)在37°C溫育細(xì)胞I小時(shí)。在于PBS中洗滌5次后，將載玻片于37°C下黑暗中用以1:2000稀釋于PBS中的第二抗-兔Alexa-555或抗-兔Alexa-488抗體(Molecular Probes;Germany)溫育30分鐘。作為陰性對(duì)照,使用未感染的細(xì)胞。使用由Dr.Rudiger Raue 提供的 ORFV-特異性兔抗血清PAS2274 (Pfizer Inc, UK)進(jìn)行用ORFV感染后晚期的細(xì)胞的檢測(cè)。將血清以1:100稀釋于具有1%FCS的PBS中，以1:2000的稀釋度使用第二抗體抗-兔Alexa-488。按照制造商的說明書(Biotium;Germany),利用鬼筆環(huán)肽-647進(jìn)行肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的染色，然后在RT下于黑暗中利用0.04 μ g/ml DAPI (4’，6-二脒基-2’ -苯基吲哚二鹽酸鹽；Roche Molecular Biochemicals;Germany)進(jìn)行細(xì)胞核染色，進(jìn)行20-30分鐘。在于PBS中充分洗漆后,用Mowiol-DABCO包埋載玻片，使用Axiovision軟件，用Zeiss ApoTome進(jìn)行熒光成像。利用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。圖3中顯示的結(jié)果明確證實(shí)，⑶V H蛋白或⑶V F蛋白在用每一種重組體(MOI=L O)感染的Vero細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)?？赏ㄟ^利用抗血清PAS2274的特異性染色額外鑒定晚期感染的細(xì)胞。通過使用未感染的細(xì)胞或用D1701-V或D1701-VrV感染的細(xì)胞來測(cè)試染色的特異性。通過Western印跡檢測(cè)CDV H或F蛋白以3.0的MOI同時(shí)感染Vero細(xì)胞(3X105個(gè)細(xì)胞)，將其在37°C下于5%C02大氣中進(jìn)行溫育。在感染后不同時(shí)間上，收獲細(xì)胞+上清液，離心(8，900Xg，10分鐘，4°C )，用1.0ml PBS洗滌細(xì)胞沉淀3次，將其重懸浮于0.15ml含有l(wèi)%(v/v)Triton X-1OO的PBS中。在冰上進(jìn)行30分鐘后，將裂解物以15.000Xg，4°C離心15分鐘，保存上清液以用于SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)。為此，將3份裂解物與I份4X DualColor蛋白上樣緩沖液(Fermentas; Germany)混合，煮沸5分鐘，進(jìn)行超聲處理，并且如所推薦的(FMC Bioproducts, Biozym; Germany),利用 Tris-Tricine-SDS 電泳緩沖液，使用8%(w/v)ProSieve50凝膠，通過SDS-PAGE分離約IOyg蛋白質(zhì)。將預(yù)染的蛋白質(zhì)Ladder (Fermentas; Germany)用作分子量標(biāo)記物。電泳后，按照制造商的說明書(Pierce, Thermo Fisher Scientific;Germany),將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜。在室溫下于 3XRotiblock (Roth; Germany)中進(jìn)行膜封閉3小時(shí)后，使用以1:10，000稀釋于IX RotiBlock中的多克隆兔抗-H或抗-F抗血清(由Dr.P.Plattet&Dr.A.Zurbriggen提供；Univ.Bern, Switzerland)。在 4°C 下過夜溫育后，將膜于 TBS-T(具有 0.05%v/v Tween-20 的Tris-緩沖鹽溶液)中充分洗滌5次，用偶聯(lián)有過氧化物酶的抗-兔抗體(1:20，000; Jackson-1mmunoRes., Dianova;Germany)在RT下溫育I小時(shí)。在TBS-T洗漆后，如所推薦的(Immobilon Western, Millipore; Germany),使用ECL底物。通過使用化學(xué)發(fā)光X-射線膠片(CL-XPosure, Pierce, Thermo Fisher Scientific;Germany)來檢測(cè)反應(yīng)的蛋白質(zhì)。在感染后在不同時(shí)間點(diǎn)上確認(rèn)了具有預(yù)期的分子量的CDV H或F蛋白(H=80kDa;F0=60kDa, Fl=40kDa)的表達(dá)。圖4代表性顯示了 CDV的F蛋白的檢測(cè)。上圖框顯示與多克隆F特異性兔抗血清的反應(yīng)，檢測(cè)到經(jīng)切割的(Fl) CDV基因產(chǎn)物。中圖框顯示肌動(dòng)蛋白-β蛋白的檢測(cè)，其證明已將相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)的量加載入每一個(gè)孔。下圖框顯示晚期ORFV主要包膜蛋白(F13L)的檢測(cè)。

體外病毒的產(chǎn)生為了測(cè)試⑶V基因至ORFV載體的基因組內(nèi)的插入是否會(huì)影響病毒生長(zhǎng)，通過滴定實(shí)驗(yàn)或單步驟病毒生長(zhǎng)曲線(SSGC)比較重組體與親代D1701-V的病毒產(chǎn)生。如圖5中對(duì)于D1701-V-⑶V-H病毒代表性顯示的，在感染后(p.1.)在指定的小時(shí)上收獲總細(xì)胞裂解物，以一式三份進(jìn)行滴定。感染性后代的產(chǎn)量與親代D1701-V病毒難以區(qū)分。該實(shí)驗(yàn)支持結(jié)論:與親代載體病毒相比，CDV基因的插入不會(huì)導(dǎo)致改變的體外生長(zhǎng)特征。實(shí)施例3.利用免疫熒光進(jìn)行的CDV-H特異性抗體的檢測(cè)用QW株Onderstepoort感染Vero細(xì)胞(圖6A-C)或不感染Vero細(xì)胞(圖6D),將細(xì)胞固定，且與用重組D1701-V-CDV-H(10TPFU)肌內(nèi)免疫的小鼠的血清(1: 1000稀釋)一
起溫育。利用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。核外染色為與小鼠抗血清的特異性反應(yīng)性的結(jié)果。圖框D顯示相襯圖，且更好地顯現(xiàn)了特征在于細(xì)胞融合的CDV-感染的細(xì)胞。 該測(cè)定顯示，用表達(dá)⑶V-H抗原的ORFV重組體免疫小鼠導(dǎo)致特異性血清抗體的產(chǎn)生。 實(shí)施例4.利用免疫熒光進(jìn)行的CDV-F特異性抗體的檢測(cè)
4-6 周齡的 Balb/C 小鼠(n=5/ 組)用含有 IO6PFU 或 IO7PFU 的 D1701-V-CDV-F 的0.1ml以2周的間隔肌內(nèi)免疫1、2或3次。每周I次采集個(gè)體的血清樣品，直至最后一次免疫后2周。為了測(cè)試D1701-V-⑶V-F的免疫原性，按照上述方案通過免疫熒光和Western印跡分析血清。綜上所述，這些結(jié)果顯示，⑶V H-在ORFV重組體D1701-V-⑶V-H中的成功表達(dá)。它們還顯示F基因在OR FV重組體D1701-V-⑶V-F中的成功表達(dá)。
序舛
< Martinon5 Olivier MichelReddy3 Nanda Kumar D
<120)副fi病謁獲體
<130>PCT1700
<160〉12
<170>PatentIn version 3.5
<210>I
<211>1824
<212>DKA<213>犬盤熱病毒
`<220>
<221> niiscfeature<223> H *Η
<400> I
atgctctcctaccaagacaa ggtgggtgcc ttct.at.aaag ataatgcasg agctaattca60
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gataaagatg tccttactga gtccaattta gtggtgttgc ctacacagaa ttttagatat1560

權(quán)利要求
1.一種重組副痘病毒，其包括副痘病毒和來源于犬瘟熱病毒的異源DNA。
2.權(quán)利要求1的重組副痘病毒，其中所述副痘病毒為綿羊副痘病毒(ORFV)。
3.權(quán)利要求2的重組副痘病毒，其中所述副痘病毒為綿羊副痘病毒株D1701。
4.權(quán)利要求3的重組副痘病毒，其中所述重組副痘病毒選自綿羊副痘病毒D1701-V-CDV-H 和綿羊副痘病毒 D1701-V-CDV-F。
5.權(quán)利要求1的重組副痘病毒，其中所述異源DNA選自編碼犬瘟熱病毒的H蛋白的基因、編碼H蛋白的所述基因的片段、編碼犬瘟熱病毒的F蛋白的基因以及編碼F蛋白的所述基因的片段。
6.權(quán)利要求5的重組副痘病毒，其中所述異源DNA為編碼犬瘟熱病毒的H蛋白的基因或其片段。
7.權(quán)利要求5的重組副痘病毒，其中所述異源DNA為編碼犬瘟熱病毒的F蛋白的基因或其片段。
8.權(quán)利要求1的重組副痘病毒，其中所述異源DNA選自SEQID NO: 1，與SEQ ID NO:1具有至少約98%的同一性的序列，SEQ ID N0:2，和與SEQ ID NO:2具有至少約98%的同一性的序列。
9.權(quán)利要求1的重組副痘病毒,其中將所述異源DNA插入在綿羊副痘病毒株D1701的HindIII 片段 H/H 內(nèi)。
10.權(quán)利要求9的重組副痘病毒，其中將所述異源DNA插入在綿羊副痘病毒株D1701的HindIII片段H/H內(nèi)的VEGF編碼序列或相鄰非編碼序列內(nèi)。
11.一種制備權(quán)利要求1的重組副痘病毒的方法，其包括將異源DNA插入副痘病毒的基因組。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述副痘病毒為綿羊副痘病毒。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述副痘病毒為綿羊副痘病毒株D1701。
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述重組副痘病毒選自綿羊副痘病毒D1701-V-⑶V-H和綿羊副痘病毒D1701-V-CDV-F。
15.權(quán)利要求11的方法，其中所述異源DNA選自編碼犬瘟熱病毒的H蛋白的基因、編碼H蛋白的所述基因的片段、編碼犬瘟熱病毒的F蛋白的基因以及編碼F蛋白的所述基因的片段。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述異源DNA為編碼犬瘟熱病毒的H蛋白的基因或其片段。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述異源DNA為編碼犬瘟熱病毒的F蛋白的基因或其片段。
18.權(quán)利要求11的方法，其中所述異源DNA選自SEQID NO: 1，與SEQ ID NO:1具有至少約98%的同一性的序列，SEQ ID NO:2和與SEQ ID NO:2具有至少約98%的同一性的序列。
19.一種免疫原性組合物，其包含權(quán)利要求1的重組副痘病毒和載體。
20.權(quán)利要求19的免疫原性組合物，其中所述副痘病毒為綿羊副痘病毒。
21.權(quán)利要求20的免疫原性組合物，其中所述副痘病毒為綿羊副痘病毒株D1701。
22.權(quán)利要求19的免疫原性組合物，其中所述重組副痘病毒選自綿羊副痘病毒D1701-V-CDV-H 和綿羊副痘病毒 D1701-V-CDV-F。
23.權(quán)利要求19的免疫原性組合物，其中所述異源DNA選自編碼犬瘟熱病毒的H蛋白的基因，編碼H蛋白的所述基因的片段，編碼犬瘟熱病毒的F蛋白的基因和編碼F蛋白的所述基因的片段。
24.權(quán)利要求23的免疫原性組合物，其中所述異源DNA為編碼犬瘟熱病毒的H蛋白的基因或其片段。
25.權(quán)利要求23的免疫原性組合物，其中所述異源DNA為編碼犬瘟熱病毒的F蛋白的基因或其片段。
26.權(quán)利要求19的免疫原性組合物，其中所述異源DNA選自SEQID N0:1，與SEQ IDNO:1具有至少約98%的同一性的序列，SEQ ID NO:2和與SEQ ID NO:2具有至少約98%的同一'I"生的序列。
27.—種制備權(quán)利要求19的免疫原性組合物的方法，其包括將權(quán)利要求1的重組副痘病毒與載體組合。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述副痘病毒為綿羊副痘病毒。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述副痘病毒為綿羊副痘病毒株D1701。
30.權(quán)利要求27的方法，其中所述重組副痘病毒選自綿羊副痘病毒D1701-V-⑶V-H和綿羊副痘病毒D1701-V-CDV-F。
31.權(quán)利要求27的方法，其中所述異源DNA選自編碼犬瘟熱病毒的H蛋白的基因，編碼H蛋白的所述基因的片段，編碼犬瘟熱病毒的F蛋白的基因和編碼F蛋白的所述基因的片段。
32.權(quán)利要求27的方法，其中所述異源DNA選自SEQID ΝΟ:1，與SEQ ID ΝΟ:1具有至少約98%的同一性的序列，SEQ ID NO:2和與SEQ ID NO:2具有至少約98%的同一性的序列。
33.一種在動(dòng)物受試者中誘導(dǎo)抗犬瘟熱病毒的免疫應(yīng)答的方法，其包括給所述動(dòng)物施用治療有效量的權(quán)利要求19至26的任一項(xiàng)的免疫原性組合物。
34.權(quán)利要求33的方法，其中誘導(dǎo)了抗-H或抗-F蛋白-特異性保護(hù)性免疫應(yīng)答。
35.一種用于治療動(dòng)物受試者以抗犬瘟熱病的方法，其包括給所述動(dòng)物施用治療有效量的權(quán)利要求19至26的任一項(xiàng)的免疫原性組合物。
36.權(quán)利要求1至10的任一項(xiàng)的重組副痘病毒用于制備藥劑的用途，所述藥劑用于治療動(dòng)物以抗犬瘟熱病。
37.權(quán)利要求1至10的任一項(xiàng)的重組副痘病毒用于測(cè)定的用途，所述測(cè)定用于區(qū)分感染的動(dòng)物與接種的動(dòng)物。
38.權(quán)利要求37的用途，其中所述重組副痘病毒選自綿羊副痘病毒D1701-V-⑶V-H和綿羊副痘病毒D1701-V-CDV-F。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含來源于犬瘟熱病毒的異源DNA的重組副痘病毒，此類構(gòu)建體的制備，以及其在免疫原性組合物和疫苗中的用途。本發(fā)明還涉及重組副痘病毒用于診斷的用途。
文檔編號(hào)A61K39/175GK103079593SQ201180035295
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2011年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月20日
發(fā)明者O·M·馬蒂農(nóng), N·K·D·雷迪 申請(qǐng)人:Ah美國(guó)42有限責(zé)任公司