專利名稱：：重組鼻病毒載體的制作方法重組鼻病毒栽體
背景技術(shù)：
：當(dāng)一種新型流感病毒亞型出現(xiàn)而全人類對其沒有或幾乎沒有免疫力時，就會出現(xiàn)流感大流行。20世紀期間，流感大流行造成全世界范圍內(nèi)上百萬人死亡、社會混亂并造成嚴重的經(jīng)濟損失。研究流感的專家們認為可能還會發(fā)生流感，但卻不知道什么時候會發(fā)生。全世界范圍內(nèi)在下一次大流行爆發(fā)時所做的準備工作的水平?jīng)Q定了這種疾病對公共健康和經(jīng)濟的影響?，F(xiàn)在世界衛(wèi)生組織(WHO)估計，在很短的時間內(nèi)全球?qū)兄辽賻装偃f次門診、2500多萬次住院和幾百萬死亡。這個問題在2003年時尤其顯著，當(dāng)時在很多亞洲國家，家禽中禽H5N1病毒達到了獸疫流行水平，然后傳播到歐洲和非洲。幸運的是，迄今這種病毒在人類中的傳播已受到控制，記錄有246次感染，其中死亡數(shù)高達144(世界衛(wèi)生組織(WHO)網(wǎng)站，2006年9月14日)。傳統(tǒng)的流感疫苗設(shè)計用于引發(fā)對流感病毒血凝素蛋白(HA)的中和抗體反應(yīng)。由于HA蛋白中總是發(fā)生抗原漂移，所以必須每年改變疫苗組成以匹配預(yù)期的流通(circulating)病毒株。這種免疫方法對大流行而言是不可取的，因為大流行病毒林的分離和鑒定以及合適疫苗的構(gòu)建和生產(chǎn)需要很長時間?？刂苹蝾A(yù)防流感大流行的一種更有效的方法考慮構(gòu)建"通用"疫苗，它能夠引發(fā)對近來鑒定的高度保守性流感病毒免疫決定簇的保護性免疫。這種疫苗應(yīng)該提供對A型流感病毒抹的廣泛保護。此外，這種疫苗應(yīng)該全年都能夠生產(chǎn)，能夠儲存，和/或全年都能夠給藥。已證明流感基質(zhì)蛋白M2是開發(fā)疫苗的有效靶標(DeFilette等，Virology337:149-161,2005)。M2是A型流感病毒的一種975個氨基酸組成的跨膜蛋白(Lamb等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A78:4170-4174，1981;Lamb等，Cell40:627-633,1985)。成熟的蛋白形成同源四聚體(Holsinger等，Virology183:32-43,1991;Sugme等，Virology180:617-624,1991),具有可被pH誘導(dǎo)的離子通道活性(Pinto等，Cell69:517-528，1992;Sugrue等，Virology180:617-624,1991)。M2四聚體在受感染細胞的質(zhì)膜中高密度表達，同時也以較低的頻率整合到成熟病毒顆粒膜中(Takeda等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100:14610-14617，2003;Zebedee等，J,Virol.62:2762-2772,1998)。在A型流感病毒中，M2N末端24個氨基酸的胞外域(M2e)高度保守(Fiers等，VirusRes.103:173-176,2004)。M2e與Ml(這種病毒中最保守的蛋白)(Ito等，J.Virol.65:5491-5498，1991)的遺傳關(guān)系形成的限制以及天然感染期間缺少M2e特異性抗體(Black等，J.Gen.Virol.74(Pt.1):143-146，1993)可以解釋M2e的高度保守性。如下文利用NCBI流感It據(jù)庫(http:〃www.ncbi,nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database/multiple.cgi)的序列進行的比對所示，禽流感H5N1病毒的M2e似乎朝著典型的人H1、H2、和H3病毒中的共有序列進化，表明可能能夠利用"人"流感M2e表位進行廣譜性(免疫)保護，包括針對新型禽病毒的(免疫)保護人H1N1MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD人H5N12001-2006......................T..........E........S........人H5N11997-2000.....................LT….G.............S........禽H5N11983-1998.....................LT….G.............S........基于對分離自印尼和越南的人和鳥類的800個H5H1病毒林序列的分析，最近報道了H5N1M2e朝著H1N1M2e序列進化這一現(xiàn)象(Smith等，Virology350:258-268,2006)。用抗人M2e單克6隆抗體(Mab)成功地識別進化的禽M2e肽EVETPTRN，^f旦未識別其"前身"EVETLTRN(Liu等，Microbes.Infect.7:171-177，2005)。這一發(fā)現(xiàn)非常重要，因為之前已發(fā)現(xiàn)某些"禽流感樣"變化會降低人M2e特異性Mab提供的保護的有效性。非常有趣的是，M2e中某些"禽流感樣"氨基酸變化降低了人H1N1病毒在小鼠中的致病性(Zharikova等，J.Virol.79:6644-6654,2005)。WHO已強調(diào)，有可能在不同國家同時發(fā)生不同危險水平的流感大流行，2004年爆發(fā)的加拿大H7N3和亞洲的H5N1禽流感就是如此(http:〃www.who.int/en/)。如下面的比對所示，M2eH7N7與H5N1的"人源化，，變體僅相差一個氨基酸。已證明H7N7亞型能夠在多物種之間傳播(Koopmans等，Lancet363:587-593,2004)，并且對人類是致死性的(Fouchier等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A101:1356-1361,2004)。已證明其他病毒林(H9N2)也能夠感染家禽并傳播到人類中(Cameron等，Virology278:36-41，2000;Li等,J.Virol.77:6988-6994,2003;Wong等，Chest129:156-168，2006)。人H1N1MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD家禽/馬H7N7......................T.…G…E.......S.........家禽H9Nx1966-1996......................T....G...E..K...S.........家禽H9Nx1997-2004....................HT….G...........S.........人H9N21999-2003....................LT....G....E..K..S........已證明基于M2e的重組蛋白疫苗能夠引發(fā)對同源和異源A型流感病毒攻擊的保護性免疫反應(yīng)(Fiers等，VimsRes.103:173-176,2004;Slepushkin等，Vaccine13:1399-1402,1995)。近來利用偶聯(lián)于鑰孔血藍素和腦膜炎奈瑟球菌外膜蛋白的M2e肽進行的研究表明，M2e肽不僅能在小鼠中引發(fā)良好的免疫應(yīng)答，而且也能夠在雪貂和恒河猴中引發(fā)良好的免疫應(yīng)答(Fan等，Vaccine22:2993-3003,2004)。最近發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體M2e疫苗在小鼠中7具有針對Hl、H5、H6和H9A型流感病毒的保護作用(Fan等,Vaccine22:2993-3003，2004)。開發(fā)用于流感抗原的遞送系統(tǒng)對于開發(fā)針對流感病毒感染的疫苗例如大流行流感疫苗非常重要。發(fā)明概迷本發(fā)明第一方面提供包含如本文所述的抗原例如流感病毒抗原(例如，M2e肽)的鼻病毒載體。所述載體可以是對人類無致病性的(例如，人鼻病毒14(HRV14))。所述抗原可以插入到本發(fā)明載體中，插入位點可以是選自中和免疫原I(Niml)、中和免疫原II(NimII)(例如，NimII的第158位氨基酸和160位氨基酸之間)、中和免疫原III(Nimin)、中和免疫原IV(NimIV)或其組合的中和免疫原的位點。所述抗原(例如，流感病毒抗原)任選在其一端或兩端側(cè)接接頭序列。本發(fā)明的鼻病毒載體可以是活的或滅活的。本發(fā)明第二方面提供藥物組合物，所述藥物組合物含有本文所述的鼻病毒載體和一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。所述藥物組合物任選可進一步包含佐劑(例如基于鋁或幾丁質(zhì)的佐劑)和/或一種或多種其他活性成分(例如，與抗原序列例如M2e序列融合的乙肝病毒核心蛋白)。本發(fā)明第三方面提供一種在受試者(例如，所述受試者是人)中誘導(dǎo)對抗原(例如，流感病毒抗原)的免疫應(yīng)答的方法，包括給予所述受試者本文所述的藥物組合物。一個實施例中，所述受試者未患有感染，但有感染的風(fēng)險，例如流感病毒感染。另一個實施例中，所述受試者被感染(例如流感病毒感染)，而所述載體可誘導(dǎo)對該感染的免疫。在多個實施例中，所述藥物組合物鼻內(nèi)給予所述受試者。本發(fā)明第四方面提供一種制備如本文所述的藥物組合物的方法，包括將本文所述的鼻病毒載體和一種或多種藥學(xué)上可接受的載8體或稀釋劑混合。任選所述方法可包括加入佐劑、重建凍干的材料、和/或與其他活性成分混合。本發(fā)明第五方面提供一種核酸分子，該核酸分子編碼或?qū)?yīng)于本文所述的鼻病毒載體的基因組。本發(fā)明第六方面提供包含一種或多種異源抗原序列例如插入的流感病毒抗原序列(例如，M2e序列)的NimII肽。本發(fā)明第七方面提供一種生產(chǎn)如本文所述的鼻病毒載體的方法，所述鼻病毒載體包含抗原例如流感病毒抗原(例如，流感病毒M2e)。所述方法可包括以下步驟(i)產(chǎn)生基于感染性cDNA克隆的重組鼻病毒載體文庫，所述感染性cDNA克隆含有插入的抗原序列(例如，流感病毒抗原序列)，(ii)從文庫中選擇符合以下條件的重組病毒(a)傳代后能保留插入序列，和(b)能被針對插入序列的抗體中和。這些方法的一個實施例中，所述鼻病毒載體是人鼻病毒14(HRV14)。其他實施例中，所述插入的抗原序列的插入位置選自Niml、NimII、NimIII和NimIV。如本文所述，插入的抗原序列任選在其一端或兩端側(cè)接隨機接頭序列。本發(fā)明第八方面l是供一種培養(yǎng)含有插入的抗原(例如，流感病毒抗原)序列的鼻病毒載體的方法。這些方法包括在HeLa或MRC-5細胞中傳代所述載體。本發(fā)明提供幾種益處。例如，利用活的載體系統(tǒng)遞送抗原如M2e有以下優(yōu)勢，包括(i)僅單劑疫苗即可引發(fā)非常強烈和持久的抗體應(yīng)答，(ii)與亞單位或滅活疫苗相比，更容易擴大生產(chǎn)(即，成本較低的情況下可獲得更多劑量)。因此，在發(fā)生大流行的情況下，活疫苗在較短時期內(nèi)能夠免疫接種的人數(shù)要多得多。此外，本發(fā)明的HRV載體可鼻內(nèi)遞送，因此既可引發(fā)全身性的免疫應(yīng)答，也可引發(fā)粘膜免疫應(yīng)答。使用HRV14提供了另外的優(yōu)勢，因為該病毒對人無致病性，并且很少在人群體中發(fā)現(xiàn)該病毒(Andries等，J.Virol.64:1117-1123,1990;Lee等，Virus9Genes9:177-181,1995)，這減少了在疫苗接受者中預(yù)先存在抗載體免疫力的可能性。另外，感染人類所需的HRV的量非常小(1個組織培養(yǎng)物感染劑量(TCID5Q)(Savolainen-Kopra,"人鼻病毒的分子流行病學(xué)(MolecularEpidemiologyofHumanRhinoviruses),，，國家公共健康研究院出版物，2/2006,Helsinki,芬蘭，2006))，這對于基于HRV的疫苗生產(chǎn)成本有效性而言是有利的。根據(jù)下文的發(fā)明詳述、附圖和權(quán)利要求，很容易發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的其他特點和益處。附圖簡述圖1圖示了HRV14的病毒顆粒(上欄)和基因組(下欄)。人鼻病毒14(HRV14)衣殼具有假-T=3(P-3)二十面體(isochedral)對稱性，由60個拷貝的病毒蛋白VP1、VP2、VP3和VP4組成，其中VP4蛋白位于RNA-衣殼界面處(Rossmann等，Nature317:145-153,1985)。VP1-3蛋白形成一個峽谷，包含細胞受體(細胞內(nèi)粘連分子l(ICAM-l))的受體結(jié)合位點(Cokmno等，J.Virol.63:36-42，1989)。在所述峽谷邊緣的表面鑒定到三種主要的中和免疫原性(Nim)位點NimI(AB)、NimII和NimIII,它們是中和抗體的結(jié)合位點(Sherry等，J.Virol.57:246-257,1986)。在嵌合體(Chimera)程序中基于HRV14的晶體結(jié)構(gòu)與Niml特異性抗體mAbl7(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫弁lRVF)進行HRV14顆粒的重建。圖2如下所述(A)本研究中制備的HRV14-M2e構(gòu)建物。使用HRV14cDNA克隆的衍生物即質(zhì)粒pWRl構(gòu)建M2e-插入突變體。(B)HRV14-NimlI-XXX17AA和HRV14-NimlI-XXX23AA病毒文庫以及衍生自pWRl的野生型HRV14產(chǎn)生的噬斑。如本文所述和其他數(shù)據(jù)(圖3和4)所支持的，構(gòu)建物#1不產(chǎn)生噬斑，表明隨機接頭策略是在HRV中工程化新表位的有效手段。圖3顯示M2e插入物在不同的HRV14-M2e構(gòu)建物中的穩(wěn)定10性。用引物對Pl-upl00Fw、VPl-dwn200Rv(綠色)或14FAfllI-1730Rv(紅色)對含插入物的片段進行RT-PCR,分別產(chǎn)生"PCRB"(綠色)或"PCRA"(紅色)DNA片段。用Xhol消化這些片段。示出了第2、3、4代HRV14-M2e嵌合體和第4代HRV14-NimlI-XXX17AA、HRV14-NimlI-XXX17AA病毒文庫的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。兩個酶切片段(箭頭所示)代表含有插入物的病毒。圖4顯示NimII位點處23個氨基酸的M2e插入物可能給HRV14受體結(jié)合域帶來的空間干擾。如圖中所示，沒有接頭的插入物可以乂人NimII位點伸出，幾乎伸到山夾谷結(jié)構(gòu)的對面一邊(即Niml位點處)。該障礙能夠有效地阻礙受體進入到峽谷結(jié)構(gòu)中。N末端接頭能夠改變該插入物的位置(箭頭示出了方向)，打開通4主山夾谷的通3各。用AccelrysDiscoveryStudio4欠i"牛(AccelrysSoftware,Inc)創(chuàng)建HRV14-NimlI-M2e(23AA)的VP1-VP4亞基的分子模型。這表明我們能夠根據(jù)現(xiàn)有的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)和建模軟件將新表位工程化到HRV14中。圖5顯示HRV14、HRV14-NimlI-XXX23AA文庫和HRV14-NimlI-XXX17AA文庫與抗-M2eMab14C2(Abcam，Inc;Cat#ab5416)的噬斑減少中和測驗(PRNT)的結(jié)果。結(jié)果證明，兩種文庫均有效中和，但載體病毒(HRV14)不能中和。從結(jié)果中也可明顯看出兩種文庫的純度(沒有野生型污染)。圖6顯示在攻擊之前經(jīng)免疫小鼠中的M2e特異性IgG抗體免疫應(yīng)答(合并的樣本)。終點效{介(Endpointtiter)(ET)顯示在相關(guān)組標題之后。括號中顯示相應(yīng)免疫接種的時間(d0和d21分別表示第0天和第21天)。圖7顯示在攻擊之前經(jīng)免疫小鼠中的HRV14特異性IgG抗體免疫應(yīng)答(合并的樣本)。(A)-用1、2或3劑量的HRV14-M2e(17AA)病毒免疫的組；(B)-用1或2劑量的親代iiHRV14病毒免疫的組。圖8顯示經(jīng)免疫的小鼠中各自的M2e特異性IgG抗體免疫應(yīng)合。圖9顯示根據(jù)表4所述進行免疫接種的小鼠中M2e特異性抗體同種型IgGl和IgG2a:(A)IgGlELISA(組中合并樣本)；(B)IgG2aELISA(組中合并樣本)；(C)圖9A和9B的標題；(D)第4組(紅色；第1和第3組數(shù)據(jù))和第7組(綠色；第2和第4組數(shù)據(jù))小鼠中各血清樣本(稀釋度1:2,700)的M2-e-特異性IgGl(圓點)和IgGh(菱形)的水平(見表4)。圖10顯示根據(jù)表4所述免疫接種的小鼠中M2e特異性抗體的IgG2a同種型。(A)用1VQe肽(組中合并樣本)進行ELISA;(B)檢測ELISA中第4組(紅色；第1組數(shù)據(jù))和第7組(綠色；第2組數(shù)據(jù))小鼠中的各血清樣本(稀釋度1:2,700)抗M2e特異性肽的情況(見表4)。圖11顯示根據(jù)表4所述免疫接種的小鼠中M2e特異性抗體的IgG2a同種型(上欄)。圖12顯示用A型流感病毒抹PR8攻擊后28天所有組的存活率。圖13顯示用A型流感病毒4朱PR8攻擊后28天所有組的發(fā)病率(圖13A);第4組(圖13B)和第7組(圖13C)的各小鼠體重。圖14顯示在攻擊之前經(jīng)免疫小鼠中的M2e特異性IgG抗體免疫應(yīng)答(合并的樣本)(對組而言見表5)。圖15顯示用A型流感病毒抹PR8非致死攻擊后17天中所有組的發(fā)病率(體重的百分數(shù))。圖16顯示HRV14和HRV6與小鼠抗-HRV14-NimlvHRv6血清的噬斑減少中和測驗(PRNT)結(jié)果。這些數(shù)據(jù)證明了NimIVHRV6在HRV14衣殼背景中的免疫顯性，提示了可用于插入外源表位的新位點。12圖17顯示了Balb/c小鼠中針對流感病毒致死性鼻內(nèi)攻擊的保護A)攻擊后存活百分數(shù)，B)攻擊后體重減輕。圖18圖示了HRV14病毒粒子蛋白中的插入位點?？蓪2e引入到NimI、NimII、NimIII和NimIV中的指定位點。XXXM2e代表本文所述的M2e文庫。圖19圖示HRV14的結(jié)構(gòu)性區(qū)域，示出了根據(jù)本發(fā)明制備的兩種嵌合體中所用的VP2中NimII內(nèi)的插入位點。還提供了這些嵌合體HRV14-M2e(17AA)和HRV14-M2e(23AA)的核苷酸序列。發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種通用的(universal)(大流行)流感疫苗，該疫苗利用人鼻病毒(HRV)作為載體進行通用流感病毒決定簇的有效遞送和呈遞。如下文進一步描述的，4艮據(jù)本發(fā)明，流感病毒基質(zhì)蛋白2(M2e)的胞外域是一種"通用"表位，可包含在通用流感(A型流感)疫苗中。該方法提供了一種有效的流感大流行疫苗，可鼻內(nèi)給予該疫苗以誘導(dǎo)局部粘膜免疫。圖9圖示了根據(jù)本發(fā)明的兩種疫苗實例HRV14-M2e(17AA)和HRV14-M2e(23AA)，還示出了這些病毒的核苷酸序列。這些疫苗是通用流感疫苗候選物的實例。例如根據(jù)這些信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員可構(gòu)建包含如這些實例所示的M2e序列或其他流感表位的疫苗候選物。如下文進一步描述的，也可構(gòu)建基于其他非流感表位的疫苗候選物。下文進一步描述了本發(fā)明的載體、疫苗組合物和方法。HRV栽體本發(fā)明的載體基于人鼻病毒，例如非致病血清型人鼻病毒14(HRV14)。圖1圖示了HRV14病毒顆粒和基因組結(jié)構(gòu)，示出了病毒結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)和非結(jié)構(gòu)蛋白(P2-A、P2-B、P-2C、P3-A、3B(VPg)、3C和3D)以及HRV14中主要中13和免疫原位點(Nims:Niml、NimII、NimIII和NimIV)的位置?？捎糜诒景l(fā)明的一種示例性HRV14分子克隆是pWR3.26(美國典型培養(yǎng)物保藏中心ATCC⑧號VRMC-7TM)。下文進一步描述了該克隆，Lee等，J.Virology67(4):2110-2122,1993(也可參見序列附錄3)也詳細描述了該克隆。HRV14的其他來源也可用于本發(fā)明(例如，ATCC登錄號VR284;也可參見GenBank登錄號L05355和K02121;Stanway等，NucleicAcidsRes.12(20):7859隱7875,1984;Callahan等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82(3):732國736，1985)。除HRV14之外，其他人鼻病毒血清型也可用于本發(fā)明。本領(lǐng)域已知100多種人鼻病毒血清型，所有這些血清型均可通過與HRV14同樣的方式衍生感染性克隆以用于本發(fā)明。雖然本文參考HRV14進行描述，但本發(fā)明也適用于其他鼻病毒血清型。根據(jù)本發(fā)明，可將抗原序列插入HRV載體，如下文所述，可插入不同位點。一個實施例中，所述序列插入到一種血清型例如HRV14的NimII位點。NimII(中和免疫原II)是HRV14中的一個免疫顯性區(qū)域，包括VP1的第210位氨基酸和VP2的第156、158、159、161和162位氨基酸(Savolainen-Kopra,"人鼻病毒的分子流行病學(xué)(MolecularEpidemiologyofHumanRhinoviruses)，，，國家公共健康研究院出版物，2/2006,Helsinki,芬蘭，2006))。在下文描述的一個具體實施例中，所述序列插入到VP2的第158和160位氨基酸之間。也可在NimII表位的其他位點插入。例如，可在VP2的第156、158、159、161或162位、VP1第210位或它們的組合中的任意位置插入?？刹迦氲钠渌稽c(單獨或與其他位點(例如NimII位點)的插入組合)包括NimI(A和B)、NimIII和NimIV。因此，例如可在以下位置插入VP1的第91和/或95位(NimIA)、VP1的第83、85、138和/或139(NimlB)、和/或VP1的第287位(NimIII)14(參見，例如圖18)。NimIV是VP1的羧基末端區(qū)，該區(qū)包含的序歹'J代表HRV14VP1的第274-289位氨基酸NTEPVIKKRKGDIKSY。該區(qū)域內(nèi)任何氨基酸之間的插入均包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明包括例如在以下氨基酸之間的插入274和275;275和276;276和277;277和278;278和279;279和280;280和281;281和282;282和283;283和284;284和285;285和286;286和287;287和288;以及288和289。除這些插入外，本發(fā)明包括該區(qū)域中一個或多個(例如，3、4、5、6、7、8、9或10個)氨基酸被刪除的插入。因此，例如，本發(fā)明包括在以下氨基酸之間的插入274和276;275和277;276和278;277和279;278和280;279和281;280和282;281和283;282和284;283和285;284和286;285和287;286和288j287和289;288和290;以及289和291。使用分子生物學(xué)中的標準方法構(gòu)建本發(fā)明的載體，下文以在HRV14的NimII中包含插入的載體為例解釋構(gòu)建過程。此外，如下文進一步描述的，本發(fā)明的載體可以活病毒形式給藥，或在給藥之前用福爾馬林滅活或紫外線處理滅活，滅活方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。所述載體任選在氨基端和/或羧基端包含HRV載體序列和插入的流感病毒序列之間的接頭序列。這些接頭序列可用于為插入的序列提供柔性，使插入的序列能夠以引發(fā)免疫應(yīng)答的方式呈遞插入的表位。下文提供了此類接頭序列的例子。可用例如本文所述的本發(fā)明文庫篩選方法來鑒定與特定插入物一起使用的接頭序列。簡言之，在該方法中，構(gòu)建的文庫在適于鑒定有效的接頭序列的區(qū)域中有隨機序列。4企測文庫產(chǎn)生的病毒的活力和插入序列的免疫原性以鑒定有效接頭。外源肽15本發(fā)明的病毒載體可用來傳遞任何具有預(yù)防或治療價值的肽或蛋白。例如，本發(fā)明的載體可用來誘導(dǎo)針對插入到HRV蛋白中的任何基于蛋白的抗原的免疫應(yīng)答(預(yù)防性或治療性)。本發(fā)明的載體可各自包括單個表位。或者，可以將多個表位插入到所述載體的單個位點(即作為多表位，其中不同的表位可以被一個柔性的接頭隔開，諸如氨基酸的一個多聚甘氨酸延伸)或不同位點(例如不同的Nim位點)或其任何組合。所述不同的表位可來源于一種病原體，或者可來源于不同的種和/或不同的屬。所述載體可包含多個肽，例如，例如本文所述肽的多個拷貝或本文所述肽的組合。作為例子，所述載體可包含人和禽M2e肽(和/或其共有序列)。可用于本發(fā)明的抗原可來源于如病毒、細菌和寄生蟲等感染性因子。此類感染性因子的一個具體例子是流感病毒，包括感染人的流感病毒(例如A、B和C病毒抹)和禽流感病毒。來源于流感病毒的抗原的例子包括衍生自以下物質(zhì)的抗原M2、血凝素(HA;例如，Hl-H16中任何一個或其亞基)(或HA亞基HA1和HA2)、神經(jīng)氨酸酶(NA;例如，Nl-N9中任何一個)、Ml、核蛋白(NP)和B蛋白。可包含在本發(fā)明載體中的其他序列是流感病毒M2e序列。說明書全文和序列附錄1中提供了此類序列的例子。此類序列的具體例子包括MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD;MSIXTEVETPTRNEWECRCSDSSD;MSLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSD;EVETPTRN;SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD;和SLLTEVETPIRNEWGCR。可用于本發(fā)明的其他M2e序列包括來自B型流感病毒BM2蛋白的胞外域的序列(共有序列MLEPFQ)和來自H5N1禽流感16病毒的M2e肽(MSLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSD)。包含在本發(fā)明載體中的肽可包括如上所述的完整序列，或者包括能誘導(dǎo)所需免疫應(yīng)答的表位的片段。這些片段可包括這些肽中的例如2-20、3-18、4-15、5-12或6-10個氨基酸的片段。另夕卜，這些肽中還可包含另外的氨基和/或羧基末端氨基酸序列。因此，這些肽可包括例如1-10、2-9、3-8、4-7或5-6個此類氨基酸，這些氨基酸可以是天然存在的、連續(xù)序列或是人工接頭(參見下文)。以上所述序列的所有可能的肽片段都包括在本發(fā)明內(nèi)。流感病毒中的其他保守性肽也可用于本發(fā)明，包括B型流感病毒的NBe肽(共有序歹'JMNNATFNYTNVNPISHIRGS)。可用于本發(fā)明的流感病毒肽的其他例子以及可衍生這些肽的蛋白(例如通過片段化)描述于以下文獻US2002/0165176、US2003/0175290、US2004/0055024、US2004/0116664、US2004/0219170、US2004/0223976、US2005/0042229、US2005/0003349、US2005/0009008、US2005/0186621、美國專利號4,752,473、美國專利號5,374,717、U.S.6,169,175、美國專利號6,720,409、美國專利號6,750,325、美國專利號6,872,395、WO93/15763、WO94/06468、WO94/17826、WO96/10631、WO99/07839、WO99/58658、WO02/14478、WO2003/102165、WO2004/053091、WO2005/055957,和序列附錄1和附錄2(包括其中引用的文獻)，這些文獻的內(nèi)容均通過參考納入本文。另夕卜，可,人www.immuneepitope.org凄丈寺居庫中選擇流感病毒的保守性免疫原性/保護性T細胞和B細胞表位，最近從該數(shù)據(jù)庫中已篩選到很多很有前景的交叉保護表位(Bui等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A104:246-251,2007，及其增補表)。本發(fā)明可利用線上IEDB資源中的任何肽，例如包括如上所述Bui等描述的保守性B細胞表位和T細胞表位的流感病毒表位。本發(fā)明載體中還可包含來自其他人/獸病原體的保護性表位，所述病原體例如寄生蟲(例如，瘧疾)、其他致病性病毒(例如，人乳頭瘤病毒(HPV)、單純皰瘆病毒(HSV)、人免疫缺陷病毒(HIV;例如，gag)、丙肝病毒(HCV))、以及細菌(例如，結(jié)核分枝桿菌(Af7c06a"er^w&6en^/cw\s)、？艮難沖炎狀芽孢桿菌(C/oWn'A'Mmc^j^'"7e)禾口幽門螺牙干菌(Z/e〃coZa"erp少/on')。文獻中很容易找到這些以及其他一些病原體的各種合適表位。例如，Schiller及其同事從乳頭瘤病毒L2蛋白中鑒定到的交叉保護性表位/肽，該交叉保護性表位/肽誘導(dǎo)的廣譜交叉-中和抗體能夠提供針對不同HPV基因型的保護，所述表位/肽例如HPV16病毒L2蛋白的第1-88位、1-200位或17-36位的氨基酸(WO2006/083984Al;QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV)。可用于本發(fā)明中的其他病原體以及這些病原體中的抗原和表位的例子可參見WO2004/053091、WO03/102165、WO02/14478和US2003/0185854，這些文獻的內(nèi)容均通過參考納入本文。下表1列出了可從中得到抗原的其他病原體的例子，這些抗原的具體例子包括下表2列出的抗原。此外，表3提供了可插入本發(fā)明載體中的表位的具體例子。如表3所示，用于本發(fā)明載體的表位可以是B細胞表位(即中和表位)或T細胞表位(即T輔助細胞和細胞毒性T細胞特異性表位)。例如，本發(fā)明的載體可用來傳遞腫瘤相關(guān)抗原，以用于抗癌免疫療法。本領(lǐng)域已知許多胂瘤相關(guān)抗原，并且可將其根據(jù)本發(fā)明給藥。癌癥(和相應(yīng)的腫瘤相關(guān)抗原)的實例如下黑素瘤(NY-ESO-l蛋白(準確地講是位于氨基酸位置157-165的CTL表位)、CAMEL、MART1、gp100、酪氨酸相關(guān)蛋白TRP1和2、和MUC1));腺癌(ErbB2蛋白)；結(jié)腸直腸癌(17-1A、791Tgp72和癌胚抗原)；前列腺癌(PSA1和PSA3)。熱激蛋白(hspllO)也可用作這樣的抗原。在本發(fā)明的另一個實施方案中，可以使用編碼需要對其產(chǎn)生18免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)的抗原表位的外源蛋白。另外，本發(fā)明的載體可包括用于靶向所述載體的配體，以將諸如抗原的肽傳遞至接受所述載體給藥的受治療者的特定細胞(例如包括所述配體的受體的細胞)。本發(fā)明載體中所插入的肽或蛋白大小的長度范圍可以例如為3-1000個氨基酸，例如5-500個、IO-IOO個、20-55個、25陽45個或35-40個氨基酸，本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定合適的長度。因此，長度為10-25、12-22或15-20個氨基酸的肽可用于本發(fā)明。此外，本文所述的肽可包括其他序列或可縮短其長度，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠合適地確定。本文所述的肽可以是本文所述的本發(fā)明載體形式，或者可以經(jīng)過修飾，例如通過替代或刪除一個或多個氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、IO或更多氨基酸)。此外，所述肽存在于載體中時可以是在更大的肽內(nèi)。如上所述，任選所述肽例如上述肽或本文所述的其他肽在氨基末端和/或羧基末端包含其他序列，這些序列可以是與所述肽序列天然相連的(即所述序列與所述肽在流感病毒(或其他來源)基因組中是毗連的)，或者不是天然相連的(例如合成的接頭序列)。因此所述肽可在一個末端或兩個末端含有1-25、2-20、3-15、4-10或4-8個氨基酸的序列。作為一個具體的例子，所述肽可在氨基末端和/或羧基末端含有l(wèi)-3個接頭序列。給藥當(dāng)用于免疫方法時，可以將本發(fā)明載體作為一級預(yù)防藥給予有感染特定病原體危險的成人或兒童。所述載體也可以用作二級受感染患者。當(dāng)進行抗癌免疫時，可將疫苗給予有患癌風(fēng)險或已罹患癌癥的受試者。對于疫苗應(yīng)用，可以任選使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的佐劑。19根據(jù)給藥途徑選擇佐劑。對于鼻內(nèi)給藥，可用幾丁質(zhì)微粒(CMP)(Asahi-Ozaki等，MicrobesandInfection8:2706-2714,2006;Ozdemir等，ClinicalandExperimentalAllergy36:960-968，2006;Strong等，ClinicalandExperimentalAllergy32:1794-1800,2002)。適用于通過粘膜途徑(例如鼻內(nèi)或口腔途徑)給藥的其他佐劑包括大腸桿菌的熱不穩(wěn)定性毒素(LT)及其突變衍生物。對于滅活的病毒而言，可用胃腸外佐劑，包括例如鋁化合物(例如，氫氧化鋁、磷酸鋁或羥基磷酸鋁化合物)、脂質(zhì)體制劑、合成佐劑例如(例如，QS21),胞壁酰二肽、單磷酸類脂A或聚磷腈。此外，可將具有佐劑活性的編碼細胞因子的基因插入本發(fā)明載體中。因此，可將編碼細胞因子例如GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-13或IL-5的基因與外源抗原基因一起插入以產(chǎn)生具有增強的免疫應(yīng)答的疫苗，或調(diào)節(jié)所針對的免疫性使其更特異于細胞免疫應(yīng)答、體液免疫應(yīng)答或粘膜免疫應(yīng)答?；蛘撸赏ㄟ^公知方法(例如直接接種、棵DNA、在病毒載體中遞送等)獨立于重組疫苗病毒、與重組疫苗同時或按順序遞送細胞因子。本發(fā)明的病毒可與其他免疫接種方法組合使用。例如，本發(fā)明的病毒可與含有相同或不同抗原的亞單位疫苗組合給藥。本發(fā)明的組合方法可包括本發(fā)明的病毒與所述抗原的其他形式(例如，亞單位形式或包含乙肝病毒核心蛋白的遞送載體(例如大腸桿菌產(chǎn)生的表面上含有M2e的乙肝病毒核心蛋白(HBc-M2e;Fiers等，VimsRes.103:173-176,2004;WO2005/055957;US2003/0138769Al;US2004/0146524A1;US2007/0036826Al)),或滅活的完整病毒或部分病毒)共同給藥(co-administration)?；蛘?，本發(fā)明載體可與其他方式(例如亞單位或HBc方式)以引發(fā)-加強策略組合使用，其中本發(fā)明的載體或所述其他方式用于引發(fā)免疫應(yīng)答，然后使用所述其他方式加強免疫，或相反。另外，本發(fā)明包括本發(fā)明載體既用作引發(fā)劑又用作加強劑的引發(fā)-加強20策略。因此，這些方法可包括先給予本發(fā)明載體，之后一周或多周、一月或多月、一年或多年再進行后續(xù)的一次或多次(例如，1、2、3或4次)給藥?？捎脴藴史椒▽⒈景l(fā)明載體給予受試者例如哺乳動物(例如人)。鼻內(nèi)給藥時，可以鼻內(nèi)滴劑形式給藥或通過吸入氣溶膠或噴霧制劑給藥。病毒可以是凍干形式或溶解在生理相容性溶液或緩沖液例如鹽水或水中?？墒褂美纭独酌黝D藥物科學(xué)(第18版)》，A.Gennaro主編,1990,MackPublishingCompany,Eastern,PA中所述的標準生產(chǎn)和制劑方法。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易確定合適的劑量和給藥方案。本發(fā)明載體可以活疫苗或滅活疫苗形式給予受試者例如人?？捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知方法鼻內(nèi)給予活疫苗(參見，例如，Griinberg等，Am.J.Respir.Crit.Car.Med.156:609-616，1997)。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易確定合適的劑量和給藥方案。例如劑量可以是103-10spfu/劑。有利地，可以單劑形式給予疫苗，但如果本領(lǐng)域技術(shù)人員認為需要的話也可進行加強免疫。至于滅活疫苗，可用例如福爾馬林或UV處理殺死病毒，以108pfu/劑的劑量鼻內(nèi)給藥，任選與合適的佐劑(例如幾丁質(zhì)或突變體LT;見上文)一起給藥。這些方法中，給予多于一劑(例如2-3劑)可能是有利的。本發(fā)明部分地基于以下實施例。實驗實施例I.HRV14-NimlI-M2e嵌合體的構(gòu)建我們已構(gòu)建了HRV14Nimll-M2e重組病毒?？筂2e單克隆抗體能夠中和該重組病毒的感染性，因此證明該病毒在病毒粒子表面上表達M2e。構(gòu)建了三種類型的HRV14-M2e構(gòu)建物(圖2)。1.在VP2的第159位和160位氨基酸(NimII位點)之間插入攜帶M2e的23AA的HRV14-NimlI-23AA;2.HRV14-NimlI-XXX23AA文庫。這組構(gòu)建物(質(zhì)粒文庫)類似于第一構(gòu)建物，但肽上融合有3-AA的隨機N末端接頭。用5，(直接(direct)引物(含有編碼接頭氨基酸的9個隨機核普酸)在M2e序列旁產(chǎn)生隨機接頭；3.HRV14-NimlI-XXX17AA文庫。用與第一構(gòu)建物相同的方式構(gòu)建該文庫，但該文庫含有縮短的M2e肽，該肽只含有M2e的開頭17個氨基酸。為有利于向HRV14感染性克隆中進行克隆，我們通過將pWR3.26感染性克隆的pUC質(zhì)粒主鏈替換為pEt載體的(Novagen)從而對pWR3,26進行了修飾。產(chǎn)生的質(zhì)粒pWRl(圖2)能夠在大腸桿菌中更穩(wěn)定地維持并更易于操作。病毒文庫#2和弁3的噬斑形態(tài)與HRV14親本的不同(圖2B)。這些文庫的噬斑大小似乎與野生型相似，但噬斑不透明。構(gòu)建物#1轉(zhuǎn)染時不形成為監(jiān)測所構(gòu)建病毒的遺傳穩(wěn)定性，我們通過沉默突變在M2e序列中部插入了Xhol酶切位點。從含有突變M2e基因的病毒中獲得的RT-PCR片段被Xhol酶切，但野生型HRV14上產(chǎn)生的相應(yīng)DNA產(chǎn)物未一皮消化(圖3)。HRV14-NimlI-23AA嵌合構(gòu)建物(弁1)產(chǎn)生有活力但相當(dāng)不穩(wěn)定的病毒。如圖3所示，僅在第2代檢測到"PCRA"片段的兩個Xhol消化產(chǎn)物，以后各代未檢測到。相反，文庫(#2)和(#3)穩(wěn)定保留了M2e插入物HlHeLa細胞中的第4代病毒文庫中獲得的"PCRB"片段被Xhol完全消化(圖3)。構(gòu)建物#1的不穩(wěn)定性可能是由于插入的肽與受體結(jié)合域的空間干擾造成的(圖4)，在構(gòu)建物#2和#3中，簡并接頭的存在可能削弱了這種空間干擾。隨機的N末端接頭可能已經(jīng)改變了肽的方向，使其離開含有受體結(jié)合域的峽谷，從而使病毒有效結(jié)合到其受體(圖4)。22我們用抗M2e單克隆抗體(14C2MAb,Abeam,Inc.Cat#ab5416)進行了病毒文庫的中和試驗。病毒中和試驗也可用作檢驗文庫純度(即，不存在野生型HRV14)的工具。噬斑減少中和測驗(PRNT)的結(jié)果證明Mab14C2對兩個文庫均具有極高的特異性和中和能力(圖5)。即使對于最低的單克隆抗體稀釋度1:10,兩個文庫均極易被抗M2e單克隆抗體中和(圖5),而對照病毒(pWRl)未被中和。約1:2,000,000的抗體稀釋度(14C2的儲液濃度是1mg/ml)時，兩個文庫均觀察到50%的中和。這種對重組病毒的高效中和表明，HRV14的NimII中呈遞的M2e肽具有合適的構(gòu)象，易于^皮抗體識別。II.鑒定穩(wěn)定的HRV14-NimlI-M2e重組子在HlHeLa細胞中傳代4代之后，各文庫中選擇6個單獨的克隆進行p藍斑純化，再過4代之后，對攜帶的插入物測序進行鑒定。各文庫產(chǎn)生一個顯性和穩(wěn)定復(fù)制的病毒克隆。分離自HRV14-NimII-XXX23AA文庫的所有病毒均具有相同的插入序列GHTSLLKEVETPIRNEWGSRSNDSSD，GHT作為N末端接頭，而分離自HRV14-NimlI-XXX17AA文庫的所有病毒具有相同的序列QPASLLTEVETPIRNEWGSR,QPA作為N末端接頭。攜帶23AA插入物的所有活克隆在第7位氨基酸處具有酪氨酸至賴氨酸的取代(在M2e外源插入物中是第4位)。攜帶17AA插入物的克隆均含有野生型M2e序列。這些結(jié)果表明可分離到遺傳穩(wěn)定的重組HRV-M2e病毒。在進一步的體內(nèi)研究中，用腹膜內(nèi)給藥途徑評估HRV14-M2e(17AA)提供針對A型流感病毒株P(guān)R8的保護的可能性。III.HRV14-NimlI-M2e重組子的體內(nèi)研究23A.體內(nèi)試驗#1:腹膜內(nèi)免疫接種1.試-驗i殳計第0天，用在500pL體積中與100pg佐劑(氫氧化鋁)混合的蔗糖純化的HRV14-M2e(17AA;參見表4的注腳(4))病毒(5.0xl06pfu的HRV14-M2e(17AA)，1.3x107pfu的親本HRV14,或作為陰性對照的模擬物(mock)(PBS)通過腹膜內(nèi)途徑免疫引發(fā)9周齡雌性Balb/c小鼠(8只小鼠/組)，第21天加強免疫。作為黃金標準，使用了現(xiàn)在是疫苗候選物的ACAM-FluA(帶有3個M2e拷貝的重組乙肝病毒核心顆粒)。后者單獨或與HRV14-M2e或HRV14聯(lián)合用于引發(fā)/加強免疫(表4)。為了驗證免疫接種所提供的保護，第35天用4LD5Q的流感A/PR/8/34(H1N1)病毒攻擊所有的小鼠。監(jiān)測發(fā)病率和致死率21天。為了檢測針對所攜帶肽的小鼠血清抗體，免疫接種前(基線)和第33天分別取血。用涂覆有合成的M2e肽的微量滴定板進行規(guī)定的ELISA試驗，測定血清中M2e特異性抗體的效價。測定了M2e特異性總IgG、Ig2a和Ig2b的效價。2.結(jié)果a.免疫原性i.免疫接種動物中的總IgG用合并的血清樣本(圖6)以及單獨的動物樣本(圖7)沖企測了各組中M2e特異性抗體的效價。合并樣本的結(jié)果(圖6)顯示，用攜帶17AAM2e的重組HRV14引發(fā)并用ACAM-FluA加強免疫與用兩劑量的乙肝病毒核心蛋白-M2e重組病毒樣顆粒(IO(xg/劑)引發(fā)的抗體水平相同(終點效價(ET)-218,700)。用ACAM-FluA加強免疫時，用HRV14-M2e(17AA)(組4;ET=218，700)比用HRV14載體(組6;ET-2，700)引發(fā)產(chǎn)生的M2-e特異性免疫應(yīng)答高約100倍。因此，HRV14-M2e的引發(fā)作用僅依賴于M2e插入24物而不依賴于載體。基于Arnold等，2006(Arnold,G.F.和Arnold,E.嵌合病毒疫苗(ChimericVimsVaccine).11/176,182[US2006/0088549Al],1-57.4-27-2006.US.7-7-2005)的假設(shè)，109pfuHRV14的免疫接種劑量約相當(dāng)于10pg蛋白。我們粗略地估計，l免疫接種劑量的重組HRV-M2e病毒相當(dāng)于10ng蛋白?？紤]到分子量和重組乙肝病毒核心顆粒中亞基數(shù)目的多重性，我們推測l免疫接種劑量的HBc-M2e比HRV-M2e含有的M2e蛋白約多10,000倍。用HRV載體獲得的相當(dāng)?shù)目贵w水平可能能夠用較低價的生產(chǎn)方法提供更具免疫原性的呈遞系統(tǒng)。M2e抗體水平與HRV14-M2e(17AA)的劑量數(shù)目成反比。實際上，3劑HRV14-M2e(17AA)病毒(組l)引起了最低的M2-e特異性應(yīng)答(ET二2.700),而2劑方案引起的應(yīng)答高IO倍(組2;ET=24,300)，1劑比2劑高3倍(組5;ET=72，900)。為驗證該(劑量-應(yīng)答)關(guān)系是否是抗-載體免疫引起的，我們獨立地檢測了HRV14載體所有組的免疫應(yīng)答(圖7)。所有3種類型的HRV"-M2e(17AA)給藥(l、2或3劑)均顯示相當(dāng)?shù)腍RV14-特異性免疫應(yīng)答水平(ET=72》00)(圖7A)。這說明抗-載體免疫不是引起對M2-e免疫應(yīng)答降低的原因，同時說明l劑的給藥可能已經(jīng)足夠。單獨的血清樣本的M2e特異性ELISA(圖8)檢測到與用合并的樣本所示相同的組內(nèi)差異如在兩個血清稀釋度(1:300和l:2,700)所示，第4組和第7組中各小鼠的平均抗體水平顯著高于所研究的任何其他組。ii.免疫接種動物中抗體的IgG2a、IgG2b和IgGl亞型已證明M2e免疫接種小鼠中的顯性M2特異性Ab同種型是IgG2b,還有一些IgG2a(Jegerlehner等，J.Immunol.172.9:5598-5605,2004)。已證明這兩種同種型是小鼠中抗體依賴25性細胞毒性(ADCC)最重要的介導(dǎo)物(Denkers等，J.Immunol.135:2183，1985)，據(jù)信這也是M2e依賴性保護的主要機制。本研究中，我們檢測了合并組樣本和單獨的血清樣本中的IgGl、IgG2a和IgG2b同種型效價。在所有組中，第4組(HRV14-M2e(17AA)引發(fā)/ACAM-FluA加強)和第7組(ACAM-FluA引發(fā)和加強)的IgGl、IgG2a抗體效價最高(圖9)。第7組的IgGl效價顯著高于第4組(圖9A和9D)，IgG2a效價在第4組中較高(圖9B和9D)，而第7組動物的IgG2b效價高于第4組(圖10)。圖11顯示了免疫接種小鼠中的IgG2a同種型的M2e特異性抗體。b.發(fā)病率和致死率用PR8病毒林攻擊之后，監(jiān)測小鼠的發(fā)病率和致死率28天。如圖12所示，與本研究中所有其他組相比，第4組顯示出最高的存活率(80%)，而第7組與陰性對照(PBS)沒有顯著差別。第4組的發(fā)病率最低該組體重變化顯著低于所有其他組(圖13A,B)。因此，HRV14-M2e(17AA)病毒在小鼠中具有高度免疫原性和保護性。將傳統(tǒng)重組蛋白方案的免疫應(yīng)答和引發(fā)-加強方案中兩者組合引起的免疫應(yīng)答進行比較。后者與單獨的重組蛋白相比具有明顯不同的免疫應(yīng)答2劑攜帶M2e的重組HBc(Acam-FluA)誘導(dǎo)出顯性IgGl抗體亞型，而用HRV14-M2e(17AA)引發(fā)和用Acam-FluA加強免疫產(chǎn)生IgG2a作為顯性同種型，已證明其對ADCC非常重要。此外，后組與所有其他各組相比都顯示出最高的保護。很重要的一點是要注意到，因為HRV不在小鼠中復(fù)制，在該模型中接種HRV-M2e重組子是和合適的胃腸外佐劑聯(lián)合進行的，模擬了滅活疫苗的免疫接種。我們提議最終在人中進行評價，有兩種選擇方案給予活的重組HRV14-M2e病毒疫苗和/或滅活疫苗(福爾馬林滅活)與經(jīng)批準的胃腸外佐劑例如氬氧化鋁共同給藥。B.體內(nèi)試驗#2.鼻內(nèi)免疫接種1.用于接種的病毒該體內(nèi)研究中，用鼻內(nèi)給藥途徑評估HRV14-M2e(17AA)針對A型流感病毒抹PR8的非致死攻擊提供保護的可能性。注意上文已描述了HRV14-M2e(17AA)序列。2.試一驗設(shè)計第0天，用在50pL體積中與5pg大腸桿菌熱不穩(wěn)定性毒素(LT)佐劑混合的、蔗糖純化的HRV14-M2e(17AA)或HRV14(參見表5的注腳(3))(1()Spfu/劑，第3-6組)病毒通過鼻內(nèi)途徑免疫引發(fā)9周齡雌性Balb/c小鼠(8只小鼠/組)，第21天加強免疫。作為黃金標準，使用了包含帶有3個M2e拷貝的重組乙肝病毒核心顆粒的疫苗(ACAM-FluA)。后者單獨或與HRV14-M2e或HRV14聯(lián)合用于引發(fā)/加強免疫(表5)。為了驗證免疫接種所提供的保護，第35天用4LD5o的流感A/PR/8/34(H1N1)病毒攻擊所有小鼠。監(jiān)測發(fā)病率和致死率21天。為了檢測針對所攜帶肽的小鼠血清抗體，免疫接種前(基線)和第33天分別取血。用涂覆有合成的M2e肽的微量滴定板進行規(guī)定的ELISA試驗，測定血清中M2e特異性抗體的效價。測定了M2e特異性總IgG、Ig2a和Ig2b的效價。3.結(jié)果a.免疫原性i.M2e特異性抗體的效價用合并的血清樣本檢測各組的抗體效價(圖14)。用1劑攜27帶17AAM2e的重組HRV14(引發(fā))并用ACAM-FluA加強免疫與用2劑乙肝病毒核心蛋白-M2e重組病毒樣顆粒(IO)ig/劑)引發(fā)的總IgG抗體水平相當(dāng)(終點效價(ET)〉218,700;圖14A)。后面的結(jié)果與通過IP途徑免疫接種獲得的數(shù)據(jù)一致。1劑HRV14-M2e與1劑AcamFluA誘導(dǎo)產(chǎn)生的M2e特異性總IgG水平相當(dāng)(ET=24,300)。HRV14-M2e病毒負載降低2倍對總IgG水平無太大影響(第7組；ET-=24，300)。與用IP途徑給藥一樣，用HRV14-M2e引發(fā)和用AcamFluA加強免疫產(chǎn)生了最高的IgG2a水平(圖14C;ET》218,700)。l劑HRV14-M2e比1劑AcamFluA誘導(dǎo)產(chǎn)生的IgG2a水平稍高(ET=72,900對ET=24,300)。2劑AcamFluA產(chǎn)生了最高效價的IgG2b(圖14B)和IgGl(圖14D)。b.發(fā)病率用PR8病毒抹非致死性攻擊之后監(jiān)測小鼠的發(fā)病率17天(圖15)。1劑HRV14-M2e提供的保護水平與2劑AcamFluA或用HRV14-M2e引發(fā)并用AcamFluA加強免疫提供的免疫保護水平相當(dāng)。第2組小鼠(1劑AcamFluA)出現(xiàn)了明顯的疾病癥狀。對照組(組4)在攻擊后頭9天中出現(xiàn)了嚴重的體重減輕。IV.HRV14病毒中新的顯性中和免疫原(NimIV)，一個新發(fā)現(xiàn)的外源表位插入位點我們已鑒定到一種新的HRV中和免疫原中和免疫原IV(NimIV)。其可用于開發(fā)表位-插入重組疫苗。NimIV具有高度免疫原性，在小鼠中誘導(dǎo)很高的病毒中和滴度。HRV的NimIV包括結(jié)構(gòu)蛋白VP1的C末端區(qū)域。該表位可在不同的HRV血清型之間交換。如果一種HRV的NimIV被引入另一種血清型病毒中，它會給產(chǎn)生的嵌合重組子帶來供體血清型的中和特性。已證明在28ELISA和Western印跡試驗中，合成的NimIV肽能夠被相應(yīng)的血清型特異性抗體有效識別。特別地，通過將HRV14中的NimIVHRV14替換為HRV6病毒的NimIV而產(chǎn)生了HRV14-NimlvHR^嵌合體。該病毒被抗HRV6多克隆抗體有效中和并在小鼠中誘導(dǎo)了抗-HRV6中和免疫應(yīng)答。用HRV14-NimlvHR"免疫的小鼠血清中的50%中和滴度對于HRV6病毒約是1:800，而對于HRV14只有l(wèi):400(圖16)。相比之下，小鼠抗-HRV14血清的50%中和滴度對于同源病毒而言是1:1400，表明HRV6特異性NimIV顯著降低了抗其余HRV14Nims(1、II和ni)的抗體中和病毒的中和有效性。V.流感病毒小鼠攻擊模型可用合適的病毒抹在小鼠流感病毒攻擊模型中檢測疫苗候選物的保護效力。我們研究中所用的原型流感攻擊病毒株是適合于小鼠的病毒林A/PR/8/34(H1N1)。該病毒獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(目錄號VR-1469,編號2013488),適合通過連續(xù)傳代在Balb/c小鼠中生長。對于小鼠傳代，鼻內(nèi)免疫接種病毒，3天后制備肺組織勻漿。勻漿被盲法傳代(blind-passaged)到其他小鼠中傳至5代。然后另外傳代用于制備肺勻漿等份，用作攻擊儲液。對于小鼠的攻擊，鼻內(nèi)免疫接種50pL給藥。接種時麻醉小鼠以抑制咽反射，使病毒進入肺中。用致死劑量的病毒感染的小鼠體重減輕很快，大多數(shù)在接種后7-9天死亡。適合小鼠的A/PR/8/34病毒的中值致死劑量(LDso)在成年Balb/c小鼠中測定為7.5噬斑形成單位(pfu)。圖17顯示了典型的保護試驗的結(jié)果。10個小鼠/組的小鼠用氫氧化鋁佐劑假免疫(sham-immunized)或用混合有氫氧化鋁的10i!g流感病毒M2e肽免疫原免疫。所述免疫原由表達M2e肽的乙肝病毒核心蛋白病毒樣顆粒組成。以3周間隔免疫接種小鼠兩次，4周后用4LDso適合小鼠的A/PR/8/34病毒鼻內(nèi)免疫攻擊。攻擊后第10天假免疫組所有小鼠均死亡，而免疫組只有l(wèi)只小鼠死亡。兩組中攻擊后均出現(xiàn)體重減輕，但假免疫組中體重減輕更大?？深愃频厥蛊渌鞲胁《灸ㄟm應(yīng)在小鼠肺中生長。某些情況下，病毒抹可不經(jīng)過體內(nèi)適應(yīng)即可使用，或者即使經(jīng)過肺內(nèi)連續(xù)傳代也不具有足夠的致病性。這種情況下，我們不檢測發(fā)病率和死亡率，而是檢測肺中和鼻曱組織中病毒的復(fù)制。攻擊后3天收獲組織，在lml組織培養(yǎng)基中超聲波破碎，用噬斑試驗或TCIDso試驗滴定病毒的濃度。30表1-可從中衍生表位/抗原/肽的病原體例子列表病毒黃病毒科黃熱病病毒日本腦炎病毒登革熱病毒，1、2、3和4型西尼羅病毒蟲皁傳腦炎病毒(TickBorneEncephalitisvirus)丙肝病毒(例如，基因型la,lb，2a,2b，2c，3a，4a，4b,4c和4d)乳多空病毒科(Papoviridae):乳頭瘤病毒反轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)人免疫缺陷病毒，I型人免疫缺陷病毒，II型猿免疫缺陷病毒人親T淋巴細胞病毒(Tlymphotropievirus),I&II型肝炎病毒科(Hepnaviridae)乙肝病毒小斗亥jf唐核酸病毒牙斗(Picornaviridae)曱肝病毒鼻病毒脊髓灰質(zhì)炎病毒皰滲病毒科單純皰滲病毒，I型單純皰疹病毒，II型巨細月包病毒愛潑斯坦-巴爾(EpsteinBarr)病毒水痘-帶狀皰疹病毒披膜病毒科(Togaviridae)a病毒風(fēng)滲病毒副粘病毒科呼吸道合胞體病毒副流感病毒麻滲病毒流行性腮腺炎病毒正粘病毒牙牛流感病毒絲狀病毒科(Filoviridae)馬爾堡病毒埃博拉病毒4侖習(xí)犬病毒f牛(Rotoviridae):輪狀病毒冠狀病毒科冠狀病毒腺病毒科腺病毒彈狀病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒(Rabiesvirus)細菌腸毒性大腸桿菌致腸道疾病的大腸桿菌空腸彎曲桿菌(Cam;y/ofofl"er)幽門承累才f菌(//e//co6crCerjoy/or/)傷寒沙門氏菌(5Wmowe〃a(y;/n')霍亂弧菌(c/io/e麼)艱難才炎狀芽孑包桿菌(C7oW"Wwmt/(/rz"7e)破傷風(fēng)桿菌(C7oWnWwmf"am')^f匕膿'f生鏈3求菌(iS7rep^)coccciw/joge"es)百日咳桿菌f5ord"e〃ape由肌、J刀S刀莫炎奈瑟氏菌fiVe/^wer/oJ淋病奈瑟氏菌f7Ve^en.agcmor/joe"J月^炎軍團菌fZ^g7'cme〃a打e"mo/7/^7wi1,衣原體嗜血桿菌志賀氏菌寄生蟲蟲蟲蟲蟲體子蟲曼原吸蟲形孢囊什疾血錐弓隱肺利表2-從所列病毒中選擇抗原的例子病毒抗原黃病毒黃熱病病毒核殼體，M&E糖蛋白日本腦炎病毒"登革熱病毒，1、2、3和4型"西尼羅病4"蜱傳腦炎病毒"丙肝病毒乳多空病毒科:乳頭瘤病毒反轉(zhuǎn)錄病毒牙斗人免疫缺陷病毒，I型人免疫缺陷病毒，II型猿免疫缺陷病毒人親T淋巴細胞病毒，I&II型核殼體，El&E2糖蛋白L1&L2衣殼蛋白，E6&E7轉(zhuǎn)化蛋白(致癌基因)gag,pol,vif,tat，vpu,env,nefgag,pol,env表3-所列病毒/抗原的B細胞和T細胞表位的例子<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>表4.免疫接種組(腹膜內(nèi)研究)<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>表4注腳(1)ACAM-FluA是現(xiàn)有的一種通用A型流感疫苗候選物，基于攜帶3拷貝23AAM2-e肽的乙肝病毒核心抗原(HBc);用作黃金標準(goldenstandard);劑量=每只小鼠10|ug。(2)HBcAg是一種"棵，，HBc抗原；用作ACAM-FluA的載體對照；劑量=每只小鼠10pg。(3)HRV14是從pWR3.26感染性克隆(ATCC)中產(chǎn)生的"野生型，，HRV14;用作HRV14-M2e(17AA)的載體對照。(4)HRV14M2e(17AA)是在VP2的第159位和第160位氨基酸之間(NimII位點)攜帶QPASLLTEVETPIRNEWGSR序列的HRV14病毒。該插入物的頭三個氨基酸(QPA)代表如前所述選自HRV14M2eXXX(17AA)文庫的獨特接頭。(5)ADJ二佐劑(所有免疫中均使用鋁)(6)所有組均采用腹膜內(nèi)免疫。表5.免疫接種組f鼻內(nèi)研究)<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>(1)ACAM-FluA是現(xiàn)有的一種通用A型流感疫苗候選物，基于攜帶3拷貝23AAM2-e肽的乙肝病毒核心抗原(HBc);用作黃金標準(goldenstandard);劑量=每只小鼠10|tig。(2)HRV14是從pWR3.26感染性克隆(ATCC)中產(chǎn)生的"野生型，，HRV14;用作HRV14-M2e(17AA)的載體對照。(3)HRV14M2e(17AA)是在VP2的第159位和第160位氨基酸之間(NimII位點)攜帶QPASLLTEVETPIRNEWGSR序歹'J的HRV14病毒。該插入物的頭三個氨基酸(QPA)代表如前所述選自HRV14M2eXXX(17AA)文庫的獨特接頭。("AD卜佐劑(LT-熱不穩(wěn)定大腸桿菌毒素)(6)所有組均采用鼻內(nèi)免疫。(7)第3、4、5和6組用1()8pfu/劑的相應(yīng)病毒免疫接種。其它實施方式本說明書中引用的所有出版物和專利均通過參考納入本文，如同具體和單獨地說明將各獨立的出版物或?qū)＠ㄟ^參考納入本文一樣。本文使用單數(shù)形式，例如"一種"和"這種"，不排除表示相應(yīng)復(fù)數(shù)形式，除非上下文有其它明確表示。雖然為使本發(fā)明能被清楚地理解，以闡釋和舉例的方式詳細描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)，可對本發(fā)明進行一些變化和改動而不脫離所附權(quán)利要求書的精神或范圍。其它實施方式在以下所述權(quán)利要求中。<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>序列附錄2流感病毒T細胞表位表l.A型流感病毒核蛋白的CTL表位<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>參考文獻(1)McMlohael，A.J.,Gotah,F.M.&Rothbard,J.HLAB37determinesaninfluenzaAvirusnucleoproteinepitopesrecognizedbyhumancytotoxicTlymphocytes(HLAB37決定了由人細月包毒T淋巴細胞識別的A型流感病毒核蛋白表位).J.Bxp.Med，164,1397-1406，1986.(2)Townsend，A.R.M.,Rothbard,J.,Gotoh,F.M,,Bahadur,Q.,Wraith，D.&McMichael,A.J.TheetipoesofinfluenzanucleoproteinrecognizedbycytotoxioTlymphocytescanbedefinedwithshortsyntheticpeptides(由人細月包毒T'淋巴細月包識別的流感病毒核蛋白表位可用短合成肽確定).Cell44,959-968，1986.(3)Bastin,J.,Rothbard,J.,Davey,J.,Jones,I&Townsend,A.UseofsyntheticpeptidesofinfluenzanucleoproteintodefineepitopesrecognizedbyclassI-restrictedcytotoxioTlymphocytes(用流感病毒核蛋白的合成肽確定I型限制性細胞毒T淋巴細胞識別的表位)丄Exp.Med,165，1508-1223，1987.(4)Gotch,F.，Rothbard,Hciwland，IL，Townsend,A.&McMichael，ACytotoxicTlymphocytesrecognizeafragmentofinfluenzavirusmatrixproteininassociationwithHLA-A2(人纟田胞毒T淋巴細胞識別與HLA-A2相關(guān)的流感病毒核蛋白片段).Nature326,881-882,1987.(5)Bodmer，H.C,Pemberton，R,M,Rothbard,J.B.&Askcmas，B.A.EnhancedRecognitionofaModifiedPeptideAntigenbyCytotoxicTCellsSpecificforInfluenzaNuoleoprotein(流感病毒核蛋白特異性細胞毒T淋巴細胞對修飾肽的識別增強).Cell52,253-258,1988.(6)Ceppelini，R.,Fmmentn.G.,Ferrara,0.B.，Tosi,KJ,Chersi，A.&Perais，B.BindingoflabelledinfluenzamatrixpeptidetoHLADRinlivingBlymphoidcells(在活B淋巴樣細胞中的標記的流感病毒基質(zhì)肽與HLADR的結(jié)合).Nature339,392-394,1989.(7)Sweeter,M.T.，Morrison,L.A.Braciale,V.L.&Brariale,T:J.Recognitionofpre-processedendogenousantigenbyclassIbutnotclassIIMHC-restrictedTcells(是I類而不是II類MHC-限制性T細胞識別域加工的內(nèi)源抗原).Nature，342,180-182,1989.(8)Gao，X-M,,Liew,F.Y.&The,J.P.IdentificationandCharacterizationofTHelperEpitopesintheNueleoproteinofInfluenzaAVirus(A型流感病毒核蛋白中T輔助細胞表位的鑒別和鑒定片段).J.Immunol143，3007-3014，1989.(9)Rotzschke,O.，F(xiàn)aBc,IL,Deres，KX,Schfld，H.,Norda,M,Metzger,J.Jung,G.&Rammensee,H.G.IsolationandanalysisofnaturallyprocessedviralpeptidesasrecognizedbycytotoxicT-cels(細胞毒T細胞識別的自然加工病毒肽的分離與分析).Nature348,252-254,1990.(10)Milligan,G.N"Morrison,L.A"Gorka,J,Braciale,V.L.&Braciale,T.J.TneRecognitionofaViralAntigenicMoietybyClaasIMHC-RestrictedCytolyticTLymphocytesisLimitedbytheAvailabilityoftheEndogenouslyProcessedAntigen(I類MHC-卩艮制性細胞毒T淋巴細胞對病毒抗原部分的識別受內(nèi)源性加工的抗原有效性的限制).J，Immunol.145,3188-3193，1990.(11)Brett,S.J.,Blan,J,Hughes-Jenkms,C.M,Rhodes,J.，Liew，F(xiàn).Y.&Tite，J.P.HumanTCellRecognitionofInfluenzaANucleoprotein(A型流感病毒核蛋白的人T細胞識別).SpecificityandGeneticRestrictionofImmunodominantTHelperCellEpitopes(免疫顯性T輔助細胞表位的特異性和遺傳限制).J.Immunol.147，_984-991,1991.(12)Bednarek，M.A.,Sa歸a,S.Y.，，Gammon,M.C,Porter,G.，Tanhankar,S.，Williamson,A.R.&Zweerink,H.J.Theminimumpeptideetitopefromtheinfluenza-virusmatrixprotein(流感病毒基質(zhì)蛋白的最小月太表^f立).ExtraandintracellularloadingofHLA-A2(HLA-A2的額外和細胞內(nèi)裝載).J.Immunol.147,4047-4053，1991.(13)Cer飄dolo，V，tse,A.G.D.，Salter,R.D.，parham，P&Townsend，A.CD8independenceandspecificityofcytotoxicT-lymphocytesrestrictedbyHLAAw68.1(HLAAw68.1限制的細胞毒T淋巴細胞的CD8獨立性和特異性).Proc.Roy.SecLond.SeriesBboilSci.244,169-177,1991.(14)DiBrino,M.,Tuuchida,T.Turner,R.V,Parker,ELC,Coligan,J.E.&Biddison，W.B.HLA-AlandHLA-A3T-cellepitopesderivedfrominfiuenza-vimsproteinspredictedfrompeptiebindingmotifs(由肽結(jié)合基序預(yù)測的流感病毒蛋白衍生的T-細胞表位)J.Immunol.151,5930-5935,1993.(15)Dong,T.,Boyd,D.,Rosenberg,W.,Alp,N,,TaMgucM,M.,McMJchael，A.&Rowland-Jones,S.AnHLA-B35-restrictedepitopemodifiedatananchorresidueresultsinanantagonistpeptide(在錨殘基的HLA-B35限制性表位修飾產(chǎn)生拮抗劑肽).Eur.J.Immunol.26,335-339，1996.(16)Parker,C.E.&Gould,K.G.InfluenzaAvims.AmodelforviralantigenpresentationtocytotoxicTlymphocytes(病毒抗原遞呈于細月包毒T'淋巴細月包的才莫式).SeminarsinVirology7,61-73,1996。序列附錄3人鼻病毒14(HRV14);通過以下序列(SEQIDNO:50)中核苷酸629-7168的翻譯獲得所編碼的氨基酸序列。1ttaaaacagcggatgggtatcccaccattcgacccattgggtgtagtactctggtactat61gtacctttgtacgcctgtttctccccaaccacccttccttaaaattcccacccatgaaac121gttagaagctgtacaataggtggrcgccatatccaatggtgtctatgtaca181agcacttctgtttccccggagcgaggtataggctgtacccgcctttaacc241gttatccgccgtaacagttagtaccatcttgttcttgact301tcaggtggattttccctccactagtttggtcgatgaggctaggaattccccacgggtgac361cgtgtcctagcctgcgtggcggccaacccagcttatgctgggacgcccttttaaggacat421ggtgtgasgactcgcatgtgcttggttgtgagtcctccggcccctgaatgcggctaacct481taaccctggagccttatgccacgstccagtggttgtaaggcaactccggg541acgggaccgactactttgggtgtccgtgtttctcatttttcttcatattgtcttatggtc601acagcatatatatacatatactgtgatcatgggcgctcsggtttctacac661atctcacgaattttgaccaatggstcaaatcagactttcacagttataaa721ttactataaggatgcagcaagtacatcatctcactgtcaatggacccatc781taagtttacagaaccagttaaagatctcatgcttasgggtgcaccagcattgaattcacc841caatgttgaggcctgtggttatagtgatagstcacactcgggaattcaac901ccaacgctgttgtgtgttatgctgaatggccagagtacct961tccagatgtggacgctagtgatgtcaataaccagaicacttctgtctgtag1021gttttacacattggatagt這sgacatggacaacaggttctaaaggctggtgctggaaatt1081accagatgceictcaaiagatatgggtgtgttatgtttttccactcactagg1141tacac這gtacacgttcagtgc站tgccacagcggttgtct1201acttgtagttgtaataccagggcttcacatatgtttcagt1261taaatacacattcacgcatccaggtgaacgtggtateigstttatcatctgcaaatgaagt1321gtcaaggatgtcaitatacaatatgaatggtactttattaggaaatctgct1381C3ttttCCCtcaccagttcaaaccaataattagtgatacc1441atacataaactcagtacccattgattcaatg3c3cgtc3caacaatgtctcactgstggt1501C3tCCCtSttgcccctcttacagtaccaacccctcactcccta仁aacagt1561cacaatagcacctatgtgcactgagttctctgggataa的tccasgtcsattgtgccaca1621aggtttgccaactacaactttgccggggtcaggacaattcttgaccacagatgacaggca1681atcccccagtgcactgccaaattatgagccaactccaagaatacacatac1741tcataacttgctagaaattatacaggtagatacactcattcctatgaacaacacgcatac1801aaaagatgaggttaacagttacctcataccactaaatgcaaacaggcaaaatgagcaggt1861ttttgggacaiaacctgtttattggtgatggggtcttcaaaactactcttctgggtgaaat1921tgttcagtactatacacattggrtctggatcacttagattctctttgatgtatactggtcc"81tgccttgtccsgtgcta站ctcattctagcatacaccccgcct的tgctcgt的tccaca2041ggacaggagagaagcaatgctaggtactcatgttgtctgggatattggtctgcaatccac2101catagtaatgac3ataccatggacatcaggggtgcagtttagatatactgatccagatac2161gctggctttctatcatgttggtatcaaacttctcttatacttcccccaga2221aacgaccggccaggtctacttattatcattcataagtgcatgtccagatttt站gctt3g2281gctgatgaaagaitactcaasictatctcacagactgttgcactcactgaaggcttaggtga2341tgsattagaagaagtcatcgttgagaaaacgtggcctcaatctcatctgg2401tccaaaacactccccatactgaaacagg的ccacsstgcc2461tgttcttccatcagacagcatagaaaccag33ct3cctacatgcactttaatggttcaga2521aactgatgtaigaatgctttttgggtcgtgcagcttgtgtgcatgtaactg2581caaagatgctataaitcacagttgttcaatgattggaaaat2641caacctgtccagccttgtccgaaactagaactcttcacttatgttaggtt2701tgaittctgagtatsicc3tactggccactgcatctc站cctgattcagcaaactattcaag2761caatttggtggtcc3agccatgtatgttccacctggtgccccgsLatcceiaaagagtggga2821cgattacacatggcaaagtgCttC333CCCcagtgtattcttc站ggtgggggatacatc2881caggtttagtgtgccttsitgtaggattggcatcagcatataattgtttttatgatggtta2941ctcacatgatgatgcagaaactcagtatggcataactgttctaaaccatatgggtagtat3001ggcattcagaatagtaaatgaacatgatgaacata站sctcttgtcaagatcagagttts3061tcacagggcaaagcacgttgaagcatggattccaagagcacccagagcactaccctacac3121atcaatagggCgCSC333ttatcctaagaagtaattaagaagagg33agg47<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>4861aagtga仁ttctgcaaattacagattccctagaaacactgtttcaaggacc4921agtgtataaattgatgtttgcctccagaatgtatcaacga4981tttactgaaatctgtagattcagaagagattaggg站tsttgtaagaagaagaaatggat5041tatacctgaaattcctaccaacatagaaagggctatgaatcaagccagcatgattattaa5101tactattctgatgtttgtcagtacattaggtattgtttatgtcatttataaattgtttgc5161ggaccatattctggtaacccgcctcacaataaactaaaagccccaacttt5221atcgcccagttgttgtgcaagagaatttgcactstccctgt5281cataatgactataacaacctcaaagggagagttc3csgggttaggcatacatgatcgtgt5341ctgtgtgatacac這gcctggtgatgatgtactsgtgaatg5401tagagttaagg3taagtac3aattagtagatccagagaaicattaatctagagcttacagt5461gttgactttaaaaaattcagagatatcaggggatttatat5521agaaggtgtggatgccactttggtagtacattcaaataactttaccaacactatcttaga5581agttggccctcaggacttattaatttgagt3gc3cccccactaacagast5641gsttcgttstgattatgcaacaaaaactgggcagtgtggaggtgtgctgtgtgctactgg5701taagatctttggtattcatgttggcggtaatggaagacaaggattttcagctcaactt站5761aaaacaatattttgtagagaaacaaggccaagt站tagctagacataaggttagggagtt5821taacatsaatccagtcaacacgcc站ccsEigtcaaaattacatcccagtgtattctatga5881tgttttcccaggtgac站ggaacctgctgtattgagtgacaatgatcccagactggaagt5941taaattgactgaatcattattctctsiagtacaaggggaatgta站tacggaacccactga6001aaatatgcttgtggctgtagaccattatgcagggcaactattatcactagataitccccacS061ttctgaacttacacta^aagaaigcattatatggagtaigstggactagaacctatagatat6121tacaaccagtgcaggatttccctatgtgagtcttgggatc6181caggacacagaaasgatgaagttttatctagacaaigtatggcattgactt6241gcctctsgttacatatattaaggatgaatt3ag3agtgttg3caaagtcc6301attgaagcctccagtttgaatgattctgttascatgagaatgaaactagg6361caacctttacaaagcattccatcaaaatccc的tgttctgactgggtcagcagtgggttg6421tgstcctgatgtgttttggtctgtcatcccttgcttaatggstgggcacctgatggcatt6481tgsttactctaattttgatgcctctttgtcaccagtttggtttgtctgtctagagaaggt49<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>權(quán)利要求1.一種包含流感病毒抗原的鼻病毒載體。2.如權(quán)利要求1所述的鼻病毒載體，其中所述鼻病毒載體對人無致病性。3.如權(quán)利要求2所述的鼻病毒載體，其中所述鼻病毒載體是人鼻病毒14(HRV14)。4.如權(quán)利要求1所述的鼻病毒載體，其中所述流感病毒抗原包含M2e肽。5.如權(quán)利要求1所述的鼻病毒載體，其中所述流感病毒抗原插入到中和免疫原位點，所述中和免疫原選自中和免疫原I(Niml)、中和免疫原II(NimII)、中和免疫原III(NimIII)、中和免疫原IV(NimIV)、或它們的組合。6.如權(quán)利要求5所述的鼻病毒載體，其中所述流感病毒抗原插入到中和免疫原II(NimII)位點。7.如權(quán)利要求6所述的鼻病毒載體，其中所述流感病毒抗原插入到NimII的第158位和第160位氨基酸之間。8.如權(quán)利要求I所述的鼻病毒載體，其中所述流感病毒抗原的一端或兩端側(cè)4妻4妾頭序列。9.如權(quán)利要求1所述的鼻病毒載體，其中所述鼻病毒載體是活的。10.如權(quán)利要求1所迷的鼻病毒載體，其中所述鼻病毒載體是滅活的。11.一種含有如權(quán)利要求1-10中任一項所述的鼻病毒載體和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的藥物組合物。12.如權(quán)利要求11所述的藥物組合物，還含有佐劑。13.如權(quán)利要求11所述的藥物組合物，還含有一種或多種其它活性成分。14.如權(quán)利要求13所述的藥物組合物，還含有與M2e序列融合的乙肝病毒核心蛋白。15.—種在受試者中誘導(dǎo)對流感病毒的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予所述受試者如權(quán)利要求11-14中任一項所述的藥物組合物。16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述受試者未患有流感病毒感染但具有患流感病毒感染的風(fēng)險。17.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述受試者患有流感病毒感染。18.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述組合物鼻內(nèi)給予所述受試者。19.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述受試者是人。20.—種制備藥物組合物的方法，包括將權(quán)利要求1所述的鼻病毒載體和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑混合。21.—種編碼如權(quán)利要求1所述鼻病毒載體的基因組或與權(quán)利要求1所述鼻病毒栽體的基因組對應(yīng)的核酸分子。22.包含插入的流感病毒抗原的NimII肽。23.—種生產(chǎn)包含流感病毒抗原的鼻病毒載體的方法，所迷方法包括以下步驟(i)產(chǎn)生基于感染性cDNA克隆的重組鼻病毒載體文庫，所述感染性cDNA克隆含有插入的流感病毒抗原序列，和(ii)從所述文庫中選擇符合以下條件的重組病毒(a)傳代后能保留插入序列，和(b)能被針對插入序列的抗體中和。24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述鼻病毒載體是人鼻病毒14(HRV14)。25.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述插入的流感病毒抗原序列插入的位點選自Niml、NimII、NimIII和NimIV。26.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述插入的流感病毒抗原序列是M2e序列。27.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述插入的流感病毒抗原序列一端或兩端側(cè)接隨機接頭序列。28.—種培養(yǎng)包含流感病毒抗原的鼻病毒載體的方法，所述方法包括在HeLa或MRC-5細胞中傳代所述載體。29.—種如本文所述的鼻病毒載體，其包含基于病原體、癌癥或過壽丈原的抗原。30.—種包含如權(quán)利要求29所述的鼻病毒載體的藥物組合物。31.—種如本文所述誘導(dǎo)對基于病原體、癌癥或過敏原的抗原的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予如權(quán)利要求29或30所述的載體或組合物。全文摘要本發(fā)明提供重組鼻病毒載體，其包含例如流感病毒抗原。本發(fā)明還提供相應(yīng)的藥物組合物和方法。文檔編號C12N7/00GK101688184SQ200780044282公開日2010年3月31日申請日期2007年10月1日優(yōu)先權(quán)日2006年9月29日發(fā)明者H·克利恩索斯,K·凱爾寧,Y·顏申請人:賽諾菲巴斯德生物制劑公司