專利名稱：蘋果花葉病毒的檢測方法、檢測用引物組及檢測用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蘋果花葉病毒的檢測方法、檢測用引物組及檢測用試劑盒。
背景技術(shù)：
蘋果花葉病毒是屬于雀麥花葉病毒(Bromovirus)屬的植物病原性病毒，廣泛地感染啤酒花(^/z/w7ws 7w/w7ws L.)和蘋果Q/a7^ i/o/Be"i'c3 Malus)。蘋果花葉病毒一旦感染啤酒花和蘋果，感染災(zāi)情主要通過機械接觸傳播而擴大。
在德國、美國、英國和捷克等啤酒花的主要生產(chǎn)國以及日本，為了防止蘋果花葉病毒引發(fā)的感染災(zāi)情，使用通過莖尖培養(yǎng)生產(chǎn)的無病毒苗來進行啤酒花的栽培。
在栽培啤酒花的農(nóng)場，定期地進行蘋果花葉病毒的感染調(diào)查，防止蘋果花葉病毒的二次感染。蘋果花葉病毒的感染調(diào)查中， 一般通過ELISA法檢測感染了啤酒花的蘋果花葉病毒。
采用ELISA法的蘋果花葉病毒的檢測方法由以下的步驟構(gòu)成在固相化
有特異性地識別蘋果花葉病毒的一級抗體的微孔板中，使檢查標本中所含的蘋果花葉病毒粒子和一級抗體反應(yīng)的步驟；清洗未與一級抗體結(jié)合的檢
查標本中的成分的步驟；使與一級抗體結(jié)合的蘋果花葉病毒粒子和經(jīng)酶標且特異性地識別蘋果花葉病毒的二級抗體反應(yīng)的步驟；清洗未與蘋果花葉病毒粒子結(jié)合的二級抗體的步驟；使酶標于二級抗體的酶和化學(xué)顯色底物或化學(xué)發(fā)光底物進行酶反應(yīng)的步驟；根據(jù)通過酶反應(yīng)得到的顯色或發(fā)光的強度，估計蘋果花葉病毒粒子的量的步驟。
非專利文獻l:Pethybridge等，2004年，澳大利亞農(nóng)業(yè)研究期刊(Australian journal of agricultural research), 55巻，765-770頁發(fā)明的揭示
然而，ELISA法中使用的識別蘋果花葉病毒的抗體的效價或特異性不足時，由于受到存在于檢查標本中的除蘋果花葉病毒以外的成分的影響，因此發(fā)生將表示蘋果花葉病毒的存在的信號評價為背景的信號或?qū)⒎翘禺愋缘慕Y(jié)合評價為表示蘋果花葉病毒的存在的信號等情況。
此外，采用ELISA法的蘋果花葉病毒的檢測方法如上所述由多個步驟構(gòu)成，各步驟必須在實驗室中確定反應(yīng)時間和清洗次數(shù)等，于相同的條件下進行操作，檢查標本數(shù)量增加時，各步驟中的操作變得煩雜，存在給正確的評價帶來障礙的傾向。
另外，ELISA法是以病毒粒子本身作為目標進行檢測的方法，因此無法
檢出病毒基因組或整合于宿主基因組的原病毒，例如在已知蘋果花葉病毒粒子的含量因高溫而顯著下降的夏季，即使是感染了蘋果花葉病毒的啤酒花也可能被判斷為可疑陽性或未檢出。
于是，鑒于上述的問題，本發(fā)明的目的在于提供不限定檢測蘋果花葉病毒的抗體的性能(效價和特異性)、檢查標本數(shù)和進行評價的場所，在栽培時、收獲時、保存時等所有季節(jié)，都可特異性且高靈敏度地檢測蘋果花葉病毒的方法。本發(fā)明的目的還在于提供用于該方法的蘋果花葉病毒的檢測用引物組及檢測用試劑盒。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供蘋果花葉病毒的檢測方法，該檢測方法包括從檢查標本提取蘋果花葉病毒的RNA的提取步驟；使用包含由序列表的序列編號1 4中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸的引物組，以所述RNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(Reverse transcription-Loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)法進行cDNA的擴增反應(yīng)的擴增步驟；在擴增步驟中發(fā)現(xiàn)包含序列表的序列編號8中所示的堿基序列的cDNA的擴增的情況下，判斷為存在蘋果花葉病毒的判斷步驟。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過利用作為等溫的基因擴增反應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法(以下記作RT-LAMP法)來擴增蘋果花葉病毒的編碼蛋白質(zhì)基因的特定區(qū)域，可以簡便且高靈敏度地進行蘋果花葉病毒的檢測。在這里，"RT-LAMP法"是指組合反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和采用LAMP法的等溫基因擴增反應(yīng)，以RNA為模板擴增與之互補的CDNA的方法。對于原理的詳細部分，記載于國際公
開第00/28082號文本。
如果按照上述檢測方法，從欲調(diào)查是否感染蘋果花葉病毒的啤酒花的組織提取RNA，在其提取液中加入包含由序列表的序列編號1 4中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸的引物組，進行采用RT-L雄P法的cDNA的擴增反應(yīng)，則可以簡便且高靈敏度地檢測蘋果花葉病毒的基因組RNA的部分序列的cDNA，能夠判斷是否感染蘋果花葉病毒。
此外，與序列表的序列編號8中所示的堿基序列互補的蘋果花葉病毒的基因組RNA的堿基序列以及由序列表的序列編號1 4中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸分別退火結(jié)合的蘋果花葉病毒的基因組RNA的堿基序列為蘋果花葉病毒的編碼蛋白質(zhì)基因的部分序列，包含這些堿基序列的蘋果花葉病毒的基因組RNA的區(qū)域適合作為用于通過RT-LAMP法擴增cDNA的靶區(qū)域。因此，通過確認是否有被擴增的cDNA，可以特異性地檢測蘋果花葉病毒的有無。
上述擴增步驟較好是使用包含由序列表的序列編號1 6中所示的堿基序列構(gòu)成的6種寡核苷酸的引物組，以所述RNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(RT-LAMP)法進行cDNA的擴增反應(yīng)的步驟。
如果在由序列表的序列編號1 4中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸的基礎(chǔ)上增加由序列表的序列編號5和6中所示的堿基序列構(gòu)成的2種寡核苷酸作為環(huán)引物來進行cDNA的擴增反應(yīng)，則可以增加DNA合成的起點，因此能夠縮短擴增時間，可實現(xiàn)更高效的蘋果花葉病毒的檢測。
此外，本發(fā)明提供包含由序列表的序列編號1 4中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸或由序列表的序列編號1 6中所示的堿基序列構(gòu)成的6種
寡核苷酸的蘋果花葉病毒的檢測用引物組。
如果從欲調(diào)查是否感染蘋果花葉病毒的啤酒花的組織提取RNA，在其提取液中加入上述引物組，進行采用RT-LAMP法的cDNA的擴增反應(yīng)，則可以簡便且高靈敏度地檢測蘋果花葉病毒的基因組RNA的部分序列的cDNA，能夠判斷是否感染蘋果花葉病毒。
此外，本發(fā)明提供蘋果花葉病毒的檢測用試劑盒，所述試劑盒包括包含由序列表的序列編號1 4中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸或由
序列表的序列編號1 6中所示的堿基序列構(gòu)成的6種寡核苷酸的蘋果花葉病毒的檢測用引物組、反轉(zhuǎn)錄酶、鏈置換型DNA聚合酶、dNTPs和緩沖液。
如果有上述檢測用試劑盒，則可以同時獲得采用RT-LAMP法的蘋果花葉病毒的檢測所需的試劑，例如在野外進行蘋果花葉病毒的檢測時，也不需要試劑的濃度調(diào)整等煩雜的操作，可以簡便地進行蘋果花葉病毒的檢測。
如果采用本發(fā)明，則不限定檢查標本數(shù)和進行評價的場所，在栽培時、收獲時、保存時等所有季節(jié)，都可特異性且高靈敏度地檢測蘋果花葉病毒。此外，本發(fā)明的蘋果花葉病毒的檢測用引物組和檢測用試劑盒可良好地用于RT-LAMP法，能夠?qū)崿F(xiàn)蘋果花葉病毒的簡便且高靈敏度的檢測。
附圖的簡單說明


圖1是表示包含由序列表的序列編號1 4中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸的引物組和蘋果花葉病毒的基因組RNA的靶區(qū)域的位置關(guān)系的圖。
圖2是表示將使用蘋果花葉病毒檢測用檢査標本的RNA稀釋試樣通過RT-LAMP法擴增而得的cDNA用限制性酶Alu I或Taq I消化，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳后的條帶圖案的凝膠照片。
實施發(fā)明的最佳方式
以下，對本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式進行詳細說明。
本發(fā)明的蘋果花葉病毒的檢測方法的特征在于，包括從檢查標本提
取蘋果花葉病毒的RNA的提取步驟；使用包含由序列表的序列編號1 4中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸的引物組，以所述RNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法進行cDNA的擴增反應(yīng)的擴增步驟；在擴增步驟中發(fā)現(xiàn)包含序列表的序列編號8中所示的堿基序列的cDNA的擴增的情況下，判斷為存在蘋果花葉病毒的判斷步驟。
"蘋果花葉病毒"是指Apple Mosaic Ilarvirus，是屬于雀麥花葉病毒屬的RNA病毒。已知蘋果花葉病毒的宿主主要是啤酒花和蘋果，感染了蘋果花葉病毒的啤酒花的球花產(chǎn)量減少，導(dǎo)致作為啤酒釀造所需的苦味物質(zhì)
6的a酸的含量下降。
作為上述檢測方法中使用的"檢査標本"，可以例舉例如植物的葉、莖、根和果實等，因采樣容易而優(yōu)選葉和果實，更優(yōu)選葉。作為采集檢查標本的時間，可以例舉例如栽培時、收獲時和保存時等。
上述提取步驟中，提取存在于被細胞壁包圍的植物細胞中的蘋果花葉
病毒的RNA，例如可以通過在蒸餾水或具有弱堿性附近的pH的緩沖液中將檢查標本以物理方式勻漿，從而提取蘋果花葉病毒的RNA。
使用的緩沖液的pH較好是例如pH8.0 pH9. 5附近，作為使用的緩沖液，可以例舉例如Tris/鹽酸緩沖液、Tris/醋酸緩沖液、磷酸緩沖液、碳酸緩
沖液、硼酸緩沖液等。此外，為了更高效地從檢查標本提取蘋果花葉病毒的RNA，適合采用從植物提取RNA的方法和提取基因組DNA的方法，這些方法記載于例如《分子克隆(Molecular cloning)》(Maniatis等，1989年，冷泉港實驗室出版社)等基因工程實驗方案中。提取RNA的方法中更優(yōu)選使用含異硫氰酸胍的緩沖液，提取基因組DNA的方法中更優(yōu)選使用含十六烷基三甲基溴化銨(以下記作CTAB)的提取緩沖液。
勻漿只要可以破壞檢査標本的細胞壁而提取存在于植物細胞中的蘋果花葉病毒的RNA即可，可以使用例如寶創(chuàng)(Polytron)勻漿器、特富龍(Teflon)
勻漿器、研缽等進行。此外，如果在凍結(jié)的狀態(tài)下對檢查標本進行勻漿，則可以更高效地破壞檢查標本的細胞壁，容易地提取存在于細胞中的蘋果花葉病毒的RNA。此外，使用上述的含異硫氰酸胍的RNA提取緩沖液或含CTAB
的基因組DNA提取緩沖液時，僅通過用旋渦攪拌器等反復(fù)進行攪拌，就可以提取存在于細胞中的蘋果花葉病毒的基因組RNA。
提取步驟中所提取的蘋果花葉病毒的基因組RNA可以通過進行醇沉淀而作為沉淀回收，置換為適合于RT-LAMP法的緩沖液，在蒸餾水或具有弱堿性附近的pH的緩沖液中提取蘋果花葉病毒的RNA時，也可以直接在以下的擴增步驟中使用。
擴增步驟中，使用由序列表的序列編號2和4中所示的堿基序列構(gòu)成的2種寡核苷酸作為引物，以提取步驟中所提取的蘋果花葉病毒的RNA為模板，進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，緊接著使用包含由序列表的序列編號1 4中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸的引物組，以反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中所得的CDNA為模板，反
復(fù)進行采用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法(以下記作LAMP法)的等溫基因擴增反應(yīng)。
擴增步驟中所實施的cDNA的擴增方法被稱為RT-LAMP法，通過同時在等
溫條件下進行由RNA合成cDNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和采用LAMP法的等溫基因擴增
反應(yīng)，可以擴增蘋果花葉病毒的基因組RNA的耙區(qū)域的部分序列的cDNA。圖1是表示包含由序列表的序列編號1 4中所示的堿基序列構(gòu)成的4種
寡核苷酸的引物組和蘋果花葉病毒的基因組RNA的靶區(qū)域的位置關(guān)系的圖。序列表的序列編號7表示蘋果花葉病毒的基因組RNA的靶區(qū)域的cDNA的
堿基序列。
由序列表的序列編號l中所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸(以下記作ApMV-FIP引物)為FIP引物，可以如下進行設(shè)計在3，末端側(cè)具有作為與F2c區(qū)域互補的序列的F2區(qū)域，在5'末端側(cè)具有與Flc區(qū)域相同的序列。
由序列表的序列編號2中所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸(以下記作ApMV-BIP引物)為BIP引物，可以如下進行設(shè)計在3'末端側(cè)具有作為與B2c區(qū)域互補的序列的B2區(qū)域，在5'末端側(cè)具有與Blc區(qū)域相同的序列。
由序列表的序列編號3中所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸(以下記作ApMV-F3引物)為F3引物，可以如下進行設(shè)計具有作為與F3c區(qū)域互補的序列的F3區(qū)域。
由序列表的序列編號4中所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸(以下記作ApMV-B3引物)為B3引物，可以如下進行設(shè)計具有作為與B3c區(qū)域互補的序列的B3區(qū)域。
采用RT-LAMP法的cDNA的擴增反應(yīng)如下進行即可將含有提取步驟中所提取的蘋果花葉病毒的RNA、包含由序列表的序列編號1 4中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸的引物組、反轉(zhuǎn)錄酶、鏈置換型DNA聚合酶、dNTPs(dATP、 dTTP、 dGTP和dCTP)和緩沖液的反應(yīng)液在等溫條件下靜置一定時間。
溫度較好是5(TC 75t:，更好是60。C 65'C，進一步更好為65'C。靜置時間在15分鐘以上就可檢出cDNA的擴增，但較好是15分鐘 1小時，更好是20分鐘 40分鐘。作為反轉(zhuǎn)錄酶、鏈置換型DNA聚合酶、dNTPs和緩沖液，可以使用例如Loopamp RNA擴增試劑盒(榮研化學(xué)株式會社(栄研化學(xué)社)制)中所包括的各試劑。
此外，擴增步驟中，較好是使用增加了由序列表的序列編號5和6中所示的堿基序列構(gòu)成的2種寡核苷酸所構(gòu)成的引物的由序列表的序列編號1 6中所示的堿基序列構(gòu)成的6種寡核苷酸的引物組來代替包含由序列表的序列編號1 4中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸的引物組。
由序列表的序列編號5中所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸(以下記作ApMV-環(huán)F引物)和由序列表的序列編號6中所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸(以下記作ApMV-環(huán)B引物)是具有與成為擴增反應(yīng)的起點的啞鈴結(jié)構(gòu)的5，末端側(cè)的環(huán)的單鏈部分互補的序列的環(huán)引物。ApMV-環(huán)F可以如下進行設(shè)計具有與圖中的F1區(qū)域和F2區(qū)域之間的序列互補的序列；ApMV-環(huán)B可以如下進行設(shè)計具有與圖中的B1區(qū)域和B2區(qū)域之間的序列互補的序列。通過使用ApMV-環(huán)F和ApMV-環(huán)B，可以增加DNA合成的起點，擴增效率提高，能夠?qū)U增所需的時間縮短至1/3 1/2。
判斷步驟中，在上述擴增步驟中發(fā)現(xiàn)重復(fù)包含序列表的序列編號8中所示的堿基序列的cDNA的擴增的情況下，可以判斷為存在蘋果花葉病毒。
序列表的序列編號8中所示的堿基序列是蘋果花葉病毒的基因組RNA的靶區(qū)域的部分序列的cDNA,是通過采用上述引物組的RT-L細P法被反復(fù)擴增的核心序列。與該核心序列互補的蘋果花葉病毒的基因組RNA的堿基序列以及由序列表的序列編號1 4中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸分別退火結(jié)合的蘋果花葉病毒的基因組RNA的堿基序列為蘋果花葉病毒的編碼蛋白質(zhì)基因的部分序列，包含這些堿基序列的蘋果花葉病毒的基因組RNA的區(qū)域適合作為用于通過RT-LAMP法擴增cDNA的靶區(qū)域。因此，通過確認是否有被擴增的cDNA，可以特異性地檢測蘋果花葉病毒的有無。
蘋果花葉病毒的有無的判斷例如可如下進行通過肉眼觀察進行采用RT-LAMP法的cDNA的擴增反應(yīng)后的反應(yīng)液，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)液產(chǎn)生白濁的情況下，判斷為存在蘋果花葉病毒。此外，可如下進行在該反應(yīng)液中加入熒光嵌入劑，在UV照射下發(fā)現(xiàn)表示cDNA擴增的發(fā)光的情況下，判斷為存在蘋果花葉病毒。
更細致地判斷蘋果花葉病毒的有無時，例如可如下進行將所擴增的
cDNA用存在于序列表的序列編號8中所示的堿基序列中的限制性酶Alu I或 Taql消化并進行電泳，在分別發(fā)現(xiàn)134bp和75bp的2個DNA片段或發(fā)現(xiàn)209bp 的DNA片段的情況下，判斷為存在蘋果花葉病毒。
本發(fā)明的蘋果花葉病毒的檢測用引物組的特征在于，包含由序列表的 序列編號1 4中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸，或包含由序列表的序 列編號1 6中所示的堿基序列構(gòu)成的6種寡核苷酸。
上述的引物組可以基于序列表的序列編號1 6各自的堿基序列信息通 過DNA合成機合成。
此外，使用本發(fā)明的蘋果花葉病毒的檢測方法所需的各種試劑類可以 預(yù)先封裝而試劑盒化。具體來說，能夠以試劑盒的形式提供包含由序列表 的序列編號1 4中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸或由序列表的序列 編號1 6中所示的堿基序列構(gòu)成的6種寡核苷酸的引物組、作為核酸合成的 底物的4種dNTPs(dATP、 dCTP、 dGTP和dTTP)、由RNA合成cDNA的反轉(zhuǎn)錄酶、 具有鏈置換活性的鏈置換型DNA聚合酶、提供適于酶反應(yīng)的條件的緩沖液、 作為輔助因子的鹽類(鎂鹽或錳鹽等)、使酶和模板穩(wěn)定的保護劑以及根據(jù) 需要采用的反應(yīng)生成物的檢測所需的試劑類。
試劑盒中可以包含用于確認RT-LAMP反應(yīng)通過本發(fā)明的引物正常地進 行的陽性對照。作為陽性對照，可以例舉例如包含被本發(fā)明的引物擴增的 區(qū)域的DNA。
實施例
以下，例舉實施例對本發(fā)明進行更詳細的說明，但本發(fā)明并不受到這 些實施例的限定。
(實施例l)采用RT-LAMP法的蘋果花葉病毒的檢測 l)蘋果花葉病毒的檢測中使用的啤酒花組織樣品的制備 將從來源于感染了蘋果花葉病毒的啤酒花的腋芽的啤酒花試管苗除去 根而得的樣品作為蘋果花葉病毒檢測用檢查標本，將從無病毒的啤酒花試 管苗除去根而得的樣品作為對照檢査標本，由這些檢查標本分別制備啤酒花組織樣品。
蘋果花葉病毒檢測用檢查標本和對照檢查標本分別用液氮冷凍，用研 缽粉碎至組織形成粉末狀，向其中加入相對于檢查標本重量5倍量的蒸餾水 而懸浮。這樣得到的蘋果花葉病毒檢測用檢査標本和對照檢査標本的懸浮 液分別作為啤酒花組織樣品用于以下的實驗。
2) RNA試樣的制備
向各啤酒花組織樣品(各40u L)分別加入160ixL的2XCTAB溶液(2X十 六垸基三甲基溴化銨、20mMEDTA、 1. 4MNaCl、 5% 0 -巰基乙醇、0. lMTris， pH 9.5)，在65。C保溫20分鐘。然后，以15000轉(zhuǎn)離心分離IO分鐘，將殘渣 作為沉淀除去，將其上清移至新的微量離心管。向其中加入200ixL的異丙 醇混合，以15000轉(zhuǎn)離心分離10分鐘，從而將RNA作為沉淀回收，用70%乙 醇清洗后風(fēng)干，用40uL滅菌水溶解而制成RNA試樣。
這樣得到的蘋果花葉病毒檢測用檢查標本的RNA試樣和對照檢査標本 的RNA試樣分別用滅菌水梯度稀釋至103倍、104倍、105倍、106倍和107倍，將 其中的2n L作為RNA稀釋試樣供于采用RT-LAMP法的cDNA的擴增反應(yīng)。RNA稀 釋試樣分別相當于啤酒花組織樣品的2X1()4分之一、2X105分之一、2X106 分之一、2X1()7分之一和2X108分之一。
3) RT-LAMP法中使用的引物
引物采用作為FIP引物的ApMV-FIP引物(序列編號l)、作為BIP引物的 ApMV-BIP引物(序列編號2)、作為F3引物的ApMV-F3引物(序列編號3)、作為 B3引物的ApMV-B3引物(序列編號4)、作為環(huán)引物的ApMV-環(huán)F(序列編號5)和 ApMV-環(huán)B(序列編號6)。通過使用這6種引物進行采用RT-LAMP法的cDNA的擴 增反應(yīng)，可以擴增重復(fù)包含作為蘋果花葉病毒的編碼蛋白質(zhì)基因的cDNA的 部分序列的序列表的序列編號8中所示的堿基序列的cDNA。
4) 采用RT-LAMP法的cDNA的擴增
采用RT-LAMP法的cDNA的擴增使用Lo叩amp RNA擴增試劑盒(榮研化學(xué) 株式會社制)進行。具體來說，按照制造商的實驗方案，向反應(yīng)液中分別加 入經(jīng)梯度稀釋的上述RNA稀釋試樣(2u 1)，向其中加入上述的6種引物、反 轉(zhuǎn)錄酶、鏈置換型DNA聚合酶、dNTPs和緩沖液，在65'C靜置50分鐘。5)經(jīng)擴增的cDNA的檢測
確認采用RT-LAMP法的cDNA的擴增的情況下，游離的焦磷酸與鎂離子反 應(yīng)而形成焦磷酸鎂，因此反應(yīng)液產(chǎn)生白濁時可判定為發(fā)現(xiàn)cDNA的擴增。通 過上述的采用RT-LAMP法的cDNA的擴增所擴增的cDNA是相當于蘋果花葉病 毒的編碼蛋白質(zhì)基因的cDNA的部分序列的序列表的序列編號8中所示的堿 基序列，因此反應(yīng)液產(chǎn)生白濁時判斷為存在蘋果花葉病毒。
表1為使用蘋果花葉病毒檢測用檢查標本的RNA稀釋試樣和對照檢查標 本的RNA稀釋試樣通過RT-LAMP法進行蘋果花葉病毒的檢測的結(jié)果。
自啤酒花組織樣品 的稀釋倍數(shù)2X1042X1052X1062X1072X108
啤酒花潛隱病毒檢 測用檢查標本白濁白濁白濁白濁ND
對照檢查標本NDNDNDNDND
ND:表示未發(fā)現(xiàn)白濁
其結(jié)果為，對照檢查標本的RNA稀釋試樣都未檢出蘋果花葉病毒，但對 于蘋果花葉病毒檢測用檢査標本的RNA稀釋試樣，即使將啤酒花組織樣品稀 釋2X10'倍也可以檢出蘋果花葉病毒。根據(jù)以上的結(jié)果，明確采用RT-LAMP 法的檢測中，僅感染了蘋果花葉病毒的蘋果花葉病毒檢測用檢查標本檢出 了蘋果花葉病毒，示意檢測靈敏度遠遠高于后述的采用ELISA法的檢測。
然而，RT-LAMP法中，即使在cDNA被非特異性地擴增的情況下也發(fā)現(xiàn)反 應(yīng)液的白濁，因此通過以下的實驗進行確認試驗。具體來說，使用蘋果花 葉病毒檢測用檢查標本的RNA稀釋試樣的采用RT-L認P法的cDNA的擴增反應(yīng) 中，將luL發(fā)現(xiàn)了cDNA的擴增的各反應(yīng)液用限制性酶AluI或TaqI消化， 用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，分別確認是否檢出134bp和75bp的2個DNA片段 或209bp的DNA片段。Alu I禾BTaq I存在于序列表的序列編號8中所示的堿基 序列中，因此通過用限制性酶Alu I或Taq I消化，可以將通過RT-LAMP法擴 增了的cDNA分別作為134bp和75bp的2個DNA片段或209bp的DNA片段檢出。電 泳后的凝膠通過在溴化乙啶中浸漬10分鐘而將被分離的DNA片段染色，通過 照射紫外線，可以觀察到DNA條帶。
12圖2是表示將使用蘋果花葉病毒檢測用檢査標本的RNA稀釋試樣通過 RT-LAMP法擴增而得的cDNA用限制性酶Alu I或Taq I消化，進行聚丙烯酰胺 凝膠電泳后的條帶圖案的凝膠照片。
其結(jié)果為，采用RT-LAMP法的cDNA的擴增反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)白濁，表l中檢出 了蘋果花葉病毒的各反應(yīng)液中的cDNA通過用限制性酶AluI或Taq I消化都 分別檢出134bp和75bp的2個DNA片段或209bp的DNA片段的條帶。將用Taq I 消化了的cDNA進行電泳而得的泳道的凝膠中，除了209bp的主條帶之外，還 發(fā)現(xiàn)155bp、 98bp、 53bp的次條帶，由于采用LAMP法的cDNA的擴增反應(yīng)中， 靶區(qū)域的部分序列的cDNA在相連的狀態(tài)下被擴增，因此除了209bp的主條帶 之外還發(fā)現(xiàn)155bp、 98bp、 53bp的次條帶的結(jié)果可以說是正確的結(jié)果。
根據(jù)以上的結(jié)果，上述的實施例l中，證明通過RT-LAMP法發(fā)現(xiàn)了表示 cDNA的擴增的白濁的情況下，并不是發(fā)生了非特異性的cDNA的擴增，而是 蘋果花葉病毒的編碼蛋白質(zhì)基因的一部分特異性地擴增，明確蘋果花葉病 毒的檢測是取決于蘋果花葉病毒的存在的結(jié)果。
因此，示意實施例1中所示的采用RT-LAMP法的蘋果花葉病毒的檢測方 法是靈敏度遠遠高于后述的釆用ELISA法的蘋果花葉病毒的檢測的方法，是 僅通過視覺上判斷反應(yīng)液的白濁就可以容易地判定蘋果花葉病毒的有無的 方法。
(比較例l)采用ELISA法的蘋果花葉病毒的檢測
1) 蘋果花葉病毒的檢測用ELISA用板的制作
將特異性地識別蘋果花葉病毒的抗蘋果花葉病毒抗體(阿格利雅公司 (7夕、、U了社)，美國)用O. 05MSCB緩沖液(1. 59g/LNa2C03、 2. 93g/L NaHCO" pH9.6)稀釋至lu g/mL，以每孔O. 2mL注入96孔微孔板，在37"C靜置4小時。 然后，用O. 02MPBS-T(8. Og/LNaCl、 0. 2g/L歸04、 2. 9g/L Na2HP04 12H20、 0.2g/L KC1、 0.5mL/L吐溫-20， pH7. 4)以5分鐘的間隔清洗5次，將這樣得 到的抗體固相板作為蘋果花葉病毒的檢測用ELISA用板用于以下的試驗。
2) 采用ELISA法的檢測
向?qū)嵤├齦中記載的由蘋果花葉病毒檢測用檢查標本和對照檢查標本 的懸浮液制成的各啤酒花組織樣品(各40uL)加入160uL蒸餾水，再加入20L的PBS-T/PVP溶液(16. 0g/L NaCl、 0. 4g/L KH2P04、 5. 8g/L Na2HP04 1 2H20、 0. 4g/L KC1、 1. OmL/L吐溫-20、 40g/L聚乙烯吡咯烷酮，pH7.4)混合， 以15000轉(zhuǎn)離心分離10分鐘，回收其上清作為蛋白質(zhì)試樣(200nL)。
然后，蘋果花葉病毒檢測用檢査標本和對照檢查標本的蛋白質(zhì)試樣分 別用PBS-T/PVP溶液梯度稀釋至10倍、102倍、103倍，分別取200uL作為蛋 白質(zhì)稀釋試樣供于ELISA。未稀釋的蛋白質(zhì)試樣相當于啤酒花組織樣品的二 分之一，梯度稀釋至10倍、102倍、103倍的蛋白質(zhì)稀釋試樣分別相當于啤酒 花組織樣品的20分之一、2X1()2分之一、2X103分之一。
接著，將蛋白質(zhì)試樣和各蛋白質(zhì)稀釋試樣(各200 u L)分別添加至上述 的ELISA用板，靜置一晚。用0.02M PBS-T以5分鐘的間隔清洗5次，以每孔2 OOwL加入將堿性磷酸酶標記的抗蘋果花葉病毒抗體(阿格利雅公司，美國) 用0. 02M PBS-T稀釋1000倍而得的試劑，在37t:靜置3小時。然后，將ELISA 用板的各孔用0.02M PBS-T以5分鐘的間隔清洗5次，加入200 u L的底物溶液 (10%二乙醇胺、lg/L對硝基苯磷酸二鈉)，在室溫下使其反應(yīng)一定時間， 測定405nm的吸光度。
表2為使用蘋果花葉病毒檢測用檢查標本的蛋白質(zhì)試樣及各蛋白質(zhì)稀 釋試樣以及對照檢查標本的蛋白質(zhì)試樣及各蛋白質(zhì)稀釋試樣通過ELISA法 進行蘋果花葉病毒的檢測的結(jié)果。
自啤酒花組織樣品 的稀釋倍數(shù)2202X1022X103
啤酒花潛隱病毒檢 測用檢查標本白濁白濁NDND
對照檢查標本NDNDNDND
ND:表示未發(fā)現(xiàn)白濁
其結(jié)果為，對照檢査標本的RNA稀釋試樣都未檢出蘋果花葉病毒，但對
于蘋果花葉病毒檢測用檢查標本的蛋白質(zhì)試樣及各蛋白質(zhì)稀釋試樣，至將 啤酒花組織樣品稀釋20倍而得的試樣為止，都可以檢出蘋果花葉病毒。根 據(jù)以上的結(jié)果，可以確認采用ELISA法的檢測中，僅感染了蘋果花葉病毒的 蘋果花葉病毒檢測用檢査標本檢出了蘋果花葉病毒，正常地檢出了蘋果花
14葉病毒，但明確與上述的采用RT-LAMP法的檢測相比，檢測靈敏度至少低106 倍(100萬倍)。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性
如果采用本發(fā)明，則不限定檢查標本數(shù)和進行評價的場所，在栽培時、 收獲時、保存時等所有季節(jié)，都可特異性且高靈敏度地檢測蘋果花葉病毒。 此外，本發(fā)明的蘋果花葉病毒的檢測用引物組及檢測用試劑盒可良好地用于
RT-LAMP法，能夠?qū)崿F(xiàn)蘋果花葉病毒的簡便且高靈敏度的檢測。
權(quán)利要求
1.蘋果花葉病毒的檢測方法，其特征在于，包括從檢查標本提取蘋果花葉病毒的RNA的提取步驟；使用包含由序列表的序列編號1～4中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸的引物組，以所述RNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法進行cDNA的擴增反應(yīng)的擴增步驟；在所述擴增步驟中發(fā)現(xiàn)包含序列表的序列編號8中所示的堿基序列的cDNA的擴增的情況下，判斷為存在蘋果花葉病毒的判斷步驟。
2. 如權(quán)利要求l所述的檢測方法，其特征在于，所述擴增步驟是使用 包含由序列表的序列編號1 6中所示的堿基序列構(gòu)成的6種寡核苷酸的引 物組，以所述RNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法進行cDNA的擴增反 應(yīng)的步驟。
3. 蘋果花葉病毒的檢測用引物組，其特征在于，包含由序列表的序列 編號1 4中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸。
4. 蘋果花葉病毒的檢測用引物組，其特征在于，包含由序列表的序列 編號1 6中所示的堿基序列構(gòu)成的6種寡核苷酸。
5. 蘋果花葉病毒的檢測用試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求3或4 所述的引物組、反轉(zhuǎn)錄酶、鏈置換型DNA聚合酶、dNTPs和緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明提供蘋果花葉病毒的檢測方法，該檢測方法包括從檢查標本提取蘋果花葉病毒的RNA的提取步驟；使用包含由序列表的序列編號1～4中所示的堿基序列構(gòu)成的4種寡核苷酸的引物組，以所述RNA為模板，通過RT-LAMP法進行cDNA的擴增反應(yīng)的擴增步驟；在擴增步驟中發(fā)現(xiàn)包含序列表的序列編號8中所示的堿基序列的cDNA的擴增的情況下，判斷為存在蘋果花葉病毒的判斷步驟。
文檔編號C12N15/09GK101563452SQ20078004424
公開日2009年10月21日 申請日期2007年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月30日
發(fā)明者岡田行夫, 糸賀裕 申請人:札幌啤酒株式會社