專利名稱：：由gras表達(dá)的食品級嗜熱性阿拉伯糖異構(gòu)酶以及使用其制備塔格糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種嗜熱性阿拉伯糖異構(gòu)酶和使用其制備塔格糖的方法，更準(zhǔn)確地，涉及來自嗜熱脂肪土芽胞桿菌(Geo6ac/〃wWewoAem印/n7w)DSM22的編碼阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因，含有該基因的重組表達(dá)載體，由從所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的重組GRAS(通常認(rèn)為是安全的，GenerallyRecognizedAsSafe)菌株制備食品級嗜熱性阿拉伯糖異構(gòu)酶的方法，以及通過使用所述酶由半乳糖制備塔格糖的方法。
背景技術(shù)：
：隨著對舒適或者健康生活的興趣日益增加，塔格糖已經(jīng)被建議作為糖的替代物，因為其具有更小的副作用，并且糖是引起各種成人疾病的主要因素之一。塔格糖是半乳糖的異構(gòu)體并且已知具有與果糖類似的生理化學(xué)性質(zhì)。塔格糖是天然的低熱量糖，并且近來己經(jīng)由美國FDA認(rèn)證為GRAS(GenerallyRecognizedAsSafe),于是目前其被允許作為加甜劑被加入到食品、飲料、保健品、飲食添加劑等中。GRAS表示通常被認(rèn)可為安全的物質(zhì)，所述安全由具有足夠經(jīng)驗和技能的專業(yè)人員通過科學(xué)程序并在指示條件和使用目的下檢查來進(jìn)行判斷。GRAS是僅在美國使用來評估食品和食品化學(xué)物質(zhì)的安全性(在一定條件下)的獨特系統(tǒng)，但其在世界范圍內(nèi)被認(rèn)可。塔格糖還能通過半乳糖的異構(gòu)化來生產(chǎn),該異構(gòu)化為使用催化劑制造異構(gòu)體的化學(xué)方法，或者使用異構(gòu)酶對半乳糖進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化的生物學(xué)方法來生產(chǎn)。3本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一種生物學(xué)方法是使用酶將醛糖或醛糖衍生物轉(zhuǎn)化成酮糖或酮糖衍生物。使用阿拉伯糖異構(gòu)酶將半乳糖異構(gòu)化成塔格糖一般在高溫下通過熱動力學(xué)來進(jìn)行，并表現(xiàn)出成比例的高轉(zhuǎn)化率。因此，開發(fā)可在高溫下具有穩(wěn)定作用的酶和使用其制備塔格糖的方法對于基于使用異構(gòu)酶進(jìn)行塔格糖的生物轉(zhuǎn)化的工業(yè)應(yīng)用來說是關(guān)鍵技術(shù)。通過篩選源自嗜熱性菌的阿拉伯糖異構(gòu)酶，來嘗試獲得工業(yè)上可應(yīng)用的嗜熱性異構(gòu)酶，并且已經(jīng)由許多研究團(tuán)隊付出了許多努力使用這種方法來建立異構(gòu)化工藝。在韓國，使用阿拉伯糖異構(gòu)酶的酶異構(gòu)化方法已經(jīng)由TongYangConfectioneryCorp開發(fā)。根據(jù)該方法，來自大腸桿菌的阿拉伯糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中通過重組技術(shù)大量表達(dá)。將該重組異構(gòu)酶在3(TC下反應(yīng)24小時，使半乳糖轉(zhuǎn)化成塔格糖，此時轉(zhuǎn)化率為25%，表明熱穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)化產(chǎn)量兩者都非常低(申請?zhí)枮?9-16118的韓國專利申請)。Oh，Deok-keun教授和他的同事們(Sejong大學(xué))通過重組技術(shù)成功地在大腸桿菌中實現(xiàn)了來自嗜熱脂肪土芽胞桿菌的阿拉伯糖異構(gòu)酶的表達(dá)，并基于此他們提出了在高溫下將半乳糖轉(zhuǎn)化成塔格糖的異構(gòu)化過程。TongYangConfectioneryCorp的研究組通過篩選嗜熱性微生物文庫從溫泉區(qū)域分離嗜熱性微生物，然后在重組大腸桿菌宿主中以活性形式對其進(jìn)行表達(dá)，以便將半乳糖用于高溫異構(gòu)化過程。類似地，CheBiGenInc.也在大腸桿菌中生產(chǎn)了來自Geo6a"7/wA'""nykwwDBG-A1的嗜熱性異構(gòu)酶，并使用該酶通過固定化開發(fā)了生產(chǎn)塔格糖的技術(shù)。來源于土芽胞桿菌(GeW""7/w^)微生物的異構(gòu)酶的表達(dá)水平太低而不能在工業(yè)中應(yīng)用。使用源自嗜熱性菌阿拉伯糖異構(gòu)酶的塔格糖生產(chǎn)仍依賴于使用在重組大腸桿菌中重組酶的大量表達(dá)或者使用含有重組酶的宿主將半乳糖異構(gòu)化成塔格糖的方法。大腸桿菌對于作為食品原料的塔格糖的生產(chǎn)來說是不合適的。為了生產(chǎn)作為食品添加劑的塔格糖，在該4宿主中表達(dá)阿拉伯糖異構(gòu)酶是必須的，該宿主為GRAS微生物并適于大量生產(chǎn)。對于重組酶生產(chǎn)來說可工業(yè)應(yīng)用的GRAS微生物可選自由芽孢桿菌屬(5ac/〃wJ、棒狀桿菌屬(^Cor_yweZa"en'wwJ禾口乳桿菌屬(丄a"o6a"7/w組成的組。很容易操縱芽孢桿菌屬和棒狀桿菌屬菌株用于工業(yè)化和大量培養(yǎng)，并且它們在各種條件下高度穩(wěn)定。事實上，在GRAS微生物中，絕大多數(shù)芽孢桿菌屬和棒狀桿菌屬菌株己經(jīng)被用作用于重組酶生產(chǎn)的宿主。本發(fā)明的發(fā)明人成功地在GRAS微生物諸如芽孢桿菌屬和棒狀桿菌屬菌株中以活性形式表達(dá)了來源于土芽胞桿菌的嗜熱性阿拉伯糖異構(gòu)酶。本發(fā)明的發(fā)明人通過使用所述表達(dá)的GRAS重組酶進(jìn)一步建立了將高濃度半乳糖誘導(dǎo)異構(gòu)化成塔格糖的方法。
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于由GRAS微生物表達(dá)來源于嗜熱性菌作為活性形式的阿拉伯糖異構(gòu)酶，并提供通過半乳糖異構(gòu)化制備食品級塔格糖的方法。技術(shù)方案本發(fā)明的上述和其他目的通過本發(fā)明的下列實施方式來實現(xiàn)。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的發(fā)明人通過將源自嗜熱性脂肪土芽胞桿菌的嗜熱性阿拉伯糖異構(gòu)酶基因引入到GRAS微生物中生產(chǎn)了食品級重組酶，并由此從半乳糖生產(chǎn)了塔格糖。此后，將詳細(xì)描述本發(fā)明。本發(fā)明的GRAS(GenerallyRecognizedAsSafe)微生物優(yōu)選包括芽孢桿菌屬和棒狀桿菌屬菌株，并且谷氨酸棒桿菌(C07"e&"eWwmg/wtom/cwwJKCTC13032和枯草芽孢桿菌(5flc/〃w168是更優(yōu)選的。本發(fā)明的阿拉伯糖異構(gòu)酶基因優(yōu)選來源于嗜熱性菌，更優(yōu)選來源于脂肪土芽胞桿菌DSM22。本發(fā)明的阿拉伯糖異構(gòu)酶基因可由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用任何常規(guī)基因突變方法來修飾，諸如定向進(jìn)化和定點基因突變。因此，與GRAS宿主具有一定同源水平的任何宿主細(xì)胞，例如與GRAS宿主具有至少70%的同源性，但優(yōu)選至少為80%，更優(yōu)選至少為卯％，和在宿主細(xì)胞中以活性形式表達(dá)的重組酶和含有該酶的任何宿主細(xì)胞都包括在本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)。本發(fā)明的實施例還提供了含有編碼本發(fā)明的阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因的載體。本發(fā)明的載體是用于克隆或表達(dá)的典型載體。載體不限于特定載體，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的任何載體都是可接受的。在本發(fā)明中，在芽孢桿菌(5a"7/w和棒狀桿菌(Corynebacterium)中具有活性的啟動子被用作載體來表達(dá)活性形式的嗜熱性異構(gòu)酶。在棒狀桿菌中用于基因表達(dá)的啟動子序列不像工業(yè)微生物諸如大腸桿菌或者枯草芽孢桿菌中使用的其他啟動子那樣已被鑒定。這里，來自棒狀桿菌這種流行的工業(yè)微生物的并能夠在大腸桿菌中表達(dá)的強(qiáng)啟動子已經(jīng)被開發(fā)。tac啟動子己知為最強(qiáng)的啟動子之一。tac啟動子通過將大腸桿菌的色氨酸操縱子啟動子的-35區(qū)與大腸桿菌的乳糖操縱子啟動子的-10區(qū)序列融合來制備。在本發(fā)明中由CJ-1組成的啟動子被認(rèn)為在棒狀桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)目標(biāo)基因比tac啟動子更為有效(韓國專利公開10-2006-0068505)。本發(fā)明的芽孢桿菌啟動子不僅在芽孢桿菌屬微生物中顯示了啟動子活性，而且在乳桿菌屬微生物諸如乳酸菌"""06^///^>)和雙歧桿菌(5zy^o6""en'wmJ中也顯示了啟動子活性。棒狀桿菌啟動子還在棒狀桿菌屬和大腸桿菌屬(五sc/ien'c/i/fl印J以及大腸桿菌細(xì)胞中都顯示啟動子活性。特別是，本發(fā)明的啟動子在大腸桿菌細(xì)菌細(xì)胞中顯示了比tac啟動子的活性至少高兩倍的活性。根據(jù)本發(fā)明，重組菌株通過使用載體轉(zhuǎn)化芽孢桿菌和棒狀桿菌來制備，轉(zhuǎn)化菌株然后被培養(yǎng)以提供食品級阿拉伯糖異構(gòu)酶。培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件取決于宿主的種類。根據(jù)本發(fā)明，塔格糖可通過使用重組阿拉伯糖異構(gòu)酶由半乳糖來制備。本發(fā)明的優(yōu)選實施例的應(yīng)用參照附圖被最佳理解，在附圖中圖1是示出含有來自嗜熱脂肪土芽胞桿菌DSM22菌株的嗜熱性阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因的重組表達(dá)載體pHT01-GSAl的構(gòu)建的示意性圖示，圖2是示出含有來自嗜熱脂肪土芽胞桿菌DSM22菌株的嗜熱性阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因的重組表達(dá)載體pCJ-l-GSAI的構(gòu)建的示意性圖示，圖3是示出在重組芽孢桿菌宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的嗜熱性阿拉伯糖異構(gòu)酶的酶活性的圖表。A表示僅在宿主細(xì)胞(枯草芽孢桿菌168)培養(yǎng)物的粗酶溶液中測定的酶活性，B表示在含有穿梭載體的重組宿主細(xì)胞(GSAIB-1)中測定的酶活性，所述穿梭載體含有(harboring)阿拉伯糖異構(gòu)酶基因，圖4是示出用于重組菌株GSAIB-1的表達(dá)的最佳條件和用于酶活性的最佳條件的圖表，圖5是示出在最佳培養(yǎng)基中重組菌株GSAIC-1的生長的圖表。具體實施例方式本發(fā)明的實際和現(xiàn)有優(yōu)選實施例如在下列例子中顯示的那樣被示出。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在考慮公開內(nèi)容的基礎(chǔ)上，可在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)進(jìn)行修改和改進(jìn)。實施例在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中來自超嗜熱脂肪土芽胞桿菌DSM22的編碼嗜熱性阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因被插入到pCJ-l(大腸桿菌-棒狀桿菌穿梭載體，韓國專利公開10-2006-0068505)和pHT10(大腸桿菌-芽孢桿菌穿梭載體，MoBiTech.,Goettingen,德國)。谷氨酸棒桿菌KCTC13032和枯草芽孢桿菌168用上述載體轉(zhuǎn)染，其中所述蛋白質(zhì)最終被過表達(dá)。重組菌株谷氨酸棒桿菌GSAIC-1和枯草芽孢桿菌GSAIB-1被培養(yǎng)并且從細(xì)胞培養(yǎng)物的每個階段得到細(xì)胞抽提物。塔格糖的生產(chǎn)活性通過測定活性重組蛋白的量逐階段被測定。最佳表達(dá)的合成培養(yǎng)物被分離并通過細(xì)胞裂解、熱處理、離子交換樹脂和凝膠色譜純化。最后，氨基末端的氨基酸序列被檢査并且通過測定蛋白質(zhì)的活性來確認(rèn)塔格糖的生產(chǎn)活性。實施例l:阿拉伯糖異構(gòu)酶的克隆在需氧條件下培養(yǎng)嗜熱脂肪土芽胞桿菌DSM22。在8000xg下離心10分鐘以回收培養(yǎng)的細(xì)胞。通過使用細(xì)胞培養(yǎng)物DNAMidiKit(Qiagen，美國)從得到的細(xì)胞提取基因組DNA。通過使用具有Xbal和BamHi限制酶位點序列插入的寡核苷酸5'-TCTAGAATGATGCTGTCATTACGTCCTTATGAATTTTG-S'(SEQ.ID.NO:1)禾口5'-TCTAGATTACCGCCCCCGCCAAAACACTTCGTTCC誦S'(SEQ.ID.NO:2)作為弓l物，使用基因組DNA進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。PCR產(chǎn)物1通過從嗜熱脂肪土芽胞桿菌擴(kuò)增含有阿拉伯糖異構(gòu)酶基因的1494bp的DNA得到。再次通過使用具有EcoRV和Pstl限制酶位點序列插入的寡核苷酸5'-CCCGATATCATGCTGT-CATTACGTCCTTATG-S'(SEQ.ID.NO:3)和5'-TGCACTGCAGTTACCGCCCCCGCCAAAACAC-3'(SEQ.ID.NO:4)作為引物，使用基因組DNA再次進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物2通過從嗜熱脂肪土芽胞桿菌擴(kuò)增含有阿拉伯糖異構(gòu)酶基因的1512bp的DNA得到。為了過表達(dá)由上述兩個擴(kuò)增基因編碼的阿拉伯糖異構(gòu)酶，來自芽孢桿菌屬的穿梭載體pHT01和來自棒狀桿菌屬的穿梭載體pCJ-l被使用。穿梭載體pHT01被引入到大腸桿菌DH5a，其于2004年11月6日被保藏在國際保藏單位(IDA)KoreanCultureCenterofMicroorganisms(KCCM)(保藏號KCCM-10611)。穿梭載體pHT01得自MoBiTechCb.(PBS001)(表1)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>將由限制酶Xbal和BamHI消化的PCR產(chǎn)物1插入到由相同酶消化的穿梭載體pHTOl中，導(dǎo)致重組表達(dá)載體pHT01-GSAI的構(gòu)建(見圖1)。將由限制酶EcoRV和Pstl消化的PCR產(chǎn)物2插入到由相同酶消化的穿梭載體pCJ-l中，導(dǎo)致重組表達(dá)載體pCJ-l-GSAI的構(gòu)建(見圖2)。谷氨酸棒桿菌KCTC13032和枯草芽孢桿菌168使用重組表達(dá)載體pHTOl-GSAl和pCJ-l-GSAl轉(zhuǎn)染以制備重組菌株，它們被命名為谷氨酸棒桿菌GSAIC-1和'枯草芽孢桿菌GSA舊-l'。重組菌株于2006年10月18日被保藏在地址為#361-221,Hongjel-Dong，Seodaemun-Gu，Seoul,Korea的國P示保藏單位(IDA)KoreanCultureCenterofMicroorganisms(KCCM)(保藏號:KCCM10789P和KCCM10788P)。實施例2:阿拉伯糖異構(gòu)酶在芽孢桿菌中的表達(dá)在上述實施例I中制備的重組菌株枯草芽孢桿菌GSA舊-1(保藏號KCCM10788P)被接種在含有20嗎/mL的氯霉素的LB培養(yǎng)基(Bacto-胰蛋白胨10g/L,Bacto-酵母膏5g/L,NaCl10g/L)中，接著在37。C下230rpm搖瓶培養(yǎng)12小時。產(chǎn)生預(yù)培養(yǎng)液。然后將預(yù)培養(yǎng)液接種到具有濃度為0.1%的相同成分的主培養(yǎng)基中，接著在37'C下230rpm搖瓶培養(yǎng)直到OD^達(dá)到1，以誘導(dǎo)重組阿拉伯糖異構(gòu)酶的表達(dá)。為了測定所表達(dá)的阿拉伯糖異構(gòu)酶的酶活性，培養(yǎng)物溶液在12000xg下離心IO分鐘，并回收細(xì)胞。細(xì)胞被懸浮在50mMTris-HCl(pH8.2)緩沖液中，接著超聲(170瓦，以l秒/2分鐘的間隔在冰上冷卻)裂解細(xì)胞。在12000xg下再次離心12分鐘，使用上清液作為粗酶溶液誘導(dǎo)半乳糖的異構(gòu)化。半乳糖的異構(gòu)化，使用25^1100mM的半乳糖和100nl的粗酶溶液的混合物作為底物在6(TC下進(jìn)行1小時。為了測定半乳糖異構(gòu)化的活性，將含有40mM的lO(Hil的粗酶溶液作為底物與lml的反應(yīng)緩沖液(50mMTris-HCl，pH7.0)混合，接著在65。C下反應(yīng)20分鐘。此時，將5mMMgCl2和lmMMnCl2加入到反應(yīng)混合物中。異構(gòu)酶的活性通過半胱氨酸-咔唑-硫酸法(Dische，Z.禾QE.Borenfreund.,ANewSpectrophotometricMethodfortheDetectionandDeterminationofKetoSugarsandTrioses,J.Biol.Chem.，192:583-587，195)測定。粗酶溶液中含有的蛋白質(zhì)使用Bradford測定試劑盒(Biorad，美國)定量。結(jié)果，異構(gòu)酶活性為0.2045±0.0078(mg-塔格糖/mg-蛋白質(zhì)，h)，表明半乳糖異構(gòu)化產(chǎn)物塔格糖成功產(chǎn)出(圖3)。為了提供用于根據(jù)每種培養(yǎng)液的成分的酶表達(dá)的最佳條件，通常被用于芽孢桿菌培養(yǎng)的MB培養(yǎng)基(Baeto-胰蛋白胨10g/L，Bacto-酵母膏5g/L，NaCl10g/L，大豆胨10g/L)和LB培養(yǎng)基(Bacto-胰蛋白胨10g/L，Bacto-酵母膏5g/L,NaCl10g/L)被用作基本培養(yǎng)基。將重組菌株GSAIB-1接種在含有濃度為20嗎/ml的氯霉素的LB培養(yǎng)基(Bacto-胰蛋白胨10g/L,Bacto-酵母膏5g/L，NaCl10g/L)中，接著在搖床中37°C下230rpm搖瓶培養(yǎng)12小時。該培養(yǎng)液被用作預(yù)培養(yǎng)液。將預(yù)培養(yǎng)液接種到含有10g/L碳源(果糖，葡萄糖，琥珀酸鹽，山梨醇或者蔗糖)的LB培養(yǎng)基和濃度為0.1。/。的MB培養(yǎng)基(Bacto-胰蛋白胨10g/L,Bacto-酵母膏5g/L,NaCl10g/L,大豆胨10g/L)中，接著在37°C下230rpm搖瓶培養(yǎng)直到OD,達(dá)到1，OD6oo達(dá)到1表明重組阿拉伯糖異構(gòu)酶的表達(dá)被誘導(dǎo)。在MB培養(yǎng)基中酶的表達(dá)水平比在LB培養(yǎng)基中低30%。根據(jù)加入的不同碳源的蛋白質(zhì)表達(dá)模式也被研究，工業(yè)上可接受的碳源諸如分別為10g/L的葡萄糖、果糖、琥珀酸鹽、山梨醇和蔗糖加入到LB培養(yǎng)基中用于該研究。酶的表達(dá)水平被研究。結(jié)果，酶表達(dá)隨著琥珀酸鹽或山梨醇的加入而略微增加(圖4)。實施例3:在棒狀桿菌中表達(dá)重組阿拉伯糖異構(gòu)酶在上述實施例1中制備的重組菌株谷氨酸棒桿菌GSAIC-1(保藏號KCCM10789P)被接種在含有10|ig/mL的卡那霉素的MB培養(yǎng)基(Bacto-胰蛋白胨10g/L，Bacto-酵母膏5g/L,NaCl10g/L，大豆胨5g/L)中，接著在30。C下200rpm搖瓶培養(yǎng)24小時以制備預(yù)培養(yǎng)溶液。將得到的預(yù)培養(yǎng)液接種到具有濃度為1%的主培養(yǎng)基中，接著在3(TC下200rpm搖瓶培養(yǎng)直到OD6(K)達(dá)到0.1，以誘導(dǎo)重組阿拉伯糖異構(gòu)酶的表達(dá)。為了測定所表達(dá)的阿拉伯糖異構(gòu)酶的酶活性，培養(yǎng)物溶液在8000xg下離心10分鐘，并回收細(xì)胞。細(xì)胞被懸浮在50mMTris-HCl(pH7.0)緩沖液中，接著超聲裂解細(xì)胞。在8000xg下再次離心12分鐘，使用上清液作為粗酶溶液誘導(dǎo)半乳糖的異構(gòu)化。包含在粗酶溶液中的蛋白質(zhì)使用使用Bradford測定試劑盒(Biorad，美國)定量。結(jié)果，異構(gòu)酶活性為1.387(mg-塔格糖/mg-蛋白質(zhì)'h)，表明半乳糖異構(gòu)化產(chǎn)物塔格糖成功地被生產(chǎn)。為了優(yōu)化阿拉伯糖異構(gòu)酶在重組菌株棒狀桿菌GSAIC-1中的表達(dá)，將重組菌株接種到含有10嗎/mL的濃度為OD,=0.6的的卡那霉素的MB培養(yǎng)基(Bacto-胰蛋白胨10g/L,Bacto-酵母膏5g/L,NaCl10g/L，大豆胨5g/L)中。棒狀桿菌菌株在兩種基本培養(yǎng)基，即MB培養(yǎng)基(Bacto-胰蛋白胨10g/L，Bacto-酵母膏5g/L，NaCl10g/L,大豆胨5g/L)和改良培養(yǎng)基(Bacto-蛋白胨10g/L，Bacto-酵母膏5g/L，NaCl2.5g/L,牛肉膏5g/L)中的生長被研究。比較了兩種培養(yǎng)基中的溫度依賴型(25°C3(TC,37'C)、pH依賴型、葡萄糖(碳源)和蔗糖濃度依賴型生ii長。另外，在平穩(wěn)性條件和需氧條件下的生長也進(jìn)行了比較。在各種條件下的生長和酶的表達(dá)的水平由此每小時被測定以判斷用于重組阿拉伯糖異構(gòu)酶的大量生長的最佳表達(dá)條件(表2和表3)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>為了測定重組阿拉伯糖異構(gòu)酶的酶活性，酶以實施例2中描述的相同方式被處理并定量。當(dāng)細(xì)胞在3(TC在需氧條件下加入2.5M的蔗糖培養(yǎng)時，塔格糖顯示大約為57.0mU/ml的酶活性，比在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物中觀察到的(31.6mU/ml)高1.8倍，表明酶活性隨著細(xì)胞生長的增加而增加。在最佳培養(yǎng)基中得到的細(xì)胞生長在圖5中顯示。實施例4:重組阿拉伯糖異構(gòu)酶的分離和純化2L重組菌株的培養(yǎng)在上述實施例3中確定的最佳培養(yǎng)條件下進(jìn)行。將培養(yǎng)液在8000xg下離心10分鐘并回收細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮在50mMTris-HCl(pH7.0)緩沖液中，并用于蛋白質(zhì)純化。使用高壓細(xì)胞勻漿器T-series(4.0kW;Constantsystems,英國)將細(xì)胞懸浮物進(jìn)行裂解，然后在80'C下熱處理20分鐘。在10000xg下離心IO分鐘以分離表達(dá)的重組嗜熱性阿拉伯糖異構(gòu)酶。分離的重組酶溶液通過超過濾(MW:10,000;Sartorius，美國)純化。過濾物被用于隨后的實驗。工業(yè)實用性如此前解釋的那樣，在本發(fā)明中來自嗜熱性微生物土芽胞桿菌的阿拉伯糖異構(gòu)酶成功并穩(wěn)地在GRAS微生物棒狀桿菌屬菌株和芽孢桿菌屬菌株中被表達(dá)。因此，本發(fā)明提供了活性重組酶和制備塔格糖的方法，所述方法包括使用重組酶有效固定的連續(xù)反應(yīng)步驟。其對于食物添加劑來說本質(zhì)上是安全的，特別是在使用微生物酶的生物技術(shù)食品的生產(chǎn)過程中。根據(jù)本發(fā)明，來源于土芽胞桿菌屬菌株的阿拉伯糖異構(gòu)酶被確認(rèn)是安全的食品級的，于是其能夠被表達(dá)并連續(xù)應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，前述說明書中公開的構(gòu)思和特定實施例可以很容易作為基礎(chǔ)被利用以便修改或重新設(shè)計其他實施例來實現(xiàn)本發(fā)明的相同目的。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將會理解，這些等同實施例都不偏離在所附的權(quán)利要求數(shù)中闡明的本發(fā)明的精神和范圍。權(quán)利要求1、一種由GRAS微生物表達(dá)的食品級嗜熱性阿拉伯糖異構(gòu)酶。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的阿拉伯糖異構(gòu)酶，其特征在于，GRAS微生物選自由棒狀桿菌屬、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬和酵母菌組成的組。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的阿拉伯糖異構(gòu)酶，其特征在于，GRAS微生物是棒狀桿菌或芽孢桿菌。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的阿拉伯糖異構(gòu)酶，其特征在于，阿拉伯糖異構(gòu)酶來源于嗜熱脂肪土芽胞桿菌。5、一種使用根據(jù)權(quán)利要求1的阿拉伯糖異構(gòu)酶由半乳糖制備塔格糖的方法。全文摘要本發(fā)明涉及一種嗜熱性阿拉伯糖異構(gòu)酶和使用該酶制備塔格糖的方法，更精確地說，涉及來自嗜熱脂肪土芽胞桿菌DSM22的編碼阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因、含有該基因的重組表達(dá)載體，通過所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的重組食品級GRAS(GenerallyRecognizedAsSafe)菌株制備食品級嗜熱性阿拉伯糖異構(gòu)酶的方法，以及使用所述酶由半乳糖制備塔格糖的方法。文檔編號C12N9/90GK101636491SQ200780044169公開日2010年1月27日申請日期2007年11月22日優(yōu)先權(quán)日2006年11月27日發(fā)明者宋相勛,樸承源,李康杓,李英美,金成俌,金政勛申請人:Cj第一制糖株式會社