專利名稱：一種假病毒載體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，涉及ー種動(dòng)物病原微生物假病毒載體的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
二十世紀(jì)末，Pasloske等人提出了一種新的RNA質(zhì)控品制備技木，即裝甲 RNA (Armorea RNA)技術(shù)(Pas丄osKe B L, et al. Armored RNAtechnology for production of ribonuclease-resistant viral RNA controls and standards[J]. J Clin Microbiol, 1998,36(12) :3590-3594 ；W alker Peach C R, et al. Ribonuclease resistant RNA controls (Armored RNA)for reverse transcription-PCR,branched DNA, and genotyping assays for hepatitis C virus [J]. Clin Chem，1999，45 (12) :2079-2085)。該技術(shù)解決了傳統(tǒng)RNA質(zhì)控品存在的問(wèn)題(或者穩(wěn)定性差，或存在生物傳染隱患，或達(dá)不到監(jiān)測(cè)核酸提取及反轉(zhuǎn)錄過(guò)程的目的等)。裝甲R(shí)NA技術(shù)的原理是將包含有大腸桿菌MS2噬菌體的外殼蛋白基因的序列及外源基因克隆到表達(dá)載體中，這ー載體能夠?qū)⑼庠椿蜣D(zhuǎn)錄成RNA，并利用載體上MS2的外殼蛋白編碼基因組裝的外殼蛋白將其裝配成球狀RNA病毒結(jié)構(gòu)的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，我們稱之為裝甲R(shí)NA假病毒顆粒。目前構(gòu)建假病毒顆粒的常用假病毒載體主要由可以編碼MS2噬菌體外殼蛋白的基因序列和具有高效表達(dá)的表達(dá)載體組成。MS2噬菌體是單鏈正性RNA病毒，為^nm長(zhǎng)的 20面體，包含有3個(gè)基因，編碼成熟酶蛋白、外殼蛋白、復(fù)制酶蛋白和裂解蛋白4種蛋白質(zhì)分子。噬菌體由180個(gè)外殼蛋白単體、一分子成熟酶蛋白和一分子基因組RNA組成。每個(gè) MS2噬菌體是含有180個(gè)拷貝的外殼蛋白，一拷貝的成熟酶蛋白，包裏一分子RNA的正二十面體(賈盤興.噬菌體分子生物學(xué)-基木知識(shí)和技能[M].北京科學(xué)出版社，2001，2-5)。 在早期噬菌體的研究中發(fā)現(xiàn)，噬菌體復(fù)制酶基因的5’端有ー個(gè)約21個(gè)核苷酸組成的莖-環(huán)區(qū)域(操縱子或Pac位點(diǎn))，噬菌體外殼蛋白的ニ聚體與這個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的結(jié)合不但引發(fā)了外殼蛋白本身的組裝，而且還引發(fā)了外殼蛋白包裹整個(gè)噬菌體基因組RNA的過(guò)程(Peabody DS. The RNAbinding site of bacteriophage MS2 coat protein. EMBO J,1993,12(2) 595-600 ；Peabody DS. Role of the coat protein-RNA interaction in the life cycle of bacteriophage MS2. Mol Gen Genet, 1997,254(4) :358-364)。MS2 噬菌體成熟酶蛋白可與噬菌體RNA的兩個(gè)位點(diǎn)發(fā)生作用。這種相互作用不是噬菌體包裝過(guò)程所必須的，但是在噬菌體顆粒中這種相互作用可以用來(lái)保護(hù)基因組RNA不被廣泛存在的核糖核酸酶消化 (Shiba T,Suzuki Y. Localization of A protein in the RNA-Aprotein complex of RNA phage MS2. Biochim Biophys Acta. 1981,654(2) :249-255.)研究表明 MS2 噬菌體成熟酶蛋白對(duì)噬菌體外殼的包裝起重要作用(Kuzmanovic DA, Elashvili 1，Wick C, et al. The MS2しoat Protein bne11 is Likely assembled Under fension :a novel role ior the MS2 Bacteriophage A Protein as revealed by small-angle neutron scattering[J]. J Mol Biol, 2006, 355 (5) :1095-1111)。裂解蛋白和復(fù)制酶蛋白不是噬菌體顆粒的組成部
3分。裂解蛋白的作用是裂解大腸桿菌細(xì)胞從而釋放出病毒顆粒。復(fù)制酶蛋白的作用是與其它3個(gè)大腸桿菌宿主蛋白組成ー個(gè)蛋白復(fù)合體，這個(gè)蛋白復(fù)合體負(fù)責(zé)基因組RNA的復(fù)制和合成。在MS2噬菌體外殼蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)外殼蛋白與噬菌體復(fù)制酶5'端由19個(gè)堿基(19mer)組成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)RNA序列有特異性相互作用，這種作用可引發(fā)噬菌體外殼的組裝，同時(shí)又將噬菌體基因組RNA包裝到包膜內(nèi)。研究人員發(fā)現(xiàn)在包裝位點(diǎn)后引入非噬菌體基因序列也可以引發(fā)包裝。因此，如果將外源基因克隆于MS2噬菌體外殼蛋白基因編碼序列下游，并在其下游插入終止子，轉(zhuǎn)錄后得到帶有噬菌體操縱子RNA序列的外源基因RNA轉(zhuǎn)錄本，誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程中噬菌體外殼蛋白得以表達(dá)并組裝成蛋白外殼，并將攜帶有外源基因的噬菌體基因組包裹到包膜內(nèi)，構(gòu)成噬菌體病毒樣顆粒。由于單獨(dú)表達(dá)的外殼蛋白組裝過(guò)程不成熟，不能得到耐RNase的病毒包膜，研究者將MS2噬菌體的成熟酶蛋白和外殼蛋白的基因編碼序列以及其基因組部分包含基因調(diào)節(jié)元件序列的5'非編碼序列相應(yīng)的cDNA序列都連接到表達(dá)載體啟動(dòng)子下游，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)得到成熟酶蛋白和外殼蛋白，在成熟酶以及噬菌體基因組RNA的協(xié)同作用下，外殼蛋白可組裝為成熟的假病毒顆粒外殼，并具有耐 RNase作用的特性。在假病毒顆粒制備技術(shù)中，目前存在的最大問(wèn)題是純化問(wèn)題以及含有假病毒顆粒溶液的純度問(wèn)題。傳統(tǒng)方法一般如下操作含有外源基因的重組體成功構(gòu)建后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，然后破碎細(xì)胞，雙酶(DNaseI和RNase A)消化，再按照噬菌體純化方法進(jìn)行純化鹽沉淀，梯度離心回收假病毒顆粒。這種方法操作繁瑣，對(duì)設(shè)備要求高(需要高速低溫離心機(jī))， 更關(guān)鍵的是梯度離心回收的含有假病毒顆粒的溶液中仍然存在一定量的核酸，并且殘余核酸在PCR鑒定含有假病毒顆粒溶液的純度過(guò)程中很容易使PCR產(chǎn)生假陽(yáng)性，更進(jìn)一歩影響到假病毒顆粒定量的研究。雖然有些研究人員在純化的含有假病毒顆粒溶液提取RNA 后，再進(jìn)行DNase I酶消化，以去除殘存核酸干擾，但這樣會(huì)造成制備的RNA損失很大，同樣造成下一歩定量不精確。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種假病毒載體pTrcMS。本發(fā)明的另一目的是提供制備假病毒載體pTrcMS的方法和應(yīng)用。所述的假病毒載體包括出發(fā)載體的啟動(dòng)子序列和終止子序列，MS2噬菌體 (NC_001417)成熟酶蛋白基因編碼序列、突變的外殼蛋白基因編碼序列、部分裂解蛋白和復(fù)制酶基因編碼序列，出發(fā)載體ー個(gè)末端的多克隆位點(diǎn)序列。其中，突變的外殼蛋白基因編碼序列是在位于MS2噬菌體的外殼蛋白基因編碼序列的第15-16個(gè)氨基酸之間，插入6His標(biāo)簽(CATCACCATCACCATCAC)得到的。所述的出發(fā)載體為pTrcHis2A載體。本發(fā)明提供的假病毒載體為pTrcMS，核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。假病毒載體pTrcMS結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖1。本發(fā)明提供了ー種假病毒載體pTrcMS的構(gòu)建方法，包括以下步驟1)在pTrcHis 2A載體多克隆位點(diǎn)的NcoI和BglII雙酶切位點(diǎn)處插入噬菌體 MS2的成熟酶蛋白、外殼蛋白、部分裂解蛋白和復(fù)制酶的基因編碼序列，得到前假病毒載體 pTrcHis-MS2 ；
2)通過(guò)基因插入方法將載體pTrcHis-MS2中外殼蛋白的第15_16個(gè)氨基酸之間插入6His序列，構(gòu)建得到假病毒載體；3)假病毒載體pTrcMS用His柱進(jìn)行純化。具體地，上述步驟2)是以步驟1)獲得的前假病毒載體pTrCHis-MS2為模板，以兩對(duì)含有突變基因的PCR引物對(duì)為引物，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，50ul PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為:5X Prime STAR Buffer (Mg2+ plus) IOul，prime STAR HS DNAPolymerase 1.3U，dNTP Mixture 2. 5mM) 4ul, primerl (lOpmol/ul) lul, primer2 (lOpmol/ul) Iul, pTrcHis-MS2 DNA 10ng，補(bǔ)ddH20至50ul。PCR擴(kuò)增的循環(huán)程序?yàn)?8°C變性10s，55°C退火10s，72°C延伸30s，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin，回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物；用XhoI 和 Hind III 雙酶切前假病毒載體 pTrcHis_MS2 ；采用 In- Fusion HD Cloning Kit將兩次PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物與酶切后的pTrcHis_MS2連接，轉(zhuǎn)化受體菌，搖菌、PCR 鑒定 G^rimer-Ul :5’ -GACAATTAATCATCCGGCTCG-3，，Primer-Ll 5，-GATCTTCGTTTAGGGCAAGGTAG-3，)，獲得陽(yáng)性質(zhì)粒 pTrcMS ；pTrcMS 重組菌采用 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體。沉淀中加入細(xì)胞裂解液i^ast Break CellLysis Reagent(IOX)破碎細(xì)胞，離心收集上清，采用MagneHis Protein Purification System純化蛋白方式回收產(chǎn)物，得到假病毒載體pTrcMS。本發(fā)明提供了含有突變基因的PCR引物對(duì)，其核苷酸序列為Primerl-F 5' -AGGTAACATGCTCGAGGGCCTT-3，，Primerl-R 5' -GACATCACCATCACCATCACACTGGCGACGTGGCTGTCGCCCCA-3’ ；Primer2-F 5’ -GTGTGATGGTGATGGTGATGTCCGCCATTGTCGACGAGAACG-3’，Primer2-R :5’ -GTTCGGGCCCAAGCTTCGAATTCCC-3，。本發(fā)明提供了ー種假病毒載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟1)在pTrcHis 2A載體多克隆位點(diǎn)的NcoI和BglII雙酶切位點(diǎn)處插入噬菌體MS2的成熟酶蛋白、外殼蛋白、部分裂解蛋白和復(fù)制酶的基因片段，得到前假病毒載體 pTrcHis-MS2 ；2)通過(guò)基因插入方法將載體pTrcHis-MS2中外殼蛋白的第15_16個(gè)氨基酸之間插入6His序列，具體是以步驟1)獲得的前假病毒載體pTrCHis-MS2為模板，以兩對(duì)含有突變基因的PCR引物對(duì)為引物，其核苷酸序列為Primerl-F 5' -AGGTAACATGCTCGAGGGCCTT-3，，Primerl-R 5' -GACATCACCATCACCATCACACTGGCGACGTGGCTGTCGCCCCA-3’ ；Primer2-F 5’ -GTGTGATGGTGATGGTGATGTCCGCCATTGTCGACGAGAACG-3’，Primer2-R 5' -GTTCGGGCCCAAGCTTCGAATTCCC-3，；分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，50ul PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為5 X Prime STAR Buffer(Mg2+plus) IOul, Prime STAR HS DNA Polymerasel. 3U, dNTP Mixture (各 2. 5mM)4ul, primerl(lOpmol/ul)lul, primer2(lOpmol/ul)lul, pTrcHis-MS2DNA 10ng，補(bǔ) ddH20至50ul。PCR擴(kuò)增的循環(huán)程序?yàn)?8°C變性10s，55°C退火10s，72°C延伸30s，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin，回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物；用XhoI和Hind III雙酶切前假病毒載體pTrcHis_MS2 ；采用In- Fusion HD Cloning Kit將兩次PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物與酶切后的pTrcHis-MS2連接，轉(zhuǎn)化受體菌，搖菌、PCR 鑒定，鑒定用引物為(Primer-Ul :5，-GACAATTAATCATCCGGCTCG-3，，Primer-Ll 5，-GATCTTCGTTTAGGGCAAGGTAG-3，)，獲得陽(yáng)性質(zhì)粒 pTrcMS ；pTrcMS 重組菌采用 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體。沉淀中加入細(xì)胞裂解液i^ast Break Cell Lysis Reagent(IOX)破碎細(xì)胞，離心收集上清，采用MagneHis Protein Purification System純化蛋白方式回收產(chǎn)物，得到假病毒載體pTrcMS。本發(fā)明提供的假病毒載體的構(gòu)建方法，還包括將步驟幻獲得的假病毒載體 pTrcMS用His柱進(jìn)行純化。本發(fā)明提供了ー種假病毒顆粒，含有假病毒載體pTrcMS及其攜帯有外源基因的噬菌體基因組。本發(fā)明提供了ー種假病毒顆粒的制備方法，其特征在于，將外源基因克隆于假病毒載體pTrcMS中的MS2噬菌體外殼蛋白基因編碼序列下游，在其下游插入終止子，轉(zhuǎn)錄后得到帶有噬菌體操縱子RNA序列的外源基因RNA轉(zhuǎn)錄本，誘導(dǎo)表達(dá)噬菌體外殼蛋白并組裝成蛋白外殼，并將攜帶有外源基因的噬菌體基因組包裹到包膜內(nèi)，得到假病毒顆粒。本發(fā)明提供了假病毒載體pTrcMS或假病毒顆粒在制備檢測(cè)動(dòng)物病原微生物質(zhì)控品中的應(yīng)用。假病毒顆粒主要作為參比物質(zhì)，應(yīng)用于各類動(dòng)物病原微生物核酸和血清學(xué)檢測(cè)技木。因此本發(fā)明還提供了假病毒載體PTrcMS或假病毒顆粒在制備動(dòng)物病原微生物檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的假病毒載體pTrcMS用于制備假病毒顆?？梢源蟠鬁p少假病毒顆粒制備的繁瑣操作過(guò)程，同時(shí)提高假病毒顆粒純化的質(zhì)量。本發(fā)明制備的假病毒顆粒，具有以下特點(diǎn)(1)易純化。由于假病毒顆粒表達(dá)后為RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，利用His純化蛋白方法捕獲假病毒顆粒，可以大大減少假病毒顆粒制備的繁瑣操作過(guò)程，同時(shí)提高假病毒顆粒純化的質(zhì)量。(2)耐核酸酶，穩(wěn)定性好，易保存和運(yùn)輸。由于基因組RNA包裹在假病毒載體的外殼蛋白內(nèi)，所以可以抵抗外界核酸酶的作用，不易被降解。因此，假病毒穩(wěn)定性良好，在室溫條件下可以保存至少30d，4°C可以保存更長(zhǎng)時(shí)間，從而解決了 RNA質(zhì)控品在使用、保存和運(yùn)輸中的穩(wěn)定性問(wèn)題。(3)無(wú)生物傳染性，安全。與自然源性病毒相比，假病毒顆粒整合了其他病毒的外殼蛋白，而且核酸分子上編碼外殼蛋白的基因被修飾棹，所以這種病毒喪失了病毒的自我復(fù)制能力，只能進(jìn)行“一個(gè)細(xì)胞周期”的侵染，從而得到的假病毒顆粒無(wú)傳染性，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)人員造成傷害，也不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。(4)全程監(jiān)控核酸制備及鑒定過(guò)程。假病毒顆粒的RNA-蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu)與天然病毒相似，即都是外殼蛋白包裏核酸，因此可以把假病毒顆粒視為病毒材料對(duì)待，必須經(jīng)過(guò)RNA提取、反轉(zhuǎn)錄后才可用于PCR擴(kuò)增，從而對(duì)RNA病毒的檢測(cè)進(jìn)行全程監(jiān)控，保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。


圖1顯示的是假病毒載體pTrcMS結(jié)構(gòu)圖譜；圖2顯示的是假病毒載體pTrcMS純化效果，圖中1為RT-PCR鑒定結(jié)果，2為PCR鑒定結(jié)果，3為陰性對(duì)照，M為Marker2000 ；圖3顯示的是假病毒顆粒pTrcMS-NP對(duì)溫度的敏感性試驗(yàn)結(jié)果。其中1為空白對(duì)照，2-6 分別為 56 °C /ld、37°C /20d、室溫/30d、4°C /30d、-20 °C /60d 保存條件下，樣本 RT-PCR 鑒定結(jié)果，M 為 Marker2000 ；圖4顯示的是假病毒顆粒pTrcMS-NP對(duì)RNase A的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果。圖中1為陰性對(duì)照，2-6分別為RNase A 1 μ g、2 μ g、3 μ g、4 μ g、0 μ g樣本處理后RT-PCR鑒定結(jié)果，M 為 Marker2000 ；圖5顯示的是假病毒顆粒pTrcMS-NP的電鏡觀察圖。(80000 X JEM1400)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)ー步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段， 實(shí)施例中所用的生化試劑均為市售購(gòu)買得到。實(shí)施例1前假病毒載體pTrcHis-MS2構(gòu)建1)提取MS2噬菌體(ATCC 15597-B1，購(gòu)買自美國(guó)ATCC) RNA，參考ー步法one step RT-PCR kit進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物回收純化連入pGEM-T Easy Vector,構(gòu)建MS2-T質(zhì)粒。MS2-T質(zhì)粒(本實(shí)驗(yàn)室保存)和表達(dá)載體pTrcHis2A(購(gòu)自hvitrogen公司)分別進(jìn)行 NcoI 和 BglII 雙酶切，酶切體系如下Ncol/Bglll 10U, IOXK buffer 2ul,0. 1% BSA 2ul，模板lyg，補(bǔ)水至20ul。37°C池。分別將酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化，產(chǎn)物分別命名為 MS2-T (N/B)、pTrcHis2A (Ν/Β)。2)將酶切產(chǎn)物用Τ4 DNA連接酶連接，連接體系如下10 X buffer lul，T4DNA酶 0. 5ul, pTrcHis2A (N/B)50ng, MS2-T (N/B) 120ng，25°C，lOmin，然后立即放冰上。3)將連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑取單克隆搖菌、測(cè)序。測(cè)序正確的菌株命名為 pTrcHis-MS20 實(shí)施例2假病毒載體pTrcMS構(gòu)建利用基因插入的方法，在pTrcHis-MS2載體上MS2中外殼蛋白基因編碼序列的 15-16個(gè)氨基酸之間插入6His序列，得到假病毒載體pTrcMS，其具體構(gòu)建方法如下①在PCR引物中引入突變的堿基，以前假病毒載體pTrCHis-MS2為模板，分別以 Primerl 和 Primer2 為引物對(duì)，用Primer STAR HS DNAPolymerase 分別進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物命名為PCR產(chǎn)物I、II。其中，PCR擴(kuò)增引物為Primerl-F 5' -AGGTAACATGCTCGAGGGCCTT-3，，Primerl-R 5' -GACATCACCATCACCATCACACTGGCGACGTGGCTGTCGCCCCA-3’ ；Primer2-F 5’ -GTGTGATGGTGATGGTGATGTCCGCCATTGTCGACGAGAACG-3’，Primer2-R :5，-GTTCGGGCCCAAGCTTCGAATTCCC-3，。50ul PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系為:5 χ Prime STAR Buffer (Mg2+ plus) 1 Ou 1, Prime STAR HS DNA Polymerase 1. 3U, dNTP Mixture 2. 5mM) 4ul, primerl (lOpmol/ul) lul, primer2(10pmol/ul) Iul, pTrcHis-MS2 DNA 10ng，補(bǔ) ddH20 至 50ul。PCR 擴(kuò)增的循環(huán)程序
7為98°C變性10s，55°C退火10s，72°C延伸30s，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmin0擴(kuò)增產(chǎn)物純化
回收，保存?zhèn)溆?。②pTrcHis-MS2 質(zhì)粒采用 XhoI 和 HindIII 雙酶切，體系如下XhoI/HindIII 10U,IOXM buffer 5ul，模板1 μ g，補(bǔ)水至50ul。37°C池。分別將酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化，命名為 Vector DNA。③使用Fusion HD Cloning Kit(Clontech Code No. 639648)，將PCR產(chǎn)物 I、PCR產(chǎn)物II和Vector DNA連接，反應(yīng)體系及條件如下PCR產(chǎn)物I 50ng，PCR產(chǎn)物II 50ng,Vector DNA 300ng，5 X In—Fusion HD Enzyme Premix 2ul，補(bǔ)水至 10ul。50°C 15min。④取上述h-Fusion 產(chǎn)物 2. 5ul 熱轉(zhuǎn)化至 E. coli Competent Cel 1JM109 (CodeNo. D9052)，37 °C過(guò)夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性菌落進(jìn)行測(cè)序鑒定，鑒定用引物為(ft~imer-Ul 5，-GACAATTAATCATCCGGCTCG-3，，Primer-Ll :5，-GATCTTCGTTTAGGGCAAGGTAG-3，)，將測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pTrcMS。⑤假病毒載體菌體采用IPTG(終濃度為lmol/L)誘導(dǎo)表達(dá)16h，5000rpm，離心lOmin，收集菌體。⑥產(chǎn)物沉淀加入細(xì)胞裂解液Fast Break Cell Lysis Reagent (10X) IOul/ml菌體沉淀，渦旋混勻，室溫消化30min。4 °C，13000rpm,離心15min。上清加入MagneHis Ni-Particles 10ul/ml菌體，室溫結(jié)合30min。溶液放置磁力架上，吸附2min，除去上清，加入200ulMagneHiSTM Bingding/ffash Buffer，顛倒混勻，放置磁力架上吸附，除去上清。將上述MagneHis Ni-Particles重復(fù)洗滌。洗滌的MagneHis Ni-Particles加入Elution Buffer 10ul/ml菌體，顛倒混勻，室溫作用30min，放置磁力架上吸附，回收上清，即為純化后的假病毒載體PTrcMS。假病毒載體核苷酸序列見(jiàn)SEQ ID No. 1所示。其中l(wèi)bp_410bp為p^TrcHisZA載體前半部分基因序列，190bp-382bp為啟動(dòng)子區(qū)域，411bp-416bp為NcoI酶切位點(diǎn)，1713bp-1730bp 為突變序列(插入的 6His 標(biāo)簽)，2141bp_2146bp 為 Bglll，2172bp_2177bp為HindIII，2178bp-6119bp區(qū)域?yàn)閜TrcHis2A載體后半部分基因序列，2!352bp-2508bp區(qū)域?yàn)閜TrcHis2A載體終止子區(qū)域，2473bp_2516bp區(qū)域?yàn)閜TrcHis2A載體終止子rrnB_Tl，2648bp-2676bp 區(qū)域?yàn)?pTrcHis2A 載體終止子 rrnB_T2。⑦回收的假病毒載體分別進(jìn)行PCR和RT-PCR鑒定，以判定假病毒載體的純度，即是否溶液中存在殘余的基因組DNA。純化產(chǎn)物作為RT-PCR反應(yīng)模板，其中一組不經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄直接進(jìn)行PCR鑒定，檢測(cè)結(jié)果為陰性，表明制備的假病毒顆粒溶液中，無(wú)基因組DNA污染。另一組樣本提取RNA后進(jìn)行RT-PCR鑒定，檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，表明溶液中含有假病毒顆粒(見(jiàn)圖2)。實(shí)施例3尼帕(NP)假病毒顆粒的研制1.構(gòu)建 pTrcMS-NP 質(zhì)粒pGEM-T-NP質(zhì)粒與實(shí)施例2制備的pTrcMS質(zhì)粒分別進(jìn)行pstl和Hindi11雙酶切，膠回收純化，連接，測(cè)序，構(gòu)建PTrcMS-NP。具體方法參照實(shí)施例1前假病毒載體pTrcHis-MS2的構(gòu)建方法。2. pTrcMS-NP假病毒顆粒的純化制備將pTrcMS-NP重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物處理同實(shí)施例2，回收的假病毒顆粒分別進(jìn)行PCR和RT-PCR鑒定。PCR鑒定產(chǎn)物電泳顯示無(wú)目的條帶，RT-PCR鑒定產(chǎn)物電泳顯示存在明顯目的條帶，表明該溶液中含有尼帕假病毒顆粒，并且無(wú)DNA污染。
實(shí)施例4pTrcMS_NP假病毒假病毒顆粒特性鑒定將實(shí)施例3獲得的純化的假病毒顆粒進(jìn)行特性鑒定。主要從溫度敏感性、RNaseA攻擊和形態(tài)觀察三方面進(jìn)行鑒定。PCR鑒定引物分別為I^rimer-NPF :5’ -AACTGCAGACAAGCAATGGAGCCGGAC-3，；Primer-NPR 5' CCCAAGCTTCTCCCTGTATTGTCAATGAAG-3。PCR 產(chǎn)物目的片段大小為450bp。1)純化后的假病毒顆粒溫度敏感性試驗(yàn)將50ul/管純化的假病毒載體溶液分別放置于56°C /ld、37°C /20d、常溫/30d、4°C /30d、-20°C /60d，進(jìn)行樣品處理后RT-PCR鑒定。2)穩(wěn)定性試驗(yàn)(RNase A攻擊試驗(yàn))將50ul/管的假病毒顆粒溶液中分別加入RNase A(lmg/mL) 1 μ 1/2 μ 1/3 μ 1/4 μ 1后，放入37°C，30min,對(duì)照組不加RNaseA0所有樣品均進(jìn)行RNA抽提，進(jìn)行RT-PCR鑒定。3)形態(tài)觀察純化后的假病毒顆粒溶液先進(jìn)行醋酸雙氧鈾染色，然后自然干燥，最后透射電子顯微鏡進(jìn)行形態(tài)觀察。經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，含假病毒顆粒的溶液在37°C情況下至少可以保存20天，隨著保存溫度降低，保存時(shí)間越長(zhǎng)。由此可以看出，該假病毒顆粒具有良好的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)圖3。用RNaseA處理的假病毒顆粒溶液與對(duì)照組樣品分別RT-PCR鑒定，檢測(cè)結(jié)果一致，表明制備的假病毒顆粒能夠抵抗RNaseA的降解見(jiàn)圖4。經(jīng)電鏡觀察，看到直徑大約為^nm的多邊形顆粒，如圖5，即誘導(dǎo)表達(dá)的假病毒顆粒。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
11.ー種假病毒載體，其特征在干，包括出發(fā)載體的啟動(dòng)子序列和終止子序列，MS2噬菌體成熟酶蛋白基因編碼序列、突變的外殼蛋白基因編碼序列、部分裂解蛋白和復(fù)制酶基因編碼序列，出發(fā)載體ー個(gè)末端的多克隆位點(diǎn)序列。
2.如權(quán)利要求1所述的假病毒載體，其特征在干，所述的突變的外殼蛋白基因編碼序列是在位于MS2噬菌體的外殼蛋白基因編碼序列的第15-16個(gè)氨基酸之間，插入6His標(biāo)簽，核苷酸序列為CATCACCATCACCATCAC。
3.如權(quán)利要求1或2所述的假病毒載體，所述的出發(fā)載體為pTrCHis2A。
4.如權(quán)利要求3所述的假病毒載體，其為pTrcMS，核苷酸序列如SEQID No. 1所示。
5.一種權(quán)利要求4所述假病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在干，包括以下步驟1)在pTrcHis2A載體多克隆位點(diǎn)的NcoI和BglII雙酶切位點(diǎn)處插入噬菌體MS2的基因片段，得到前假病毒載體pTrcHis-MS2 ；2)通過(guò)基因插入方法將載體pTrCHis-MS2中外殼蛋白基因編碼序列的第15-16個(gè)氨基酸之間插入Mlis序列，構(gòu)建得到假病毒載體；3)假病毒載體pTrcMS用His柱進(jìn)行純化。
6.如權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在干，所述步驟2)是以前假病毒載體 pTrCHis-MS2為模板，以兩對(duì)含有突變基因的PCR引物對(duì)為引物，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物；用》ιοΙ和Hind III雙酶切前假病毒載體pTrcHis-MS2 ；兩次PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物與酶切后的pTrCHis-MS2連接，轉(zhuǎn)化受體菌，經(jīng)篩選，誘導(dǎo)表達(dá)，鑒定得到假病毒載體 PTrcMS0
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在干，所述的含有突變基因的PCR引物對(duì)，其核苷酸序列為Primerl-F :5’ -AGGTAACATGCTCGAGGGCCTT-3，，Primerl-R 5' -GACATCACCATCACCATCACACTGGCGACGTGGCTGTCGCCCCA-3’ ；Primer2-F :5’ -GTGTGATGGTGATGGTGATGTCCGCCATTGTCGACGAGAACG-3’，Primer2-R :5’ -GTTCGGGCCCAAGCTTCGAATTCCC-3，。
8.ー種假病毒顆粒，其特征在干，含有權(quán)利要求4所述假病毒載體pTrcMS及其攜帯有外源基因的噬菌體基因組。
9.ー種假病毒顆粒的制備方法，其特征在于，將外源基因克隆于權(quán)利要求4所述假病毒載體PTrcMS中的MS2噬菌體外殼蛋白基因編碼序列下游，在其下游插入終止子，轉(zhuǎn)錄后得到帶有噬菌體操縱子RNA序列的外源基因RNA轉(zhuǎn)錄本，誘導(dǎo)表達(dá)噬菌體外殼蛋白并組裝成蛋白外殼，并將攜帶有外源基因的噬菌體基因組包裹到包膜內(nèi)，得到假病毒顆粒。
10.權(quán)利要求4所述的假病毒載體或權(quán)利要求8所述的假病毒顆粒在制備檢測(cè)動(dòng)物病原微生物質(zhì)控品的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種動(dòng)物病原微生物假病毒載體及其制備技術(shù)。本發(fā)明將MS2噬菌體的成熟酶蛋白和外殼蛋白的基因編碼序列以及其基因組部分包含基因調(diào)節(jié)元件序列的5′非編碼序列相應(yīng)的cDNA序列連接到pTrcHis2A載體啟動(dòng)子的下游，構(gòu)建了前假病毒載體。然后通過(guò)基因插入方法，將MS2噬菌體中外殼蛋白的第15-16個(gè)氨基酸之間加入6His純化標(biāo)簽，這樣含外源基因的假病毒顆粒表達(dá)后為RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，利用純化蛋白方法捕獲假病毒顆粒，可以減化假病毒顆粒制備的繁瑣操作過(guò)程，同時(shí)提高假病毒顆粒純化的質(zhì)量。本發(fā)明假病毒載體為pTrcMS，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102559731SQ20111044502
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者吳紹強(qiáng), 林祥梅, 王彩霞, 鄧俊花 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院