專(zhuān)利名稱(chēng)：促血管生成組合物，其制備方法，及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的促血管生成組合物，涉及其制備方法及用途，尤其是其預(yù)防或治療弓I起缺血型并發(fā)癥的任何病理癥狀的治療用途。本發(fā)明的促血管生成組合物為新的細(xì)胞治療策略開(kāi)創(chuàng)了途徑。在下面的說(shuō)明書(shū)中，在方括號(hào)[]之間的參考數(shù)字是指本文結(jié)尾處所列的參考文獻(xiàn)。
現(xiàn)有技術(shù)關(guān)于存在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)及其用于刺激血管生成和血管修復(fù)的潛力的證實(shí)，是血管生物學(xué)領(lǐng)域的重要進(jìn)步。 這些細(xì)胞可存在于一般的循環(huán)系統(tǒng)中，其既可以是自發(fā)的，也可以是對(duì)于各種刺激(促炎性細(xì)胞因子，生長(zhǎng)因子，缺血，他汀類(lèi)藥物(statins)等等)的響應(yīng)。這些參與血管修復(fù)機(jī)理的細(xì)胞，為缺血性心血管疾病的治療開(kāi)創(chuàng)了一種先進(jìn)的治療途徑。已公開(kāi)了細(xì)胞標(biāo)記物/特異性配體型的促血管生成系統(tǒng)，其包括內(nèi)皮祖細(xì)胞，其中包含Eph細(xì)胞標(biāo)記物，特別是EphB4或EphBl [I]。所述系統(tǒng)中，為了刺激血管生成，包含Eph標(biāo)記物的內(nèi)皮祖細(xì)胞由屬于肝配蛋白(ephrin)家族的特異性配體活化。內(nèi)皮祖細(xì)胞可從來(lái)自骨髓、外周血液或臍帶血液的單核細(xì)胞獲得。分化后，骨髓或臍帶的單核細(xì)胞提供相對(duì)大量的內(nèi)皮祖細(xì)胞，其表達(dá)或包含Eph標(biāo)記物。外周血液中,循環(huán)EPC只占單核細(xì)胞很小的百分比。然而，經(jīng)若干步驟(通過(guò)細(xì)胞計(jì)量術(shù)預(yù)選和分選、離體培養(yǎng)、分化和成熟以及膨脹)獲得內(nèi)皮祖細(xì)胞卻需要復(fù)雜和漫長(zhǎng)的操作；因此其費(fèi)用高并且產(chǎn)率低。另外，已知心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)因子可通過(guò)內(nèi)皮功能異常誘導(dǎo)血管和心血管障礙，所述功能異常可能導(dǎo)致參與組織修復(fù)的EPC數(shù)量和功能的下降[2]。循環(huán)EPC的功能異常和低于正常值的量，已在具有心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)因子的某些個(gè)體中觀察到，所述心血管疾病例如高膽固醇血癥、糖尿病或高血壓[3]。因此確實(shí)需要提供可刺激血管生成的新的組合物，所述刺激至少具有與各種來(lái)源的EPC相同的功效，或甚至具有與血管生成因子例如VEGF相同的強(qiáng)度，并且這些新組合物包含容易獲得的細(xì)胞，所述細(xì)胞不必然要求-通過(guò)細(xì)胞計(jì)量術(shù)預(yù)選和分選的步驟、離體培養(yǎng)的步驟、分化和/或成熟的步驟或-作為與用于刺激血管生成的其他細(xì)胞的混合物。還實(shí)際需要提供新的組合物，其能夠刺激血管生成功能，該組合物包含數(shù)量保持穩(wěn)定的細(xì)胞。另外，實(shí)際需要新的促血管生成組合物，其使用簡(jiǎn)單、可再現(xiàn)且便宜。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是滿(mǎn)足了這些需要，這通過(guò)提供包含源自外周血液的單核細(xì)胞(MNC)和能夠使所述外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞(MNC)活化的配體L的促血管生成組合物而實(shí)現(xiàn)，其中循環(huán)血液?jiǎn)魏思?xì)胞(MNC)包含能夠接受配體L以使所述細(xì)胞活化的受體。由配體L激活后，循環(huán)血液MNC獲得促血管生成性質(zhì)，其相當(dāng)于或大于源自骨髓或臍帶血液的EPC的作用。對(duì)于本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“循環(huán)血液?jiǎn)魏思?xì)胞”是指達(dá)到成熟狀態(tài)并分化為單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的單核細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“外周血液”等同于術(shù)語(yǔ)“循環(huán)血液”。相比于EPC，所述單核細(xì)胞更直接地和更容易獲得，因?yàn)槠鋸难h(huán)血液的分離并不需要通過(guò)細(xì)胞計(jì)量術(shù)的預(yù)選和分選的步驟、離體培養(yǎng)的步驟、分化和/或成熟的步驟。因此這不但促進(jìn)了本發(fā)明的促血管生成組合物的使用，還可降低所述組合物的生產(chǎn)成本。在病理癥狀需要緊急治療而不能拖延的情況下，本發(fā)明的組合物可迅速獲得，這 也成為其重要優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明的組合物避免了異源性血液細(xì)胞輸入所帶來(lái)的問(wèn)題，并且構(gòu)成一種有希望的方法。事實(shí)上，本發(fā)明的組合物適用于自體輸血。迄今為止，從未考慮到循環(huán)血液?jiǎn)魏思?xì)胞(MNC)可直接活化以刺激促血管生成活性。另外，現(xiàn)有技術(shù)僅教導(dǎo)了基于內(nèi)皮祖細(xì)胞的促血管生成組合物，其為骨髓單核細(xì)胞分化的結(jié)果。本發(fā)明的組合物中，單核細(xì)胞(MNC)可包含能夠接受配體L以使所述細(xì)胞活化的受體。本發(fā)明的組合物的形式可為不同性質(zhì)和來(lái)源的細(xì)胞和分子的粗混合物，且其性質(zhì)可改變，或其數(shù)量可增加，以使MNC的量足以用于所述組合物預(yù)期的應(yīng)用中。存在于所用組合物和/或細(xì)胞批料(或混合物)中的單核細(xì)胞的量可為例如IO6至1012。本發(fā)明的組合物還可為“次粗品(less crude) ”形式，其中通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的純化方法移除了某些細(xì)胞和/或分子。這些方法不得對(duì)所述細(xì)胞(MNC)有害。相比于粗混合物的細(xì)胞(MNC)的濃度，所述“次粗品”組合物通常含有更高濃度的能夠被刺激的細(xì)胞(MNC)。存在于所用組合物和/或細(xì)胞批料(或混合物)中的細(xì)胞的量可為例如IO6至IO11個(gè)單核細(xì)胞。本發(fā)明的組合物還可包含臍帶血液或骨髓，或兩者的混合物。更具體地，循環(huán)血液?jiǎn)魏思?xì)胞(MNC)可源自哺乳動(dòng)物的外周血液。術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”表示任何哺乳動(dòng)物。例如可提及馴養(yǎng)的動(dòng)物，例如狗和貓；飼養(yǎng)動(dòng)物，例如豬、牛、綿羊和山羊；動(dòng)物，例如小鼠和大鼠；靈長(zhǎng)類(lèi)，例如猴和猩猩；和人。在本發(fā)明的上下文中，“刺激”促血管生成活性是指引起體內(nèi)和體外促血管生成性質(zhì)的增加和改善。在本發(fā)明的上下文中，使得循環(huán)血液?jiǎn)魏思?xì)胞(MNC) “活化”的術(shù)語(yǔ)，是指開(kāi)始對(duì)分化細(xì)胞(MNC)的部分產(chǎn)生細(xì)胞響應(yīng)。如前文所述，本發(fā)明的組合物包含循環(huán)血液?jiǎn)魏思?xì)胞(MNC)，該細(xì)胞包含能夠接受配體L以使所述細(xì)胞活化的受體。即使在過(guò)量存在的情況下，所述配體L也僅僅結(jié)合至能夠接受它們的受體，而不是結(jié)合至所有可存在于循環(huán)血液?jiǎn)魏思?xì)胞(MNC)上的受體。循環(huán)血液?jiǎn)魏思?xì)胞(MNC)因此包含能夠通過(guò)非循環(huán)膜配體(例如肝配蛋白)刺激的受體。這些受體可例如為選自EphA和EphB的跨膜受體酪氨酸激酶。所述配體L可為肝配蛋白家族的配體。肝配蛋白可分為兩個(gè)亞家族，即A型配體通過(guò)糖基化磷酯酰肌醇(GPI)簡(jiǎn)單地結(jié)合至質(zhì)膜，B型配體是跨膜的且具有胞質(zhì)內(nèi)域。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述配體L為具有肝配蛋白-B活性的分子，更具體地為具有肝配蛋白-B2活性的分子。所述配體L可為肝配蛋白-B2。所述配體L可任選與穩(wěn)定化和/或結(jié)合分子締合(associated)。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“締合的”包涵了不同強(qiáng)度和性質(zhì)的任何類(lèi)型的結(jié)合即，共價(jià)、離子、極性、范德華氏和疏水結(jié)合。所述穩(wěn)定化和/或結(jié)合分子可穩(wěn)定化和/或保護(hù)所述配體。其可結(jié)合所述配體但不能結(jié)合所述受體。本發(fā)明的組合物中，所述穩(wěn)定化和/或結(jié)合分子可為例如免疫球蛋白的Fe片段?！ぴ揊e片段是免疫球蛋白分子的肽鍵斷裂的結(jié)果，其不具有抗原-結(jié)合位點(diǎn)。因此其不具有抗體活性。所述Fe片段(或Fe域)是由兩個(gè)重鏈的恒定區(qū)形成的免疫球蛋白分子的部分。該Fe域給予了免疫球蛋白其性質(zhì)。Fe片段可由免疫球蛋白獲得，例如通過(guò)木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或其他任何適當(dāng)?shù)拿傅牡鞍姿庾饔谩１景l(fā)明的另一主題是促血管生成物質(zhì)，其包含通過(guò)配體L活化的循環(huán)血液?jiǎn)魏思?xì)胞(MNC)以刺激血管生成，所述配體L任選與穩(wěn)定化和/或結(jié)合分子締合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，該促血管生成物質(zhì)包含由肝配蛋白-B2分子作為配體所刺激的循環(huán)血液?jiǎn)魏思?xì)胞(MNC)，所述配體L任選與穩(wěn)定化和/或結(jié)合分子締合。在該實(shí)施方式中，所述循環(huán)血液?jiǎn)魏思?xì)胞(MNC)包含選自EphA和EphB的受體，其能夠由肝配蛋白-B2分子刺激。本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明的促血管生成組合物的方法，其包括以下步驟(i)獲得外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞(MNC)并放在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中；(ii)步驟(i)的單核細(xì)胞與配體L接觸，所述配體任選與穩(wěn)定化和/或結(jié)合分子
鋪A
φ π O根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“外周血液”等同于術(shù)語(yǔ)“循環(huán)血液”。單核細(xì)胞源自外周血液(PBMNC)。此外，臍帶血液或骨髓或兩者的混合物，可加入該步驟的包含單核細(xì)胞的外周血液中。可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)?shù)姆椒◤耐庵苎悍蛛xMNC，所述方法例如差速離心，或通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分選。步驟(i)的適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)可為主要含水的生理液體。適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)可包含至少80%，有利地85%和甚至更有利地至少90%的水。除水之外，所述適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)可包含一種或多種選自以下的要素-無(wú)機(jī)溶質(zhì)，例如痕量元素和離子，尤其是Na+，Cl_，K+，P043_，Ca2+，S042_；-有機(jī)溶質(zhì)，例如脂質(zhì)，碳水化合物，氨基酸，尿素，尿酸，膽紅素，激素；-血漿蛋白，例如白蛋白，免疫球蛋白，纖維蛋白原，脂蛋白等等。所述適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)更具體地為血漿。特定情況下，所述血漿可為自體血漿。
將該循環(huán)血液?jiǎn)魏思?xì)胞(MNC)與肝配蛋白家族的配體接觸。所述配體L有利地為具有肝配蛋白-B活性的分子，更有利地為具有肝配蛋白-B2活性的分子。步驟(ii)中所述的配體L可為肝配蛋白-B2。所述配體L可任選與前述穩(wěn)定化/結(jié)合分子締合。所用單核細(xì)胞(MNC)包含能夠由肝配蛋白家族的配體刺激的受體。這些受體可為例如選自EphA和EphB的跨膜受體酪氨酸激酶。所述配體L可任選與前述穩(wěn)定化/結(jié)合分子締合。該穩(wěn)定化/結(jié)合分子有利地為免疫球蛋白Fe片段。步驟(ii)中，循環(huán)血液?jiǎn)魏思?xì)胞(MNC)和所述配體L接觸的時(shí)間可為5分鐘至6小時(shí)，例如20分鐘至4小時(shí)，例如30分鐘至I小時(shí)。 步驟(ii)中的接觸可在20至50° C，例如25至40° C，例如37° C的溫度進(jìn)行。步驟(ii)中的接觸可在促進(jìn)所述配體L結(jié)合結(jié)合至循環(huán)血液細(xì)胞(MNC)受體的氣氛中進(jìn)行，例如CO2和氧氣的百分比分別為2%至10%和98%至90%，其中CO2和氧氣的百分比之和在所有情況下等于100%。更具體地，所選氣氛由5%的CO2和95%的氧氣組成。在本發(fā)明的方法中，還可在步驟(ii)之后進(jìn)行洗滌步驟。可用如前所述的適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)來(lái)進(jìn)行所述洗滌。本發(fā)明還涉及可根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的促血管生成組合物，所述組合物包含循環(huán)血液?jiǎn)魏思?xì)胞(MNC)和能夠活化所述循環(huán)血液?jiǎn)魏思?xì)胞(MNC)以刺激促血管生成活性的配體L ;所述配體L任選與穩(wěn)定化和/或結(jié)合分子締合。本發(fā)明的促血管生成組合物可直接使用或以藥物組合物的形式用作藥物。本發(fā)明的促血管生成物質(zhì)根據(jù)還可直接使用或以含有其的藥物組合物的形式用作藥物。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面可為本發(fā)明的促血管生成組合物或促血管生成物質(zhì)，其用作藥物，特別是用于治療和再生受損的血管組織，特別是在心臟、腦或者外周水平；或用于療法中，特別是用于預(yù)防或治療任何引起缺血并發(fā)癥的病理癥狀，所述并發(fā)癥例如糖尿病，糖尿病性神經(jīng)病，動(dòng)脈粥樣硬化，心肌梗塞，中風(fēng)，下肢動(dòng)脈病，衰老，高脂血癥，高膽固醇血癥，肥胖或高血壓。根據(jù)其另一方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的促血管生成組合物或促血管生成物質(zhì)，和任選一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物可通過(guò)已知方法制備。所述賦形劑通常是無(wú)治療活性的物質(zhì)，其形成藥物的組合物的一部分，或者其用于該組合物的制備。賦形劑的功能是改善外觀、保證儲(chǔ)存和促進(jìn)藥物的形成和給藥。其作用還有傳遞活性成分至其作用位點(diǎn)并控制其被機(jī)體吸收。取決于所需的藥物形式和給藥模式，可使用各種賦形劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)所需的藥物形式和給藥模式選擇合適的賦形劑[6]。直接給藥或包括在藥物組合物中的促血管生成組合物或促血管生成物質(zhì)的量為治療有效量。術(shù)語(yǔ)“有效量”或“治療有效量”是指產(chǎn)生所需預(yù)防或治療效果的促血管生成物質(zhì)或藥物組合物中的促血管生成組合物的量。所述有效量可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)藥物操作的手段以實(shí)驗(yàn)的方式確定。為了獲得所需治療效果，活化細(xì)胞所需的活性成分(例如肝配蛋白B2-Fc)的劑量的范圍可為10至200微克/ml，且所用的批料中活化的細(xì)胞的數(shù)量為每次治療IO8至IO11個(gè)細(xì)胞。盡管這些劑量是平均情況的實(shí)例，但也可能存在特殊的情況，其中更高或更低的劑量是合適的。所述劑量也是本發(fā)明的一部分。根 據(jù)通常的實(shí)踐，對(duì)于每位患者的合適的劑量由醫(yī)師根據(jù)給藥模式以及患者的體重和響應(yīng)來(lái)確定。給藥模式可有利地為非經(jīng)腸。非經(jīng)腸給藥可包括例如靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，皮下，腹膜內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，關(guān)節(jié)內(nèi)，池內(nèi)(intra-cisternal),皮內(nèi)，病變內(nèi)，眼內(nèi)，胸膜內(nèi)，鞘內(nèi)，子宮內(nèi)和心室內(nèi)給藥。待治療的治療性適應(yīng)癥以及組合物的生理化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)使其能夠確定給藥途徑以及最合適的制劑。各種制劑和給藥系統(tǒng)公開(kāi)于現(xiàn)有技術(shù)中[5]。本發(fā)明的促血管生成組合物或促血管生成物質(zhì)，可用于制備預(yù)期用于治療和再生受損的血管組織的藥物，特別是在心臟、腦或者外周水平。其還可用于制備預(yù)期用于預(yù)防或治療任何引起缺血并發(fā)癥的病理癥狀的藥物，所述并發(fā)癥例如糖尿病，糖尿病性神經(jīng)病，動(dòng)脈粥樣硬化，心肌梗塞，中風(fēng)，下肢動(dòng)脈病，衰老，高脂血癥，高膽固醇血癥，肥胖或高血壓。根據(jù)其一個(gè)方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的促血管生成組合物或促血管生成物質(zhì)，其用于治療和再生受損的血管組織，特別是在心臟、腦或者外周水平。根據(jù)其另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的促血管生成組合物或促血管生成物質(zhì)，其用于預(yù)防或治療任何引起缺血并發(fā)癥的病理癥狀，所述并發(fā)癥例如糖尿病，糖尿病性神經(jīng)病，動(dòng)脈粥樣硬化，心肌梗塞，中風(fēng)，下肢動(dòng)脈病，衰老，高脂血癥，高膽固醇血癥，肥胖或高血壓。本發(fā)明還涉及具有肝配蛋白-B2活性的分子作為能夠結(jié)合至單核細(xì)胞(MNC)的受體以觸發(fā)其活化的配體的用途。本發(fā)明的促血管生成組合物可用于哺乳動(dòng)物、特別是人的細(xì)胞治療。根據(jù)其另一方面，本發(fā)明還涉及預(yù)防或治療上述病理癥狀的方法，其包括給藥促血管生成組合物或包含其的藥物組合物，或給藥促血管生成物質(zhì)或包含其的藥物組合物。第一種方法可在于-從循環(huán)血液和/或骨髓分離單核細(xì)胞(MNC)；-通過(guò)將配體L結(jié)合至在MNC上存在的它們的特異性受體而體外活化MNC，以改善它們的促血管生成性質(zhì)；和-向血液或直接向缺血組織中引入由此活化的細(xì)胞(MNC)。該方法使得可顯著地提高活化細(xì)胞(MNC)的數(shù)量。MNC的體外活化還可用于例如接種人工血管。第二種方法可在于-直接使用含有細(xì)胞(MNC)以及任選含有其他細(xì)胞和細(xì)胞因子的整體的血液和/或骨髓樣品；-將配體L添加至所述樣品；-直接引入整個(gè)混合物而不分離(fractionation)細(xì)胞。在人中，該方法可描述為自體方法并且使得可進(jìn)行自體輸血，因而使得可能例如消除免疫學(xué)相容性和病毒安全性的所有問(wèn)題。


圖I表示小鼠缺血和非缺血腿部皮膚灌注的結(jié)果，其通過(guò)激光-多普勒灌注成像速度測(cè)量?jī)x(MLDI 5078, Moon instruments公司銷(xiāo)售)評(píng)價(jià)。圖2表示小鼠缺血和非缺血腿部血管造影評(píng)分結(jié)果，其通過(guò)高清晰度微血管造影法(2200, Kodak Dental Systems, France 銷(xiāo)售)評(píng)價(jià)。圖3表示小鼠缺血和非缺血腿部肌肉的毛細(xì)血管密度結(jié)果，其通過(guò)定量免疫-組織形態(tài)測(cè)定法(Leitz突光顯微鏡和Histolab軟件，Microvision(Evry)銷(xiāo)售)評(píng)價(jià)。
實(shí)施例方法和材料 根據(jù)法國(guó)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的動(dòng)物保護(hù)立法和其他法律或法規(guī)，以及根據(jù)涉及實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的看護(hù)和使用的歐洲委員會(huì)指令No. 07430，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。該研究方案經(jīng)法國(guó)農(nóng)業(yè)部的動(dòng)物保護(hù)和健康部以及環(huán)境保護(hù)部批準(zhǔn)。實(shí)施例I :本發(fā)明的促血管生成組合物的制備MNC 分離將30至40ml的人外周血液新鮮收集于肝素涂覆的管(Vacuette 455051, GreinerBio-One GmbH公司銷(xiāo)售)中。單核細(xì)胞(MNC)從外周血液通過(guò)Ficoll密度梯度離心分離。在靜脈(iv)注射細(xì)胞(MNC)于動(dòng)物中2小時(shí)之前，將血液樣品用磷酸鹽緩沖鹽水或PBS (14040，Gibco公司銷(xiāo)售)稀釋2倍。30至35ml的稀釋的血液樣品置于IOml的預(yù)先制備的Ficoll帶(I. 077g/ml ；P04-60500,Pan Biotech公司銷(xiāo)售)上成為一層。在環(huán)境溫度(大約20° C)以700Xg(或重力加速度的700倍)離心30分鐘。從血漿-Ficoll界面除去細(xì)胞(MNC)的白色層。用50ml的M199(31153，Gibco公司銷(xiāo)售)洗滌兩次后，將單核細(xì)胞計(jì)數(shù)，并再混懸于含有2%胎牛血清或FBS的M199培養(yǎng)基中，濃度為3 X IO6細(xì)胞/ml。MNC 刺激對(duì)于所述刺激，在含有5%的CO2和95%的氧氣的氣氛下在37° C用15 μ g的肝配蛋白-B2(496-EB，R&D SYSTEMS)培養(yǎng)Iml的含有2%胎牛血清或FBS的M199培養(yǎng)基中的3 X IO6單核細(xì)胞(MNC) 30分鐘。然后用IOml的含有2%FBS的M199培養(yǎng)基洗滌所刺激的細(xì)胞(MNC)兩次以除去游離的肝配蛋白-B2。MNC 灃射所洗滌的MNC以103、IO4和IO5個(gè)細(xì)胞/100 μ I的PBS的濃度重新混懸，然后在無(wú)菌條件下結(jié)扎股動(dòng)脈5小時(shí)后注射入所實(shí)驗(yàn)的小鼠尾靜脈中。實(shí)施例2 :本發(fā)明的組合物的促血管生成活性無(wú)胸腺棵小鼠的準(zhǔn)備飼養(yǎng)雄性無(wú)胸腺成年裸小鼠(6至7周齡，Harlan)至少7天，自由飲食、飲水，然后結(jié)扎右側(cè)股動(dòng)脈。將小鼠保持在倒轉(zhuǎn)的12小時(shí)夜/晝循環(huán)中早7時(shí)至晚7時(shí)將小鼠置于黑暗中，在晚7時(shí)到早7時(shí)將小鼠置于光線下，處于環(huán)境溫度(22°C)。所有操作均在無(wú)病原、無(wú)微生物的條件下進(jìn)行。將小鼠置于一次性塑料籠中，其在上部包含過(guò)濾器。事先用UV照射該籠、上部濾器部分、水瓶、進(jìn)食托盤(pán)(Innovive)和飼料(Harlan)。使用前用高壓滅菌鍋處理其所飲用的水。右側(cè)股動(dòng)脈的結(jié)扎在無(wú)菌條件下進(jìn)行手術(shù)操作以創(chuàng)造出后腿的單側(cè)缺血。通過(guò)吸入異氟烷(I. 5至
2.0%)麻醉小鼠。腿部退避反射和眨眼反射在操作之前完全抑制。通過(guò)切開(kāi)右腿的覆蓋皮膚中心部分而暴露股動(dòng)脈。使用顯微鏡，剛好在旋股外側(cè)(circomflexa femoris lateralis)起始點(diǎn)上方處，從靜脈分開(kāi)并分離股動(dòng)脈。覆蓋的皮膚隨后用外科縫合器縫合。腿部皮膚灌注評(píng)價(jià)經(jīng)由肝配蛋白-B2-刺激的細(xì)胞(MNC)的腿部皮膚血流的評(píng)價(jià)使得能夠評(píng)價(jià)刺激的細(xì)胞(MNC)改善缺血肢體灌注的能力
在結(jié)扎后第14天，通過(guò)腹膜內(nèi)(ip)注射苯巴比妥(10mg/kg)麻醉動(dòng)物。然后將小鼠放在熱毯上，直腸溫度保持在36. 5至37° C以使體溫對(duì)腿部皮膚灌注的影響最小。然后通過(guò)灌注成像多普勒激光儀(MLDI 5078,Moon Instruments公司銷(xiāo)售)進(jìn)行評(píng)價(jià)。每只動(dòng)物的皮膚灌注結(jié)果表示為缺血的右腿與不缺血的左腿之比。動(dòng)脈密度測(cè)定測(cè)定經(jīng)由肝配蛋白-B2-刺激的細(xì)胞(MNC)的血管密度使得能夠評(píng)價(jià)所述刺激的細(xì)胞誘導(dǎo)原有血管網(wǎng)絡(luò)重塑(血管重塑)的能力。評(píng)價(jià)腿部皮膚灌注之后，血管密度通過(guò)高清晰度微血管造影法(2200，KodakDental Systems, France銷(xiāo)售)確定。進(jìn)行縱向剖腹術(shù)，向腹主動(dòng)脈插入聚乙烯(PE-10)導(dǎo)管，并通過(guò)其注射大約150μ1的造影產(chǎn)品(1.67g/ml的硫酸鋇在鹽水中的溶液)(Fluka-11845, Sigma, France公司銷(xiāo)售)。然后建立后腿的微血管造影法，并通過(guò)數(shù)字X-射線傳感器獲得圖像(每只動(dòng)物2至3個(gè)圖像)。每只后腿的動(dòng)脈密度通過(guò)在動(dòng)脈所占據(jù)的定量區(qū)域中每張圖像的像素百分比估算，其使用常規(guī)定量圖像分析。每只動(dòng)物的血管密度結(jié)果表示為右腿(缺血)與左腿(不缺血)之比。為進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，收集了所有動(dòng)物的一對(duì)肱三頭肌，將其嵌入Tissue-Tek O. C. T基質(zhì)(Finetek Europe公司銷(xiāo)售)并迅速使用液氮中預(yù)先冷卻的異戍醇(isopentyl)冷凍。毛細(xì)血管密度定量經(jīng)由肝配蛋白-B2-刺激的細(xì)胞(MNC)的毛細(xì)血管密度定量，使得能夠評(píng)價(jià)所述刺激的細(xì)胞誘導(dǎo)血管系統(tǒng)從毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)發(fā)展(血管發(fā)生和/或血管生成)的能力。為評(píng)價(jià)毛細(xì)血管密度，使用低溫恒溫器(Leica公司銷(xiāo)售)切開(kāi)各個(gè)冷凍的肌肉樣品。切片厚度為7 μ m。切片在三個(gè)不同水平的樣品下進(jìn)行，間隔距離大約300 μ m。切片用綴合至異凝集素B4的異氰酸熒光素或FITCdOO μ I/片，10 μ g/ml ；L2895, Sigma公司銷(xiāo)售)在環(huán)境溫度(20° C)培養(yǎng)一小時(shí)。使用配有適當(dāng)?shù)臑V光片的突光顯微鏡(Observer ZI,Zeiss公司銷(xiāo)售)，對(duì)各個(gè)缺血或非缺血肌肉樣品得到六張圖像(每個(gè)水平兩張圖像X三個(gè)水平)。使用HistoLab軟件(版本7. O, Microvision Instrument公司銷(xiāo)售)以定量毛細(xì)血管密度。對(duì)于各個(gè)動(dòng)物的結(jié)果表示為缺血的后腿與不缺血的后腿的毛細(xì)血管密度之比。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析腿部皮膚灌注、動(dòng)脈密度和毛細(xì)血管密度結(jié)果表示為用PBS (磷酸鹽緩沖鹽水)處理的對(duì)照組的平均百分比土SEM(平均值的標(biāo)準(zhǔn)差)。各實(shí)驗(yàn)組之間的對(duì)比，通過(guò)單向方差分析(ANOVA),和隨后的Fischer’ s PLSD法(Fischer’ s保護(hù)的最小顯著差異法)的補(bǔ)充分析而進(jìn)行。若P值低于O. 05的顯著性閾值(P〈0. 05)，則被認(rèn)為是顯著的。肝配蛋白_B2(EFNB2)刺激的循環(huán)血液細(xì)胞(MNC)對(duì)于缺血后血管重新形成的作里腿部皮膚灌注 在缺血后第14天，相比于PBS，源自糖尿病患者靜脈血液的EFNB2刺激的細(xì)胞(MNC)(細(xì)胞濃度為103，104和IO5)顯著地改變了腿部皮膚灌注(對(duì)于濃度為IO3UO4和IO5個(gè)細(xì)胞的EFNB2刺激的MNC,分別為PBS組的97±7%，132± 14%和163 + 10%,如圖I)。血管造影結(jié)果在缺血后第14天，相比于PBS，源自糖尿病患者的EFNB2刺激的MNC (細(xì)胞濃度為
IO3,IO4和IO5)顯著地提高了血管造影評(píng)分(對(duì)于濃度為103、104和IO5個(gè)細(xì)胞的EFNB2刺激的 MNC,分別為 PBS 組的 142 ± 19%，157 ± 19% 和 189 ± 17%，如圖 2)毛細(xì)血管密度在結(jié)扎后第14天，濃度為103、104和IO5的EFNB2刺激的MNC細(xì)胞的靜脈內(nèi)遞送，顯著地增加了毛細(xì)血管密度(對(duì)于濃度為IO3UO4和IO5個(gè)細(xì)胞的EFNB2刺激的MNCdU為 PBS 組的 163 ±14%，156 ±11% 和 171 ±23%，如圖 3)?？傊?，肝配蛋白-B2-FC活化的糖尿病患者外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞具有有益的促血管生成的作用，其從功能的觀點(diǎn)(皮膚血流測(cè)量)和結(jié)構(gòu)的觀點(diǎn)(動(dòng)脈微血管造影和毛細(xì)血管密度測(cè)量)來(lái)看作用非常顯著。文獻(xiàn)列表[1]W0 2007/012764.[2] Quyyumi et al. , Can. J. Cardio. 20, 44B-8B, 2004; Vasa et al. , Circ.Res. 89，El-7, 2001.[3] Verma et al.，Circulat ion，105，546-549，2002 ; Vasa et al. Circ.Res. 89，cl_c7，2001; Tepper et al. , Circulation, 106，2781-2786，2002.[4] Iba et al.，Circulation，2019-2025，2002.[5] Gennaro e d. (2000) Remington^ s PharmaceuticalSciences;Hardman, Limbird and Gilman, eds. (2001)The Pharmacological Basis ofTherapeutics.[6]Pharmacopeias US P，JP，EP;A.Le Hir, J-C. Chaumeilj D. Brossardj Pharmaciegalenique[Galenical pharmacy]，9th edition, p. 36-93, 2009.
權(quán)利要求
1.促血管生成組合物，其包含外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞(MNC)和能夠活化所述單核細(xì)胞(MNC)以刺激促血管生成活性的配體L，其中所述外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞(MNC)具有能夠接受配體L以使所述細(xì)胞活化的受體。
2.權(quán)利要求I的組合物，其還包含臍帶血液或骨髓，或兩者的混合物。
3.權(quán)利要求I或2的組合物，其中所述受體能夠被肝配蛋白刺激。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中所述受體選自EphA和EphB。
5.權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)的組合物，其中所述配體L為肝配蛋白-B。
6.權(quán)利要求I至5中任一項(xiàng)的組合物，其中所述配體L為肝配蛋白-B2。
7.權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)的促血管生成組合物，其還包含穩(wěn)定化和/或結(jié)合分子，其與所述配體L締合。
8.權(quán)利要求7的組合物，其中所述穩(wěn)定化和/或結(jié)合分子為免疫球蛋白Fe片段。
9.促血管生成物質(zhì),其包含由配體L活化以刺激促血管生成活性的單核細(xì)胞(MNC)，其中所述單核細(xì)胞(MNC)包含能夠接受配體L以使所述細(xì)胞活化的受體。
10.制備權(quán)利要求I至8中任一項(xiàng)所述的促血管生成組合物的方法，其包括以下步驟 (i)獲得外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞(MNC)并放在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中； ( )將步驟(i)的外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞(MNC)與所述配體L接觸，所述配體與穩(wěn)定化和/或結(jié)合分子締合。
11.權(quán)利要求的 ο方法，其中將臍帶血液或骨髓或該兩者的混合物加入步驟α)的包含單核細(xì)胞的外周血液中。
12.權(quán)利要求10或11的方法，其中步驟(i)中所述適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)為血漿。
13.權(quán)利要求10至12中任一項(xiàng)的方法，其中所述配體L為肝配蛋白-B2。
14.促血管生成組合物，其可根據(jù)權(quán)利要求10至13中任一項(xiàng)的方法獲得，所述組合物包含外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞(MNC)和能夠活化所述外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞(MNC)以刺激促血管生成活性的配體L。
15.權(quán)利要求I至8和14中任一項(xiàng)的促血管生成組合物，或權(quán)利要求9的促血管生成物質(zhì)，其用作藥物。
16.藥物組合物，其包含權(quán)利要求I至8和14中任一項(xiàng)的促血管生成組合物或權(quán)利要求9的促血管生成物質(zhì)，以及任選一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。
17.權(quán)利要求I至8和14中任一項(xiàng)的促血管生成組合物，或權(quán)利要求9的促血管生成物質(zhì)，其用于預(yù)防或治療任何引起缺血型并發(fā)癥的病理癥狀，所述并發(fā)癥例如糖尿病、糖尿病性神經(jīng)病、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗塞、中風(fēng)、下肢動(dòng)脈病、高脂血癥、高膽固醇血癥、肥胖或高血壓。
18.具有肝配蛋白-B2活性的分子作為能夠結(jié)合至外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞(MNC)的受體以觸發(fā)其活化的配體的用途。
19.權(quán)利要求I至8和14中任一項(xiàng)的促血管生成組合物、或權(quán)利要求9的促血管生成物質(zhì)的用途，其用于抗衰老。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的促血管生成組合物，涉及其制備方法及用途，尤其是用于預(yù)防或治療引起缺血型并發(fā)癥的任何疾病。
文檔編號(hào)A61P9/10GK102917713SQ201180025892
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2011年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日
發(fā)明者G.托比萊姆, J-S.希爾韋斯特里 申請(qǐng)人:血管與血液研究院, 巴黎大學(xué)迪德羅特第七分校